Abstract
Gastrulasyon gibi Drosophila olarak çok hücreli hayvanların embriyonik gelişimi sırasında meydana gelen morfolojik dinamik olayların ilk kümesidir. Bu morfolojik değişim de mezenkimal geçiş (EMT) için epitel olarak kabul edilmektedir. EMT düzeninin bozulması fibroz ve kanser metastaz ile ilişkilidir. EMT, moleküler bir dizi mekanizma tarafından kontrol edilir dair yeni kanıtlar vardır. apikal daralma kontrol gibi, pek çok önemli genler de bilindiği gibi kanser metastazı gözlenen EMT önemli faktörler olduğu. Drosophila gastrulasyon sırasında EMT gibi, epitel hücreler şeklini değiştirmek için indüklenebilir ve çeşitli hücre tipleri karşı hücre kaderine yönlendirmek için yeniden programlanması. Burada embriyonik gelişimin bu aşamasında morfogenetik hücresel hareketler ve hücre kaderi kimlik başlatılmasını tahlil Drosophila gastrulasyon sağlam bir görüntüleme yöntemi sağlamaktır. Bu yöntemi kullanarak, c tespitell gastrulasyon sırasında yeniden düzenlenmesi ve GFP kullanarak gastrulasyon sırasında apikal daralma önemini göstermek DE-kaderin etiketli.
Introduction
Gastrulasyon Drosophila 1,2 olarak çok hücreli hayvanların embriyonik gelişimi sırasında meydana gelen morfolojik dinamik olayların ilk kümesidir. İlginçtir ki, delil ortaya çıkan bu süreç, mekanik ve moleküler mekanizmaları 3 arasındaki etkileşim yoluyla düzenlenir olduğunu göstermektedir. Ayrıca, gastrulasyon önemli bir işlemdir mezenkimal geçiş (EMT), epitelial ayrıca kanser metastazı 4-8 insan hastalık süreçlerine dahil edilir. Apikal daralma kontrol gibi birçok genler de bilindiği gibi kanser metastazı 9 gözlenen EMT önemli etkenler olarak. Böylece, gastrulasyon sırasında apikal daralma yukarıda belirtilen düzenleyici mekanizmaların araştırılması ve kanser metastazı anlayışımızı geliştirmek için mükemmel bir model. Bu tekniğin avantajı, bu nedenle, gerçek zamanlı ve gastrulasyon zamanda hücre hareketi dikkate ki, biz olacakkanser metastazı yanı sıra gastrulasyon rol oynayan genleri ekrana mümkün.
Nispeten bilinmeyen, ancak, hücre-hücre yapışması apikal daralma 1 merkezi bir rol oynadığı düşünülmektedir. Drosophila genetiği iyi düzenleyici moleküler mekanizmaları keşfetmek tek bir hücre düzeyinde araştırmaları için uygundur. Bu model gastrulasyon sırasında apikal daralma önemini ortaya çıkarmak için bize sağlayacaktır. Ayrıca, bu yöntem, kanser metastazı rol oynayan genleri taranması için kullanılabilir. Drosophila gastrulasyon yakalayan canlı görüntüleri daha daha ayrıntılı doku yeniden düzenleme düzenleyen moleküler mekanizmaları anlamak sağladı. Bu yazıda bunu başarmak için basit bir yöntem kapsamlı bir açıklama sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: DE-cad :: GFP 10: Bu çalışmada kullanılan transjenik sinekler şunlardır.
Elma Plate 1. Hazırlık
- Mikrodalgada 12.5 g ağar, 125 mL% 100 ticari olarak temin elma suyu, 12.5 g glikoz ve 375 mL H2O ısı karışımının bir karışım hazırlayın ve 3 cm hücre kültürü çanağı içine dökün. ileride kullanım için 4 ° C'de karışım saklayın.
- elma plakasını hazırladıktan sonra, sinekler yumurta bırakmaya izin bunun üzerine yoğrulmuş maya hamur ince bir tabaka ekleyin.
2. Embriyo Hazırlama ve Canlı Görüntüleme Protokolü
- dostum ve daha sonra yoğrulur maya kaplı bir elma plaka üzerinde bir gecede yumurtlamak için bir şişe yaklaşık 50 sinekler (25 erkek ve 25 kadın) yerleştirin. Şişenin ağzında elma suyu plakasını ayarlayın. baş aşağı bir kuluçka şişesi bulundurun. Inci istemi için alüminyum folyo ile plastik Drosophila stok şişeleri Wrape daha fazla yumurta bırakmaya uçar.
- Ertesi sabah, bir yenisi ile eski elma suyu plakasını değiştirin.
- sinekler alüminyum folyo ile sararak şişeyi 3 ila 4 saat süreyle yumurtalarını edelim.
- Üç dört saat sonra, bir fırça veya pamuk feci kullanarak elma suyu plaka embriyo süzgeç embriyolar toplamak ve PBS ile yıkayın. 12 oyuklu kültür tabaklarında embriyo PBS ile 2 veya 3 kez daha yıkanır.
- 12-Kaynak kültür tabağı içindeki 5 dakika için% 50 çamaşır suyu ile embriyolar Dechorionate.
- dechorionation işleminden sonra, PBS ile embriyolar, 2 ila 3 kez daha yıkanır.
- PBS basıp evre kendi sınırları şeffaflık seviyesine göre mikroskop altında 5 embriyoları içeren bir 3 cm hücre kültürü çanak embriyolar aktarın. 200 uL pipet kullanarak aşamalı embriyolar pipetle.
- Sonra, bir cam lamel seçilen iki embriyo yerleştirin ve ince bükülmüş kağıt mendil ile aşırı PBS kaldırmak. yukarı embriyolar dorsal yüzü yönlendirmekince bükülmüş kağıt mendil kullanarak lamel. Bundan sonra, ince bir iğne ve bükülmüş kağıt mendil kullanarak silikon gres ile cam lamel embriyolar takın.
- slayt altındaki biraz boşluk bırakarak, embriyolar üzerinde halokarbon yağı 700 küçük bir damla ekleyin ve baş aşağı girintili slaytta embriyoları içeren lamel yerleştirin.
- Konfokal görüntüleme sistemi, bir Argon / 488 lazer ve bir yağ daldırma objektif (63X) ile embriyolar inceleyin.
NOT: Uygun gelişim aşamasında embriyo belirlenmesi gastrulasyon olayın görüntülerini yakalamak için önemlidir. Bu koşullar altında, neredeyse tüm embriyolar analiz embriyo bir yetişkin olarak geliştirmek için daha fazla kültür edilebilir en az bir aşama 14 kadar normal gelişim gözlemleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada, Drosophila embriyo gastrulasyon olaylarını ve embriyo hazırlama prosedürünün genel bir bakış (Şekil 1) göstermektedir. Hücre zarları DE-kaderin :: GFP ve hücre hareketlerinin canlı görüntüleme Drosophila gastrulasyon sırasında yapılır (Şekil 2) kullanılarak etiketlenir. DE-kaderin GFP sinekler bize hücre yapışma kavşakları görselleştirmek için izin beri, biz apikal hücre şekli ve bu sistemi kullanarak hareketlerini takip edebiliyoruz. Daha da önemlisi, bu sistem aynı zamanda bize endojen DE-kaderin ekspresyonu izlemek için izin verir.
Şekil 1: Embriyo Hazırlama Prosedürü Genel Bakış. A) yumurtlama için sinekler ayarlayın. B) embriyolar toplayın ve bir embriyo süzgeç koyun. Yıkamanın ardından C)PBS ile embriyolar ing, bunları hemen dechorionate. D) PBS kullanarak bir 3 cm hücre kültürü çanak embriyolar transfer. E) Pipet doğru gelişim aşamasında olan ve bir lamel üzerine koyun embriyolar. F) Vakum gres kullanılarak lamel embriyolar takın. G) Sonraki lamel üzerine halokarbon petrol bir damla ekleyin. H) Son ters girintili slayt lamel yerleştirin. Embriyolar zaman atlamalı görüntüleme için artık hazır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: Gastrulasyon sırasında DE-cad :: GFP tabanlı Canlı Görüntüleme kullanan Deneysel Prosedür sonucu. Hücre zarları DE-kaderin kullanılarak etiketli ::GFP ve hücre hareketi canlı görüntüleme sonra Drosophila gastrulasyon sırasında yaklaşık 500 saniye boyunca yakalandı. Apikal hücre çevreleri zaman atlamalı görüntüleri alınmış bir dizi temsili kullanılarak tek tek hücrelerinin apikal alanları takip etmek için, DE-Cad GFP floresan kullanılarak görselleştirilmiştir; Ölçek çubuğu 20 mikron =. apikal daralma ve invajinasyon meydana nerede ok uçları gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | MKBH 5726 | |
| Vacuum grease Silicone | Beckman | 335148 | |
| Glass coverslip | Matsunami glass | Thickness No1 | 24 - 36 mm |
| Embryo stariner | Corning | Corning3477 | |
| Plastic Drosophilla Stock Bottles | Hitec | MKC-100 | |
| DE-Cadherin knock-in flies | REF (10) |
References
- Haruta, T., Warrior, R., Yonemura, S., Oda, H. The proximal half of the Drosophila E-cadherin extracellular region is dispensable for many cadherin-dependent events but required for ventral furrow formation. Genes Cells. 15 (3), 193-208 (2010).
- Oda, H., Takeichi, M. Evolution: structural and functional diversity of cadherin at the adherens junction. J. Cell Biol. 193 (7), 1137-1146 (2011).
- Fernandez-Sanchez, M. E., Serman, F., Ahmadi, P., Farge, E. Mechanical induction in embryonic development and tumor growth integrative cues through molecular to multicellular interplay and evolutionary perspectives. Methods Cell Biol. 98, 295-321 (2010).
- Alderton, G. K. Metastasis: Epithelial to mesenchymal and back again. Nat. Rev. Cancer. 13 (1), 3 (2013).
- Fabregat, I., Malfettone, A., Soukupova, J. New Insights into the Crossroads between EMT and Stemness in the Context of Cancer. J. Clin. Med. 5 (3), (2016).
- Serrano-Gomez, S. J., Maziveyi, M., Alahari, S. K. Regulation of epithelial-mesenchymal transition through epigenetic and post-translational modifications. Mol. Cancer. 15, (2016).
- Yu, A. Q., Ding, Y., Li, C. L., Yang, Y., Yan, S. R., Li, D. S. TALEN-induced disruption of Nanog expression results in reduced proliferation, invasiveness and migration, increased chemosensitivity and reversal of EMT in HepG2 cells. Oncol. Rep. 35 (3), 1657-1663 (2016).
- Zheng, X., et al. Epithelial-to-mesenchymal transition is dispensable for metastasis but induces chemoresistance in pancreatic cancer. Nature. 527 (7579), 525-530 (2015).
- Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. J. Clin. Invest. 119 (6), 1420-1428 (2009).
- Huang, J., Zhou, W., Dong, W., Watson, A. M., Hong, Y. Directed, efficient, and versatile modifications of the Drosophila genome by genomic engineering. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (20), 8284-8289 (2009).
