Abstract
Icke-termiska atmosfärstryck ( "kalla") plasma har fått ökad uppmärksamhet under de senaste åren på grund av deras betydande biomedicinsk potential. Reaktionerna i kall plasma med den omgivande atmosfären i utbyte ge en mängd av reaktiva ämnen, som kan definiera dess effektivitet. Även effektiv utveckling av kall plasmabehandling kräver kinetiska modeller behöver modell benchmarking empiriska data. Experimentella studier av källan till reaktiva species som detekteras i vattenlösningar som exponerats för plasma är fortfarande sällsynta. Biomedicinsk plasma ofta drivs med han eller Ar matargasen, och ett särskilt intresse ligger i utredningen av de reaktiva species som alstras av plasma med olika gas tillsatser (O 2, N 2, luft, H2O ånga, etc.) Sådana utredningar mycket komplicerad på grund av svårigheter att kontrollera den omgivande atmosfären i kontakt med plasmautflödet. I detta arbete har vi riktat gemensamma frågor av "hög" spänningkHz driven plasma jet experimentella studier. En reaktor utvecklades möjliggör uteslutning av omgivande atmosfär från plasmat-vätskesystemet. Systemet bestod alltså matargasen med tillsatsmedel samt komponenterna i vätskeprovet. Detta kontrollerad atmosfär tillät undersökningen av källan av de reaktiva syrespecies som induceras i vattenlösningar av He-vattenånga plasma. Användningen av isotopiskt märkt vatten tillåts skilja mellan de arter med ursprung i gasfasen och de som bildas i vätskan. Plasma utrustningen som ingår i en Faradays bur för att eliminera eventuell påverkan av någon yttre fältet. Installationen är mångsidig och kan underlätta ytterligare förståelse av kall plasma-vätska interaktioner kemi.
Introduction
Låg temperatur atmosfärstryck plasma (LTPS) har fått ökad uppmärksamhet under de senaste åren på grund av sin stora potential för biomedicinska tillämpningar 1-3. Vid kontakt med omgivande atmosfär, reagerar LTP med molekylärt innehåll av luft (N2, O2, H2O ånga), som genererar en mängd olika reaktiva syre- och kväve arter (rons) 2,4. Bland dessa är relativt stabila arter (såsom väteperoxid, ozon, nitrit och nitrat anjoner) och mycket reaktiva radikaler (• OH, • OOH / O 2 • -, • H, • NO, etc.). Dessa arter, som ursprungligen alstras i gasfas, är vidare levereras av plasmat till det biologiska substratet 5. RONS interagerar med substrat och därmed definierar den antimikrobiella, anticancer och antivirala effekter av LTP 6-8.
Utvecklingen av LTP terapier kräver komplexa modellering av reaktionerna frånRONS 9. Vatten är en viktig del av den biologiska miljön, och reaktionerna i vattenfasen ökar komplexiteten i systemet dramatiskt. Undersökningen av gas-fas plasma är allmänt utförs med hjälp av olika analysmetoder, inklusive optisk emissionsspektroskopi, laserinducerad fluorescens, infraröd spektroskopi, masspektrometri (MS), etc. 10-12. Samtidigt, detaljerade undersökningar av de arter som upptäckts i den flytande fasen är fortfarande sällsynta. Tillgängliga rapporter beskriver användningen av olika analytiska metoder såsom UV-strålning och elektronparamagnetisk resonans (EPR) spektroskopi, cytometry, etc. för detektion av RONS i vattenhaltiga lösningar 13,14. EPR är en av de mest direkta metoderna för radikal detektering i vätskan. Men många radikala arter som inte detekteras av EPR på grund av deras korta livslängd. I dessa fall är spinninfångnings används ofta. Spin trapping en teknik som inbegriper en förening (spin trap) WHich reagerar snabbt och selektivt med den radikala för att ge en mer ihållande radikal addukt (t ex reagerar med hydroxylradikalen DMPO, bildar DMPO-OH-addukt).
De gemensamma utmaningarna i plasma flytande interaktionsstudier är oförmåga att kontrollera den omgivande atmosfären runt plasmautflödet och andra störande faktorer (externa fält, miljökänsliga strömförsörjningsdelar, osv). Här visar vi användning av en uppställning som består av ett metallnät lådupptagande det opererade plasma och en in-hus byggt reaktor runt plasma strålmunstycket. Metallnätet tjänar som Faradays bur, vilket tillåter signifikant förbättrad reproducerbarhet och allmän användbarhet av plasmastråle. Reaktorn glaset inkapslar både plasmastrålen och vätskeprovet, med undantag för den omgivande atmosfären från systemet.
Denna metod kan användas för något atmosfäriskt tryck plasmastråle i kontakt med vätskeformiga lösningar.Till exempel, har vi nyligen presenterat en undersökning av källan av de reaktiva syrespecies som detekteras i ett vattenhaltigt prov exponerades för plasma. Isotopmärkt vatten användes för att skilja mellan de arter som bildas i vätskan och i gasfas av plasmastrålen-vätskelösning systemet 15.
Protocol
1. Skärmplasma Setup
- Placera alla delar av den elektriska miljön inne i buren: strömförsörjning, spänning / strömmätare, strömkabel, plasmaelektroder, plasmastråle, etc.
- Se till att utrymmet inuti buren är tillräcklig så att den levande elektrod, jordelektroden och respektive kablar är inte i kontakt med varandra eller metallnät.
- Utrusta buren med en spärr som är ansluten till plasmaströmförsörjningen för att undvika risken för elektriska stötar från högspänningselektroden under plasmaoperationen.
- Placera reglagen för spänning och frekvens på den yttre ytan på buren för att tillåta byte av parametrarna utan att avbryta plasmaoperationen.
- Ground all metall stöder inuti mask buren och buren själv genom ledningar dem till en jordbindnings plugg.
2. Urladdnings Parametrar
- Placera levande elektroden under jordelektroden on glasröret (dvs närmare rörets munstycke).
- Anslut spänningsprob till plasmaströmförsörjningen för att mäta driftspänningen, och passera jordelektroden genom den cirkulära strömprob för att övervaka returströmmen.
- Ansluta både spänningen och strömmen sonden till ett oscilloskop, övervakning av strömmen, spänningen och plasmaarbetsfrekvensen (bestämd genom antingen den aktuella eller den spänningssond).
- Ställa in flödet av gas genom glasröret till 2 sim med användning av de massflödeskontrollorgan (MFC).
- Antända plasmat i ett glasrör med matargasen helium som passerar genom den genom att vrida på plasmaströmförsörjningen. Med hjälp av avläsningarna från sonderna, ställa in spänning och frekvens av utsläpp till 18 kV och 25 kHz, respektive.
OBS: Parameter variationer genomförs för att bestämma den minimala spänning och frekvens vid vilken urladdningen sker med den högsta molekylinnehållet i alla experimenten. the ökad molekyl innehåll kräver högre spänning för plasma att antändas. Notera att förhöjda spänningar kan resultera i signifikant ökning av plasma gastemperatur, vilket sålunda leder till ökad avdunstning av vätskeprovet. - Hålla spänningen konstant i alla experiment.
3. Presentation Tillsatser till gastillförseln
- Anslut den andra maskinen till huvudmatargasen rör med hjälp av en T-kontakt.
- För att lägga till vattenångan till matargasen, rikta en MFC-reglerat flöde av helium genom en Drechsel kolv fylld med vatten och placeras utanför (ovanpå eller på sidan) av nätet buren.
- Erhålla en önskad nivå av mättnad genom att dela upp flödet av matargasen. Direkt 10% av gasflödet (200 sccm) genom Drechsel kolv med vatten (H 2 16 O) för att uppnå en 10% mättnad av matningsgasen.
- Använda T-kontakt, kombinera detta helt vattenånga mättad gas med 90% (1800 sccm) avtorrt gasflöde.
4. Reaktor
- Förbereda en glasreaktor som består av två delar, övre och undre. Utrusta den nedre delen av den med en avgasröret.
- Placera glasreaktor vid munstycket hos plasmastrålen.
- Infoga plasmastrålen munstycke in en gummigenomföring inuti öppningen i den övre delen av reaktorn.
- Förbereda behållaren bestående av en väl-liknande reservoar på toppen av ett stativ. Göra både stativet och brunnen av ett dielektriskt material (t.ex., glas, kvartsglas).
- Placera provbehållaren inuti reaktorn, så att den utsätts för plasmautflödet från munstycket av strålen.
- Sätt en flytande H2 17 O prov i provbehållaren. För detektering av hydroxylradikaler, använd en lösning av 5,5-dimetyl-1-pyrroline- N-oxid (DMPO) spin trap (se 5.1).
OBS: Valet av spinnfällan samt valet av vätskeprovet comkomponenter beror på de specifika djurslag. Till exempel, studeras källan till • OH-radikalen med användning av H 2 16 O / H 2 17 O och DMPO spin trap. Källan för • H-radikal kräver användning av en H 2 O / D2O (gas och vätska). N-tert-butyl-α-fenylnitron (PBN) bör användas för detektion av den • H-radikal. När det gäller han plasma med H2O ånga, visade det sig att övervägande fälla väteradikal, medan DMPO bildas mestadels DMPO-OH-addukt 15. - Anslut de två reaktordelar via markglasytor kontakt.
5. Spin fångst av radikaler
- Bereda lösningarna av den valda spin fällan med den erforderliga koncentrationen. För vattenlösningar, använda avjoniserat vatten. För nitron spin fällor (t.ex. DMPO), använd en 100 mM koncentration.
- Pre-spola reaktorn med matargasen (2 sim) under 30 sek.
- ignite plasman (se 2.5) och exponera vätskeprovet till plasmautflödet under en viss tidsperiod (t.ex. 60 sekunder).
- Efter en önskad tid exponering, stänga av plasmaströmförsörjningen och öppna reaktorn. Avlägsna provbehållaren från reaktorn.
- Samla provet och analysera den med hjälp av elektronspinnresonans-spektroskopi (EPR) 15.
Representative Results
Användning av förfarandet och utrustningen som beskrivits ovan, har vi undersökt ursprunget av de reaktiva syrespecies i LTP-systemet i kontakt med vatten. Plasmaarbetsfrekvens och spänning var 25 kHz och 18 kV (topp-till-topp), respektive (Figur 1).
Till exempel, var källan till hydroxylradikalen bestämdes med användning av isotopiskt märkt vatten. Detta gjorde det möjligt att skilja mellan vattenmolekylerna i matargasen från de i vätskeprovet. För det, var H 2 16 O infördes i matargasen (som ånga). Ett vätskeprov av H 2 17 O med det upplösta spin trap DMPO placerades i en provbehållare. Reaktorn förväg spolades i 30 s med den tillförda gasen. Viktigt är i detta fall längre pre-spolning tid kan resultera i betydande mängd H2 16 O levereras till flytande H
Liknande studier kan utföras med hjälp av andra system, såsom en D 2 O / H2O system för att upptäcka källan till • H (• D) radikal 15.
Figur 1. Setup används för undersökning av källan av reaktiva syrespecies. Plasman genererades på en kvartsglasröret (4 mm innerdiameter, 1 mm väggtjocklek) med helium matargasen. Matnings gasflödet var två sim. Gastillförseln innehöll H2O ånga infördes som nämnts ovan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. En EPR-spektrum för blandning av DMPO-H, DMPO- 16 OH och DMPO- 17 OH-radikal addukter induceras i lösning av DMPO i H 2 17 O utsätts för plasma. Analysen genomfördes med hjälp av spektra simuleringsprogram med hjälp av hyperfinnivåerna värden som är tillgängliga i litteraturen 16. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1. Koncentrationen av DMPO- 16 OH och DMPO- 17 OH radikala addukter och mängden H2 16 O i vätske H 2 17 O prov efter plasmaexponeringen. De absoluta mängder av addukter koncentrationer erhölls med användning av EPR kalibrering med den stabila radikalen 2,2,6,6-tetrametylpiperidin 1-oxyl (TEMPO). I fallet med ingen tillsatt vattenånga (posten 1), en kvarvarande fuktighet var närvarande i matargasen. De relativa mängderna av H 2 17 O och H 2 16 O i vätskeprovet bestämdes med användning av en hydrolysreaktion av cinnamoylklorid i utbyte ge en blandning 16 O- och 17 O-kanelsyror vid reaktion med den post-plasmaexponering lösning. Den resulterande blandningen analyserades genom högupplösande masspektrometri såsom beskrivs på annan plats 15.
Discussion
Här visar vi att använda en in-hus byggt atmosfärstryck plasma setup. Den metallnät bur bidrar till att uppnå reproducerbara plasmaförhållanden med minimerad interferens från externa fält, samtidigt skydda närliggande känslig utrustning från eventuella störningar och / eller skada av någon plasma-inducerad fält. Skärmn (placering i bur) i inställnings beror på vilken typ av drift plasma och dess elektriska egenskaper. Syftet är att säkerställa frånvaro av yttre störningar på plasma drift och undvika plasma fält stör kringutrustning. I detta fall maskstorleken är 22 mm, emellertid kan reducerad maskstorlek behövas för olika plasmer. Driftparametrarna plasmakontrollerades med användning av en spänning och en strömsond ansluten till ett oscilloskop. Införandet av högspänningssonden förändras väsentligt den elektriska miljön, och därför måste proben bli en del av det elektriska systemet och bli positioned samma sätt under alla experimenten.
Användningen av glasreaktorn inkapslande provet och plasmastrålen möjliggör uteslutning av omgivande atmosfär av ofta okänd sammansättning från reaktionssystemet. I de presenterade resultaten (se ovan), användes för att bestämma källan för de plasma inducerad reaktiva syrespecies i det vattenhaltiga provet exponeras för plasmat utflödet. Sådan undersökning är möjlig om molekylerna i det flytande vattnet och vattnet i tillförselgasen (ånga) kan differentieras. För att bestämma huruvida de hydroxylradikaler bildades i gasfas eller från de flytande vattenmolekyler, isotopiskt märkt vatten infördes: H 2 17 O som det vätskeformiga mediet, H 2 16 O ånga i matargasen. Om ett hypotetiskt experiment utfördes i en öppen atmosfär, och skilja mellan de två faserna skulle ha hämmats av närvaron av vattenånga i den omgivande luften. Enalternativ metod för att minimera inverkan av den omgivande atmosfären demonstrerades i litteraturen, i vilka diffusion av arter från atmosfären in i plasmautflödet förhindrades med användning av en skyddsgas 17. Skyddsgas (N2 eller O 2) skapar en gas gardin med en känd sammansättning 18. Reaktorn som presenteras i detta manuskript är ett enkelt sätt att ta bort inverkan av de omgivande luftkomponenter (såsom vattenånga), och kan användas med olika plasmastrålar utan införandet av det ytterligare gasflödet. Liknande den • OH-radikal, kan källan till • H-radikal bestämmas genom användning av en D 2 O / H 2 O-systemet. Den billiga D2O kan också införas i matargasen som en ånga såsom beskrivits ovan.
Mättnaden av den gas med H2O ånga bestämdes genom vägning av Drechsel kolv före och efter genombubbling gasflödet through den. Den relativa fuktigheten (dvs., mättnad) av gasen beräknas genom att mängden av det vatten som förångas och volymen av gas som passerat genom.
Notera att i förlängda experiment, kan temperaturen hos vätskan i Drechsel kolv minska på grund av avdunstningen. Den relativa fuktigheten är beräknad för en specifik temperatur. De beräknade värdena är ytterligare jämfört med de i litteraturen 19 för att bestämma den relativa fuktigheten hos den inmatade gasen. Vi har empiriskt upptäckt att ett flöde av upp till 2 sim av He genom en vattenfylld Drechsel kolv fullständigt mättar gasen med vattenånga. Emellertid kan förhöjda flödeshastigheter inte tillåta tillräcklig uppehållstid för gasen i vätskan för full mättnad. Andra mättnadstekniker kan krävas.
En annan utmanande uppgift är att säkerställa att ingen omgivande luft är närvarande i systemet. Reaktorn är i förväg spolades med matargasen för att avlägsna kvarvarande luft.Den tid som krävs för pre-spolning kommer att bero på volymen av reaktorn och flödet av matargasen. Frånvaro av yttre omgivningsluft diffusion och medbringning i systemet, såsom en helium matargas plasmasystem kan testas med användning av en • NO radikal infångningsreaktion. Kväveoxid genererad av plasma från N 2 och O 2 molekyler luft kan detekteras genom EPR som en radikal addukt av (MGD) 2 Fe 2+ komplex 20 (MGD = N-metyl-D-glukamin ditiokarbamat). I fallet med den fullständiga frånvaron av luft, är den EPR-signal av addukten inte observerats. Frånvaro av yttre vattenmolekyler i reaktorn kan demonstreras genom följande experiment. Ett flytande prov av D2O utsätts för en torr matar gasplasma. NMR-analysen av provet efter exponering avslöjar den mängd H2O bringas in i vätskan under exponeringen. Detta gör det möjligt att uppskatta mängden av den kvarvarande H2O i Tubing används för matargasen 15 i experimentet.
Provbehållaren utformning är avgörande för det experimentella arbetet. Initialt, har vi försökt att använda plast- och glas mikrocentrifugrör. Tillsammans med relativt hög plasmamatargasflödet, betyder den lilla diametern hos öppningen inte låta den omgivande luften tränga in i mikrocentrifugrör. Emellertid har denna många nackdelar. Plasman uppvisade valvbildning och stora temperaturökning nära kanterna på den mikrocentrifugrör. Leveransen av de arter från gasfasen in i vätskan var också betydligt mindre effektiv på grund av de olika gasfasprocesser dynamik och den låga ytarean (och stor volym) av vätskeprovet. Sålunda är avgörande för leveransen av de reaktiva species från gasfasen till vätskeprovet ytarean av vätskeprovet. Detta är särskilt viktigt för de kortlivade radikaler. Vätskeprovet behållaren måste därför utformas så att den exponeradevätska att ha hög ytarea för effektiv diffusion. Provet bör också ha lågt djup för att minimera konvektion relaterade begränsningar av vätskeprovet. Det måste tas hänsyn till att förhöjda gasflöden och särskilt med antänt plasma skapa allvarliga störningar på ytan av vätskeprovet 21. Därför har provbehållaren en väl-liknande form med diameter och djup som krävs för det specifika experimentet. Höjden på stativet där den väl är positionerad kan justeras till experimentella behov. Gummigenomföringen genom vilket plasmastrålen införes i reaktorn gör det möjligt att ändra kontaktvinkeln av utflödet med vätskan.
Denna metod medger undersökning av källan av de reaktiva species (• OH, • H, etc.) som induceras i vätskan av en kHz-frekvensen parallellt fältplasmastråle. Det förfarande som använder en glasreaktor som omger strålen är inte begränsad till den described betingelser, och kan användas med andra atmosfäriska tryck plasmor. Metoden möjliggör införandet av eventuella tillsatser till matargasen: ånga, O2, N2, etc. Bland dess andra fördelar är möjligheten att genomföra optiska mätningar inuti den, men i detta fall optisk kvalitet kvartsglas ska användas som en reaktor material. Avgasröret i den nedre delen av reaktorn möjliggör användning av plasmastrålen i praktiskt taget alla lab: avgas kan anslutas via plastslang till en avlägsen utsugningshuv. Reaktorkoncept är mångsidig och kan användas i forskning av olika plasmer som kräver kontrollerad atmosfär. Till exempel är polymerisation av styren inhiberas av de syrespecies 22, men kan observeras i reaktorn när vätska styren exponeras för gasplasma helium foder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasma Resonant and Dielectric Barrier Corona Driver power supply | Information Unlimited | PVM500 | |
| Mass flow controller (MFC) | Brooks Instruments | 2 slm (He calib.) | |
| MFC | Brooks Instruments | 5 slm (He calib.) | |
| Microcomputer controller for MFCs | Brooks Instruments | 0254 | |
| H217O | Icon Isotopes | IO 6245 | |
| 5,5-dimethyl-1-pyrroline N-oxide | Dojindo Molecular Technologies, Inc. | D048-10 | ≥99% |
| 2,2,6,6-tetramethylpiperidine 1-oxyl | Sigma-Aldrich | 214000 | 98% |
| Helium | BOC UK | 110745-V | 99.996% |
| High voltage probe | Tektronix | P6015A | |
| Current probe | Ion Physics Corporation | CM-100-L | |
| Oscilloscope | Teledyne LeCroy | WaveJet 354A |
References
- Boxhammer, V., et al. Bactericidal action of cold atmospheric plasma in solution. New J. Phys. 14, 113042 (2012).
- Graves, D. B. The emerging role of reactive oxygen and nitrogen species in redox biology and some implications for plasma applications to medicine and biology. J. Phys. D: Appl. Phys. 45, 263001 (2012).
- von Woedtke, T., Reuter, S., Masur, K., Weltmann, K. -D. Plasmas for medicine. Phys. Rep. 530, 291-320 (2013).
- Machala, Z., et al. Formation of ROS and RNS in Water Electro-Sprayed through Transient Spark Discharge in Air and their Bactericidal Effects. Plasma Proc. Polym. 10, 649-659 (2013).
- Lu, X., et al. Reactive species in non-equilibrium atmospheric-pressure plasmas: Generation, transport, and biological effects. Phys. Rep. 630, 1-84 (2016).
- Takamatsu, T., et al. Microbial Inactivation in the Liquid Phase Induced by Multigas Plasma Jet. PLoS One. 10, 0132381 (2015).
- Ahlfeld, B., et al. Inactivation of a Foodborne Norovirus Outbreak Strain with Nonthermal Atmospheric Pressure Plasma. mBio. 6, 02300 (2015).
- Hirst, A., et al. Low-temperature plasma treatment induces DNA damage leading to necrotic cell death in primary prostate epithelial cells. Brit. J. Cancer. 112, 1536-1545 (2015).
- Norberg, S. A., Tian, W., Johnsen, E., Kushner, M. J. Atmospheric pressure plasma jets interacting with liquid covered tissue: touching and not-touching the liquid. J. Phys. D: Appl. Phys. 47, 475203 (2014).
- Greb, A., Niemi, K., O'Connell, D., Gans, T. Energy resolved actinometry for simultaneous measurement of atomic oxygen densities and local mean electron energies in radio-frequency driven plasmas. Appl. Phys. Lett. 23, 234105 (2014).
- Wagenaars, E., Gans, T., O'Connell, D., Niemi, K. Two-photon absorption laser-induced fluorescence measurements of atomic nitrogen in a radio-frequency atmospheric-pressure plasma jet. Plasma Sources Sci. Technol. 21, 042002 (2012).
- Abd-Allah, Z., et al. Mass spectrometric observations of the ionic species in a double dielectric barrier discharge operating in nitrogen. J. Phys. D: Appl. Phys. 48, 085202 (2015).
- Takamatsu, T., et al. Investigation of reactive species using various gas plasmas. RSC Adv. 4, 39901-39905 (2014).
- Uchiyama, H., et al. EPR-Spin Trapping and Flow Cytometric Studies of Free Radicals Generated Using Cold Atmospheric Argon Plasma and X-Ray Irradiation in Aqueous Solutions and Intracellular Milieu. PloS One. 10, e0136956 (2015).
- Gorbanev, Y., O'Connell, D., Chechik, V. Non-thermal plasma in contact with water: The origin of species. Chem. Eur. J. 22, 3496-3505 (2016).
- Spin Trap Database, National Institute of Environmental Health Sciences. , Available from: http://tools.niehs.nih.gov/stdb/ (2016).
- Schmidt-Bleker, A., Winter, J., Iseni, S., Rueter, S. Reactive species output of a plasma jet with a shielding gas device - Combination of FTIR absorption spectroscopy and gas phase modelling. J. Phys. D: Appl. Phys. 47, 145201 (2014).
- Schmidt-Bleker, A., et al. On the plasma chemistry of a cold atmospheric argon plasma jet with shielding gas device. Plasma Sources Sci. Technol. 25, 015005 (2015).
- CRC Handbook of Chemistry and Physics. Lide, D. R. , CRC Press. Boca Raton, Florida, USA. (1992).
- Tsuchiya, K., et al. Nitric oxide-forming reactions of the water-soluble nitric oxide spin-trapping agent, MGD. Free Radic. Biol. Med. 27, 347-355 (1999).
- Robert, E., et al. Rare gas flow structuration in plasma jet experiments. Plasma Sources Sci. Technol. 23, 012003 (2014).
- Allen, T. L. Oxygen inhibition of the polymerization of styrene. J. Appl. Chem. 4, 289-290 (1954).
