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Immunology and Infection

Zika Virus Infectious Zellkultursystem und die doi: 10.3791/54767 Published: August 23, 2016

Abstract

Zika-Virus (ZIKV) ist eine aufstrebende Erreger, die fetale Entwicklungsstörungen wie Mikrozephalie verbunden ist, Augenfehler und Wachstumsstörungen. ZIKV ist ein RNA - Virus der Familie Flaviviridae. ZIKV wird hauptsächlich durch Stechmücken übertragen, kann aber auch als auch sexuellen Kontakt durch mütterliche fetalen vertikale Übertragung verteilt werden. Bis heute gibt es keine zuverlässige Behandlung oder Impfung Optionen zur Verfügung, die mit dem Virus infiziert zu schützen. Die Entwicklung einer reproduzierbaren, effektive Zika Virus infektiös Zellkultursystem ist von entscheidender Bedeutung für die molekularen Mechanismen der ZIKV Replikation sowie Drogen-und Impfstoff-Entwicklung zu studieren. In dieser Hinsicht ist ein Protokoll einer Säugerzelle basierenden in vitro Zika Viruskultursystem für die virale Produktion und Wachstumsanalyse beschreibt , wird hier berichtet. Einzelheiten zur Bildung von Plaques durch Zika Virus auf einer Zellmonoschicht und Plaque-Assay für Virustiter Messung dargestellt. Viralen Genomreplikation kineticsund doppelsträngigen RNA-Genom replicatory Zwischenprodukte werden bestimmt. Diese Kultur Plattform zum Screenen gegen eine Bibliothek von einer kleinen Gruppe von Cytokinen, was zu der Identifizierung von Interferon-α (IFN-α), IFN-β und IFN-γ als potente Inhibitoren von Zika virales Wachstum genutzt wurde. Zusammengefasst ein in vitro - Infektions Zika Viruskultursystem und verschiedene virologische Tests sind in dieser Studie gezeigt, die das Potenzial hat, die Forschungsgemeinschaft bei der Aufklärung die Mechanismen der viralen Pathogenese und die Entwicklung der viralen Virulenz stark profitieren. Antivirale IFN-alpha kann weiter als Prophylaktikum, Post-Expositions-Prophylaxe zu bewerten und Behandlungsoption für Zika Virusinfektionen in Hochrisikogruppen, einschließlich der infizierten schwangeren Frauen.

Introduction

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Zika - Virus (ZIKV) ist eine wichtige menschliche Krankheitserreger im Zusammenhang mit Mikrozephalie und schlechte Schwangerschaft 1,4 Ergebnisse. ZIKV gehört zur Gruppe von medizinisch relevanten Flaviviren, die neurologische Defekte wie das Dengue-Fieber, West-Nil, und St. Louis-Enzephalitis-Viren verursachen können. Der Hauptmodus der viralen Übertragung durch den Moskito - Vektor Aedes aegypti, und zusätzlich hat die sexuelle Übertragung auch 5,6 berichtet. ZIKV hat ein großes globales Gesundheitsproblem geworden aufgrund der wachsenden geographischen Verteilung des Moskito-Vektor und seine starke Korrelation mit Geburtsfehler. ZIKV wurde isoliert zuerst 7,8 im Jahr 1947 von einem Sentinel - Rhesusaffen im Zika Wald, Uganda und der erste Mensch Fall wurde im Jahr 1952 berichtet. Personen, die mit ZIKV mit milden Symptomen vorhanden infiziert werden, wie Fieber, Hautausschlag, Kopfschmerzen, Konjunktivitis und Muskel / Gelenkschmerzen. Infizierte schwangere Frauen können ZIKV auf den sich entwickelnden Fötus 1 übertragen. ZIKV - Infektion hat sich auch Guillain-Barre - Syndrom in Verbindung gebracht worden, einer peripheren Nerven Auto-Immun - Erkrankung Demyelinisierung 9.

Die Zika virale Genom besteht aus einer positiven Sinn, einsträngige RNA-Molekül, das etwa 10,8 Kilobasen lang ist. Die Struktur des Genoms ist als 5'NCR-C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-2K-NS5-3'NCR organisiert, wobei nicht-kodierenden Regionen (NCR) flankieren eine Protein-codierende Region 6. Ein einzelnes Polyprotein (3419 aa) übersetzt wird, dass ist Co- und post-translational in 10 kleinere Peptide gespalten. Sowohl die 5'NCR und 3'NCR RNA-Stem-Loop-Strukturen spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufnahme des viralen Genoms Übersetzung und Replikation. Die strukturellen Komponenten des Genoms der Capsid, Membran besteht und Hüllproteine. Die nicht-strukturellen Proteine ​​sind entscheidend für die Genom-Replikation.

Derzeit sind Zika Virusstämme gruppiert in drei Haupt Genotypen: West African, Ost - Afrika, Asien und 6,10-13. Es hat sich gezeigt , dass die East African Abstammung verbreiten nach Westafrika und Asien vorgeschlagen, wo es später weitere 12 entwickelt. Der asiatische Genotyp ist verantwortlich für die aktuellen Ausbrüche in Nord- und Südamerika. Zika Virus kann sowohl kultiviert werden in Mücke und Säugerzellen. Primäre Hautfibroblasten, unreife dendritische Zellen, kortikalen neuronalen Vorläuferzellen und Vero - Zellen sind empfänglich für eine virale Infektion Zika 10,14,15. Sowohl Typ I und Typ II - Interferonen wurden ZIKV Wachstum in Fibroblasten der Haut 15 gezeigt zu beschränken. Die Ziele dieser Studie sind eine stufenweise, detailliertes Protokoll für die Herstellung und das Testen des asiatischen Genotyp ZIKA Virusstamm PRVABC59 in einer Säugerzellkultursystem zur Verfügung zu stellen und den Nutzen dieser infektiösen Kultursystems als Medikamenten-Entwicklungsplattform zu demonstrieren. Diese Ressource hat das Potenzial, zu stark die Zika virale und neurologische Forschung profitieren weiter i erläuternts Mechanismen der viralen Pathogenese und Entwicklung von viralen Virulenz.

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Protocol

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Hinweis: Eine schematische Darstellung der Arbeitsablauf ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Zellen

  1. Verwenden Sie Vero-Zellen für Zika Virusproduktion und Analyse von viralen Replikationszyklus.
  2. Bereiten vollständige Wachstumsmedium enthaltend 10% fötales Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin, Penicillin (100 Einheiten / ml), Streptomycin (100 Einheiten / ml) und 10 mM HEPES.
  3. Kultur Vero - Zellen mit dem angegebenen vollständige Wachstumsmedium bei 37 ° C mit 5% CO 2.

2. Zika Virusproduktion

  1. Ernten Sie die Vero-Zellen bei 80% Zelldichte unter Verwendung von 0,25% Trypsin in T-75-Kolben und die Zellen zu zählen.
    1. Aspirieren das Medium aus dem T-75 Kulturflasche und spülen Sie die Zellen mit 2 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
    2. 2 ml 0,25% Trypsin und Inkubation Der Kolben wird bei 37 ° C für 5 min.
    3. 8 ml des Serums Wachstumsmedium, das Trypsin zu inaktivieren. Pipettieren nach oben und unten zu suspend Zellen und übertragen Sie die Zellen in ein 15-ml-Tube.
    4. Entfernen Sie 10 ul Zellen und mischen mit der gleichen Menge von 0,4% Trypanblau. Laden der vorbereiteten Mischung in die Zelle Zählkammer Dia- und erhalten Lebendzellanzahl eines automatisierten Zellzähler verwendet wird.
  2. Seed insgesamt 7 Millionen Zellen in einem 30 ml Volumen in einem T-160-Kolben.
  3. Am nächsten Tag vorzubereiten eine geeignete Multiplizität der Infektion (0,01 bis 0,1 MOI) von Zika Virus Inoculum in einem 10 ml serumfreies Kulturmedium pro Flasche.
  4. Entfernen Sie die verbrauchte Medien aus dem T-160-Kolben und fügen Sie dann den frisch viralen Inokulum hergestellt (10 ml).
  5. Inkubieren der inokulierten Kolben in 37 ° C mit 5% CO 2 für 4-6 Std. Verbreiten Sie das Inokulum durch sanft die Kolben seitlich in jeder Stunde zu kippen.
  6. Bei Beendigung der Inkubation ersetzt das Inokulum mit warmem Serum-ergänztem Wachstumsmedien (30 ml) für jeden Kolben. Dann weiter die Viruskultur für den nächsten 96 Stunden.
  7. Stellen Sie sicher, das Fortschreiten der infection durch das Auftreten von viralen Plaques auf der Zellschicht Beobachtung eines Phasenkontrastmikroskop und nehmen Bilder (Abbildung 2) als bei 40 - facher und 200 - facher Vergrößerung erforderlich.

Figur 2
Abbildung 2:. Plaketten von Zika Virus auf einer Monoschicht von Vero - Zellen gebildet Hellfeldbilder von verschiedenen Vergrößerungen zeigen Zika viralen Plaques bei 48 hpi. Beachten Sie die Anwesenheit von gerundeten Zellfoci auf der Monoschicht. (Maßstabsbalken = 50 & mgr; m) Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

  1. Erntezellkulturüberständen an der 96 Stunden Zeitpunkt und zentrifugieren der Überstand bei 300 xg für 10 min bei 4 ° C die Zelltrümmer zu entfernen.
  2. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand ohne störende pelle Schutt und Transfer to 15-ml-Röhrchen. Ultrazentrifugation bei 24.000 xg durchgeführt werden, um die Viruspartikel (optional) zu konzentrieren.
  3. Lagern Sie die viralen Kulturüberständen in mehreren Aliquots bei -80 ° C.

3. Mess Titer Zika Virus durch Plaque-Assay

  1. Seed naive Vero - Zellen bei 1 × 10 5 Zellen pro Vertiefung in 2 ml Volumen einer 12-Well - Platte verwendet wird .
  2. Am nächsten Tag vorbereiten serielle Verdünnungen von Virus-Kulturüberständen 10-fach von den T-160-Kolben gesammelt Serum-freien Medien. Entfernen Sie die verbrauchten Medien aus jeder Vertiefung und fügen 400 ul vorbereitet Inokulum auf Vero-Zellen in dreifacher Ausfertigung.
  3. Inkubieren der inokulierten Kolben in 37 ° C mit 5% CO 2 für 4-6 Std. Verbreiten Sie das Inokulum durch sanft die Platte seitlich an jedem eine Stunde zu kippen.
  4. Am Ende der Inkubation, ersetzen Sie das Inokulum mit Serum ergänzten Medium (2 ml pro Vertiefung).
  5. Bei 48 Stunden nach der Impfung, zählen die Virusherde eine Phase contr mitast Mikroskop. Berechne die Virustiter als Plaque bildende Einheiten (PFU) pro ml. Siehe Abbildung 3 für Plaque - Test.
  6. Fix und färben die Zellen in 4% Formaldehyd und 0,1% Kristallviolett-Lösung in 20% Ethanol für eine klare Darstellung von Plaques.

4. Zika virale Genom-Replikation Assay

  1. Seed naiver Vero - Zellen bei 1 × 10 5 Zellen pro Vertiefung in 2 ml Volumina einer 12-Well - Platte verwendet wird . Am nächsten Tag vorbereiten virale Inokula (MOI von 0,01 und 0,1; 400 & mgr; l / Vertiefung) mit niedrigem und hohem Titer Serum freie Medien in dreifacher Ausfertigung mit. Für Mock-Infektion verwenden Serum freie Medien (400 & mgr; l / Vertiefung) nur.
  2. Wiederholen Sie die Schritte 3.2 bis 3.4.
  3. Bei den 48 und 96 h Zeitpunkte, sammeln die Proben für die RNA und Immunzytochemie (ICC).
    1. Für die Ernte RNA-Proben, die Medien zu entfernen und dann 400 ul Lyselösung hinzufügen direkt in jede Vertiefung und sammeln die Lysaten.
    2. Für ICC, entfernen Sie die Medien und tHenne fixieren die Zellen durch Zugabe von 1 ml Methanol in jede Vertiefung und die Platte für 30 Minuten bei 4 ° C inkubiert.
    3. Aus dem Zelllysat, isolieren die Gesamt-RNA eine RNA-Extraktions-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet wird. Quantifizieren der RNA mit einem Spektralphotometer.
  4. Durchführen eines Zweischritt reverse Transkription quantitative PCR (RT-qPCR) das Genom ZIKV Gehalt von geernteten RNA zu bestimmen.
    1. Zur Umkehr der RNA transkribieren, zunächst eine 13 & mgr; l-Reaktionsmischung aufgebaut, bestehend aus 5 ug isolierte RNA, 1 ul dNTPs (10 mM) und 1 ul zufälligen Hexamer (250 ng) in einer 0,2-ml-Röhrchen. Inkubieren der Röhrchen bei 65ºC für 5 min und dann für eine Minute auf Eis stellen. Anschließend fügen 1 ul reverse Transkriptase, 4 & mgr; l Synthesepuffer 5fach Strang, 1 ul 0,1 M Dithiothreitol und 1 & mgr; l RNase-Inhibitor zu dem Reaktionsgemisch. Inkubiere das Rohr für weitere 5 min bei 25 ° C, gefolgt von 60 min bei 50 ° C und inactivaß die Reaktion durch Erhitzen auf 70 ° C für 15 min.
    2. Führen Sie qPCR unter Verwendung von 1 & mgr; l der resultierenden cDNA mit 12,5 ul 2x grünen Farbstoff Supermischung, die DNA-Polymerase und 1 ul 10 mM einzelnen Primer, die spezifisch für Zika Virus [Zika Virus pan-Genotyp-Primer (für: 5'-AARTACACATACCARAACAAAGTGGT-3 ' Rev;: 5'-TCCRCTCCCYCTYTGGTCTTG-3 '), Zika Virus asiatischen Genotyp PRVABC59 Stamm-Primer (5'-AAGTACACATACCAAAACAAAGTGGT-3'; Rev: 5'-TCCGCTCCCCCTTTGGTCTTG-3 ')], oder Hepatitis-C-Virus (JFH RTQ F: 5 'CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3'), oder zelluläre Housekeeping-Gen GAPDH (für: 5'-CCACCTTTGACGCTGGG-3 '; Rev: 5'-CATACCAGGAAATGAGCTTGACA-3') in einem 25 ul Reaktionsvolumen.
    3. Führen PCR unter Verwendung der Ausführungsbedingung 95 ° C für 15 sec und 60 ° C für 30 Sekunden (40 Zyklen) in einem Echtzeit-PCR-System.
    4. Verwenden Sie GAPDH Expressionsniveau basierend auf cycle threshold (Ct) Wert der Z zu normalisierenika viralen Genoms Messung. Berechnen Sie die Delta - Ct (ACt) -Wert von Zika Genoms im Vergleich zu derjenigen von GAPDH und erhalten die 2 ACt Wert. Dann berechnen die Falte Änderung, indem das Verhältnis der normalisierten Zika Genom Inhalte zwischen infizierten und nicht infizierten Zellen zu den angegebenen Zeitpunkten nehmen. Siehe Abbildung 4 für ZIKV Genomreplikation Ergebnisse.
  5. Führen ICC das Methanol fixierten Zellen.
    1. Waschen der fixierten Zellen dreimal mit 1x PBS und Blockieren mit ICC Blockierungspuffer (3% Ziegenserum, 3% BSA, 0,1% Triton-X 100 in PBS).
    2. Mit der Maus monoklonaler anti-dsRNA Antikörper J2 (1 ug / ml) in einer Verdünnung von 1: 100 in Blocking-Puffer und über Nacht bei 4 ° C inkubieren.
    3. Waschen der Zellen mit 1x PBS und fügen sekundären Antikörper Ziege-anti-Maus-IgG-594 (1 ug / ml) in einer 1: 1000 Verdünnung in Blockierungspuffer und Inkubation für eine Stunde bei Raumtemperatur.
    4. Wash-Zellen mit 1x PBS und Färbung für Kerne mit Hoechst-Farbstoff undbeachten Sie die Zellen , die ein Fluoreszenzmikroskop bei 100 - facher Vergrßerung (Abbildung 4) verwendet wird .

5. Screening Zytokin-Bibliothek gegen eine Infektion Zika Virus

  1. Seed naive Vero - Zellen bei 1 × 10 5 Zellen pro Vertiefung einer 12-Well - Platte verwendet wird . Sobald die Zellen gebunden sind (6 Stunden nach der Aussaat), für jede Zytokin in den angegebenen Konzentrationen in biologischen Duplikaten (2 ml Volumen / Well). Enthalten Fahrzeug (PBS) allein Kontrolle.
  2. Bei 12 Stunden nach der Behandlung, führen Zika Virusinfektion (MOI von 0,1 in 400 & mgr; l pro Vertiefung). Fügen Negativkontrollen ohne Infektion (mock).
  3. Bei 4 Stunden nach der Infektion, ersetzen Sie die viralen Inokulum mit Medien Zytokin behandelt (2 ml). Inkubieren der Zellen bei 37 ° C für weitere 44 Std.
  4. Bei 48 Stunden nach der Infektion zählen virale Plaques ein Phasenkontrastmikroskop und erwerben repräsentative Bilder von infizierten Zellen bei 40 - facher Vergrößerung (Abbildung 5).

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Representative Results

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Ein Zika - Virusstamm (PRVABC59; GenBank - Zugangsnummer KU501215) des asiatischen Genotyp wurde in dieser Studie 12 genutzt. Vero - Zellen bei 80% Konfluenz wurden zur Untersuchung der de novo Zika Virusinfektion verwendet. Für die virale Produktion und anschließende virologischen Charakterisierung, eine frühe Passage (P3) Zika Virus wurde verwendet. Die viralen Plaques wurden am zweiten Tag der Infektion beobachtet. Zika viralen Nachkommen von der anfänglich infizierten Zelle freigesetzt wird, kann auf benachbarte Zellen ausbreiten, die in der Bildung von sichtbaren Plaques auf der Monoschichtkultur führen (Abbildung 2). Die cytopathische Wirkung (CPE) von Zika viralen Infektion wird durch morphologische Veränderungen wie Abrundung und Ablösung der Zellen sowie lytischen Zelltod charakterisiert.

Zur Messung der viralen Titer, virushaltige zellfreien Überstand von T-160-Kolben geerntet wurde auf 10-fol unterworfend serielle Verdünnung und in einer 12-Well - Platte - Format (Figur 3) auf die Monoschicht von Vero - Zellen gegeben. Die 48 Stunden nach der Inokulation Zeitpunkt wurde als Endpunkt verwendet, um die Plaques zu vermeiden Zählen von Sekundärinfektion entstehen. Die Wells mit 30-100 Plaques wurden zum Zählen gewählt, um eine genaue Titer zu erhalten.

RT-qPCR-Assay wurde die Genomreplikation von Zika Virus zu schätzen, verwendet. Ein pan-Genotyp Primerpaar spezifisch für die hochkonservierten ZIKV NS5 - Region wurde 3,16 enthalten. Zika Virusstamm PRVABC59-spezifische Primer basierend auf der genomischen Lage von pan-genotypische Primer wurden ebenfalls getestet (Sequenzen der Primer sind in dem Protokoll Abschnitt 4.4.2 angegeben). Beide der Primerpaare zeigten ähnliche Empfindlichkeitsstufen in Amplifizieren Zika viralen Genoms aus infizierten Zellen (Figur 4). Als negative Kontrolle, Hepatitis - C - Virus-spezifischen Primer wurden auch 17 getestet. Ein wesentlicher incrLeichtigkeit im ZIKV viralen Genom - Gehalt wurde zwischen 48 und 96 Stunden Zeitpunkten sowohl in der niedrigen und hohen MOI infizierten Zellen, was auf eine robuste virale Infektion (Abbildung 4) beobachtet. Während Flavivirus Genomreplikation, doppelsträngige (ds) RNA replicatory Zwischenprodukte werden durch die Bildung von Basenpaarung zwischen den Sense- und Antisense-genomischen RNA erzeugt. Eine Antikörpersonde speziell zur Erkennung dsRNA detektiert viral infizierte Zellen (Abbildung 4). Viral dsRNA wurden in das Zytoplasma lokalisiert die Genomreplikation Abteile hindeutet. Immunhistochemie-Färbung ergab Expansion von virusinfizierten Zellen in den 48 und 96 h Zeitpunkte.

Mit dem infektiösen Kultursystem Zika Virus wurde eine kleine Bibliothek von Zytokinen gescreent antivirale Aktivität zu bestimmen (Abbildung 5). Die Zellen wurden für 12 h mit verschiedenen Zytokinen vorbehandelt und dann mit Zika Virus infiziert. Typ I i nterferon, IFN-α, zeigten starke antivirale Aktivität gegen Zika Virus in einem breiten Bereich von Dosen getestet [10 internationalen Einheiten (IU), 100 IU und 1000 IU]. IFN-β zeigte eine starke als auch hemmende Wirkung. Typ II IFN-γ auch anti-virale Aktivität Zika demonstriert. Zytokine TNF-α, IL-1 und IL-6 nicht ZIKV in den angegebenen Wirkstoffkonzentrationen hemmte.

Abbildung 1
Abb . 1: Allgemeine Übersicht über Zika Virusproduktion und Test - Workflow für die Virusproduktion wird ZIKV auf Vero - Zellen in T-160 - Gewebekulturkolben geimpft. Bei 48 oder 96 hpi, die zellfreie Virusüberstand wird bei -80 ° C für die nachfolgende Analyse geerntet und gelagert. Virustiter wird durch eine Grenzverdünnungsassay gemessen. Das Inokulum Zika Virus wird anschließend zur Untersuchung der Virusreplikation Kinetik verwendet und Arzneimittelverbindungen Screening.href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54767/54767fig1large.jpg" target = "_ blank"> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3:. Plaque - Assay für Zika Virusproduktion Messung Naive Vero - Zellen wurden zur Messung der Virustiter verwendet. Hellfeldbilder zeigen die Dichte von viralen Plaques in verschiedenen Verdünnungen (Maßstabsbalken = 50 & mgr; m). Hinweis: Die 1:. 100 Verdünnung Bild zeigt deutliche Plaques , die genau gezählt werden können , bitte hier klicken um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4: Assays für Zika Virusreplikation zu bewerten. (A) Graph zeigt Inhalt von RT-qPCR gemessen genomischen Zika - Virus. Sowohl pan-Genotyp (ZIKV GEN) und PRVABC59-Stamm (ZIKV UNI) Primer zeigte gleich Sensitivität und Spezifität. Wie erwartet, virale Hepatitis C (HCV) Primer amplifizieren keine Produkte. (B) Graph stellt die Zika viral Wachstumskinetik bei den angegebenen Zeitpunkten in niedrigen und hohen Titer infizierten Zellen im Vergleich zu derjenigen der nicht - infizierten mock Kontrolle. Die Mittelwerte und Standardabweichungen angegeben. (C) Immunocytochemistry Assay für die virale Replikation zu untersuchen. Zika-Virus infizierten Zellen wurden mit dsRNA Antikörper, der spezifisch gefärbt. Bei 48 hpi sind infizierten Zellen in wenigen Clustern, während bei 96 hpi die meisten Zellen infiziert sind. Hoechst-Färbung wurde für die Visualisierung von Kernen (Maßstabsbalken = 50 um) verwendet. BF:. Hellfeldbild Bitte klicken Sie hier eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5
Abb . 5: Interferone zeigen potente antivirale Aktivität Zika (A) Diagramm zeigt die Modulation der Zika virales Wachstum von verschiedenen Zytokinen im Vergleich zu der Fahrzeugsteuerung. Die Mittelwerte und Standardabweichung sind in dem Balkendiagramm dargestellt. Interferone zeigten statistisch signifikante Hemmung der Virusreplikation Zika (p-Wert <0,05). (B und C) Phasenkontrastbilder von Zika virus-infizierten Zellen mit oder ohne Cytokin - Behandlung. Virale Plaques durch infizierte Zellen gebildet wird, kann als Foci sichtbar. Beachten Sie, dass Interferon-behandelten Vertiefungen haben keine viralen Plaques. Mock Kontrolle ohne ZIKV Infektion enthalten als negative Kontrolle. (Maßstabsbalken = 50 & mgr; m) Bitte hier klicken , um eine größere zu sehenVersion dieser Figur.

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Discussion

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Hier wird eine rationalisierte Protokoll zur Kultivierung Zika Virus in vitro dargestellt. Kritische Schritte, einschließlich Identifizierung optimale Endpunkte für Viruskultur erweitert, Titer zu messen und zu quantifizieren Genomreplikation bereitgestellt wurden. Zika-Virus ist ein menschlicher Krankheitserreger, so, beim Umgang mit infektiösen Erregern, die Biosicherheit Verfahren sind strikt befolgt werden. Ein Affennierenzelllinie, Vero, wurde für den Nachweis verschiedener virologische Tests verwendet. Zika virale Replikation Kinetik kann in Zellen von verschiedenen Geweben und Spezies unterscheiden. Zusätzliche Zelllinien können verwendet werden , wie zuvor beschrieben 15. Zika Virus hat sich von den Hirngewebe von infizierten Föten 3 isoliert worden und wurde kortikalen 14 neuralen Vorläuferzellen gezeigt zu infizieren. Somit kann die Pathophysiologie der ZIKV Infektion in neuronalen Zellen Auswertung zusätzliche zellspezifische Einsichten. Unterschiede in der neurovirulenten Phänotyp von afrikanischen und asiatischen Genotypen untersucht werdenmit dieser infektiösen Kultursystem. Die Virusproduktion hier beschriebene Verfahren wird auch zur Erzeugung von hohem Titer - Virus gegenüber in vivo pathogen - Studien bei nicht-menschlichen Primaten oder Nagetier Modellsystemen.

Während diese Studie zur Verwendung von Vero-Zellen beschränkt ist, mit hohem Titer produzierende Zelllinien von menschlichen und Mücken Ursprungs getestet werden. Während der viralen Produktion, wenn CPE in nur 10-30% der Zellen am Tag 3 beobachtet wird, können die infizierten Zellen in 1 aufgeteilt werden: 4 Dichte und die Kultivierung für zusätzliche 4-5 Tage fortgesetzt werden. Am Ende des 7. Tages eine vollständige CPE beobachtet werden.

Die Effizienz der ZIKV pan-Genotyp und Stamm-spezifische Primer wurden verglichen und festgestellt, dass beide empfindlich sind bei der Quantifizierung Zika viralen Genoms in niedrigen und hohen Titer-Virus infizierten Zellen. Weiterhin in dieser Studie eine Antikörper-basierte Sonde verifiziert infizierten Zellen zu identifizieren. Diese dsRNA-spezifischer Antikörper erfolgreich recognized cytoplasmatischen Virusgenome in den Zika virusinfizierten Zellen. Diese optimierten Reagenzien wird eine nützliche Ressource sein, um verschiedene Stadien der Virusreplikation wie Translation, Genomreplikation, Montage und Virionmorphogenese sezieren.

Diese in vitro infektiöse Zellkultursystem ist anwendbar auf zukünftige Studien Zika virusspezifischen subgenomischen Replikons und infektiöses Virus erzeugt aus komplementärer DNA (cDNA) -Klone verwendet. Entwicklung Zika viralen infektiösen cDNA-Klone wird die funktionelle Untersuchung der viralen Gene einschließlich NS1 und NS4B durch Kombinieren von genetischen und molekularbiologischen Techniken beschleunigen. Gründung der Virus Zika mit einem fluoreszierenden oder lumineszente basierten Reportergens markiert würde bei der Herstellung weiter ein wertvolles Instrument sein, verwenden Sie das Zellkultursystem in High-Content-Screening-Assays.

Sowohl Typ I und Typ II IFNs zeigte anti-virale Aktivität Zika. IFN-α, IFN-β und IFN-γ kann weiter ev seinaluated im klinischen Umfeld als Prophylaktikum, Post-Expositions-Prophylaxe und Behandlung gegen Infektionen Zika Virus und die damit verbundenen Krankheiten. Hochrisikogruppen, einschließlich schwangere Frauen positiv für Zika-Virus kann mit Interferonen als erste Linie der Behandlung behandelt werden. Interferon-α - Behandlung wurde für schwangere Frauen 18,19 als sicher erwiesen.

Zusammenfassend, eine Infektionszellkultursystem, die verwendet werden können, verschiedene Aspekte der Zika virales Wachstum zu untersuchen, wird beschrieben und erläutert. Das Protokoll und Reagenzien hier beschrieben sind wichtige Ressourcen für diejenigen, die Zika Virus und die neurologische Forschung studieren.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Sigma Life Science D5796
HEPES Life Technologies 15630080
Glutamax Life Technologies 35050061
2.5% Trypsin, 10x [-] Phenol Red   Corning 25-054-C1
Trypan Blue Stain 0.4% Life Technologies T10282
Countess – Automated Cell Counter ThermoFisher Scientific C10227
Countess-cell counting  chamber slides ThermoFisher Scientific C10283
Rneasy Mini Kit Qiagen 74104
Nanodrop 2000 Thermo Scientific Nanodrop 2000
mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2  English & Scientific Consulting Kft. 10010200
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 Life Technologies A11020
SUPERSCRIPT III RT  Life Technologies 18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX Life Technologies 11744500
QuantStudio12K Flex Real-Time PCR System Thermo Fischer 4471088
RNase-Free DNase Promega M6101
Vero Cell Line  ATCC CCL-81
Zika viral strain PRVABC59 Centers for Disease Control and Prevention (CDC)
IL-6 Peprotech 200-06             
IL-1 alpha        Peprotech 200-01A          
TNF-alpha Peprotech 300-01A          
Interferon alpha A   R & D Systems 11100-1
Interferon beta Peprotech 300-02BC
Interferon gamma Peprotech 300-02
Centrifuge 5415R Eppendorf 5415R
Centrifuge 5810R Eppendorf 5810R
Nikon Eclipse Ti Immunofluorescence Microscope with Nikon Intenselight C-HGFI Nikon Visit Nikon for Request

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References

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Zika Virus Infectious Zellkultursystem und die<em&gt; In Vitro</em&gt; Prophylaktische Wirkung von Interferonen
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Contreras, D., Arumugaswami, V. Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons. J. Vis. Exp. (114), e54767, doi:10.3791/54767 (2016).More

Contreras, D., Arumugaswami, V. Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons. J. Vis. Exp. (114), e54767, doi:10.3791/54767 (2016).

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