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Immunology and Infection

Zika वायरस संक्रामक सेल संस्कृति प्रणाली और Published: August 23, 2016 doi: 10.3791/54767
Automatic Translation
1, 1,2,3
1Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 2Department of Surgery, Cedars-Sinai Medical Center, 3Department of Surgery, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Abstract

Zika वायरस (ZIKV) एक उभरती हुई रोगज़नक़ कि इस तरह के microcephaly, नेत्र दोष, और बिगड़ा विकास के रूप में भ्रूण विकास संबंधी असामान्यताएं से जुड़ा हुआ है। ZIKV Flaviviridae परिवार के एक शाही सेना वायरस है। ZIKV मुख्य रूप से मच्छरों से फैलता है, लेकिन यह भी भ्रूण ऊर्ध्वाधर संचरण के साथ ही यौन संपर्क करने के लिए मातृ से फैल सकता है। तिथि करने के लिए, वहाँ वायरस से संक्रमित लोगों की रक्षा करने के लिए उपलब्ध कोई विश्वसनीय उपचार या टीका विकल्प हैं। एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, प्रभावी Zika वायरस संक्रामक सेल संस्कृति प्रणाली के विकास ZIKV प्रतिकृति के साथ ही दवा और टीका विकास की आणविक तंत्र के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है। इस संबंध में एक प्रोटोकॉल एक स्तनधारी सेल आधारित इन विट्रो Zika वायरस संस्कृति वायरल उत्पादन और विकास के विश्लेषण के लिए प्रणाली का वर्णन यहां सूचना दी है। एक सेल monolayer और वायरल अनुमापांक को मापने के लिए पट्टिका परख पर Zika वायरस से सजीले टुकड़े के गठन पर विवरण प्रस्तुत कर रहे हैं। वायरल जीनोम प्रतिकृति कैनेटीक्सऔर डबल असहाय आरएनए जीनोम replicatory मध्यवर्ती निर्धारित कर रहे हैं। यह संस्कृति मंच इंटरफेरॉन α (IFN-α) की पहचान करने में जिसके परिणामस्वरूप साइटोकिन्स के एक छोटे से सेट के एक पुस्तकालय के खिलाफ स्क्रीन करने के लिए उपयोग किया गया था, IFN-β और Zika वायरल विकास की प्रबल अवरोधकों के रूप में IFN-γ। सारांश में, इन विट्रो संक्रामक Zika वायरल संस्कृति प्रणाली और विभिन्न विषाणुजनित assays इस अध्ययन है, जो संभावित बहुत आगे वायरल रोगजनन के तंत्र और वायरल डाह के विकास elucidating में अनुसंधान समुदाय के लाभ के लिए है, में प्रदर्शन कर रहे हैं। एंटीवायरल IFN-अल्फा आगे एक रोगनिरोधी, बाद जोखिम रोगनिरोधी, और उपचार के उच्च जोखिम आबादी में Zika वायरस के संक्रमण, संक्रमित गर्भवती महिलाओं सहित के लिए विकल्प के रूप में मूल्यांकन किया जा सकता है।

Introduction

Zika वायरस (ZIKV) एक महत्वपूर्ण मानव microcephaly और गरीब गर्भावस्था के परिणामों 1,4 के साथ जुड़े रोगज़नक़ है। ZIKV चिकित्सकीय प्रासंगिक flaviviruses कि इस तरह के डेंगू, पश्चिम नील नदी, और सेंट लुइस में इन्सेफेलाइटिस वायरस के रूप में मस्तिष्क संबंधी दोष उत्पन्न कर सकते हैं के सेट के अंतर्गत आता है। वायरल संचरण के मुख्य मोड इसके अलावा, यौन संचरण भी 5,6 सूचित किया गया है मच्छर एडीज एजिप्टी वेक्टर के द्वारा होता है, और। ZIKV मच्छर वेक्टर के विस्तार भौगोलिक वितरण और जन्म दोष के साथ अपने मजबूत संबंध के कारण एक प्रमुख वैश्विक स्वास्थ्य मुद्दा बन गया है। ZIKV पहले Zika जंगल में एक प्रहरी रीसस बंदर से 1947 में अलग किया गया था, युगांडा और पहले मानव मामला 1952 में 7.8 की सूचना मिली थी। लोग कहते हैं कि इस तरह के बुखार, व्यग्रता, सिर दर्द, नेत्रश्लेष्मलाशोथ, और मांसपेशियों / जोड़ों के दर्द के रूप में हल्के लक्षण के साथ मौजूद ZIKV से संक्रमित हो जाते हैं। संक्रमित गर्भवती महिलाओं को भ्रूण के विकास के लिए 1 ZIKV हस्तांतरित कर सकते हैं। जेडIKV संक्रमण भी Guillain-Barre सिंड्रोम, एक परिधीय तंत्रिका ऑटो प्रतिरक्षा माइलिन रहित विकार 9 से जोड़ा गया है।

Zika वायरल जीनोम एक सकारात्मक भावना, एकल असहाय आरएनए अणु जो लंबाई में 10.8 बारे में kilobases है के होते हैं। जीनोम की संरचना, गैर-कोडिंग क्षेत्रों (एनसीआर) के साथ 5'NCR-सी पी आर एम-ए-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A -2 k-NS4B-NS5-3'NCR के रूप में आयोजित किया जाता है एक प्रोटीन कोडिंग क्षेत्र flanking 6। एक एकल polyprotein (3,419 हूँ) अनुवाद किया है कि सह और बाद translationally 10 छोटे पेप्टाइड में cleaved है। दोनों 5'NCR और 3'NCR आरएनए स्टेम पाश संरचनाओं वायरल जीनोम अनुवाद और नकल के प्रारंभ में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। जीनोम के संरचनात्मक घटकों कैप्सिड, झिल्ली, और लिफाफा प्रोटीन के शामिल हैं। गैर-संरचनात्मक प्रोटीन जीनोम प्रतिकृति के लिए महत्वपूर्ण हैं।

वर्तमान में, Zika वायरल उपभेदों तीन मुख्य जीनोटाइप में बांटा जाता है: पश्चिम अफ्रीकीपूर्वी अफ्रीकी और एशियाई 6,10-13। यह प्रस्ताव किया गया है कि पूर्वी अफ्रीकी वंश पश्चिम अफ्रीका और एशिया में, जहां बाद में इसे आगे विकसित करने के लिए 12 फैल गया। एशियाई जीनोटाइप अमेरिका में वर्तमान फैलने के लिए जिम्मेदार है। Zika वायरस दोनों मच्छर और स्तनधारी कोशिकाओं में संवर्धित किया जा सकता है। प्राथमिक त्वचीय fibroblasts, अपरिपक्व वृक्ष के समान कोशिकाओं, cortical तंत्रिका पूर्वज कोशिकाओं, और वेरो कोशिकाओं Zika वायरल संक्रमण 10,14,15 के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं। दोनों प्रकार मैं और प्रकार द्वितीय इंटरफेरॉन त्वचा fibroblasts 15 में ZIKV वृद्धि को सीमित करने के लिए दिखाया गया है। इस अध्ययन के उद्देश्यों उत्पादन और एशियाई जीनोटाइप Zika वायरल तनाव PRVABC59 की परख करने की क्रिया एक स्तनधारी सेल संस्कृति प्रणाली में एक कदम वार, विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करने और एक दवा के विकास मंच के रूप में इस संक्रामक संस्कृति प्रणाली की उपयोगिता का प्रदर्शन कर रहे हैं। इस संसाधन के संभावित बहुत Zika वायरल और तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान समुदाय आगे मैं स्पष्ट करने के लिए लाभ के लिए हैवायरल रोगजनन और वायरल डाह के विकास के टीएस तंत्र।

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Protocol

नोट: काम के प्रवाह का एक योजनाबद्ध रूपरेखा चित्र 1 में प्रस्तुत किया है।

1. प्रकोष्ठों

  1. Zika वायरस उत्पादन और वायरल प्रतिकृति चक्र के विश्लेषण के लिए वेरो कोशिकाओं का प्रयोग करें।
  2. पूर्ण विकास 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 2 मिमी एल glutamine, पेनिसिलिन (100 इकाइयों / एमएल), स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त (100 इकाइयों / एमएल) और मीडिया, 10 मिमी HEPES तैयार करें।
  3. 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर निर्दिष्ट पूरा मध्यम विकास के साथ संस्कृति वेरो कोशिकाओं।

2. Zika वायरस उत्पादन

  1. T-75 फ्लास्क में 0.25% trypsin का उपयोग 80% सेल घनत्व में वेरो कोशिकाओं फसल और कोशिकाओं की गिनती।
    1. टी -75 संस्कृति कुप्पी से मीडिया Aspirate और 2 मिलीलीटर फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ कोशिकाओं कुल्ला।
    2. 0.25% trypsin के 2 मिलीलीटर जोड़ें और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर फ्लास्क सेते हैं।
    3. मध्यम विकास युक्त trypsin निष्क्रिय करने के लिए सीरम के 8 मिलीलीटर जोड़ें। Pipet और SUS करने के लिए नीचेPend कोशिकाओं और एक 15 मिलीलीटर ट्यूब कोशिकाओं हस्तांतरण।
    4. कोशिकाओं के 10 μl निकालें और 0.4% trypan नीले रंग के बराबर राशि के साथ मिश्रण। सेल गिनती चैम्बर स्लाइड करने के लिए तैयार मिश्रण लोड और व्यवहार्य सेल प्राप्त एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग गिनती।
  2. एक टी-160 फ्लास्क में एक 30 मिलीलीटर की मात्रा में 7 मिलियन कोशिकाओं की कुल बीज।
  3. अगले दिन, फ्लास्क प्रति एक 10 मिलीलीटर सीरम मुक्त संस्कृति मीडिया में एक उपयुक्त Zika वायरस inoculum के (0.1 MOI के 0.01) संक्रमण की बहुलता तैयार करते हैं।
  4. टी-160 कुप्पी से बिताया मीडिया निकालें और फिर हौसले से तैयार वायरल inoculum (10 एमएल) जोड़ें।
  5. 4-6 घंटे के लिए 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस में टीका बोतल सेते हैं। धीरे हर मानव संसाधन पर बग़ल में बोतल झुकने से inoculum बिखरा हुआ है।
  6. ऊष्मायन के पूरा होने पर, प्रत्येक फ्लास्क के लिए गर्म सीरम पूरक विकास मीडिया (30 एमएल) के साथ inoculum की जगह। फिर अगले 96 घंटे के लिए वायरल संस्कृति जारी है।
  7. में की प्रगति को सत्यापित करेंएक चरण विपरीत माइक्रोस्कोप का उपयोग और छवियों (चित्रा 2) के रूप में 40X और 200X आवर्धन पर जरूरत लेने सेल monolayer पर वायरल सजीले टुकड़े की उपस्थिति को देख कर fection।

चित्र 2
चित्रा 2:। विभिन्न आवर्धन की वेरो कोशिकाओं की एक monolayer पर Zika वायरस द्वारा गठित सजीले उज्ज्वल क्षेत्र छवियों 48 HPI पर Zika वायरल सजीले टुकड़े दिखा। monolayer पर गोल सेल foci की उपस्थिति पर ध्यान दें। (स्केल बार = 50 माइक्रोन) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. 96 घंटा समय बिंदु और सेंट्रीफ्यूज 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर सतह पर तैरनेवाला पर फसल सेल संस्कृति supernatants सेल मलबे को हटाने के लिए।
  2. ध्यान से परेशान pelleted मलबे और स्थानांतरण टी बिना सतह पर तैरनेवाला हटानेओ 15 मिलीलीटर ट्यूब। 24,000 XG पर ultracentrifugation वायरल कणों (वैकल्पिक) ध्यान केंद्रित करने के लिए किया जा सकता है।
  3. -80 डिग्री सेल्सियस पर कई aliquots में वायरल संस्कृति supernatants स्टोर।

3. मापने Zika वायरस पट्टिका परख द्वारा टिटर

  1. 2 मिलीलीटर की मात्रा में अच्छी तरह से प्रति 1 x 10 5 कोशिकाओं पर बीज भोली वेरो कोशिकाओं एक 12 अच्छी तरह से थाली का उपयोग कर।
  2. अगले दिन, तैयार सीरम मुक्त मीडिया का उपयोग टी 160 कुप्पी से एकत्र वायरल संस्कृति supernatants के धारावाहिक dilutions 10 गुना। अच्छी तरह से प्रत्येक से बिताया मीडिया निकालें और तीन प्रतियों में वेरो कोशिकाओं पर तैयार inoculum के 400 μl जोड़ें।
  3. 37 में टीका बोतल सेते 5% सीओ 2 के साथ सी ° 4-6 घंटे के लिए। धीरे हर एक घंटे पर बग़ल में प्लेट झुकने से inoculum बिखरा हुआ है।
  4. ऊष्मायन के अंत में, सीरम पूरक मीडिया के साथ inoculum (प्रति अच्छी तरह से 2 मिलीलीटर) की जगह।
  5. 48 घंटा के बाद टीका में एक चरण contr का उपयोग कर वायरल foci गिनतीएएसटी माइक्रोस्कोप। मिलीलीटर प्रति पट्टिका गठन इकाइयों (pfu) के रूप में वायरल अनुमापांक गणना। पट्टिका परख के लिए चित्रा 3 देखें।
  6. फिक्स और 4% formaldehyde में कोशिकाओं और 0.1% क्रिस्टल बैंगनी समाधान सजीले टुकड़े के स्पष्ट दृश्य के लिए 20% इथेनॉल में तैयार दाग।

4. Zika वायरल जीनोम प्रतिकृति परख

  1. एक 12 अच्छी तरह से थाली का उपयोग कर 2 मिलीलीटर की मात्रा में अच्छी तरह से प्रति 1 x 10 5 कोशिकाओं पर बीज भोले वेरो कोशिकाओं। तीन प्रतियों में सीरम मुक्त मीडिया का उपयोग कम और उच्च अनुमापांक की, अगले दिन, वायरल inocula (400 μl / अच्छी तरह से 0.01 और 0.1 के MOI) तैयार करते हैं। नकली संक्रमण के लिए, केवल सीरम मुक्त मीडिया (400 μl / अच्छी तरह से) का उपयोग करें।
  2. 3.4 करने के लिए कदम 3.2 दोहराएँ।
  3. 48 और 96 घंटा समय बिंदुओं पर, शाही सेना और immunocytochemistry (आईसीसी) के लिए नमूने इकट्ठा।
    1. कटाई शाही सेना के नमूने लिए, मीडिया को हटाने और फिर lysates अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए सीधे सेल समाधान के 400 μl जोड़ें और इकट्ठा।
    2. आईसीसी के लिए, मीडिया और टी को दूरमुर्गी अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए मेथनॉल के 1 मिलीलीटर जोड़कर कोशिकाओं को ठीक करने और 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं।
    3. सेल lysate से, कुल शाही सेना निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक शाही सेना अलगाव किट का उपयोग कर अलग। आरएनए एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग यों।
  4. काटा शाही सेना से ZIKV जीनोम सामग्री का निर्धारण करने के लिए एक दो कदम रिवर्स प्रतिलेखन मात्रात्मक पीसीआर (आरटी-qPCR) का प्रदर्शन।
    1. आरएनए टाइप उलटने के लिए, पहली बार एक 0.2 मिलीलीटर ट्यूब में एक 13 μl प्रतिक्रिया मिश्रण पृथक शाही सेना के 5 माइक्रोग्राम, dNTPs (10 मिमी) के 1 μl, और 1 μl यादृच्छिक hexamer (250 एनजी) के शामिल की स्थापना की। 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब सेते हैं और फिर एक मिनट के लिए बर्फ पर जगह है। बाद में, रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस के 1 μl, 5x कतरा संश्लेषण बफर के 4 μl, 0.1 एम dithiothreitol के 1 μl, और प्रतिक्रिया मिश्रण करने के लिए RNase अवरोध के 1 μl जोड़ें। 50 डिग्री सेल्सियस और inactiv में 25 डिग्री सेल्सियस पर एक अतिरिक्त 5 मिनट के लिए ट्यूब, 60 मिनट के द्वारा पीछा सेते15 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करने से प्रतिक्रिया खा लिया।
    2. qPCR 2x हरे रंग सुपर मिश्रण का 12.5 μl युक्त डीएनए पोलीमरेज़ और 10 मिमी व्यक्ति Zika वायरस [Zika वायरस अखिल जीनोटाइप प्राइमरों (के लिए के लिए विशिष्ट प्राइमरों के 1 μl के साथ जिसके परिणामस्वरूप सीडीएनए के 1 μl का उपयोग कर प्रदर्शन करना: 5'-AARTACACATACCARAACAAAGTGGT -3 ' ; रेव: 5'-TCCRCTCCCYCTYTGGTCTTG-3 '), Zika वायरस एशियाई जीनोटाइप PRVABC59 तनाव प्राइमरों (5'-AAGTACACATACCAAAACAAAGTGGT -3'; रेव: 5'-TCCGCTCCCCCTTTGGTCTTG-3 ')], या हेपेटाइटिस सी वायरस (JFH RTQ एफ: 5 'CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ आर: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3'), या सेलुलर गृह व्यवस्था जीन GAPDH (के लिए: 5'-CCACCTTTGACGCTGGG -3 '; रेव: 5'-CATACCAGGAAATGAGCTTGACA -3') एक 25 μl प्रतिक्रिया मात्रा में।
    3. रन हालत 15 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस और एक वास्तविक समय पीसीआर प्रणाली में 30 सेकंड (40 चक्र) के लिए 60 डिग्री सेल्सियस का उपयोग करते हुए पीसीआर प्रदर्शन करना।
    4. जेड सामान्य करने के लिए (सीटी) मूल्य चक्र दहलीज पर आधारित GAPDH अभिव्यक्ति के स्तर का प्रयोग करेंIka वायरल जीनोम माप। GAPDH की तुलना Zika जीनोम के डेल्टा सीटी (ΔCt) मूल्य की गणना और 2 ΔCt मूल्य प्राप्त करते हैं। फिर, संकेत समय बिंदुओं पर संक्रमित और असंक्रमित कोशिकाओं के बीच सामान्यीकृत Zika जीनोम सामग्री के अनुपात से लेकर गुना परिवर्तन की गणना। ZIKV जीनोम प्रतिकृति परिणामों के लिए चित्रा 4 देखें।
  5. मेथनॉल तय कोशिकाओं का उपयोग कर आईसीसी प्रदर्शन करना।
    1. तय कोशिकाओं (0.1% ट्राइटन x 100 पीबीएस में 3% बकरी सीरम, 3% बीएसए) 1x पीबीएस के साथ तीन बार धोएं और आईसीसी अवरुद्ध बफर के साथ ब्लॉक।
    2. 1 के एक कमजोर पड़ने पर माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी विरोधी dsRNA J2 (1 माइक्रोग्राम / एमएल) का उपयोग करें: 100 अवरुद्ध बफर में और 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं।
    3. 1x पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें और एक 1 पर माध्यमिक एंटीबॉडी बकरी विरोधी माउस आईजीजी 594 (1 माइक्रोग्राम / एमएल) जोड़ें: अवरुद्ध बफर में 1,000 कमजोर पड़ने और कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए सेते हैं।
    4. Hoechst डाई का उपयोग नाभिक के लिए 1x पीबीएस और दाग के साथ कोशिकाओं को धो लें और100X बढ़ाई पर एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप (चित्रा 4) का उपयोग कोशिकाओं निरीक्षण करते हैं।

5. Zika वायरस के संक्रमण के खिलाफ साइटोकाइन लाइब्रेरी स्क्रीनिंग

  1. अच्छी तरह से एक 12 अच्छी तरह से थाली का उपयोग कर प्रति 1 x 10 5 कोशिकाओं पर भोली वेरो कोशिकाओं बीज। एक बार कोशिकाओं से जुड़े होते हैं (6 घंटा के बाद बोने), जैविक डुप्लिकेट में संकेत दिया सांद्रता (2 मिलीलीटर मात्रा / अच्छी तरह से) पर प्रत्येक साइटोकाइन जोड़ें। वाहन (पीबीएस) अकेले नियंत्रण शामिल हैं।
  2. 12 घंटे बाद उपचार में Zika वायरल संक्रमण (अच्छी तरह से प्रति 0.1 400 में μl के MOI) प्रदर्शन करते हैं। संक्रमण (नकली) के बिना नकारात्मक नियंत्रण कुओं को शामिल करें।
  3. 4 घंटा बाद संक्रमण में साइटोकाइन में इलाज मीडिया (2 एमएल) के साथ वायरल inoculum की जगह। अतिरिक्त 44 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं।
  4. 48 घंटा के बाद संक्रमण में एक चरण विपरीत माइक्रोस्कोप का उपयोग वायरल सजीले टुकड़े गिनती और 40x बढ़ाई (चित्रा 5) में संक्रमित कोशिकाओं के प्रतिनिधि छवियों का अधिग्रहण।

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Representative Results

एक Zika वायरल तनाव, एशियाई जीनोटाइप के (PRVABC59 परिग्रहण नंबर KU501215) इस अध्ययन में 12 उपयोग किया गया था। 80% confluency पर वेरो कोशिकाओं नए सिरे से Zika वायरल संक्रमण की जांच के लिए इस्तेमाल किया गया। वायरल उत्पादन और बाद में विषाणुजनित लक्षण वर्णन के लिए, एक जल्दी पारित होने (पी 3) Zika वायरस कार्यरत था। वायरल संक्रमण सजीले टुकड़े के दूसरे दिन मनाया गया। Zika वायरल शुरू में संक्रमित कोशिका से रिहा संततियों पड़ोसी कोशिकाओं है, जो monolayer संस्कृति (चित्रा 2) पर दिखाई सजीले टुकड़े के गठन में परिणाम में फैल सकता है। Zika वायरल संक्रमण के cytopathic प्रभाव (सीपीई) ऐसे गोलाई और कोशिकाओं की टुकड़ी के साथ ही अपघट्य कोशिका मृत्यु के रूप में morphological परिवर्तन की विशेषता है।

वायरल अनुमापांक को मापने के लिए, वायरस युक्त सेल मुक्त सतह पर तैरनेवाला टी-160 बोतल से काटा 10 fol के अधीन थाडी धारावाहिक कमजोर पड़ने और एक 12 अच्छी तरह से थाली प्रारूप में वेरो कोशिकाओं के monolayer पर जोड़ा (चित्रा 3)। 48 घंटा के बाद टीका समय बिंदु माध्यमिक संक्रमण से उत्पन्न होने वाली सजीले टुकड़े गिनती से बचने के लिए एक समापन बिंदु के रूप में इस्तेमाल किया गया था। 30-100 सजीले टुकड़े के साथ कुओं एक सटीक अनुमापांक प्राप्त करने के लिए गिनती के लिए चुने गए हैं।

RT-qPCR परख Zika वायरस के जीनोम प्रतिकृति अनुमान लगाने के लिए उपयोग किया गया था। अखिल जीनोटाइप प्राइमर जोड़ी अत्यधिक संरक्षित ZIKV NS5 क्षेत्र के लिए विशिष्ट 3,16 शामिल किया गया था। Zika वायरल तनाव PRVABC59 विशेष अखिल genotypic प्राइमरों के जीनोमिक स्थान पर आधारित प्राइमरों (प्राइमरों के दृश्यों प्रोटोकॉल खंड 4.4.2 में दिए गए हैं) ने भी परीक्षण किया गया। प्राइमर जोड़े के दोनों संक्रमित कोशिकाओं (चित्रा 4) से Zika वायरल जीनोम amplifying में संवेदनशीलता के समान स्तर से पता चला है। एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, हेपेटाइटिस सी वायरस विशिष्ट प्राइमरों भी 17 परीक्षण किया गया। एक महत्वपूर्ण incrZIKV वायरल जीनोम सामग्री में आसानी दोनों कम और उच्च MOI संक्रमित कोशिकाओं, एक मजबूत वायरल संक्रमण का सुझाव (चित्रा 4) में 48 और 96 घंटा समय बिंदुओं के बीच मनाया गया। Flavivirus जीनोम प्रतिकृति के दौरान, डबल असहाय (डी एस) आरएनए replicatory मध्यवर्ती भावना और विरोधी भावना जीनोमिक शाही सेना के बीच आधार बाँधना के गठन के द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं। पहचानने dsRNA के लिए विशेष रूप से एक एंटीबॉडी जांच वायरल संक्रमित कोशिकाओं (चित्रा 4) का पता चला। वायरल dsRNA कोशिका द्रव्य जीनोम प्रतिकृति डिब्बों सुझाव के लिए स्थानीय कर रहे थे। Immunocytochemistry धुंधला 48 और 96 घंटा समय बिंदुओं के दौरान वायरस से संक्रमित कोशिकाओं के विस्तार का पता चला।

संक्रामक वायरस Zika संस्कृति प्रणाली का उपयोग करते हुए, साइटोकिन्स का एक छोटा सा पुस्तकालय (चित्रा 5) एंटीवायरल गतिविधि का निर्धारण करने के लिए दिखाई गई। कोशिकाओं को 12 घंटे के लिए विभिन्न साइटोकिन्स के साथ पहले से इलाज किया गया और उसके बाद Zika वायरस से संक्रमित। प्रकार मैं मैं nterferon, IFN-α, परीक्षण खुराक [10 अंतरराष्ट्रीय इकाइयों (आइयू), 100 आइयू आइयू और 1000] की एक विस्तृत रेंज में Zika वायरस के खिलाफ मजबूत एंटीवायरल गतिविधि का प्रदर्शन किया। IFN-β के रूप में अच्छी तरह से एक शक्तिशाली निरोधात्मक प्रभाव का प्रदर्शन किया। प्रकार द्वितीय IFN-γ भी विरोधी Zika वायरल गतिविधि का प्रदर्शन किया। साइटोकिन्स TNF-α, आईएल -1 और आईएल -6 संकेत दवा सांद्रता में ZIKV को बाधित नहीं किया।

आकृति 1
चित्रा 1:। Zika वायरस उत्पादन और परख कार्यप्रवाह के सामान्य रूपरेखा वायरस उत्पादन के लिए, ZIKV टी 160 टिशू कल्चर बोतल में वेरो कोशिकाओं पर टीका है। 48 या 96 HPI में, सेल मुक्त वायरस सतह पर तैरनेवाला काटा और नीचे की ओर विश्लेषण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जाता है। वायरस अनुमापांक एक सीमित कमजोर पड़ने परख द्वारा मापा जाता है। Zika वायरस inoculum बाद में वायरस प्रतिकृति कैनेटीक्स का अध्ययन और दवा यौगिकों स्क्रीनिंग के लिए प्रयोग किया जाता है।href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54767/54767fig1large.jpg" लक्ष्य = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। Zika वायरस उत्पादन को मापने के लिए पट्टिका परख भोले वेरो कोशिकाओं वायरस अनुमापांक को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया। उज्ज्वल क्षेत्र छवियों विभिन्न dilutions (स्केल बार = 50 माइक्रोन) पर वायरल सजीले टुकड़े के घनत्व को दर्शाती है। नोट: 1:। 100 कमजोर पड़ने की छवि अलग सजीले टुकड़े सही है कि गिना जा सकता है पता चलता है यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: Zika वायरस प्रतिकृति के मूल्यांकन के लिए assays। (ए) ग्राफ़ Zika वायरस जीनोमिक सामग्री RT-qPCR द्वारा मापा पता चलता है। दोनों अखिल जीनोटाइप (ZIKV जनरल) और PRVABC59 तनाव (ZIKV यूएनआई) प्राइमरों बराबर संवेदनशीलता और विशिष्टता दिखाया। जैसी कि उम्मीद थी, वायरल हेपेटाइटिस सी (एचसीवी) प्राइमरों किसी भी उत्पाद बढ़ाना नहीं था। (बी) ग्राफ़ Zika वायरल विकास संकेत समय बिंदुओं पर कम और उच्च अनुमापांक संक्रमित कोशिकाओं में असंक्रमित नकली नियंत्रण की तुलना कैनेटीक्स प्रस्तुत करता है। मतलब मूल्यों और मानक विचलन दिया जाता है। (सी) वायरल प्रतिकृति की जांच के लिए Immunocytochemistry परख। Zika वायरस संक्रमित कोशिकाओं को विशेष रूप से dsRNA एंटीबॉडी के साथ दाग रहे थे। 48 HPI में संक्रमित कोशिकाओं जबकि 96 HPI पर कोशिकाओं के सबसे संक्रमित होते हैं, कुछ समूहों में हैं। Hoechst दाग नाभिक के दृश्य (स्केल बार = 50 माइक्रोन) के लिए इस्तेमाल किया गया था। बीएफ:। उज्ज्वल क्षेत्र छवि यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5:। इंटरफेरॉन प्रबल विरोधी Zika वायरल गतिविधि का प्रदर्शन (ए) ग्राफ़ विभिन्न साइटोकिन्स द्वारा Zika वायरल विकास के मॉडुलन दिखा वाहन पर नियंत्रण की तुलना में। मतलब मूल्यों और मानक विचलन बार ग्राफ में दिखाया जाता है। इंटरफेरॉन Zika वायरस प्रतिकृति (पी मूल्य <0.05) के सांख्यिकीय महत्वपूर्ण निषेध दिखाया। (बी और सी) के साथ या साइटोकाइन इलाज के बिना Zika वायरस से संक्रमित कोशिकाओं के चरण विपरीत छवियों। वायरल संक्रमित कोशिकाओं द्वारा गठित सजीले टुकड़े foci के रूप में देखा जा सकता है। ध्यान दें कि इंटरफेरॉन इलाज कुओं वायरल सजीले टुकड़े की जरूरत नहीं है। ZIKV संक्रमण के बिना नकली नियंत्रण के रूप में नकारात्मक नियंत्रण शामिल थे। (स्केल बार = 50 माइक्रोन) एक बड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करेंयह आंकड़ा का संस्करण।

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Discussion

इधर, इन विट्रो में Zika वायरस संवर्धन के लिए एक सुव्यवस्थित प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है। , सहित वायरस संस्कृति का विस्तार, अनुमापांक मापने, और जीनोम प्रतिकृति बढ़ाता प्रदान किया गया के लिए इष्टतम अंत अंक की पहचान महत्वपूर्ण कदम। Zika वायरस एक मानव रोगज़नक़ है, ऐसा है, जबकि संक्रामक एजेंटों से निपटने, जैव सुरक्षा प्रक्रियाओं का कड़ाई से पालन किया जाना है। एक बंदर गुर्दे सेल लाइन, वेरो, विभिन्न विषाणुजनित assays के प्रदर्शन के लिए इस्तेमाल किया गया था। Zika वायरल प्रतिकृति कैनेटीक्स विभिन्न ऊतकों और प्रजातियों की कोशिकाओं में अलग हो सकता है। अतिरिक्त सेल लाइनों के रूप में पहले 15 में वर्णित किया जा सकता है। Zika वायरस संक्रमित भ्रूण 3 के मस्तिष्क के ऊतकों से अलग-थलग कर दिया गया है और cortical तंत्रिका कोशिकाओं पूर्वज 14 संक्रमित करने के लिए दिखाया गया है। इस प्रकार, neuronal कोशिकाओं में ZIKV संक्रमण के pathophysiology के मूल्यांकन के अतिरिक्त सेल विशिष्ट अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं। अफ्रीकी और एशियाई जीनोटाइप के neurovirulent phenotype में मतभेद की जांच की जा सकती हैइस संक्रामक संस्कृति प्रणाली का उपयोग करते हुए। वायरल उत्पादन प्रक्रिया यहाँ वर्णित भी गैर मानव प्राइमेट या कृंतक मॉडल प्रणाली में इन विवो रोगजनक अध्ययन की दिशा में उच्च अनुमापांक वायरस पैदा करने के लिए उपयोगी हो जाएगा।

जबकि, इस अध्ययन वेरो कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए सीमित है, उच्च अनुमापांक मानव और मच्छर मूल के सेल लाइनों का निर्माण का परीक्षण किया जा सकता है। वायरल उत्पादन के दौरान, यदि सीपीई 3 दिन कोशिकाओं का केवल 10-30% में मनाया जाता है, संक्रमित कोशिकाओं 1 में विभाजित किया जा सकता: 4 घनत्व और संवर्धन के अतिरिक्त 4-5 दिनों के लिए जारी रखा जा सकता है। 7 वें दिन के अंत में, एक पूरा सीपीई मनाया जा सकता है।

ZIKV अखिल जीनोटाइप और तनाव विशिष्ट प्राइमरों की दक्षता की तुलना में और निर्धारित किया है कि दोनों कम और उच्च अनुमापांक वायरस संक्रमित कोशिकाओं में Zika वायरल जीनोम बढ़ाता में संवेदनशील हो रहे थे। इसके अलावा, इस अध्ययन में, एक एंटीबॉडी आधारित जांच संक्रमित कोशिकाओं की पहचान सत्यापित है। इस dsRNA विशिष्ट एंटीबॉडी सफलतापूर्वक recoZika वायरस से संक्रमित कोशिकाओं में gnized cytoplasmic वायरल जीनोम। ये अनुकूलित अभिकर्मकों ऐसे अनुवाद, जीनोम प्रतिकृति, विधानसभा और virion morphogenesis के रूप में वायरल प्रतिकृति के विभिन्न चरणों काटना के लिए एक उपयोगी संसाधन हो जाएगा।

यह इन विट्रो संक्रामक सेल संस्कृति प्रणाली Zika वायरस-विशिष्ट उप-जीनोमिक replicons और संक्रामक वायरस पूरक डीएनए (सीडीएनए) क्लोन से उत्पन्न का उपयोग कर भविष्य के अध्ययन के लिए लागू है। Zika वायरल संक्रामक सीडीएनए क्लोन के विकास आनुवंशिक और आणविक जैविक तकनीक के संयोजन से NS1, और NS4B सहित वायरल जीनों के कार्यात्मक अध्ययन को गति देगा। Zika एक फ्लोरोसेंट या luminescent आधारित रिपोर्टर जीन के साथ टैग वायरस की स्थापना के लिए आगे कर रही है उच्च सामग्री स्क्रीनिंग assays में सेल संस्कृति प्रणाली का उपयोग करने में एक महत्वपूर्ण उपकरण होगा।

दोनों प्रकार मैं और प्रकार द्वितीय IFNs विरोधी Zika वायरल गतिविधि का प्रदर्शन किया। IFN-α, IFN-β और IFN-γ आगे EV हो सकता हैएक रोगनिरोधी, बाद जोखिम रोगनिरोधी, और Zika वायरस के संक्रमण और जुड़े रोगों के खिलाफ उपचार के रूप में नैदानिक ​​सेटिंग में aluated। Zika वायरस के लिए सकारात्मक गर्भवती महिलाओं सहित उच्च जोखिम वाले समूहों, उपचार की पहली पंक्ति के रूप में इंटरफेरॉन के साथ इलाज किया जा सकता है। इंटरफेरॉन-α उपचार गर्भवती महिलाओं 18,19 के लिए सुरक्षित करने के लिए दिखाया गया है।

सारांश में, एक संक्रामक सेल संस्कृति प्रणाली है कि Zika वायरल विकास के विभिन्न पहलुओं की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता वर्णित है और उल्लिखित है। प्रोटोकॉल और यहाँ वर्णित अभिकर्मकों जो उन लोगों के Zika वायरस और तंत्रिका संबंधी अनुसंधान समुदाय के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण संसाधन हैं।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Sigma Life Science D5796
HEPES Life Technologies 15630080
Glutamax Life Technologies 35050061
2.5% Trypsin, 10x [-] Phenol Red   Corning 25-054-C1
Trypan Blue Stain 0.4% Life Technologies T10282
Countess – Automated Cell Counter ThermoFisher Scientific C10227
Countess-cell counting  chamber slides ThermoFisher Scientific C10283
Rneasy Mini Kit Qiagen 74104
Nanodrop 2000 Thermo Scientific Nanodrop 2000
mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2  English & Scientific Consulting Kft. 10010200
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 Life Technologies A11020
SUPERSCRIPT III RT  Life Technologies 18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX Life Technologies 11744500
QuantStudio12K Flex Real-Time PCR System Thermo Fischer 4471088
RNase-Free DNase Promega M6101
Vero Cell Line  ATCC CCL-81
Zika viral strain PRVABC59 Centers for Disease Control and Prevention (CDC)
IL-6 Peprotech 200-06             
IL-1 alpha        Peprotech 200-01A          
TNF-alpha Peprotech 300-01A          
Interferon alpha A   R & D Systems 11100-1
Interferon beta Peprotech 300-02BC
Interferon gamma Peprotech 300-02
Centrifuge 5415R Eppendorf 5415R
Centrifuge 5810R Eppendorf 5810R
Nikon Eclipse Ti Immunofluorescence Microscope with Nikon Intenselight C-HGFI Nikon Visit Nikon for Request

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References

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संक्रमण अंक 114 Zika वायरस ZIKV microcephaly इंटरफेरॉन साइटोकिन्स IFN-α IFN-γ Zika वायरस रोकथाम ZIKV निरोधक मच्छर जनित बीमारी, उभरते रोग
Zika वायरस संक्रामक सेल संस्कृति प्रणाली और<em&gt; इन विट्रो</em&gt; इंटरफेरॉन की रोगनिरोधी प्रभाव
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Contreras, D., Arumugaswami, V. Zika … More

Contreras, D., Arumugaswami, V. Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons. J. Vis. Exp. (114), e54767, doi:10.3791/54767 (2016).

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