Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה חדשה לגדול ואיכותי לנתח biofilms חיידקים על עובש פטרייתי על ידי מיקרוסקופ confocal אלקטרונים.
Abstract
biofilms חיידקי יוצרים לעתים קרובות על משטחים פטרייתי יכול להיות מעורבים בתהליכי האינטראקציה חיידקי פטרייתי רבים, כגון שיתוף פעולה מטבולית, תחרות, או טריפה. המחקר של biofilms חשוב בתחומים ביולוגיים רבים, כולל מדעי הסביבה, ייצור מזון, ותרופות. עם זאת, מחקרים מעטים התמקדו biofilms חיידקים כזה, באופן חלקי בשל הקושי לחקור אותם. רוב השיטות ביופילם איכותי וכמותיים ניתוחיים המתוארים בספרות מתאים רק biofilms להרכיב על משטחים אביוטי או על משטחים ביוטיים הומוגנית ורזים, כגון בשכבה של תאי אפיתל.
בעוד מיקרוסקופיה confocal סריקת לייזר (LSCM) משמש לעתים קרובות כדי לנתח באתרו ב biofilms vivo, טכנולוגיה זו הופכת להיות מאוד מאתגר כאשר מוחל על biofilms חיידקים על העובש פטרייתי, בשל העובי שלושת הממדים של hyphal networks. כדי להתגבר על חיסרון זה, פיתחנו פרוטוקול שילוב מיקרוסקופ עם שיטה להגביל את הצטברות של שכבות hyphal במושבות פטרייתי. באמצעות שיטה זו, הצלחנו לחקור את הפיתוח של biofilms חיידקים על העובש פטרייתי בקני מידה מרובים הן באמצעות מיקרוסקופיה אלקטרונית LSCM ואת סורק (SEM). דו"ח זה מתאר את הפרוטוקול, כולל תרבויות מיקרואורגניזם, תנאי היווצרות ביופילם בקטריאלי, ביופילם מכתים, LSCM והדמיות SEM.
Introduction
יש פטריות וחיידקים הרבה הזדמנויות לתקשר אחד עם השני כי הם גרים יחד ללא נישואים ברוב הסביבות יבשתיות. בשל המגוון שלהם Ubiquity שלהם, אינטראקציות אלה חשובות בתחומים ביולוגיים רבים, כולל ביוטכנולוגיה, חקלאות, עיבוד מזון, ותרופות 1, 2. אינטראקציות מולקולריות דורשות מידה מסוימת של קרבה לאפשר חילופי דברים בין השותפים, ובמקרים מסוימים, עמותה פיזית מבני הזוג היא הכרחית עבור אינטראקציה תפקודית 3. יש ליצור שיתוף פיזי משותף בין חיידקים ופטריות הוא ההיווצרות של biofilms חיידקים על משטחים פטרייתי 4. המגע הישיר הזה בין תאי חיידקיים עובש פטרייתי מתיר אינטראקציות אינטימיות שבם מעורבים בתהליכים ביולוגיים שונים. לדוגמה, ברפואה, במחקר של היווצרות ביופילם של aeruginosa Pseudomonas על opportunistic הפתוגן פטרייתי קנדידה אלביקנס יכולה לספק תובנות על הקשר בין היווצרות ביופילם ו ארסיות 5. בחקלאות, מחקרים מצביעים על כך שצמיחה-צמח-קידום חיידקי rhizobacteria ו ביוקונטרול יש יעילות מוגברת כאשר קשורים פטרייה בתוך ביופילם מעורב. לדוגמא, elkanii Bradyrhizobium הגביר פעילות N 2 -fixing כאשר הקשורים ostreatus Pleurotus בתוך ביופילם מעורב 6. לבסוף, ב bioremediation, biofilms מעורבת חיידקי פטרייתי שימשו במשך משיקום של אתרים מזוהמים 7, 8.
LSCM מתאים במיוחד ללמוד biofilms מאז היא מאפשרת תצפית תלת מימדי של החיים biofilms hydrated עם pretreatments המינימום, ובכך לשמר מבנה biofilm והארגון. לפיכך, ניתוח biofilm ידי LSCM מאוד אינפורמטיבי, במיוחד Detסמור את מהלך הזמן של היווצרות ביופילם ואת זיהוי שלבי מאפיין 9, 10, משלב ההידבקות להתפתחות של ביופילם בוגרת. כמו כן הוא במיוחד מותאם כדי להמחיש את מבנה biofilm מטריקס 11, 12 או לכמת את גודל biofilm 13, 14. אמנם שיטה זו מתאימה ללמוד biofilms על משטחים ביוטיים אביוטי או רזים, לומד biofilm חיידקים על מושבת filamentous פטרייתי הוא עדיין מאוד מאתגר. ואכן, רוב הפטריות פילמנטיות לבנות עבות, מורכבות, רשתות tridimensional בתרבות. גם אם ניתן הדמית אובייקטים עבים על ידי מיקרוסקופ confocal, ההנחתה של חדירת הליזר ואת פליטת הקרינה לעתים קרובות להפחית את איכות התמונות הסופיות מעל לעומק של 50 מיקרומטר 15. יתר על כן, כי מושבות פטרייתיים אינן נוקשות, אניt קשה להתמודד עם מיקרואורגניזמים מבלי להפריע biofilms. בשל העובי של הדגימות, כמה הניתוחים המיקרוסקופים של biofilms חיידקים על עובש פטרייתי מבוצעים בדרך כלל רק על חלק קטן של המושבה פטרייתי, ולכן המכיל עובש כמה רק 16, 17, 18. כל זה מגביל את יכולתנו לתאר הפצת ביופילם על המושבה פטרייתי ולכן יכול להביא הטיות לתוך הניתוח במקרה של חלוקת הטרוגנית של ביופילם בתוך המושבה פטרייתי.
כדי להתגבר על קשיים כאלה, אנו מדווחים על שיטה לגידול ועל הניתוח של ביופילם חיידקים על עובש פטרייתי. שיטה זו יושמה כדי לחקור היווצרות ביופילם ב Pseudomonas fluorescens BBc6 על העובש של basidiomycete ectomycorrhizal S238N בשני צבעים Laccaria. מיקרואורגניזמים יער-אדמה שני אלה תוארו בעבר כדי ליצור מעורבותביופילם מבנים דמוי 19, 20. שיטה זו יכולה בקלות להיות מותאמת נוספת למערכות פטרייתי / חיידקים filamentous אחרים. השיטה המוצגת כאן מבוססת על שילוב של שיטה תרבות פטרייתי, המאפשר צמיחה של מושבות פטרייתיים רזה מאוד, עם LSCM והדמיה SEM. זה מותר לנו להשיג מיקרו (טווח מיקרומטר) ו meso- (טווח מ"מ) סולם נופים של אינטראקציה בין שני מיקרואורגניזמים, המאפשר אפיון איכותי של ביופילם. גם הראינו כי הדגימות ניתן לצפות עם SEM, המתירים ניתוח מבנים של ביופילם ברמת ננו בהיקף (טווח ננומטר).
Protocol
1. הכנת תרבויות חיידקים ופטריות
- הכנת תרבויות פטרייתי
- הכן ממברנות צלופן עם אותו קוטר כמו צלחות פטרי ומרתיחים אותם EDTA (1 גר '/ ל במים deionized) למשך 30 דקות. יש לשטוף את הסדינים עם מים ללא יונים ו חיטוי אותם פעמים.
- הכן מראש תרבות פטרייתי ידי יחסנו אגר פטרייתי המתחבר על המדיום אגר המתאים מכוסה קרום צלופן שטופלו מראש EDTA. דגירה זה בטמפרטורה לצמיחה אופטימלית כדי להשיג מושבות כ 1 ס"מ קוטר.
- לקבלת S238N בשני צבעים ל ', לדגור על 25 מעלות צלזיוס למשך 5 ימים על מדיום אגר P5 Pachlewski, עשויים 0.5 גרם של tartrate diNH4, 1 גרם של KH 2 PO4, 0.5 גרם של MgSO 4 .7H 2 O, 5 גרם של מלטוז D + , 20 גרם של גלוקוז D +, 1 מ"ל של 10% תיאמין HCl, 1 מ"ל של 1/10 פתרון micronutrient מדולל (6 גר '/ ל סולפט ברזלי; trioxyde מוליבדן 0.27 g / L; 8.45 g / L חומצת בור; 5 g / איש Lסולפט ganese; 5 גר '/ ל סולפט Cupric; 2.27 g / L אבץ סולפט) עשה עד 1 ליטר עם מים ללא יונים; ו 20 גרם של אגר; pH 5.5.
- מתוך מראש התרבות פטרייתי, לחסן צלחת אגרה חדשה מכוסית קרום צלופן טרום טיפול EDTA המכיל מדיום אגר פחמן נמוך לקדם את ההתפשטות רדיאלי של המושבות.
- כדי לחסן צלחת פטרי, בעדינות לגרד את האזור החיצוני (שבו יש תאים באותו מצב פיסיולוגי) של מושבה פטרייתי מן-התרבות מראש עם אזמל ולהעביר את העובש על הצלחת אגרה החדשה.
- דגירה בטמפרטורת לצמיחה אופטימלית עד המושבות החדשה הם כ 1 ס"מ קוטר. לקבלת S238N בשני צבעים ל ', דגירה אותם 25 מעלות צלזיוס למשך 5 ימים על מדיום אגר P20 (0.25 גר' Dinh 4 tartrate; 0.5 גרם של KH 2 PO 4; 0.25 גרם של MgSO 4 .7H 2 O; 1 גרם של גלוקוז D + ; 0.5 מ"ל של 10% תיאמין-HCl; 0.5 מ"ל של 1/10 פתרון micronutrient מדולל (cf 1.1.2.1), עשה עד 1 ליטר עם מים ללא יונים; ו 20 גרם של אגר; pH 5.5).
הערה: בשל התרבות מראש על צלופן, התרבות השנייה לא תכלול תקשורת אגרה מצת המרכזיים. התקעים אגרו להסירו לניתוח נוסף של biofilms, מאז תקעים אלה להציג אגרו וחומרים מזינים שיכול ליצור הטיות בניתוח. חששות צעד זה מין יחיד פטרייתי שנשמרים מופץ על צלחות אגרו, וזה לא הכרחי פטריות מופצות מ נבגים או מניות קפוא.
- הכנת תרביות חיידקים
- השתמש לולאה סטרילי לאסוף 2 עד 3 מושבות חיידקים בודדים מתרבות על המדיום אגר המתאים לחסן 25 מ"ל של מדיום נוזלי לוריא- Bertani (LB) (או בכל מדיום מתאים אחר, בהתאם לזן בשימוש). עבור פ'fluorescens BBc6, דגירה תרבות בין לילה ב 28 מעלות צלזיוס עם רעד עדין (~ 150 סל"ד).
הערה: שימוש זןמתויג עם חלבון פלואורסצנטי, כגון GFP, עדיף, כי זה ימנע ביצוע פעמים מכתימות (פטריות וחיידקים) לפני תצפיות מיקרוסקופיות. העיתוי, מהירות בחישה, והטמפרטורה של הדגירה תלוי זן בשימוש, כשהמטרה היא להשיג בתרבות גידול מעריכי מאוחר.
- השתמש לולאה סטרילי לאסוף 2 עד 3 מושבות חיידקים בודדים מתרבות על המדיום אגר המתאים לחסן 25 מ"ל של מדיום נוזלי לוריא- Bertani (LB) (או בכל מדיום מתאים אחר, בהתאם לזן בשימוש). עבור פ'fluorescens BBc6, דגירה תרבות בין לילה ב 28 מעלות צלזיוס עם רעד עדין (~ 150 סל"ד).
2. הכנת N במבחנה Biofilm של חיידקים על המושבה פטרייתיים
- צנטריפוגה התרבות חיידקים ב 5000 XG 3 דקות ו להשעות גלולה ב 25 מ"ל של חיץ פוספט 0.1 M אשלגן סטרילי (25 גר '/ ל KH 2 PO 4 ו 2.78 גר' / LK 2 4 HPO, pH 5.8). חזור על פעולה זו פעם ולהתאים את ריכוז החיידקים הסופי 10 מיליליטר 9 תאים / עם אותו החיץ.
- ממלאי microplate 6 גם עם 5 מיליליטר של השעית החיידקים (או חיץ פוספט 0.1 M אשלגן סטרילי עבור השליטה השלילית).
- חותכים את הקרום צלופן של Fungתרבות אל בסכין גילוח סטרילית להשיג ריבועים של צלופן עם מושבה פטרייתי יחידה על כל קרום. מוציא בזהירות את ריבועי צלופן המכילים עובש מהמדיום המוצק באמצעות מלקחיים ולהעביר את הכיכר של עובש צלופן המכיל אל באר של microplate המכיל את ההשעיה חיידקי.
- נער בעדינות את microplate ואילו מושבות פטרייתיים עדיין מחוברים צלופן; אז, הסר את גיליונות צלופן, עוזב את מושבות פטרייתיים בצלחת.
- דגירת microplate עם תסיסה עדינה (~ 60 סל"ד) בטמפרטורה מותאמת מיקרואורגניזמים למד.
הערה: זמן הדגירה תלוי במהירות של הקמת biofilm והשלב להיות מנותח. עבור פ'fluorescens BBc6 / L. בשני צבעים, לדגור על 20 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות כדי לקבל biofilms בשלב מוקדם ועד 16 שעות כדי לקבל בוגרת biofilms.
3. ניתוח מיקרוסקופית Confocal סריקת לייזר של פורמט Biofilmיוֹן
- להכנת דגימות
- כדי להסיר חיידקים ובקטריות planktonic אלקטרוסטטי-המצורפת העובש, יש לשטוף את הפטרייה על ידי העברת אותו microplate 6-באר חדשה מלא 5 מ"ל של תמיסת מלח חזקה (NaCl, 17 גר '/ ל') 17; לנער בעדינות במשך דקות 1.
- מעביר את הפטרייה על microplate 6-באר חדשה המכיל 5 מיליליטר של 0.1 סטרילית חיץ פוספט M אשלגן, לנער בעדינות במשך 2 דקות, ולהעביר את פטריית חיץ פוספט אשלגן טרי.
- חותכים את החלק של המושבה פטרייתי להיות צילמו עם אזמל תוך שמירה על אותה למאגר פוספט אשלגן, כך סעיף המתקבל מכיל כמחצית המושבה פטרייתי.
- כדי להכתים את המדגם, ולהעביר אותו אל צלחת פטרי מלא מים סטריליים המכילים צבע פלואורסצנטי המתאים (תלוי המטרה של הניתוח), דגירה אותו בחושך.
- כדי להמחיש את הרשת פטרייתי, להשתמש, למשל, קונגו אדום (0.1% שיתוף סופיncentration, 5 דקות של דגירה), agglutin נבט חיטה (לקטינים WGA) מצומדות כדי אלקסה פלואוריד 633 (10 מיקרוגרם / מ"ל ריכוז סופי, 10 דקות של דגירה) או FUN1 (10 מיקרומטר הריכוז הסופי, 10 דקות של הדגירה).
- אם אתה משתמש חיידק ללא ניאון מתויג, counterstain התאים חיידקיים עם בדיקת ניאון ספציפי DNA בין צבעי ה- DNA בתא-permeant הרבים הזמינים מסחרי. לדוגמה, השתמש DAPI (0.25 מיקרוגרם / מ"ל ריכוז סופי, 10 דקות של הדגירה).
- כדי להמחיש את החלבונים מטריקס, השתמש חלבון כתם 21.
- לאחר מכתים, לשטוף את המדגם על ידי והעברתה מכסה צלחת פטרי המכילה 10 מ"ל של פוספט 0.1 M אשלגן סטרילי ולנער בעדינות במשך דקות 1.
- חצי לצלול שקופית במכסה צלחת פטרי ובעדינות להביא את החלק לחתוך לצוף מעל השקופית. ואז, לאט להסיר את השקופית מפתרון החיץ, מאפשר מדגם להתיישב בעדינות בשקופית.
- לבסוף, להוסיף 10 μl של המדיום גובר נגד דהייה המדגם ולכסות אותו עם coverslip זכוכית.
הערה: לאחר השקופית מוכנה, הניתוח המיקרוסקופי חייב להתבצע בהקדם האפשרי (בתוך לכל היותר 30 דקות) כדי למנוע שינוי במבנה biofilm.
- ניתוח מיקרוסקופי Confocal
- בדוק את השקופיות תחת מיקרוסקופ לייזר confocal עם עדשה אובייקטיבי 10X או 40X מצמידים את תוכנת הדמיה.
הערה: כאן, סריקת מיקרוסקופ confocal מרובת אלומות מצויד 405, 488, ו 561 לייזרים עירור ננומטר, גלאי PMT Gaasp, ו 10X 0.3 NA ו 40X 1.2 מטרות NA היה בשימוש.- בצע הדמיה באמצעות פרמטרים מותאמים לסוגי נתונים המבוקשים על אילוצי הזמן. השתמש אורכי גל ליזר עירור / פליטה על פי הכתם שננקט על ידי מומחה של recommendati היצרןלפיירפוקס. השתמש בשילוב של סריקת אריח ופונקציות מחסנית Z להשיג נופי 3D העולמיים של המושבה פטרייתי ואת biofilms.
הערה: תמונות איור 3 נרכשו באמצעות הפרמטרים הבאים: 8-bit / פיקסל, מיצוע = 2, להתעכב פיקסל = 1.58 μsec, אריחי לסרוק תמונות 5x5 עם תפרים באינטרנט (10% כיסוי, סף = 0.7); Z-צעד = 2 מיקרומטר.
- בצע הדמיה באמצעות פרמטרים מותאמים לסוגי נתונים המבוקשים על אילוצי הזמן. השתמש אורכי גל ליזר עירור / פליטה על פי הכתם שננקט על ידי מומחה של recommendati היצרןלפיירפוקס. השתמש בשילוב של סריקת אריח ופונקציות מחסנית Z להשיג נופי 3D העולמיים של המושבה פטרייתי ואת biofilms.
- להדמית נתוני 3D, השתמש באחת תוכנות חינם או מסחריות הרבות (להציע אלה אפשרויות רבות טיוח 3D).
- לדוגמה, כדי להציג נתונים Z- מחסנית כמו תחזיות בעוצמה מקסימלית 2D, להפחית את ערוץ שדה בהיר, להתאים את הבהירות והניגודיות, ולמזג ערוצי ליצור תמונה מורכבת. אם הם נמצאים, לחסל פרוסות ללא אות בקצות מחסנית Z. לאחר מכן, לבצע השלכה מרבית בעצימות 2D ולהמיר את התוצאה לתוך צבע RGB. השתמש בפונקציה "פרויקט Z" בתוכנה ImageJ 22 כדי להשיג את p תמונותהתרעם כאן על ידי תחזיות בעוצמה מקסימלית 2D.
- בדוק את השקופיות תחת מיקרוסקופ לייזר confocal עם עדשה אובייקטיבי 10X או 40X מצמידים את תוכנת הדמיה.
4. ניתוח למיקרוסקופיה אלקטרונית
- הכן את דגימות כפי שתואר עבור LSCM, למעט בשלב 3.1.2, להעביר את biofilms כדי מים סטריליים במקום חיץ פוספט אשלגן לאחר השלבים לשטוף. זה ימנע היווצרות של גבישי מלח במהלך השלב התייבשות, אשר היה להפריע הדמיה SEM.
- מעביר את biofilms לבעל מדגם ולהסיר עודפי מים; רק לאפשר קרומי של מים קטנים כדי לכסות את המדגם.
- מעביר את המדגם של לשכת מיקרוסקופ אלקטרוני סורק משתנה בלחץ (VP-SEM); להקפיא אותו עד -50 ° C על במת קירור Peltier; ולאפשר לו להקפיא-יבש לאט, ישירות לתא SEM, עם 100 Pa של לחץ משתנה להגדיר עבור 15 שעות.
- לאחר השלמת ייבוש בהקפאה, לאחזר את המדגם ולהעביר אותו לתוך מערכת בתצהיר סרט ואקום גבוה. מעיל המדגם עם 2 ננומטר של platinuמ '(מדידה קוורץ) תחת פלזמה ארגון (2.5 x 10 -2 mbar, 35 מילי-אמפר).
- שים המדגם צופה SEM מצויד באקדח פליטת שדה (FEG) באמצעות ברזולוציה הגבוהה "עדשה" גלאים מתח גבוה אלקטרוני של 1 קילו וולט.
Representative Results
ההליך סכמטית הכולל של תרבות פטרייתי והכנת ביופילם מקבל באיור 1. שיטת התרבות אפשרה לנו להשיג מושבות פטרייתיים 20 עד 50 מיקרומטר המכילים עבה כמה שכבות של עובש, המאפשר מייקרו טווה בקנה מידת המנתח של ביופילם חי hydrated באמצעות LSCM. היישום של השיטה מותר רכישת תמונות באיכות גבוהה של פ fluorescens biofilms BBc6 על העובש בשני צבעים ל לאורך היווצרות ביופילם (איורים 2 - 4).
הניתוח טווה בקנה המידה של biofilms הפגין חלוקת הטרוגנית של ביופילם של פ fluorescens BBc6 על העובש של L. בשני הצבעים S238N (איורים 2 ו -3). ניתוח בקנה מידה טווינה מותר גם עבור מעקב של היווצרות ביופילם לאורך זמן (איור3) מן השלבים המוקדמים, שבו רק כמה חיידקים צורפו עובש (איור 3 א), להיווצרות של ביופילם עבה, בוגרת (איור 3B). הרזולוציה הגבוהה של התמונות הגוניות-טווינה אפשרה לנו לבצע ניתוח מייקרו בקנה מידה על אותם הדימויים כדי להשיג את ארכיטקטורות המושבה (איור 3c - ד).
ניתוח מייקרו בקנה המידה בשילוב עם התיוג הספציפי אפשר לנו ללכת צעד נוסף באפיון ביופילם. הנה, SYPRO רובי 23, אשר תוויות רוב המדריכים של חלבונים, היה מוחל על דגימות (איור 4) ומראה נוכחות של חלבונים במטריצה.
לבסוף, לפרטים נוספים אודות מבנה biofilm התקבלו על ידי הדמית SEM של המדגם הזהה לאחר התייבשות וציפוי (איור 5). הדמית SEM הניתנתגישת ננו ברמה, ובכך נותנת גישה למבנה מטריקס.
איור 1: הליך סכמטית כולל של תרבות פטרייתי והכנה ביופילם. נתון זה מתאר את השלבים העיקריים של השיטה, מתרבויות מיקרואורגניזם לדגום ניתוחים. פרטים נוספים ניתנים בפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: לחלק מחדש ביופילם BBc6 על המושבה פטרייתי. המדגם היה צלם לאחר 18 שעות של אינטראקציה בהגדלה 10X. התמונה הושגה באמצעות הקרנת עצמה מרבית 2D של תמונות מיקרוסקופיה confocal 3D. הרשת האפורה על figuמחדש המציג את מיקום הפסיפס. ל עובש בשני צבעים מגואלות קונגו אדום (אדום) וחיידקים הם מתויגים GFP (ירוק). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: בשלבים מוקדמים ומאוחרים של היווצרות ביופילם BBc6 על עובש בשני צבעים ל. תמונה זו הושגה באמצעות הקרנת העוצמה המרבית 2D של תמונות מיקרוסקופיה confocal 3D. הדמיה בוצעה בהגדלה 40X. (א) biofilms לחלק מחדש אחרי שעה 2 של אינטראקציה. (ב) לחלק מחדש Biofilm לאחר 14 שעות של אינטראקציה. (ג) גדלה של המלבן הלבן (א). (ד) גדלה של המלבן הלבן (ב). עובש פטרייתיים מגואלות קונגו האדום (אדום) וחיידקים הם GFP-ta gged (ירוק). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: מכתים מטריקס של biofilm BBc6 על העובש בשני צבעים ל. (א) biofilms לאחר 16 שעות של אינטראקציה. (ב) גדלה של המלבן הלבן (א). הדמיה בוצעה בהגדלה 40X, ותמונות אלו נתקבלו באמצעות הקרנת העוצמה המרבית 2D של תמונות מיקרוסקופיה confocal 3D. חיידקים הם מתויגים GFP (ירוק), פטריות מוכתמות Fun1 (ירוק כהה), וחלבונים מגואלים ס רובי (אדום). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
= "Jove_content" FO: keep-together.within-page = "1"> 
איור 5: הדמיה SEM של biofilms BBc6 על העובש בשני צבעים ל. SEM הדמיה בוצעה 2360X, EHT: 1kV. לפני ההדמיה, המדגם היה לאט מיובש בהקפאה בתא SEM ומצופה פלטינה. חיצים ירוקים מצביעים על biofilms חיידקי חצים צהובים להצביע על עובש פטרייתי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Discussion
Biofilms חיידקי מאוחזרות בסביבות רבים נחקרו מאז 1950, מובילה להתפתחות של מספר שיטות לנתח אותם 24. שיטות קלסיות לכמת biofilms הצג כולל מבחני מייקרו-כייל ו, שיטה בשימוש הנרחב ביותר, סגול קריסטל מכתים (CV). שיטות אלו הן מהירות, בעלות נמוכה, וקל לטפל 25 והם יעילים במיוחד כדי לכמת ביומסה biofilm המוחלטת או לבצע מבחני כדאיות וכימות מטריקס. על מצד שני, "omics" שיטות שימושיות גם במחקרים ביופילם, המאפשרות ניתוחים כמותיים ופונקציונליים של biofilms 26, 27. למרות היתרונות של צלחת מיקרו-כייל ו "omics" שיטות, מספר תכונות חיוניות של biofilms לא יכול ליפול בפח עם הטכניקות הללו, ובכך מעכבות את הבנה מלאה של התהליך הזה. תכונות אלה כוללות מבנה מטריצההים, ארכיטקטורות מושבות חיידקים, תא / תאי אינטראקציות, ודפוסי קולוניזציה, שהן נתוני מפתח להבנה הוא בתפקוד של biofilms ואת הדינמיקה של ההיווצרות שלהם. למרות היכולת של מיקרוסקופיה ללכוד התכונות הללו, ניתוח מיקרוסקופיה של biofilms חיידקים על פטריות פילמנטיות עדיין נדירים. זאת בעיקר עקב הגידול של פטריות פילמנטיות, אשר לעתים קרובות יוצר מושבות של עבה, מורכבות, רשתות tridimensional. כינונה של biofilms חיידקים על פטריות נפוץ בסביבות מגוונות והוא מעורב באופן משמעותי בתחומים שונים 4 (למשל, רפואה, חקלאות ואיכות סביבה.); ומכאן, חשוב לפתח שיטות חדשות כדי לסייע בקידום החקירה שלהם. לשם כך, אנו בשילוב שיטה להפקת מושבות פטרייתיים מאוד רזה עם הדמיה מיקרוסקופית של biofilms החיידקים. בנוסף, הצענו סט של כלים מיקרוסקופיה איכותי לנתח biofilms אלה. ההצלחה של השיטה מסתמכת עלאת היכולת לייצר מושבות hyphal דקות מאוד ליישם את הצבעים המתאימים. נקודות אלה נדונים להלן.
בשל המבנים המורכבים של biofilms, הבנת תפקידם דורשת גישה רב היקף 28, 29. דפוסי התפוצה של biofilms, אדריכלות מושבת חיידקים, ומבנה מטריצת והרכב מנותחים בקני מידה שונים (כלומר, טווינה בקנה מידה בקנה מידה מיקרו). יתר על כן, ברזולוציה של ננו מאפשרת גישת האינטראקציות הפיזיות תא / תא ואת-ננו-המבנה של מטריקס. לכן, השיטה שפותחה בקלות מאפשרת ניתוח רב היקף של biofilms החיידקים נוצר על המושבה פטרייתי.
במרבית המחקרים, LSCM מנתח של biofilms מוגבלים סולם-מיקרו, סולם-טווינה בדרך כלל מתבצע על ידי טומוגרפיה קוהרנטיות אופטית 30, 31,
שילוב זה של ניתוחים נתן גישה בו זמנית אל לחלק מחדש ביופילם על המושבה פטרייתי, הארכיטקטורה מושבת חיידקים לאורך ביופילם בפיתוח, ואת מבנה מטריקס. הניתוח טווה בקנה המידה הראה חלוקה הטרוגנית של biofilms החיידקים על המושבות פטרייתי (איורים 2 ו -3). תצפית זו לא הייתה אפשרית עם פרוטוקולים שרק להתיר הדמיה של חלק קטן של המושבה פטרייתי, וזה לא בהכרח נציג של המושבה כולה. וכך, בעודלעיתים קרובות מוזנחים, ניתוח בקנה מידה טווינה יכול לתת מידע יקר על דפוסי התפוצה ביופילם.
לבסוף, שיטה שפותחה ניתן להשתמש כדי לנתח דגימות עם שיטות מיקרוסקופיה שונות, כולל מיקרוסקופיה אלקטרונים סורק. הנה, SEM שימש להגיע בקנה מידה ננו, וכדי לקבל את הארגון המרחבי חיידקי בתוך ביופילם. זה מבוצע היטב עם המושבות פטרייתי הדקות, בעוד SEM מותר הדמית שטח בלבד. בניגוד LSCM, SEM, עם זאת, התייבשות המדגם הנדרש ו, לרוב, ציפוי עם מוליך מתכת. תהליך התייבשות זה עשוי לשנות מבנים ביולוגיים כאשר הוא לא מבוצע כהלכה ועשוי לדרוש אופטימיזציה. הנה, התייבשות מדגמת באמצעות lyophilization האיטי שמשה 33. עם זאת, החלה היא LSCM ו SEM על הדגימות תאפשר את הביצועים של מיקרוסקופיה המצטרפת באותו המקום של המדגם.
למרות היתרונותשתוארו לעיל, מספר מגבלות קיימות. ראשית, זה לא יכול לחול על כל סוג של פטריות. ואכן, שיטת culturing זו מפותח פטריות מתפשטות רדיאלית על פני השטח של תקשורת המוצקה. שיטה זו עשויה להיות לא מתאימה פטריות להרכיב עובש אווירי בעיקר (למשל, Fusarium sp.) או פטריות מייקרו-אירובית מתפשטות בעיקר בתוך אגר. יתר על כן, צלופן משפיל פטריות עשוי להיות בעייתי גם אותו (למשל., Trichoderma sp.). שנית, חשוב לציין כי האסטרטגיה מכתים נקודה קריטית והבחירה של הכתם חייב להיעשות בזהירות, כמו כתם אסור להפריע ביופילם. לדוגמא, שמנו לב Calcofluor לבן נגרם הפרעת biofilm חלקית (מידע לא מוצג), ככל הנראה בשל רמת החומציות הגבוהה של הכתם הזה. כמו כן, כמה צבעי מיוצר מכתים הטרוגנית (למשל., קונגו אדום), ואילו יתר פיק מכתים הומוגנית (למשל., מכתים דופן תא עם לקטיני WGA), נותן איכות תמונה הטרוגנית.יתר על כן, חשוב להיות מודע לכך צבעים מסוימים עלולים להיות לא ספציפיים באופן מלא. לדוגמה, כתמים WGA לא רק קירות התא פטרייתי אלא גם חומצה N-acetylneuraminic בקירות תא החיידק חיובי גרם adhesins המיוצר על ידי גראם חיוביים וחיידקים -שלילית במהלך היווצרות ביופילם 34, 35. לכן, באמצעות חיידקי חלבון מתויג ניאון ו / או פטריות מומלצות להימנע מכתים מרובה. אם צבעי מרובים משמשים, הם חייבים לא להתערב מבחינה כימית, ואת ספקטרום הפליטה שלהם לא צריך לחפוף.
טווה בקנה מידת המנתח דורש שטח סרוקות גדול, ולכן, LSCM עשוי להיות גוזל זמן (40 דק 'עד שעה 1, בהתאם לעובי המדגם) ואת צוואר בקבוק הניתוח של מספר גדול של דגימות. עם זאת, התאמות יכול להתבצע בהתאם לסוג הנתונים הנדרשים. אפשר להקטין את זמן הרכישה ואת גודל התמונה על ידי שינוי באיכות התמונה. לדוגמה, ברזולוציה גבוההלא יש צורך לנתח את לחלק מחדש הכללי ביופילם.
לבסוף, כמה מגבלות צריכות להילקח בחשבון בעת הבחירה להציג נתוני מחסנית Z- כמו תחזיות 2D או 3D. תחזיות דו ממדים הן דרך טובה לסכם נתונים, אך מידע מעמיק הולך לאיבוד, והמבנים חפפו להיות מוסתרים. מצד השני, תחזיות 3D לאפשר להדמית מנקודות מבט שונות, אבל הם לעתים קרובות לדקלם גרועים במקרה של מורכבות המרחבית.
לסיכום, יש לנו דיווח שיטה לאפיון של biofilms חיידקים על עובש ברמה המבנית. המתודולוגיה יכול להתארך עד יישומים אחרים. אכן, שיטה זו מאפשרת את הביצועים של אפיון פונקציונלי או כימי של biofilms החיידקים להרכיב על עובש פטרייתי. בשל המגוון הגדול של מערכות כתב ניאון קיימים, ניתוח LSCM יכול לשמש למטרות רבות 29. לדוגמה, את המיקרופון הקרינהroscopy יכול לשמש כדי לפקח על שיפוע pH 36 או דיפוזיה המולקולה biofilms 37. בנוסף, השיטה מאפשרת ניתוח הקהילה biofilms multispecies. לדוגמא, קרינת הכלאה באתרו מיקוד קבוצות חיידקים ספציפיות שימושית במיוחד ללמוד לחלק מחדש חיידקים ספציפיים multispecies biofilms 38, 39. לאחרונה, צבעי ניאון רבים שניתן להשתמש בהם כדי לאפיין את הרכב מטריצה של biofilms 21. הנה, חלבונים הותקפו באמצעות Sypro, אשר מכתים מגוון גדול של חלבונים, ביניהם חלבוני מטריקס (איור 4), אבל צבעים אחרים המאפשרים ההדמיה של מרכיבים מטריקס חשובים אחרים, כגון exopolysaccharides או דנ"א תאי. מעניין לשים לב שכל הניתוחים הללו יכולים להתבצע בקנה המידה טווה בשיטה המתוארת. מאז LSCM יכול להתבצע על דגימות חיים,אפשר גם להשיג זמן לשגות הדמיה באמצעות, למשל, coverwell תאי, מתאים במיוחד מושבות פטרייתיים דקות. אפשרות זו מעניינת במיוחד, כמו היווצרות ביופילם היא תהליך מורכב, דינמי. לבסוף, למטרה כמוני, השיטה המדווחת עשויה לשפר את הדיוק של ניתוח הכמותי אוטומטי על ידי ביצוע כימות זה אפשרי על תמונות בקנה מידה טווה. זה עשוי להתגבר ההטרוגניות ביופילם ונושאים סטטיסטיים 29.
Disclosures
החוקרים אין לי מה לחשוף.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 well Falcon Tissue Culture Plates | Fisher Scientific | 08-772-33 | Used in 2.2 & 3.1 |
| Congo Red | Fisher Scientific | C580-25 | Used in 3.1.4.1 |
| FUN 1 Cell Stain | Thermo Fisher Scientific | F7030 | Used in 3.1.4.1 |
| Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 633 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | W21404 | Used in 3.1.4.1 |
| DAPI solution | Thermo Fisher Scientific | 62248 | Used in 3.1.4.2 |
| Propidium iodide | Thermo Fisher Scientific | P3566 | Used in 3.1.4.3 |
| FilmTracer SYPRO Ruby Biofilm Matrix protein Stain | Thermo Fisher Scientific | F10318 | Used in 3.1.4.4 |
| Fluoromount-G Slide Mounting Medium | Fisher Scientific | OB100-01 | Used in 3.1.7 |
| LSM780 Axio Observer Z1 | Zeiss | Used in 3.2.1 | |
| ZEN 2.1 lite black software | Zeiss | Used in 3.2.1 | |
| High Vacuum Coater Leica EM ACE600 | Leica | Used in 4 | |
| GeminiSEM-FEG | Zeiss | Used in 4 |
References
- Frey-Klett, P., Burlinson, P., Deveau, A., Barret, M., Tarkka, M., Sarniguet, A. Bacterial-Fungal Interactions: Hyphens between Agricultural, Clinical, Environmental, and Food Microbiologists. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 75 (4), 583-609 (2011).
- Scherlach, K., Graupner, K., Hertweck, C. Molecular bacteria-fungi interactions: effects on environment, food, and medicine. Annu. Rev. Microbiol. 67, 375-397 (2013).
- Schroeckh, V., Scherlach, K., et al. Intimate bacterial-fungal interaction triggers biosynthesis of archetypal polyketides in Aspergillus nidulans. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (34), 14558-14563 (2009).
- Hogan, D. A., Wargo, M. J., Beck, N. Bacterial Biofilms on Fungal Surfaces. Biofilm mode of life: mechanisms and adaptations. 13, 235-245 (2007).
- Hogan, D. A., Kolter, R. Pseudomonas - Candida interactions: an ecological role for virulence factors. Science. 296 (5576), 2229-2232 (2002).
- Jayasinghearachchi, H. S., Seneviratne, G. Can mushrooms fix atmospheric nitrogen? J. Biosci. 29 (3), 293-296 (2004).
- Seneviratne, G., Zavahir, J. S., Weerasekara, W. M. M. S., Bandara, M. L. M. A. Fungal-bacterial biofilms their development for novel biotechnological applications. World J Microbiol Biotechnol. , 739-743 (2008).
- Herath, H. M. L. I., Upamali, A., Vithanage, M., Seneviratne, G. Developed fungal - bacterial biofilms as a novel tool for bioremoval of hexavelant chromium from wastewater. Chem. Ecol. 00 (0), 1-10 (2014).
- Macedo, A. J., Kuhlicke, U., Neu, T. R., Timmis, K. N., Abraham, W. R. Three stages of a biofilm community developing at the liquid-liquid interface between polychlorinated biphenyls and water. Appl. Environ. Microbiol. 71 (11), 7301-7309 (2005).
- Da Silva, W. J., Seneviratne, J., Samaranayake, L. P., Del Bel Cury, A. A. Bioactivity and architecture of Candida albicans biofilms developed on poly(methyl methacrylate) resin surface. J. Biomed. Mater. Res. - Part B Appl. Biomater. 94 (1), 149-156 (2010).
- Flemming, H., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat. Publ. Gr. 8 (9), 623-633 (2010).
- Cerca, N., Gomes, F., Pereira, S., Teixeira, P., Oliveira, R. Confocal laser scanning microscopy analysis of S. epidermidis biofilms exposed to farnesol, vancomycin and rifampicin. BMC Res. Notes. 5, 244 (2012).
- Lepanto, P., Lecumberry, F., Rossello, J., Kierbel, A. A confocal microscopy image analysis method to measure adhesion and internalization of Pseudomonas aeruginosa multicellular structures into epithelial cells. Mol. Cell. Probes. 28 (1), 1-5 (2014).
- Mueller, L. N., de Brouwer, J. F. C., Almeida, J. S., Stal, L. J., Xavier, J. B. Analysis of a marine phototrophic biofilm by confocal laser scanning microscopy using the new image quantification software PHLIP. BMC Ecol. 6, (2006).
- Murray, J. M. Methods for imaging thick specimens: Confocal microscopy, deconvolution, and structured illumination. Cold Spring Harb. Protoc. 6 (12), 1399-1437 (2011).
- Toljander, J. F., Artursson, V., Paul, L. R., Jansson, J. K., Finlay, R. D. Attachment of different soil bacteria to arbuscular mycorrhizal fungal extraradical hyphae is determined by hyphal vitality and fungal species. FEMS Microbiol. Ecol. 254, 34-40 (2006).
- Brandl, M. T., Carter, M. Q., Parker, C. T., Chapman, M. R., Huynh, S. Salmonella Biofilm Formation on Aspergillus niger Involves Cellulose - Chitin Interactions. PLoS One. 6 (10), (2011).
- Balbontín, R., Vlamakis, H. Mutualistic interaction between Salmonella enterica and Aspergillus niger and its effects on Zea mays colonization. Microb. Biotechnol. Publ. , (2014).
- Frey-Klett, P., Garbaye, J., Tarkka, M. The mycorrhiza helper bacteria revisited. New Phytol. 176 (1), 22-36 (2007).
- Deveau, A., Brulé, C., et al. Role of fungal trehalose and bacterial thiamine in the improved survival and growth of the ectomycorrhizal fungus Laccaria bicolor S238N and the helper bacterium Pseudomonas fluorescens BBc6R8. Environ. Microbiol. Rep. 2 (4), 560-568 (2010).
- Neu, T. R., Lawrence, J. R. Advanced Techniques for In Situ Analysis of the Biofilm Matrix (Structure, Composition, Dynamics) by Means of Laser Scanning Microscopy. Methods Mol. Biol. 1147, 43-64 (2014).
- Rasband, W. S. imagej. , Available from: http://imagej.nih.gov/ij (2016).
- Berggren, K. N., Schulenberg, B., et al. An improved formulation of SYPRO Ruby protein gel stain: Comparison with the original formulation and with a ruthenium II tris (bathophenanthroline disulfonate) formulation. Proteomics. 2 (5), 486-498 (2002).
- Pantanella, F., Valenti, P., Natalizi, T., Passeri, D., Berlutti, F. Analytical techniques to study microbial biofilm on abiotic surfaces: pros and cons of the main techniques currently in use. Ann. di Ig. 25 (1), 31-42 (2013).
- Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J. Vis. Exp. (47), (2011).
- Azevedo, N. F., Lopes, S. P., Keevil, C. W., Pereira, M. O., Vieira, M. J. Time to "go large" on biofilm research: Advantages of an omics approach. Biotechnol. Lett. 31 (4), 477-485 (2009).
- Koerdt, A., Orell, A., et al. Macromolecular fingerprinting of Sulfolobus species in biofilm: A transcriptomic and proteomic approach combined with spectroscopic analysis. J. Proteome Res. 10 (9), 4105-4119 (2011).
- Morgenroth, E., Milferstedt, K. Biofilm engineering: Linking biofilm development at different length and time scales. Rev. Environ. Sci. Biotechnol. 8 (3), 203-208 (2009).
- Neu, T. R., Lawrence, J. R. Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales. Trends Microbiol. 23 (4), 233-242 (2015).
- Xi, C., Marks, D., Schlachter, S., Luo, W., Boppart, S. A. High-resolution three-dimensional imaging of biofilm development using optical coherence tomography. J. Biomed. Opt. 11 (3), 34001 (2006).
- Janjaroen, D., Ling, F., et al. Roles of ionic strength and biofilm roughness on adhesion kinetics of Escherichia coli onto groundwater biofilm grown on PVC surfaces. Water Res. 47 (7), 2531-2542 (2013).
- Derlon, N., Koch, N., et al. Activity of metazoa governs biofilm structure formation and enhances permeate flux during Gravity-Driven Membrane (GDM) filtration. Water Res. 47 (6), 2085-2095 (2013).
- Karcz, J., Bernas, T., Nowak, A., Talik, E., Woznica, A. Application of lyophilization to prepare the nitrifying bacterial biofilm for imaging with scanning electron microscopy. Scanning. 34 (1), 26-36 (2012).
- Burton, E., Yakandawala, N., LoVetri, K., Madhyastha, M. S. A microplate spectrofluorometric assay for bacterial biofilms. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 34 (1), 1-4 (2007).
- Berne, C., Ducret, A., Hardy, G. G., Brun, Y. V. Adhesins Involved in Attachment to Abiotic Surfaces by Gram-Negative Bacteria. Microbiol. Spectr. 3 (4), 1-45 (2015).
- Schlafer, S., Garcia, J. E., Greve, M., Raarup, M. K., Nyvad, B., Dige, I. Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms with C-SNARF-4. Appl. Environ. Microbiol. 81 (4), 1267-1273 (2015).
- Daddi Oubekka, S., Briandet, R., Fontaine-Aupart, M. P., Steenkeste, K. Correlative time-resolved fluorescence microscopy to assess antibiotic diffusion-reaction in biofilms. Antimicrob. Agents Chemother. 56 (6), 3349-3358 (2012).
- Almeida, C., Azevedo, N. F., Santos, S., Keevil, C. W., Vieira, M. J. Discriminating multi-species populations in biofilms with peptide nucleic acid fluorescence in situ hybridization (PNA FISH). PLoS One. 6 (3), (2011).
- Malic, S., Hill, K. E., Hayes, A., Percival, S. L., Thomas, D. W., Williams, D. W. Detection and identification of specific bacteria in wound biofilms using peptide nucleic acid fluorescent in situ hybridization (PNA FISH). Microbiology. 155 (8), 2603-2611 (2009).
