Summary
このプロトコルは、成長し、質的に、共焦点顕微鏡および電子顕微鏡により真菌の菌糸上の細菌のバイオフィルムを分析するための新しい方法を説明しています。
Abstract
細菌性バイオフィルムはしばしば真菌の表面上に形成し、そのような代謝協力、競争、または捕食のような多数の細菌、真菌の相互作用のプロセスに関与することができます。バイオフィルムの研究では、環境科学、食糧生産、および医薬を含む多くの生物学的分野において重要です。しかし、いくつかの研究では、それらを調査することの難しさに部分的に起因する、細菌バイオフィルム、に焦点を当てています。定性的および定量的なバイオフィルムのための方法のほとんどは、文献に記載の分析のみ非生物表面上又はそのような上皮細胞の単層として均一で薄い生物表面上でバイオフィルムを形成するのに適しています。
レーザー走査共焦点顕微鏡（LSCM）をしばしばインサイチュおよび インビボのバイオフィルムに分析するために使用されている間により厚みと菌糸NETWの三次元に、真菌の菌糸の細菌のバイオフィルムに適用した場合、この技術は非常に困難となりますorks。この欠点を克服するために、我々は、真菌のコロニーにおける菌糸層の蓄積を制限する方法と顕微鏡を組み合わせたプロトコルを開発しました。この方法を使用して、我々は両方のLSCMと走査電子顕微鏡（SEM）を用いて、複数のスケールでの真菌菌糸の細菌バイオフィルムの発達を調査することができました。このレポートでは、微生物培養、細菌性バイオフィルムの形成条件、バイオフィルムの染色、およびLSCMとSEMの可視化などのプロトコルを記述します。
Introduction
彼らはほとんどの地上の環境で同居ので、カビや細菌が互いに相互作用する多くの機会を持っています。その多様性とその普遍性のため、これらの相互作用は、バイオテクノロジー、農業、食品加工、および医学1、2を含む多くの生物学的分野において重要です。分子間相互作用パートナー間の交換を可能にするために、近接のある程度を必要とし、いくつかのケースでは、パートナーの物理的会合は、機能的相互作用3に必要です。細菌や真菌の間で共通の物理的会合は、真菌の表面4上の細菌のバイオフィルムの形成です。細菌細胞と菌糸との間のこの直接接触は、様々な生物学的プロセスに関与している親密な相互作用を可能にします。例えば、医学、opporに緑膿菌のバイオフィルム形成の研究でtunistic真菌病原体カンジダ・アルビカンスは、バイオフィルム形成と病原性5との間のリンクへの洞察を提供することができます。農業では、研究では、混合バイオフィルム中の菌に関連付けられたときに植物生長促進根圏細菌や生物防除細菌が増加した効率を有することを示唆しています。混合バイオフィルム6にヒラタケに関連付けられているとき、例えば、 根粒菌のelkaniiは、N 2 -fixing活性を増強しています。最後に、バイオレメディエーションでは、細菌、真菌混合バイオフィルムは、汚染された場所7、8の修復のために使用されています。
それによりバイオフィルムの構造と組織を維持し、最小限の前処理と水和バイオフィルム生体の三次元観察を可能にするためLSCMはバイオフィルムを研究するために特に適しています。したがって、LSCMによってバイオフィルムの分析は、特にDETに、非常に有益です成熟したバイオフィルムの開発に接着工程から、バイオフィルム形成の時間経過と特性ステージ9、10の検出をオコジョ。また、特にバイオフィルム構造及びマトリックス11,12を視覚化するために、またはバイオフィルムサイズ13、14を定量化するように構成されています。この方法は、真菌、糸状コロニーの細菌性バイオフィルムを研究し、非生物的または薄い生物表面上のバイオフィルムを研究するのに適しているが、依然として非常に困難です。実際、ほとんどの糸状菌は、培養中の太い、複雑な、三次元ネットワークを構築します。厚いオブジェクトは、共焦点顕微鏡によって画像化することができる場合であっても、レーザ浸透および蛍光発光の減衰は、多くの場合、50 から15μmの深さを超える最終画像の品質を低下させます。また、真菌のコロニーは、剛性ではないので、私tはバイオフィルムを乱すことなく微生物を処理することは困難です。試料の厚さに、真菌の菌糸上の細菌のバイオフィルムのいくつかの顕微鏡分析は通常のみですので、ほんの数菌糸16、17、18を含む、真菌のコロニーの小さな部分で実行されます。このすべては、真菌のコロニー上のバイオフィルムの分布を記述するために、したがって、真菌のコロニー内のバイオフィルムの不均一分布の場合には、分析にバイアスをもたらすことができる当社の能力を制限します。
このような困難を克服するために、我々は、真菌の菌糸上での成長及び細菌性バイオフィルムの分析のための方法を報告しています。この方法は、 シュードモナス外生菌根担子菌Laccaria二色 S238Nの菌糸にBBc6をオレッでバイオフィルム形成を研究するために適用されました。これらの二つの森林土壌微生物は、予め混合形成するために記載されましたバイオフィルム状の構造19、20。この方法は、容易に、さらに他の糸状菌/細菌系に適合させることができます。ここで紹介する方法は、LSCMとSEM画像で、非常に薄い真菌のコロニーの増殖を可能にする、真菌の培養法との組み合わせに基づいています。これは、マイクロを得る（μmの範囲）およびメソ（ミリメートルの範囲）バイオフィルムの定性的な特性評価を可能にする、2の微生物間の相互作用の景色をスケーリングするために私達を許可しました。我々はまた、ナノスケールレベル（nM範囲）でのバイオフィルムの構造解析を可能にする、サンプルをSEMで観察することができることを示しました。
Protocol
細菌や真菌培養の作製
- 真菌培養液の調製
- ペトリ皿と同じ直径でセロハン膜を調製し、30分間、EDTA（脱イオン水中1 G / L）でそれらを沸騰。脱イオン水でシートを洗浄し、二度、それらをオートクレーブ。
- EDTA前処理されたセロハン膜で覆われ、適切な寒天培地上での真菌の寒天プラグを接種することにより真菌の前培養を準備します。コロニーを、直径約1cmを得るために最適な成長温度でそれをインキュベートします。
- L.二色 S238Nについては、diNH4酒石酸塩を0.5gからなるPachlewski P5寒天培地上で5日間、25℃でマルトースD 5 G + KH 2 PO 4で洗浄し、MgSO 4・7H 2 Oを0.5g、1gをインキュベート0.27グラム/ Lのモリブデンtrioxyde; 8.45グラム/ Lのホウ酸; 5 G /グルコースD +、10％チアミン塩酸1mlの1/10の希釈微量栄養素溶液（6グラム/ Lの硫酸第一鉄を1mlの20 gでLの男ganese硫酸塩; 5g / Lの硫酸銅。 2.27グラム/ Lの硫酸亜鉛）を脱イオン水で1リットルにしました。寒天の20グラム。 pHは5.5。
- 真菌の前培養から、コロニーの半径方向の拡張を促進するために低炭素寒天培地を含有するEDTA前処理されたセロハン膜で覆われた新しい寒天プレートに接種します。
- ペトリ皿に接種するために、穏やかにメスで前培養からの真菌コロニーの（セルが同じ生理状態を持っている）外部領域を傷つけ、新しい寒天プレートに菌糸を移します。
- 新しいコロニーが直径約1cmになるまで、最適な成長温度でインキュベートします。 L.二色 S238Nについては、（P20寒天培地上で5日間25℃でディン4酒石酸0.25gのそれらをインキュベートし; KH 2 PO 4 0.5gを、 硫酸マグネシウム・7H 2 Oを0.25g;グルコースDを1g + 0.5 mlの10％のチアミン塩酸; 1/10希釈微量栄養素溶液0.5ml（CF 1.1.2。1）、脱イオン水で1リットルにしました。寒天の20グラム。 pHは5.5）。
注：これによりセロハン上の前培養物に、第二文化が中央プラグに寒天培地は含まれません。これらのプラグは、分析にバイアスを作成することができ、寒天や栄養素を導入するので、寒天プラグは、バイオフィルムのさらなる分析のために除去する必要があります。このステップの懸念維持し、伝播寒天プレート上で、それは胞子または凍結ストックから伝播される真菌のためには必要ではないされているだけの真菌種。
- 細菌培養物の調製
- （使用した株に応じて、または任意の他の適切な媒体）に液体ルリア - ベルターニ（LB）培地25mlを適切な寒天培地上で培養物から2〜3個々の細菌コロニーを収集し、接種するために滅菌ループを使用してください。 P.は BBc6をオレッために、穏やかに振とうしながら28℃（〜150 rpm）で一晩培養をインキュベートします。
注：菌株を使用しましたこれは、顕微鏡観察の前に二重染色（真菌や細菌）を行う避けるので、GFPなどの蛍光タンパク質、でタグ付けされた、好ましいです。タイミング、攪拌速度、およびインキュベーションの温度は、使用する菌株、後期指数増殖培養を得るために、ある目標に依存しています。
- （使用した株に応じて、または任意の他の適切な媒体）に液体ルリア - ベルターニ（LB）培地25mlを適切な寒天培地上で培養物から2〜3個々の細菌コロニーを収集し、接種するために滅菌ループを使用してください。 P.は BBc6をオレッために、穏やかに振とうしながら28℃（〜150 rpm）で一晩培養をインキュベートします。
真菌コロニー上の細菌のin vitroバイオフィルムで Nの調製
- 遠心分離機3分間5000×gで細菌培養し、無菌の0.1 Mリン酸カリウム緩衝液（25グラム/ L KH 2 PO 4および2.78グラム/ LK 2 HPO 4、pHは5.8）25mlにペレットを中断すること。一度、この手順を繰り返し、同じ緩衝液で10 9細胞/ mlに最終細菌濃度を調整します。
- 細菌懸濁液（または陰性対照のための滅菌0.1 Mリン酸カリウム緩衝液）5mlで6ウェルマイクロプレートを埋めます。
- フォンのセロファン膜をカット各膜上の単一の真菌コロニーをセロファンの正方形を取得するために滅菌カミソリの刃を持つアル文化。慎重にピンセットを用いて固形培地から菌糸を含むセロファンの正方形を削除し、細菌懸濁液を含むマイクロプレートのウェルにセロハン含む菌糸の正方形を転送します。
- 真菌のコロニーがまだセロハンに添付されていながら、静かにマイクロプレートを振ります。その後、プレートにおける真菌コロニーを残し、セロファンシートを削除します。
- 研究の微生物に適した温度で穏やかに攪拌（〜60回転）でマイクロプレートをインキュベートします。
注：インキュベーション時間を解析するバイオフィルムとステージの確立の速度に依存します。 P.についてBBc6 / Lをオレッ 。二色は、成熟したバイオフィルムを得るために早期のバイオフィルムを取得し、16時間までのために30分間20℃でインキュベートします。
バイオフィルム形式の3レーザー走査共焦点顕微鏡分析イオン
- 試料調製
- 菌糸に静電付着した浮遊性細菌や細菌を除去するには、強力な塩溶液の5ミリリットル（のNaCl、17グラム/ L）17が充填された新しい6ウェルマイクロプレートにそれを転送することにより、菌をすすぎます。静かに1分間振ります。
- 穏やかに2分間振盪、無菌の0.1 Mリン酸カリウム緩衝液5mlを含有する新しい6ウェルマイクロプレートに菌を移し、新鮮なリン酸カリウム緩衝液に菌を移します。
- 取得部は、真菌のコロニーの約半分を含むように、リン酸カリウム緩衝液中でそれを維持しながらメスで撮像される真菌のコロニーの一部を切断します。
- サンプルを染色するために、適切な蛍光色素（分析の目的に応じて）を含有する滅菌水で満たされたペトリ皿にそれを転送し、暗闇の中でそれをインキュベートします。
- 真菌のネットワークを可視化するために、例えば、使用、コンゴレッド（0.1％最終共同アレクサフルオロ633（10 / mlの最終濃度、インキュベーションの10分）またはFUN1（10μMの最終濃度、インキュベーションの10分）に結合ncentration、インキュベーションの5分）、小麦胚芽agglutin（WGA）レクチン。
- 非蛍光タグ化細菌を使用している場合、多数の細胞浸透性DNA色素のうち、DNA特異的蛍光プローブによる細菌細胞は、市販の対比染色。例えば、DAPI（0.25 / mlの最終濃度、インキュベーションの10分）を使用します。
- マトリックスタンパク質を可視化するために、タンパク質染色21を使用します 。
- 染色後、滅菌0.1 Mリン酸カリウムを10mlを含むペトリ皿の蓋にそれを転送することによって、試料をすすぎ、穏やかに1分間振とうします。
- 半分はシャーレのふたでスライドを沈めると微妙にスライドの上に浮いているように切断面をもたらします。そして、ゆっくりとサンプルをそっとスライド上に沈降させ、緩衝溶液からスライドを削除します。
- 最後に、試料に抗退色封入剤の10μlを添加し、カバーガラスでそれをカバーしています。
注意：スライドが用意されると、顕微鏡分析は、バイオフィルムの構造に変更を避けるために（最大でも30分以内）、できるだけ早く実行する必要があります。
- 共焦点顕微鏡分析
- イメージングソフトウェアに結合された10倍または40倍の対物レンズで共焦点レーザー顕微鏡下でスライドを調べます。
注：ここでは、マルチビーム走査型共焦点顕微鏡405、488、及び561 nmの励起レーザ、のGaAsP PMT検出器、および10×0.3 NA及び40X 1.2 NA対物レンズを装備を使用しました。- 要求されたデータの種類に、時間制約に適合したパラメータを用いて撮影を行います。使用汚れに、製造者のrecommendatiに係るレーザ励起/発光波長を使用しますアドオン。真菌のコロニーおよびバイオフィルムの世界的な3Dビューを得るために、タイルのスキャンおよびZ-スタック機能の組み合わせを使用してください。
注： 図3上の画像次のパラメーターを用いて取得した8ビット/ピクセルを、平均= 2、画素滞留= 1.58マイクロ秒、タイルがオンラインステッチ（10％カバレッジ、閾値= 0.7）と5x5の画像のスキャン。 Z-ステップ=2μmです。
- 要求されたデータの種類に、時間制約に適合したパラメータを用いて撮影を行います。使用汚れに、製造者のrecommendatiに係るレーザ励起/発光波長を使用しますアドオン。真菌のコロニーおよびバイオフィルムの世界的な3Dビューを得るために、タイルのスキャンおよびZ-スタック機能の組み合わせを使用してください。
- 3次元データの可視化のために、多くの無料または商用のソフトウェア（これらは3Dレンダリングのための多くのオプションを提供しています）のいずれかを使用します。
- 例えば、明視野チャンネルを減算し、2D最大強度投影としてZスタックデータの表示の明るさとコントラストを調整し、合成画像を作成するためのチャネルをマージします。それらが存在する場合、Zスタックの先端の信号なしにスライスをなくします。その後、2D最大強度投影を行い、RGBカラーに結果を変換します。画像pを得るために、ImageJソフトウェア22に「Zプロジェクト"機能を使用してください2D最大強度の投影によってここに憤慨。
- イメージングソフトウェアに結合された10倍または40倍の対物レンズで共焦点レーザー顕微鏡下でスライドを調べます。
4.電子顕微鏡分析
- ステップ3.1.2で除き、LSCMについて記載したように試料を調製すすぎ工程の後に滅菌水の代わりにリン酸カリウム緩衝液にバイオフィルムを移します。これは、SEM画像を乱すことになる脱水工程時に塩の結晶の形成を回避します。
- 試料ホルダーにバイオフィルムを移し、余分な水分を除去します。サンプルのみをカバーするために水の小さなペリクルを可能にします。
- 可変圧力走査型電子顕微鏡（VP-SEM）のチャンバーにサンプルを移します。ペルチェ冷却ステージ上で-50℃に凍結します。および15時間に設定された可変圧力の100 Paとして、直接SEMチャンバー内に、それはゆっくりと凍結乾燥をすることができます。
- 凍結乾燥が完了した後、サンプルを取り出し、高真空成膜装置にそれを転送します。コートplatinuの2ナノメートルを有するサンプルアルゴンプラズマ（2.5×10 -2ミリバール、35ミリアンペア）下メートル（石英測定）。
- 検出器とは1kVの電子ハイテンション」レンズの「高解像度を使用して、電界放出銃（FEG）を搭載したSEMでコーティングされたサンプルを観察します。
Representative Results
真菌培養及びバイオフィルム製剤の全体の概略手順を、 図1に示されています。培養方法は、私たちは厚手のマイクロおよびメソスケールを可能にする、菌糸のいくつかの層を含む20〜50ミクロンがLSCMを使用して、水和したリビングバイオフィルムの分析真菌コロニーを得ることができました。この方法の適用は、Pの高品質な画像の取得がバイオフィルム（ - 4 図2）の形成に沿っL.の二色菌糸上BBc6のバイオフィルムをオレッ許可しました。
バイオフィルムのメソスケール解析は、Pのバイオフィルムの異種分布はL.バイカラー S238N（ 図2および3）の菌糸にBBc6をオレッ実証しました。時間をかけても、バイオフィルム形成の追跡のために許可されたメソスケール解析（ 図3）初期の段階から、その中で唯一のいくつかの細菌が太い、成熟したバイオフィルム（ 図3b）の形成に、菌糸（ 図3a）に取り付けました。メソスケール画像の高解像度は、私たちは、コロニーアーキテクチャ（ - D 図3c）を得るために、同じ画像上のマイクロスケールの分析を実行することができました。
特異的標識と組み合わせたマイクロスケール解析は、バイオフィルムの特徴付けの更なるステップに行くことができました。ここでは、タンパク質のほとんどのクラスラベルSYPROルビー23は 、（ 図4）の試料に適用し、マトリックス中のタンパク質の存在を示しました。
最後に、バイオフィルム構造の更なる詳細は、脱水及びコーティング（ 図5）後の同じ試料のSEM画像によって得られました。 SEM画像を提供しますナノスケールレベルへのアクセスは、このようにマトリックス構造へのアクセスを与えます。
図1：真菌培養およびバイオフィルム製剤の全体的な概略手順。この図は、分析をサンプリングする微生物の培養物から、この方法の主な手順について説明します。詳しくは、プロトコルに記載されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：真菌のコロニーにBBc6バイオフィルム配分。サンプルは10倍の倍率での相互作用の18時間後に画像化しました。画像は、3D共焦点顕微鏡画像の2D最大値投影を介して得られました。 figu上のグレーのグリッド再モザイク位置を示しています。 L.の二色菌糸コンゴーレッド（赤）で染色し、細菌は、GFPタグ（緑色）されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：L.の二色菌糸上BBc6のバイオフィルム形成の初期と後期。この画像は、3D共焦点顕微鏡画像の2D最大値投影を介して得られました。イメージングは、40Xの倍率で行いました。 （a）は、バイオフィルムは、相互作用の2時間後に再パーティション。相互作用の14時間後（b）のバイオフィルム配分。 （C）（A）の白四角形の拡大。 （D）（B）の白四角形の拡大。 GFP-taの菌糸がコンゴーレッド（赤）と細菌で染色されていますgged（緑）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図 4：L.の二色 菌糸 上BBc6バイオフィルムのマトリックス染色 。 （a）は、相互作用の16時間後にバイオフィルム。 （b）は （A）の白四角形の拡大。イメージングは40X倍率で行い、これらの画像は、3D共焦点顕微鏡画像の2D最大値投影を介して得られました。細菌は、GFPタグ（緑）、真菌がFUN1（ダークグリーン）で染色されており、タンパク質はS.ルビー（赤）で染色されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5：L.の二色菌糸上BBc6バイオフィルムのSEM画像。 SEMイメージングはEHT、2360Xで実施した：1kVの。画像化の前に、試料をゆっくりSEMチャンバ内で凍結乾燥させ、白金で被覆されました。緑の矢印は、細菌性バイオフィルムを指し、黄色の矢印は、真菌の菌糸を指します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Discussion
細菌バイオフィルムは多くの環境で取得され、その24を分析するための多くの方法の開発につながる、1950年代から研究されています。古典的な方法は、定量化し、モニタバイオフィルムをマイクロタイターアッセイと、最も広く使用される方法、クリスタルバイオレット（CV）染色を含みます。これらの方法は、迅速、低コスト、および25を処理するのに容易であり、合計のバイオフィルムのバイオマスを定量化するために、又は生存率およびマトリックス定量アッセイを実行するために特に有用です。一方、「オミクス」の方法は、バイオフィルム26,27の定量的および機能的な分析を可能にする、バイオフィルムの研究にも有用です。マイクロタイタープレートの利点と「オミクス」の方法にもかかわらず、バイオフィルムのいくつかの本質的な特徴は、このプロセスの完全な理解を妨げ、これらの技術を用いて捕捉することはできません。このような特徴は、マトリックス構造を含みます秒、バイオフィルムの機能とその形成のダイナミクスの両方を理解するための重要なデータである細菌コロニーアーキテクチャ、細胞/細胞相互作用、およびコロニー形成パターン。これらの機能をキャプチャする顕微鏡の能力にもかかわらず、糸状菌に対する細菌バイオフィルムの顕微鏡分析はまだ不足しています。これは多くの場合、厚さ、複雑な、三次元ネットワークのコロニーを形成する糸状菌の成長、が主な原因です。菌類上の細菌のバイオフィルムの形成は、多様な環境では一般的であり、様々な分野4（ 例えば 、医療、農業、および環境。）で有意に関与しています。従って、彼らの調査を容易にするための新しい方法を開発することが重要です。この目的のために、我々は、細菌バイオフィルムの顕微鏡イメージングと非常に薄い真菌コロニーを生成するための方法を組み合わせます。また、我々は、定性的に、これらのバイオフィルムを分析するための顕微鏡ツールのセットを提案しました。この方法の成功はに依存しています能力非常に薄い菌糸のコロニーを生成するために、適切な染料を適用します。これらの点については後述します。
バイオフィルムの複雑な構造に、それらの機能を理解することは、マルチスケールアプローチ28、29が必要です。バイオフィルム、細菌コロニーのアーキテクチャ、およびマトリックス構造と組成の分布パターンは、異なるスケール（ すなわち、メソスケール及びマイクロスケール）で分析されています。また、ナノスケールの分解能は、セル/セル物理的相互作用およびマトリックスのナノ構造へのアクセスを可能にします。このように、開発された方法は、簡単に、真菌コロニー上に形成された細菌性バイオフィルムのマルチスケール解析を可能にします。
ほとんどの研究では、LSCMは、バイオフィルムの分析は、マイクロスケールに制限され、メソスケールは、通常、光コヒーレンス断層撮影法30、31によって実行されます
分析のこの組み合わせは、真菌コロニー、開発、バイオフィルムに沿った細菌コロニーのアーキテクチャ、およびマトリックス構造上のバイオフィルムの配分に同時にアクセスを与えました。メソスケールの分析は、真菌コロニー（ 図2および図 3）上の細菌バイオフィルムの異種分布を示しました。この観察は、必ずしもコロニー全体の代表ではない真菌コロニーの小さな部分の撮像を可能にするプロトコルでは不可能でした。このように、一方しばしば無視、メソスケール解析は、バイオフィルム分布パターンに関する貴重な情報を与えることができます。
最後に、開発された方法は、走査型電子顕微鏡法を含む種々の顕微鏡技術、のサンプルを分析するために使用することができます。ここでは、SEMは、ナノスケールに到達すると、バイオフィルム内の細菌の空間的な組織を得るために使用しました。 SEMは、表面のみの撮影を許可しながら、それは、薄い真菌のコロニーと非常によく行きました。 LSCMとは対照的に、SEMは、しかしながら、必要なサンプルの脱水と、ほとんどの場合、導電性の金属でコーティングします。この脱水工程は、それが正しく実行されない場合、生物学的構造を変化させる可能性があり、最適化を必要とし得ます。ここでは、ゆっくりと凍結乾燥を使用したサンプルの脱水は33を使用しました。それにもかかわらず、サンプルにLSCMとSEMの両方を適用すると、サンプルの同じ位置に相関顕微鏡の性能を可能にします。
利点にもかかわらず前述した、いくつかの制限が存在します。第一に、それは菌類のすべての種類に適用できない場合があります。確かに、この培養方法は、固体培地の表面に放射状に広がる真菌のために開発されています。このメソッドは、主に気菌糸を（ 例えば、フザリウム属 ）を形成する菌類または寒天の内側に主に拡散マイクロ好気性菌類に適していないかもしれません。また、セロファンを分解する菌類（ 例えば 、 トリコデルマ種。）も同様に問題となる可能性があります。第二に、染色戦略が重要な点であり、汚れがバイオフィルムを妨害してはならないとして、汚れの選択は、慎重に行わなければならないことに留意することが重要です。例えば、我々はカルコフロアホワイトが原因で、この汚れの高いpHに、（データは示していない）可能性が高い部分バイオフィルムの破壊を引き起こしたことに気づきました。また、いくつかの染料は異質染色を生じ（ 例えば 、コンゴーレッド）、他のものは、均一な染色を生じ、一方（ 例えば 、WGAレクチンによる細胞壁の染色）、異種の画質を与えます。また、いくつかの染料が完全に特異的ではないかもしれないことを認識することが重要です。例えば、WGA汚れだけでなく、真菌の細胞壁が、バイオフィルム形成34,35の間にグラム陽性および陰性菌によって産生されるグラム陽性細菌の細胞壁との付着でもN-アセチルノイラミン酸。そのため、蛍光タンパク質タグ付き細菌および/または真菌を使用すると、複数の染色を避けることをお勧めします。複数の染料を使用する場合、それらは化学的に妨害してはならず、それらの発光スペクトルは重複してはなりません。
メソ規模が大きく、スキャン領域を必要とする分析、したがって、LSCMは、（試料の厚さに応じて、40分、1時間）に時間がかかり、および多数のサンプルの分析をボトルネックができます。それにもかかわらず、調整が必要なデータの種類に応じて行うことができます。画質を変更することによって、取得時間と画像サイズを小さくすることができます。例えば、高解像度バイオフィルムの一般的な配分を分析する必要はありません。
最後に、いくつかの制限は、2Dまたは3Dの突起としてZ-スタックデータを表示するように選択する際に考慮する必要があります。二次元投影は、データを要約するための良い方法ですが、奥行き情報が失われ、重複する構造が隠れになります。一方、3D投影は異なる視点からの可視化を可能にするが、彼らはしばしば、空間の複雑さの場合には不十分なレンダリングします。
結論として、我々は、構造レベルでの菌糸上の細菌のバイオフィルムの特性評価のための方法を報告しています。方法は、他のアプリケーションに拡張することができます。実際、この方法は、真菌の菌糸に形成細菌バイオフィルムの機能的または化学的特性評価のパフォーマンスを可能にします。既存の蛍光レポーター系の多種多様に、LSCM分析は、複数の目的29のために使用することができます。例えば、蛍光マイクroscopyはpH勾配36またはバイオフィルム37中の分子の拡散を監視するために使用することができます。さらに、この方法は、複数種バイオフィルム中のコミュニティ分析を可能にします。例えば、特定の細菌群をターゲットに蛍光in situハイブリダイゼーションは、39複数種の特定の細菌の配分を研究するために特に有用である38バイオフィルム。最後に、多数の蛍光染料は、バイオフィルム21のマトリックス組成物を特徴付けるために使用することができます。ここでは、タンパク質は、タンパク質の大規模な範囲を染色をSypro、それらの間のマトリックスタンパク質（ 図4）を用いて標的が、他の染料は、エキソポリサッカライドまたは細胞外DNAのような他の重要なマトリックス成分の可視化を可能にしました。興味深いことに、すべてのこれらの分析は、記載された方法を用いて、メソスケールで実行することができます。 LSCMの生体サンプルに対して行うことができるので、例えば、薄い真菌コロニーのために特に適したチャンバを、coverwell用いてタイムラプス画像を達成することも可能です。バイオフィルム形成は複雑で動的なプロセスであるため、このオプションは、特に興味深いです。最後に、定量的な目的のために、報告された方法は、メソスケール画像で可能なこの定量化を行うことで、自動定量分析の精度を向上させることができます。これは、バイオフィルムの不均一性と統計的な問題29を克服することができます。
Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 well Falcon Tissue Culture Plates | Fisher Scientific | 08-772-33 | Used in 2.2 & 3.1 |
| Congo Red | Fisher Scientific | C580-25 | Used in 3.1.4.1 |
| FUN 1 Cell Stain | Thermo Fisher Scientific | F7030 | Used in 3.1.4.1 |
| Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 633 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | W21404 | Used in 3.1.4.1 |
| DAPI solution | Thermo Fisher Scientific | 62248 | Used in 3.1.4.2 |
| Propidium iodide | Thermo Fisher Scientific | P3566 | Used in 3.1.4.3 |
| FilmTracer SYPRO Ruby Biofilm Matrix protein Stain | Thermo Fisher Scientific | F10318 | Used in 3.1.4.4 |
| Fluoromount-G Slide Mounting Medium | Fisher Scientific | OB100-01 | Used in 3.1.7 |
| LSM780 Axio Observer Z1 | Zeiss | Used in 3.2.1 | |
| ZEN 2.1 lite black software | Zeiss | Used in 3.2.1 | |
| High Vacuum Coater Leica EM ACE600 | Leica | Used in 4 | |
| GeminiSEM-FEG | Zeiss | Used in 4 |
References
- Frey-Klett, P., Burlinson, P., Deveau, A., Barret, M., Tarkka, M., Sarniguet, A. Bacterial-Fungal Interactions: Hyphens between Agricultural, Clinical, Environmental, and Food Microbiologists. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 75 (4), 583-609 (2011).
- Scherlach, K., Graupner, K., Hertweck, C. Molecular bacteria-fungi interactions: effects on environment, food, and medicine. Annu. Rev. Microbiol. 67, 375-397 (2013).
- Schroeckh, V., Scherlach, K., et al. Intimate bacterial-fungal interaction triggers biosynthesis of archetypal polyketides in Aspergillus nidulans. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (34), 14558-14563 (2009).
- Hogan, D. A., Wargo, M. J., Beck, N. Bacterial Biofilms on Fungal Surfaces. Biofilm mode of life: mechanisms and adaptations. 13, 235-245 (2007).
- Hogan, D. A., Kolter, R. Pseudomonas - Candida interactions: an ecological role for virulence factors. Science. 296 (5576), 2229-2232 (2002).
- Jayasinghearachchi, H. S., Seneviratne, G. Can mushrooms fix atmospheric nitrogen? J. Biosci. 29 (3), 293-296 (2004).
- Seneviratne, G., Zavahir, J. S., Weerasekara, W. M. M. S., Bandara, M. L. M. A. Fungal-bacterial biofilms their development for novel biotechnological applications. World J Microbiol Biotechnol. , 739-743 (2008).
- Herath, H. M. L. I., Upamali, A., Vithanage, M., Seneviratne, G. Developed fungal - bacterial biofilms as a novel tool for bioremoval of hexavelant chromium from wastewater. Chem. Ecol. 00 (0), 1-10 (2014).
- Macedo, A. J., Kuhlicke, U., Neu, T. R., Timmis, K. N., Abraham, W. R. Three stages of a biofilm community developing at the liquid-liquid interface between polychlorinated biphenyls and water. Appl. Environ. Microbiol. 71 (11), 7301-7309 (2005).
- Da Silva, W. J., Seneviratne, J., Samaranayake, L. P., Del Bel Cury, A. A. Bioactivity and architecture of Candida albicans biofilms developed on poly(methyl methacrylate) resin surface. J. Biomed. Mater. Res. - Part B Appl. Biomater. 94 (1), 149-156 (2010).
- Flemming, H., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat. Publ. Gr. 8 (9), 623-633 (2010).
- Cerca, N., Gomes, F., Pereira, S., Teixeira, P., Oliveira, R. Confocal laser scanning microscopy analysis of S. epidermidis biofilms exposed to farnesol, vancomycin and rifampicin. BMC Res. Notes. 5, 244 (2012).
- Lepanto, P., Lecumberry, F., Rossello, J., Kierbel, A. A confocal microscopy image analysis method to measure adhesion and internalization of Pseudomonas aeruginosa multicellular structures into epithelial cells. Mol. Cell. Probes. 28 (1), 1-5 (2014).
- Mueller, L. N., de Brouwer, J. F. C., Almeida, J. S., Stal, L. J., Xavier, J. B. Analysis of a marine phototrophic biofilm by confocal laser scanning microscopy using the new image quantification software PHLIP. BMC Ecol. 6, (2006).
- Murray, J. M. Methods for imaging thick specimens: Confocal microscopy, deconvolution, and structured illumination. Cold Spring Harb. Protoc. 6 (12), 1399-1437 (2011).
- Toljander, J. F., Artursson, V., Paul, L. R., Jansson, J. K., Finlay, R. D. Attachment of different soil bacteria to arbuscular mycorrhizal fungal extraradical hyphae is determined by hyphal vitality and fungal species. FEMS Microbiol. Ecol. 254, 34-40 (2006).
- Brandl, M. T., Carter, M. Q., Parker, C. T., Chapman, M. R., Huynh, S. Salmonella Biofilm Formation on Aspergillus niger Involves Cellulose - Chitin Interactions. PLoS One. 6 (10), (2011).
- Balbontín, R., Vlamakis, H. Mutualistic interaction between Salmonella enterica and Aspergillus niger and its effects on Zea mays colonization. Microb. Biotechnol. Publ. , (2014).
- Frey-Klett, P., Garbaye, J., Tarkka, M. The mycorrhiza helper bacteria revisited. New Phytol. 176 (1), 22-36 (2007).
- Deveau, A., Brulé, C., et al. Role of fungal trehalose and bacterial thiamine in the improved survival and growth of the ectomycorrhizal fungus Laccaria bicolor S238N and the helper bacterium Pseudomonas fluorescens BBc6R8. Environ. Microbiol. Rep. 2 (4), 560-568 (2010).
- Neu, T. R., Lawrence, J. R. Advanced Techniques for In Situ Analysis of the Biofilm Matrix (Structure, Composition, Dynamics) by Means of Laser Scanning Microscopy. Methods Mol. Biol. 1147, 43-64 (2014).
- Rasband, W. S. imagej. , Available from: http://imagej.nih.gov/ij (2016).
- Berggren, K. N., Schulenberg, B., et al. An improved formulation of SYPRO Ruby protein gel stain: Comparison with the original formulation and with a ruthenium II tris (bathophenanthroline disulfonate) formulation. Proteomics. 2 (5), 486-498 (2002).
- Pantanella, F., Valenti, P., Natalizi, T., Passeri, D., Berlutti, F. Analytical techniques to study microbial biofilm on abiotic surfaces: pros and cons of the main techniques currently in use. Ann. di Ig. 25 (1), 31-42 (2013).
- Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J. Vis. Exp. (47), (2011).
- Azevedo, N. F., Lopes, S. P., Keevil, C. W., Pereira, M. O., Vieira, M. J. Time to "go large" on biofilm research: Advantages of an omics approach. Biotechnol. Lett. 31 (4), 477-485 (2009).
- Koerdt, A., Orell, A., et al. Macromolecular fingerprinting of Sulfolobus species in biofilm: A transcriptomic and proteomic approach combined with spectroscopic analysis. J. Proteome Res. 10 (9), 4105-4119 (2011).
- Morgenroth, E., Milferstedt, K. Biofilm engineering: Linking biofilm development at different length and time scales. Rev. Environ. Sci. Biotechnol. 8 (3), 203-208 (2009).
- Neu, T. R., Lawrence, J. R. Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales. Trends Microbiol. 23 (4), 233-242 (2015).
- Xi, C., Marks, D., Schlachter, S., Luo, W., Boppart, S. A. High-resolution three-dimensional imaging of biofilm development using optical coherence tomography. J. Biomed. Opt. 11 (3), 34001 (2006).
- Janjaroen, D., Ling, F., et al. Roles of ionic strength and biofilm roughness on adhesion kinetics of Escherichia coli onto groundwater biofilm grown on PVC surfaces. Water Res. 47 (7), 2531-2542 (2013).
- Derlon, N., Koch, N., et al. Activity of metazoa governs biofilm structure formation and enhances permeate flux during Gravity-Driven Membrane (GDM) filtration. Water Res. 47 (6), 2085-2095 (2013).
- Karcz, J., Bernas, T., Nowak, A., Talik, E., Woznica, A. Application of lyophilization to prepare the nitrifying bacterial biofilm for imaging with scanning electron microscopy. Scanning. 34 (1), 26-36 (2012).
- Burton, E., Yakandawala, N., LoVetri, K., Madhyastha, M. S. A microplate spectrofluorometric assay for bacterial biofilms. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 34 (1), 1-4 (2007).
- Berne, C., Ducret, A., Hardy, G. G., Brun, Y. V. Adhesins Involved in Attachment to Abiotic Surfaces by Gram-Negative Bacteria. Microbiol. Spectr. 3 (4), 1-45 (2015).
- Schlafer, S., Garcia, J. E., Greve, M., Raarup, M. K., Nyvad, B., Dige, I. Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms with C-SNARF-4. Appl. Environ. Microbiol. 81 (4), 1267-1273 (2015).
- Daddi Oubekka, S., Briandet, R., Fontaine-Aupart, M. P., Steenkeste, K. Correlative time-resolved fluorescence microscopy to assess antibiotic diffusion-reaction in biofilms. Antimicrob. Agents Chemother. 56 (6), 3349-3358 (2012).
- Almeida, C., Azevedo, N. F., Santos, S., Keevil, C. W., Vieira, M. J. Discriminating multi-species populations in biofilms with peptide nucleic acid fluorescence in situ hybridization (PNA FISH). PLoS One. 6 (3), (2011).
- Malic, S., Hill, K. E., Hayes, A., Percival, S. L., Thomas, D. W., Williams, D. W. Detection and identification of specific bacteria in wound biofilms using peptide nucleic acid fluorescent in situ hybridization (PNA FISH). Microbiology. 155 (8), 2603-2611 (2009).
