Summary
Este protocolo describe un nuevo método para hacer crecer y cualitativamente analizar biopelículas bacterianas en hifas de los hongos por microscopía confocal y electrónica.
Abstract
Los biofilms bacterianos con frecuencia se forman en las superficies de hongos y pueden estar implicados en numerosos procesos de interacción bacterianas de las infecciones fúngicas, como la cooperación metabólica, la competencia o la depredación. El estudio de las biopelículas es importante en muchos campos de la biología, incluyendo la ciencia del medio ambiente, la producción de alimentos y medicinas. Sin embargo, pocos estudios se han centrado en tales biopelículas bacterianas, en parte debido a la dificultad de la investigación de ellos. La mayoría de los métodos para biofilm análisis cualitativos y cuantitativos descritos en la literatura son sólo es adecuado para las biopelículas se forman en superficies abióticas o bióticas en superficies homogéneas y delgadas, como una monocapa de células epiteliales.
Mientras que la microscopía confocal de barrido láser (LSCM) se utiliza a menudo para analizar in situ e in vivo biopelículas, esta tecnología se convierte en un gran reto cuando se aplica a las biopelículas bacterianas en hifas de los hongos, debido al grosor y las tres dimensiones de la red propia de hifasorkos. Para superar este inconveniente, hemos desarrollado un protocolo que combina la microscopía con un método para limitar la acumulación de capas de hifas en las colonias de hongos. Usando este método, hemos sido capaces de investigar el desarrollo de biopelículas bacterianas en hifas de los hongos en múltiples escalas utilizando microscopía electrónica de barrido y LSCM (SEM). Este informe describe el protocolo, incluyendo cultivos de microorganismos, las condiciones de formación de biopelículas bacterianas, tinción de biopelículas, y LSCM y visualizaciones SEM.
Introduction
Los hongos y las bacterias tienen muchas oportunidades de interactuar unos con otros, ya que cohabitan en la mayoría de los ambientes terrestres. Debido a su diversidad y su ubicuidad, estas interacciones son importantes en muchos campos biológicos, incluida la biotecnología, la agricultura, procesamiento de alimentos, y la medicina 1, 2. Las interacciones moleculares requieren un cierto grado de proximidad para permitir los intercambios entre los socios, y en algunos casos, una asociación física de los interlocutores es necesaria para una interacción funcional 3. Una asociación física común entre las bacterias y los hongos es la formación de biopelículas bacterianas en las superficies de hongos 4. Este contacto directo entre las células bacterianas y las hifas fúngicas permite interacciones íntimas que están implicados en diversos procesos biológicos. Por ejemplo, en la medicina, el estudio de la formación de biopelículas de Pseudomonas aeruginosa en la oportunistas hongo patógeno Candida albicans podrían ayudar a comprender la relación entre la formación de biopelículas y la virulencia 5. En la agricultura, los estudios sugieren que crecimiento de las plantas rizobacterias promotoras y de control biológico bacterias tienen una mayor eficiencia cuando se asocia con un hongo en un biofilm mixta. Por ejemplo, Bradyrhizobium elkanii han mejorado la actividad -Fijación N2 cuando se asocia con Pleurotus ostreatus en un biofilm mixta 6. Por último, en biorremediación, las biopelículas bacterianas mixtas-hongos se han utilizado para la remediación de sitios contaminados 7, 8.
LSCM es particularmente adecuado para estudiar las biopelículas ya que permite una observación tridimensional de biofilms hidratado con tratamientos previos mínimos de vida, manteniendo de este modo la estructura y organización biofilm. Por lo tanto, el análisis de biopelículas por LSCM es muy informativo, especialmente en DetERMINE el curso temporal de la formación de biopelículas y la detección de etapas características 9, 10, de la etapa de adhesión para el desarrollo de una biopelícula madura. También está particularmente adaptado para visualizar la estructura de biopelículas y la matriz 11, 12 o para cuantificar el tamaño de biofilm 13, 14. Aunque este método es adecuado para estudiar biofilms en superficies abióticas o bióticas delgadas, el estudio de la biopelícula bacteriana en una colonia fúngica filamentosa es todavía muy difícil. De hecho, la mayoría de los hongos filamentosos construir redes gruesas y complejas, tridimensionales en cultivo. Incluso si los objetos gruesos se pueden obtener imágenes por microscopía confocal, la atenuación de la penetración del láser y la emisión de fluorescencia a menudo disminuyen la calidad de las imágenes finales sobre una profundidad de 50 micras 15. Por otra parte, debido a las colonias de hongos no son rígidos, it es difícil de manejar los microorganismos sin alterar las biopelículas. Debido al espesor de las muestras, los pocos análisis microscópicos de las biopelículas bacterianas en hifas de los hongos en general sólo se llevan a cabo en una pequeña parte de la colonia de hongos, por lo tanto, que contiene sólo unos pocos hifas 16, 17, 18. Todo esto limita nuestra capacidad para describir la distribución de biofilm en la colonia de hongos y por lo tanto puede llevar sesgos en el análisis en el caso de la distribución heterogénea de la biopelícula dentro de la colonia de hongos.
Para superar estas dificultades, se presenta un método para el crecimiento y el análisis de la biopelícula bacteriana en hifas de los hongos. Se aplicó este método para estudiar la formación de biopelículas de Pseudomonas fluorescens BBC6 en las hifas del basidiomiceto ectomicorrízica Laccaria bicolor S238N. Estos dos microorganismos del suelo forestal fueron descritas anteriormente para formar mixtabiofilm-como las estructuras 19, 20. Este método puede ser fácilmente adaptado, además, a otros sistemas de hongos / bacterias filamentosas. El método que aquí se presenta se basa en la combinación de un método de cultivo de hongos, lo que permite el crecimiento de colonias de hongos muy delgadas, con LSCM y la imagen SEM. Esto nos permitió obtener micro- (rango de micras) y meso (rango de mm) escalar puntos de vista de la interacción entre los dos microorganismos, lo que permite la caracterización cualitativa de la biopelícula. También puso de manifiesto que las muestras se pueden observar con SEM, permitiendo el análisis estructural de la biopelícula en el nivel de nanoescala (rango nm).
Protocol
1. Preparación de cultivos de bacterias y hongos
- Preparación de cultivos de hongos
- Preparar membranas de celofán con el mismo diámetro que las placas de Petri y hervir en EDTA (1 g / L en agua desionizada) durante 30 min. Enjuague las hojas con agua desionizada y se esterilice en autoclave dos veces.
- Preparar un pre-cultivo de hongos mediante la inoculación de agar hongos enchufes en el medio de agar apropiado cubierto con una membrana de celofán EDTA pre-tratada. Incubar a la temperatura de crecimiento óptima para obtener colonias de aproximadamente 1 cm de diámetro.
- Para L. S238N bicolor, se incuba a 25 ° C durante 5 días en medio de agar Pachlewski P5, hechos de 0,5 g de tartrato de diNH4, 1 g de KH 2 PO 4, 0,5 g de MgSO 4 .7H 2 O, 5 g de maltosa D + , 20 g de glucosa D +, 1 ml de 10% de tiamina-HCl, 1 ml de solución diluida 1/10 de micronutrientes (6 g / L de sulfato ferroso; 0,27 g / L de molibdeno trioxyde; 8,45 g / L de ácido bórico; 5 g / L hombresulfato de manganeso; 5 g / l de sulfato cúprico; 2,27 g / l de sulfato de zinc) hizo hasta 1 L con agua desionizada; y 20 g de agar; pH 5,5.
- Desde el pre-cultivo de hongos, inocular una nueva placa de agar cubiertos con la membrana de celofán EDTA pre-tratada que contiene un medio de agar de bajo carbono para promover la expansión radial de las colonias.
- Para inocular la placa de Petri, rayar suavemente la zona externa (donde las células tienen el mismo estado fisiológico) de una colonia de hongos de la pre-cultivo con un escalpelo y la transferencia de las hifas a la nueva placa de agar.
- Incubar a la temperatura óptima de crecimiento hasta que las nuevas colonias son de aproximadamente 1 cm de diámetro. Para L. S238N bicolor, incubarlos a 25 ° C durante 5 días en medio de agar P20 (0,25 g de 4 Dinh tartrato; 0,5 g de KH 2 PO 4; 0,25 g de MgSO 4 .7H 2 O; 1 g de glucosa D + ; 0,5 ml de 10% de tiamina-HCl, 0,5 ml de solución de micronutrientes 1/10 diluido (cf 1.1.2.1), hecho hasta 1 L con agua desionizada; y 20 g de agar; pH 5,5).
Nota: Debido a la pre-cultivo en celofán, la segunda cultura no contendrá medios de agar en los tapones centrales. Los tapones de agar deben ser retirados para su posterior análisis de las biopelículas, ya que estos tapones introducen agar y nutrientes que pueden crear sesgos en el análisis. Este paso sólo se refiere a las especies fúngicas que se mantienen y se propagaron en placas de agar, y no es necesario para los hongos que se propagan a partir de esporas o material congelado.
- Preparación de los cultivos bacterianos
- Use un asa estéril para recoger 2 a 3 colonias de bacterias individuales a partir de un cultivo en el medio de agar apropiado e inocular 25 ml de medio líquido Luria-Bertani (LB) (o cualquier otro medio apropiado, dependiendo de la cepa utilizada). Para P. fluorescens BBC6, incubar un cultivo nocturno a 28 ° C con agitación suave (~ 150 rpm).
Nota: El uso de una cepaetiquetadas con proteína fluorescente, tal como GFP, es preferible, ya que esto evita la realización de una doble tinción (hongos y bacterias) antes de las observaciones microscópicas. El momento, la velocidad de agitación, y la temperatura de la incubación depende de la cepa utilizada, con el objetivo de obtener un cultivo en crecimiento exponencial tardía.
- Use un asa estéril para recoger 2 a 3 colonias de bacterias individuales a partir de un cultivo en el medio de agar apropiado e inocular 25 ml de medio líquido Luria-Bertani (LB) (o cualquier otro medio apropiado, dependiendo de la cepa utilizada). Para P. fluorescens BBC6, incubar un cultivo nocturno a 28 ° C con agitación suave (~ 150 rpm).
2. Preparación de N In Vitro Biofilm de bacterias en la colonia de hongos
- Centrifugar el cultivo bacteriano a 5000 xg durante 3 min y suspender el sedimento en 25 ml de tampón estéril 0,1 M fosfato de potasio (25 g / L KH 2 PO 4 y 2,78 g / LK 2 HPO 4, pH 5,8). Repita este paso una vez y ajustar la concentración bacteriana final a 10 9 células / ml con el mismo tampón.
- Llenar una microplaca de 6 pocillos con 5 ml de la suspensión bacteriana (o tampón estéril 0,1 M de fosfato de potasio para el control negativo).
- Cortar la membrana de celofán de la Fungcultura al con una cuchilla de afeitar estéril para obtener cuadrados de celofán con una sola colonia de hongos en cada membrana. Retirar con cuidado las plazas de celofán que contienen hifas del medio sólido con unas pinzas y transferir el cuadrado de celofán que contiene hifas a un pocillo de la microplaca que contenía la suspensión bacteriana.
- Agitar suavemente la microplaca mientras que las colonias de hongos todavía están unidos a la celofán; a continuación, quitar las láminas de celofán, dejando las colonias de hongos en la placa.
- Incubar la microplaca con agitación suave (~ 60 rpm) a una temperatura adaptada a los microorganismos estudiados.
Nota: El tiempo de incubación depende de la velocidad de establecimiento de la biopelícula y la etapa a analizar. Para P. fluorescens BBC6 / L. bicolor, se incuba a 20 ° C durante 30 minutos para conseguir las biopelículas en fase inicial y hasta 16 horas para obtener madurar biopelículas.
3. láser confocal de barrido Microscopía Análisis del Formato de biopelículasion
- preparación de la muestra
- Para eliminar las bacterias planctónicas y bacterias electrostáticamente unidos a la hifas, enjuague el hongo mediante la transferencia a una nueva microplaca de 6 pocillos llena de 5 ml de una solución de sal fuerte (NaCl, 17 g / L) 17; agite suavemente durante 1 min.
- Transferir el hongo a una nueva microplaca de 6 pocillos que contiene 5 ml de tampón de fosfato de potasio 0,1 M estéril, agitar suavemente durante 2 min, y transferir el hongo a tampón de fosfato de potasio fresco.
- Cortar la parte de la colonia de hongos para formar una imagen con un bisturí mientras que lo mantiene en el tampón fosfato de potasio, de manera que la sección obtenido contiene aproximadamente la mitad de la colonia de hongos.
- Para la tinción de la muestra, la transferencia a una placa de Petri llena de agua estéril que contiene un colorante fluorescente apropiado (dependiendo de la finalidad del análisis), y se incuba en la oscuridad.
- Para visualizar la red de hongos, usar, por ejemplo, Rojo Congo (0,1% de co definitivancentration, 5 min de incubación), agglutin germen de trigo (WGA) lectina conjugada con Alexa Fluor 633 (10 mg concentración final / ml, 10 min de incubación) o FUN1 (10 mM de concentración final, 10 minutos de incubación).
- Si el uso de una bacteria no fluorescente de etiquetado, de contraste de las células bacterianas con una sonda fluorescente específica de ADN entre los numerosos colorantes de ADN de células permeante disponibles comercialmente. Por ejemplo, utilizar DAPI (0,25 mg / ml de concentración final, 10 minutos de incubación).
- Para visualizar las proteínas de la matriz, utilizar una tinción de proteínas 21.
- Después de la tinción, enjuague la muestra, transfiriéndolos a una tapa de placa de Petri que contiene 10 ml de fosfato potásico 0,1 M estéril y agitar suavemente durante 1 min.
- La mitad sumergir una diapositiva en la tapa de la placa de Petri y delicadamente llevar la sección de corte flotar por encima de la diapositiva. A continuación, retire lentamente el portaobjetos de la solución tampón, dejando que la muestra se asiente suavemente en la diapositiva.
- Por último, añadir 10 l de anti-fading medio de montaje de la muestra y se cubre con un cubreobjetos de vidrio.
Nota: Una vez que se prepara la diapositiva, el análisis microscópico deberá realizarse tan pronto como sea posible (el plazo máximo de 30 minutos) para evitar la modificación en la estructura del biofilm.
- Análisis microscópico confocal
- Examinar los portaobjetos en un microscopio láser confocal con una lente objetivo de 10X o 40X acoplado a un software de imagen.
Nota: En este caso, un microscopio confocal de barrido multihaz equipado con 405, 488 y 561 nm de excitación rayos láser, un detector Gaasp PMT y 10X 0,3 NA y 40X 1.2 Objetivos de NA se utilizó.- Realizar las imágenes utilizando los parámetros adecuados al tipo de datos que se solicitan y las limitaciones de tiempo. Utilice longitudes de onda de excitación / emisión de láser de acuerdo con la mancha utilizado y a recommendati del fabricanteons. Use una combinación de exploración baldosas y las funciones Z-pila para obtener visiones globales 3D de la colonia de hongos y las biopelículas.
Nota: Las imágenes en la figura 3 fueron adquiridos utilizando los siguientes parámetros: 8 bits / píxel, con un promedio = 2, permanencia píxel = 1,58 microsegundos, baldosas de barrido de imágenes de 5x5 con costuras en línea (10% de cobertura, el umbral = 0,7); Z-paso = 2 m.
- Realizar las imágenes utilizando los parámetros adecuados al tipo de datos que se solicitan y las limitaciones de tiempo. Utilice longitudes de onda de excitación / emisión de láser de acuerdo con la mancha utilizado y a recommendati del fabricanteons. Use una combinación de exploración baldosas y las funciones Z-pila para obtener visiones globales 3D de la colonia de hongos y las biopelículas.
- Para la visualización de datos en 3D, utilice uno de los muchos softwares libres o comerciales (estos ofrecen muchas opciones para 3D).
- Por ejemplo, para mostrar datos Z-stack como proyecciones de máxima intensidad en 2D, restar el canal de campo brillante, ajustar el brillo y el contraste, y combinar los canales para crear una imagen compuesta. Si están presentes, sin eliminar las rebanadas de la señal en las extremidades Z-stack. A continuación, realice una proyección de máxima intensidad 2D y convertir el resultado en color RGB. Utilice la función "Proyecto Z" en el software ImageJ 22 para obtener las imágenes presentido aquí por proyecciones de máxima intensidad en 2D.
- Examinar los portaobjetos en un microscopio láser confocal con una lente objetivo de 10X o 40X acoplado a un software de imagen.
4. Electron análisis de microscopía
- Preparar las muestras como se describe para LSCM, excepto en el paso 3.1.2, la transferencia de los biofilms a agua estéril en lugar de tampón de fosfato de potasio después de las etapas de aclarado. Esto evita la formación de cristales de sal durante la etapa de deshidratación, lo que perturba la imagen SEM.
- La transferencia de los biofilms a un soporte de muestra y eliminar el exceso de agua; sólo permiten una pequeña película de agua para cubrir la muestra.
- Transferir la muestra a la cámara de un microscopio electrónico de barrido a la presión variable (VP-SEM); congelar a -50 ° C en una etapa de enfriamiento Peltier; y permita que se congele-seca lentamente, directamente en la cámara de SEM, con 100 Pa de presión variable fijado durante 15 horas.
- Después de completar la liofilización, recuperar la muestra y la transfiere en un sistema de deposición de película de alto vacío. Escudo de la muestra con 2 nm de Platinum (medición de cuarzo) en plasma de argón (2,5 x 10 -2 mbar, 35 mA).
- Observa la muestra recubierta con un SEM equipado con un cañón de emisión de campo (FEG) usando "lente" detector de la alta resolución y una alta tensión electrónica de 1 kV.
Representative Results
El procedimiento esquemática general de cultivo de hongos y la preparación biofilm se da en la Figura 1. El método de cultivo nos ha permitido obtener colonias de hongos de 20 a 50 micras de espesor que contienen unas pocas capas de hifas, lo que permite micro y meso-escala de análisis de biopelícula de estar hidratado utilizando LSCM. La aplicación del método permite la adquisición de imágenes de alta calidad de P. fluorescens biofilms BBC6 en L. hifas bicolor a lo largo de la formación de la biopelícula (Figuras 2 - 4).
El análisis meso-escala de los biofilms demostró la distribución heterogénea de la biopelícula de P. fluorescens BBC6 en las hifas de L. bicolor S238N (Figuras 2 y 3). El análisis meso-escala también permitió el seguimiento de la formación de biopelículas en el tiempo (Figura3) a partir de los primeros pasos, en la que sólo algunas bacterias se unen a las hifas (Figura 3a), a la formación de una gruesa, biofilm maduro (Figura 3b). La alta resolución de las imágenes meso-escala nos permitió realizar el análisis de micro-escala sobre las mismas imágenes con el fin de obtener las arquitecturas de colonias (Figura 3c - d).
El análisis de micro-escala combinada con el etiquetado específico nos ha permitido dar un paso más en la caracterización de biopelículas. Aquí, SYPRO Rubí 23, que las etiquetas de la mayoría de las clases de proteínas, se aplicó a las muestras (Figura 4) y muestra la presencia de proteínas en la matriz.
Por último, más detalles de la estructura de la biopelícula se obtuvieron mediante SEM de formación de imágenes de la misma muestra después de la deshidratación y de revestimiento (Figura 5). imágenes SEM proporcionadoacceso al nivel de nanoescala, dando así acceso a la estructura de la matriz.
Figura 1: Procedimiento general esquemática de cultivo de hongos y la preparación de biopelículas. Esta figura describe los principales pasos del método, a partir de cultivos de microorganismos a la muestra de análisis. Se dan más detalles en el protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: BBC6 reparto biofilm en la colonia de hongos. La muestra fue fotografiada después de 18 horas de interacción a un aumento de 10X. La imagen fue obtenida a través de 2D proyección de intensidad máxima de 3D de imágenes de microscopía confocal. La rejilla gris en la figure representa las posiciones de mosaico. L. bicolor hifas se tiñen con rojo Congo (rojo) y las bacterias son marcado con GFP (verde). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Las etapas tempranas y tardías de la formación de biopelículas en BBC6 L. hifas bicolor. Esta imagen fue obtenida a través de 2D proyección de intensidad máxima de 3D de imágenes de microscopía confocal. Imaging se realizó a 40 aumentos. (A) Las biopelículas reparto después de 2 horas de interacción. (B) reparto de biopelículas después de 14 h de interacción. (C) La ampliación del rectángulo blanco en (a). (D) La ampliación del rectángulo blanco en (b). hifas de los hongos se tiñen con rojo Congo (rojo) y las bacterias son GFP-tagged (verde). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Matriz de tinción BBC6 biopelícula sobre las hifas L. bicolor. (A) Las biopelículas después de 16 horas de interacción. (B) ampliación del rectángulo blanco en (a). Imaging se realizó a 40 aumentos, y estas imágenes se obtuvieron a través de 2D proyección de intensidad máxima de 3D de imágenes de microscopía confocal. Las bacterias son marcado con GFP (verde), el hongo se tiñe con Fun1 (verde oscuro), y las proteínas se tiñeron con S. Ruby (rojo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: SEM imágenes de biofilms en BBC6 L. hifas bicolor. SEM de imágenes se realizó a 2360X, EHT: 1 kV. Antes de formación de imágenes, la muestra se lentamente se liofilizó en la cámara de SEM y se recubre con platino. Las flechas verdes indican las biopelículas bacterianas y las flechas amarillas indican las hifas fúngicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Biofilms bacterianos se recuperaron en muchos entornos y se han estudiado desde los años 1950, lo que lleva al desarrollo de una serie de métodos para analizar los 24. Los métodos clásicos para cuantificar y biopelículas monitor incluyen ensayos de microtitulación y, el método más ampliamente utilizado, cristal violeta (CV) tinción. Estos métodos son rápidos, de bajo coste, y fácil de manejar 25 y son particularmente útiles para cuantificar la biomasa total biofilm o para llevar a cabo los ensayos de viabilidad y de cuantificación de matriz. Por otro lado, los métodos "ómicas" también son útiles en estudios de biopelícula, lo que permite el análisis cuantitativo y funcionales de biofilms 26, 27. A pesar de las ventajas de la placa de microtitulación y métodos "ómicas", varias características esenciales de las biopelículas no pueden ser capturados con estas técnicas, lo que dificulta una comprensión completa de este proceso. Tales características incluyen la estructura de la matrizs, arquitecturas de colonias bacterianas, las interacciones célula / célula, y los patrones de colonización, que son datos clave para entender tanto el funcionamiento de las biopelículas y la dinámica de su formación. A pesar de la capacidad de la microscopía para capturar estas características, el análisis de microscopía de biopelículas bacterianas en hongos filamentosos son todavía escasos. Esto se debe principalmente al crecimiento de hongos filamentosos, que a menudo forma colonias de gruesas redes, complejos, tridimensionales. La formación de biopelículas bacterianas en los hongos es común en ambientes diversos y participa significativamente en diversos campos 4 (por ejemplo, la medicina, la agricultura y el medio ambiente.); por lo tanto, es fundamental para desarrollar nuevos métodos para facilitar su investigación. Con este fin, se combinaron un método para generar colonias de hongos muy delgadas con imágenes microscópicas de las biopelículas bacterianas. Además, hemos propuesto un conjunto de herramientas de microscopía para analizar cualitativamente los biofilms. El éxito del método se basa enla capacidad de producir colonias de hifas muy delgadas y para aplicar los colorantes apropiados. Estos puntos se discuten a continuación.
Debido a las complejas estructuras de las biopelículas, la comprensión de su función requiere un enfoque multi-escala de 28, 29. Patrones de distribución de las biopelículas bacterianas, arquitectura colonia, y la estructura de la matriz y la composición se analizan en diferentes escalas (es decir, meso-escala y micro-escala). Por otra parte, la resolución nanoescala permite el acceso a las interacciones físicas célula / célula y la nano-estructura de la matriz. Por lo tanto, el método desarrollado permite fácilmente un análisis multi-escala de las biopelículas bacterianas formadas en la colonia de hongos.
En la mayoría de los estudios, análisis LSCM de las biopelículas se limitan a la micro-escala, la escala media por lo general se realiza mediante tomografía de coherencia óptica 30, 31,
Esta combinación de análisis dio acceso concomitante a la repartición biofilm en la colonia de hongos, la arquitectura colonia bacteriana a lo largo del desarrollo de la biopelícula, y la estructura de la matriz. El análisis meso escala mostró una distribución heterogénea de las biopelículas bacterianas de las colonias de hongos (Figuras 2 y 3). Esta observación no habría sido posible con los protocolos que sólo permiten la formación de imágenes de una pequeña parte de la colonia de hongos, que no es necesariamente representativos de toda la colonia. Así, mientrasa menudo se descuida, el análisis de escala intermedia puede dar información valiosa acerca de los patrones de distribución de biopelículas.
Finalmente, el método desarrollado puede ser utilizado para analizar muestras con diferentes técnicas de microscopía, incluyendo microscopía electrónica de barrido. Aquí, SEM se utilizó para llegar a la escala nanométrica y de obtener la organización espacial de bacterias dentro de la biopelícula. Se lleva a cabo muy bien con las colonias de hongos delgadas, mientras que sólo se permite SEM de formación de imágenes de la superficie. En contraste con LSCM, SEM, sin embargo, la deshidratación de la muestra requerida y, lo más a menudo, el recubrimiento con un metal conductor. Este proceso de deshidratación puede alterar estructuras biológicas cuando no se ejecuta correctamente y puede requerir la optimización. En este caso, se utilizó la deshidratación de la muestra mediante liofilización lenta 33. Sin embargo, la aplicación de ambos LSCM y SEM de las muestras permitirá que el rendimiento de la microscopía correlativa en el mismo lugar de la muestra.
A pesar de las ventajasdescrito anteriormente, existen algunas limitaciones. En primer lugar, puede que no sea aplicable a todo tipo de hongos. De hecho, se ha desarrollado este método de cultivo para los hongos se extienden radialmente en la superficie de los medios sólidos. Este método puede no ser adecuado para los hongos que forman hifas principalmente aérea (por ejemplo, Fusarium sp.) O para los hongos micro-aeróbico se extienden principalmente en el interior de agar. Por otra parte, los hongos degradantes celofán puede ser problemático también (por ejemplo., Trichoderma sp.). En segundo lugar, es importante señalar que la estrategia de tinción es un punto crítico y la elección de la mancha se debe hacer con cuidado, ya que la mancha no debe perturbar el biofilm. Por ejemplo, hemos observado que Calcofluor blanca causó la interrupción del biofilm parcial (datos no mostrados), probablemente debido al alto pH de esta mancha. Además, algunos colorantes producen tinción heterogénea (por ejemplo., Congo Red), mientras que otros producen tinción homogénea (por ejemplo., La tinción de la pared celular con WGA lectina), dando una calidad de imagen heterogénea.Por otra parte, es importante tener en cuenta que algunos colorantes pueden no ser totalmente específica. Por ejemplo, WGA manchas no sólo las paredes celulares de los hongos pero el ácido también N-acetilneuramínico en las paredes celulares bacterianas gram-positivas y adhesinas producidas por bacterias gram-positivos y negativos durante la formación de biofilm 34, 35. Por lo tanto, el uso de bacterias en proteínas etiquetadas fluorescentes y / o se recomienda hongos para evitar múltiples manchas. Si se usan múltiples colorantes, no deben interferir químicamente, y sus espectros de emisión no deben solaparse.
Meso escala análisis requieren una gran área escaneada, y por lo tanto, LSCM puede llevar mucho tiempo (40 min a 1 hr, dependiendo del espesor de la muestra) y cuello de botella el análisis de un gran número de muestras. No obstante, se pueden hacer ajustes en función del tipo de datos requeridos. Es posible reducir el tiempo de adquisición y el tamaño de la imagen mediante la alteración de la calidad de imagen. Por ejemplo, de alta resoluciónNo es necesario analizar el reparto general de la biopelícula.
Por último, algunas limitaciones deben tenerse en cuenta al elegir para mostrar los datos de la pila Z- como proyecciones en 2D o 3D. proyecciones bidimensionales son una buena manera de resumir los datos, pero la información de profundidad se pierde, y las estructuras superpuestas se ocultan. Por otra parte, las proyecciones 3D permiten la visualización desde diferentes puntos de vista, pero que a menudo hacen poco en caso de complejidad espacial.
En conclusión, se ha informado de un método para la caracterización de las biopelículas bacterianas en las hifas a nivel estructural. La metodología se puede extender a otras aplicaciones. De hecho, este método permite que el rendimiento de la caracterización funcional o química de las biopelículas bacterianas que forman en hifas de los hongos. Debido a la gran variedad de sistemas indicadores fluorescentes existentes, el análisis LSCM se puede utilizar para múltiples propósitos 29. Por ejemplo, el micrófono de fluorescenciaroscopy podría ser utilizado para monitorear gradiente de pH 36 o difusión molécula en biofilms 37. Además, el método permite el análisis de la comunidad en las biopelículas de múltiples especies. Por ejemplo, hibridación in situ fluorescente dirigida a grupos específicos de bacterias es particularmente útil para estudiar la repartición bacteriana específica en múltiples especies biofilms 38, 39. Últimos, numerosos tintes fluorescentes se pueden utilizar para caracterizar la composición de la matriz de las biopelículas 21. Aquí, las proteínas se dirigen usando Sypro, que tiñe una amplia gama de proteínas, entre ellos proteínas de la matriz (Figura 4), pero otros colorantes permiten la visualización de los otros constituyentes de la matriz importantes, tales como exopolisacáridos o el ADN extracelular. Curiosamente, todos estos análisis podrían ser realizadas en la meso-escala usando el método descrito. Desde LSCM se puede realizar en muestras de vida,También es posible conseguir imágenes de lapso de tiempo utilizando, por ejemplo, cámaras, particularmente idónea para las colonias de hongos delgadas coverwell. Esta opción es particularmente interesante, ya que la formación de biopelículas es un proceso complejo y dinámico. Por último, para un propósito cuantitativa, el método reportado puede mejorar la precisión de análisis cuantitativo automático al hacer esta cuantificación posible en las imágenes meso escala. Esto puede superar la heterogeneidad de biopelículas y temas estadísticos 29.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 well Falcon Tissue Culture Plates | Fisher Scientific | 08-772-33 | Used in 2.2 & 3.1 |
| Congo Red | Fisher Scientific | C580-25 | Used in 3.1.4.1 |
| FUN 1 Cell Stain | Thermo Fisher Scientific | F7030 | Used in 3.1.4.1 |
| Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 633 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | W21404 | Used in 3.1.4.1 |
| DAPI solution | Thermo Fisher Scientific | 62248 | Used in 3.1.4.2 |
| Propidium iodide | Thermo Fisher Scientific | P3566 | Used in 3.1.4.3 |
| FilmTracer SYPRO Ruby Biofilm Matrix protein Stain | Thermo Fisher Scientific | F10318 | Used in 3.1.4.4 |
| Fluoromount-G Slide Mounting Medium | Fisher Scientific | OB100-01 | Used in 3.1.7 |
| LSM780 Axio Observer Z1 | Zeiss | Used in 3.2.1 | |
| ZEN 2.1 lite black software | Zeiss | Used in 3.2.1 | |
| High Vacuum Coater Leica EM ACE600 | Leica | Used in 4 | |
| GeminiSEM-FEG | Zeiss | Used in 4 |
References
- Frey-Klett, P., Burlinson, P., Deveau, A., Barret, M., Tarkka, M., Sarniguet, A. Bacterial-Fungal Interactions: Hyphens between Agricultural, Clinical, Environmental, and Food Microbiologists. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 75 (4), 583-609 (2011).
- Scherlach, K., Graupner, K., Hertweck, C. Molecular bacteria-fungi interactions: effects on environment, food, and medicine. Annu. Rev. Microbiol. 67, 375-397 (2013).
- Schroeckh, V., Scherlach, K., et al. Intimate bacterial-fungal interaction triggers biosynthesis of archetypal polyketides in Aspergillus nidulans. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (34), 14558-14563 (2009).
- Hogan, D. A., Wargo, M. J., Beck, N. Bacterial Biofilms on Fungal Surfaces. Biofilm mode of life: mechanisms and adaptations. 13, 235-245 (2007).
- Hogan, D. A., Kolter, R. Pseudomonas - Candida interactions: an ecological role for virulence factors. Science. 296 (5576), 2229-2232 (2002).
- Jayasinghearachchi, H. S., Seneviratne, G. Can mushrooms fix atmospheric nitrogen? J. Biosci. 29 (3), 293-296 (2004).
- Seneviratne, G., Zavahir, J. S., Weerasekara, W. M. M. S., Bandara, M. L. M. A. Fungal-bacterial biofilms their development for novel biotechnological applications. World J Microbiol Biotechnol. , 739-743 (2008).
- Herath, H. M. L. I., Upamali, A., Vithanage, M., Seneviratne, G. Developed fungal - bacterial biofilms as a novel tool for bioremoval of hexavelant chromium from wastewater. Chem. Ecol. 00 (0), 1-10 (2014).
- Macedo, A. J., Kuhlicke, U., Neu, T. R., Timmis, K. N., Abraham, W. R. Three stages of a biofilm community developing at the liquid-liquid interface between polychlorinated biphenyls and water. Appl. Environ. Microbiol. 71 (11), 7301-7309 (2005).
- Da Silva, W. J., Seneviratne, J., Samaranayake, L. P., Del Bel Cury, A. A. Bioactivity and architecture of Candida albicans biofilms developed on poly(methyl methacrylate) resin surface. J. Biomed. Mater. Res. - Part B Appl. Biomater. 94 (1), 149-156 (2010).
- Flemming, H., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat. Publ. Gr. 8 (9), 623-633 (2010).
- Cerca, N., Gomes, F., Pereira, S., Teixeira, P., Oliveira, R. Confocal laser scanning microscopy analysis of S. epidermidis biofilms exposed to farnesol, vancomycin and rifampicin. BMC Res. Notes. 5, 244 (2012).
- Lepanto, P., Lecumberry, F., Rossello, J., Kierbel, A. A confocal microscopy image analysis method to measure adhesion and internalization of Pseudomonas aeruginosa multicellular structures into epithelial cells. Mol. Cell. Probes. 28 (1), 1-5 (2014).
- Mueller, L. N., de Brouwer, J. F. C., Almeida, J. S., Stal, L. J., Xavier, J. B. Analysis of a marine phototrophic biofilm by confocal laser scanning microscopy using the new image quantification software PHLIP. BMC Ecol. 6, (2006).
- Murray, J. M. Methods for imaging thick specimens: Confocal microscopy, deconvolution, and structured illumination. Cold Spring Harb. Protoc. 6 (12), 1399-1437 (2011).
- Toljander, J. F., Artursson, V., Paul, L. R., Jansson, J. K., Finlay, R. D. Attachment of different soil bacteria to arbuscular mycorrhizal fungal extraradical hyphae is determined by hyphal vitality and fungal species. FEMS Microbiol. Ecol. 254, 34-40 (2006).
- Brandl, M. T., Carter, M. Q., Parker, C. T., Chapman, M. R., Huynh, S. Salmonella Biofilm Formation on Aspergillus niger Involves Cellulose - Chitin Interactions. PLoS One. 6 (10), (2011).
- Balbontín, R., Vlamakis, H. Mutualistic interaction between Salmonella enterica and Aspergillus niger and its effects on Zea mays colonization. Microb. Biotechnol. Publ. , (2014).
- Frey-Klett, P., Garbaye, J., Tarkka, M. The mycorrhiza helper bacteria revisited. New Phytol. 176 (1), 22-36 (2007).
- Deveau, A., Brulé, C., et al. Role of fungal trehalose and bacterial thiamine in the improved survival and growth of the ectomycorrhizal fungus Laccaria bicolor S238N and the helper bacterium Pseudomonas fluorescens BBc6R8. Environ. Microbiol. Rep. 2 (4), 560-568 (2010).
- Neu, T. R., Lawrence, J. R. Advanced Techniques for In Situ Analysis of the Biofilm Matrix (Structure, Composition, Dynamics) by Means of Laser Scanning Microscopy. Methods Mol. Biol. 1147, 43-64 (2014).
- Rasband, W. S. imagej. , Available from: http://imagej.nih.gov/ij (2016).
- Berggren, K. N., Schulenberg, B., et al. An improved formulation of SYPRO Ruby protein gel stain: Comparison with the original formulation and with a ruthenium II tris (bathophenanthroline disulfonate) formulation. Proteomics. 2 (5), 486-498 (2002).
- Pantanella, F., Valenti, P., Natalizi, T., Passeri, D., Berlutti, F. Analytical techniques to study microbial biofilm on abiotic surfaces: pros and cons of the main techniques currently in use. Ann. di Ig. 25 (1), 31-42 (2013).
- Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J. Vis. Exp. (47), (2011).
- Azevedo, N. F., Lopes, S. P., Keevil, C. W., Pereira, M. O., Vieira, M. J. Time to "go large" on biofilm research: Advantages of an omics approach. Biotechnol. Lett. 31 (4), 477-485 (2009).
- Koerdt, A., Orell, A., et al. Macromolecular fingerprinting of Sulfolobus species in biofilm: A transcriptomic and proteomic approach combined with spectroscopic analysis. J. Proteome Res. 10 (9), 4105-4119 (2011).
- Morgenroth, E., Milferstedt, K. Biofilm engineering: Linking biofilm development at different length and time scales. Rev. Environ. Sci. Biotechnol. 8 (3), 203-208 (2009).
- Neu, T. R., Lawrence, J. R. Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales. Trends Microbiol. 23 (4), 233-242 (2015).
- Xi, C., Marks, D., Schlachter, S., Luo, W., Boppart, S. A. High-resolution three-dimensional imaging of biofilm development using optical coherence tomography. J. Biomed. Opt. 11 (3), 34001 (2006).
- Janjaroen, D., Ling, F., et al. Roles of ionic strength and biofilm roughness on adhesion kinetics of Escherichia coli onto groundwater biofilm grown on PVC surfaces. Water Res. 47 (7), 2531-2542 (2013).
- Derlon, N., Koch, N., et al. Activity of metazoa governs biofilm structure formation and enhances permeate flux during Gravity-Driven Membrane (GDM) filtration. Water Res. 47 (6), 2085-2095 (2013).
- Karcz, J., Bernas, T., Nowak, A., Talik, E., Woznica, A. Application of lyophilization to prepare the nitrifying bacterial biofilm for imaging with scanning electron microscopy. Scanning. 34 (1), 26-36 (2012).
- Burton, E., Yakandawala, N., LoVetri, K., Madhyastha, M. S. A microplate spectrofluorometric assay for bacterial biofilms. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 34 (1), 1-4 (2007).
- Berne, C., Ducret, A., Hardy, G. G., Brun, Y. V. Adhesins Involved in Attachment to Abiotic Surfaces by Gram-Negative Bacteria. Microbiol. Spectr. 3 (4), 1-45 (2015).
- Schlafer, S., Garcia, J. E., Greve, M., Raarup, M. K., Nyvad, B., Dige, I. Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms with C-SNARF-4. Appl. Environ. Microbiol. 81 (4), 1267-1273 (2015).
- Daddi Oubekka, S., Briandet, R., Fontaine-Aupart, M. P., Steenkeste, K. Correlative time-resolved fluorescence microscopy to assess antibiotic diffusion-reaction in biofilms. Antimicrob. Agents Chemother. 56 (6), 3349-3358 (2012).
- Almeida, C., Azevedo, N. F., Santos, S., Keevil, C. W., Vieira, M. J. Discriminating multi-species populations in biofilms with peptide nucleic acid fluorescence in situ hybridization (PNA FISH). PLoS One. 6 (3), (2011).
- Malic, S., Hill, K. E., Hayes, A., Percival, S. L., Thomas, D. W., Williams, D. W. Detection and identification of specific bacteria in wound biofilms using peptide nucleic acid fluorescent in situ hybridization (PNA FISH). Microbiology. 155 (8), 2603-2611 (2009).
