Abstract
有效的头发染色通过在角蛋白毛发与植物酚的真菌漆酶催化的聚合的产物的原位孵育先前已经证明。然而，染色过程需要较长的时间相比，商业的染发产品来完成。为了克服这一瓶颈，预先合成的栓的云芝上儿茶素和儿茶酚漆酶氧化反应的聚合物产品，无论是有或没有媒剂（ 例如， 硫酸亚铁），这里被用来实现永久角蛋白毛发染色的各种颜色和色调。在酸性醋酸钠缓冲液漆酶耦合作用厂酚之间的反应后，导致了深黑的颜色。然后将着色染料产物脱盐并浓缩，之后用超滤。染料，有或没有媒剂，导致在灰色人类头发的WiΔE值（ 即，色差值）显著增加薄2.5小时。此外，不同的角蛋白颜色和色调取决于媒染和pH值的变化被诱导。染色的毛发还表现出对洗涤剂处理有很强的抵抗力，表明我们的方法可以产生永久染发。总的来说，我们的工作提供了新颖的洞察显影生态友好的染发方法以替代商业有毒二胺类染料。
Introduction
漆酶是氧化酶是对酚和多酚化合物的活性。他们已经在各种生物体，包括植物，真菌，昆虫和细菌被确定。他们的行动酶有助于几种形态的现象1。酶催化底物的单电子氧化，导致在被进一步耦合到小的有机物和固体表面自由基的形成。这种耦合过程导致的低聚物和聚合物的合成和表面functionalizations 2,3。当漆酶底物是从天然来源，如植物酚类，酶促反应是相对于绿色化学的极大兴趣。这里，两种反应物和催化剂是从天然来源。此外，所得到的产品类似于天然产物，因为整个反应模拟天然酚的体内合成聚合物，包括植物木质素，聚（flavono编号），和腐殖质其中小植物酚类化合物是高度交联通过氧化酶诱导的自由基偶合4。
从植物衍生的酚的漆酶催化的偶联反应衍生的产品可以用于通过原位孵育染灰发，并且可以开发作为替代市售染料1。这样的替代是重要的，因为是基于对苯二胺（PPD）商业染发剂，PPD相关二胺化合物，以及过氧化氢，这已被证明是有毒的，致癌和过敏人类5,6在漆酶催化的偶联反应中，漆酶和植物酚类功能替换分别过氧化氢和对苯二胺，7。但是，基于漆酶系统的染色速度比商用一个慢得多。在一般情况下，基于PPD-染色剂需要不到一小时，以实现在角蛋白毛发有效的颜色变化，而基于漆酶反应需要过夜温育7。缓慢染色动力学可以通过两种可能的现象进行说明。第一，使用低pH值缓冲液（ 例如，pH值为5），以最大限度地提高漆酶活性已被观察到降低在角蛋白基质溶胀，从而抑制染料成矩阵的深穿透程度。实际上，代理允许染色反应在高pH条件下进行已被证明是不可或缺的商用头发染色产品8。其次，聚合反应过程中表现出很强的吸附到角质表面可能发色团分子的数量已经被证明是成比例的孵育时间（ 即，聚合的程度）。例如，多巴胺聚多巴胺的转化显示出诱导到许多表面，这是伴随着黑色9的形成强粘合力。</ P>
在目前的工作中，预合成由T.获得的聚合物产品云芝儿茶素和儿茶酚的漆酶催化氧化反应被用来治疗头发角蛋白染色。我们推测的聚合物的吸附能力将比单体植物酚的强得多，他们将最初形成的低分子量的低聚物。结果表明，使用预先合成的聚合物时，酶促氧化电源不再需要。这表明，pH值可被控制，并且金属离子可以染发处理中使用，而不管酶的活性。这个协议提供了一个简单而快速的方法，同时使用生态友好的和可再生的来自植物的酚（ 图1）的染料在颜色的各种色调角蛋白毛发。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.植物苯酚衍生的高分子染料的制备
- 32毫升的100mM乙酸钠缓冲液（pH5.0）和8毫升无水乙醇中的儿茶素水合物（0.1克） - 溶解儿茶酚（0.1克）和（+）。
- 添加10毫克的T.云芝漆酶的catechol-和含儿茶素的缓冲区。混合大力和将溶液倒入方形培养皿。在室温下孵育皿在24小时的振荡培养箱（25转）。从透明的暗黑色溶液的显着的颜色变化可以用肉眼漆酶诱导的偶合反应之后观察到。
- 离心溶液10分钟以20,000 xg离心以降速不溶的聚合物颗粒。使用进一步的脱盐深黑上清。
- 脱盐用5 kDa的超滤光盘反应溶液中。浓缩反应体积至20ml通过超滤后，通过加入300毫升蒸馏水交换反应缓冲液。最后，使用过滤，浓缩溶液的体积至25ml。
2.灰色头发角蛋白染色解决方案
- 准备以下六个聚合物溶液：聚合物染料，聚合物染料/ 硫酸亚铁，聚合物染料/ 硫酸亚铁在pH为3的水，聚合物染料/ 硫酸亚铁在pH为11的水，聚合物染料/ 硫酸亚铁用乙酸，和聚合物染料/硫酸亚铁4与氨。
- 为聚合染料，混合溶于5ml蒸馏水用1ml脱盐聚合物染料（1.4）的。
- 为媒染剂溶液，从步骤2.1.1添加0.33克的FeSO 4的混合物中。大力涡旋溶解硫酸亚铁完全。
- 对于pH为3或11的水溶液，调整用1N HCl或1N的NaOH5毫升蒸馏水的pH值。再加入1毫升脱盐聚合染料（1.4）和0.33克硫酸亚铁的。
- 对于乙酸 - 或氨处理的溶液，混匀1.0毫升GL的acial乙酸或1.0毫升氨水用5ml蒸馏水。再加入1毫升脱盐聚合染料（1.4）和0.33克硫酸亚铁的。
- 于6ml蒸馏水中，有或没有0.33克的FeSO 4的儿茶素水合物（0.1克），浸泡在头发-为对植物的单体，混合邻苯二酚（0.1克）和（+）。
- 如从步骤2.1和2.2的染色溶液制备不久，完全浸泡在溶液5厘米长的灰色人发束（0.2克）。孵育在32℃的发束在2.5小时的摇动培养箱（160转）。
- 此后，取出发束，用流水冲洗。使用电子头发干燥器以除去水分。引起的聚合物染料颜色变化可以用肉眼可视化。
- 以获得颜色参数（ 即，L *，a *和b *的 ），使用根据制造商的协议的常规色度计。揉碎头发Ťresses成一团，从而使他们能够用比色计的透镜来测量。重复在毛发上与色度计透镜的不同区域这一过程。
- 测量每个染色发辫七倍的颜色参数。计算平均值和所述参数的标准偏差。使用下式计算ΔE：[（100 - L *）2 +（A *）2 +（B *）2] 1/2。
3.颜色耐久性试验
- 在40毫升的蒸馏水中溶解200毫克十二烷基硫酸钠（SDS）的。完全浸泡染发在含有SDS的水，在室温下5分钟。取出发束，然后用足够的自来水冲洗一下，以除去洗涤剂。使用电子头发干燥器以除去水分。
- 以获得颜色参数（ 即，L *，a *和b *的 ），采用根据厂家专业的常规色度计呃的协议。重复步骤3.1与同染发描述再次浸泡，然后再测量参数。
- 溶解800毫克的SDS在40毫升的蒸馏水。如步骤3.1中所述，多重复用相同的染发浸泡两次。总体而言，共四次对待每染发束用SDS溶液。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
首先，聚合物染料的染色能力相比，来自植物的单体（ 即，儿茶素和儿茶酚）的。的聚合物染料诱导的灰色角蛋白毛发（ 图2A和图3）的颜色显著变化，而头发的先天灰色保持与植物的单体非常稳定的（ 数据未显示 ）。然后媒染对聚合物产品的染色能力剂的作用进行了评价。如在图2A中看到的，除了Fe离子导致的灰色角蛋白毛发的ΔE值没有增加。但是，发色被显著与使用Fe离子（ 图3）的变化。要检查媒染剂能否诱导植物酚类单体着色，铁离子也加入到单体无氧化聚合。只要铁离子在ACI溶解与单体DIC醋酸钠反应缓冲液，深黑色立刻出现（ 数据未显示 ）。此外，Fe和植物的单体酚类的配合物被证明是在染色灰色人的毛发，从而在灰色深黑的有效转化（ 图3）有效。从铁植物酚染料得到的ΔE值是比该聚合物染料（ 图2A）的更高。
为了评价pH的变化是否会影响角蛋白毛发与铁离子聚合染料复合物，低pH的染色效率（从pH为3调整和乙酸水域含酸）和高pH（从pH值11调整和含有氨的水域）进行了测试。如在图2A中看到的那样，这样的pH值的变化导致了ΔE值变化不大，相反聚合物染料的效果。然而，从染发的可见颜色，这取决于pH值调节并改变显剂使用（ 图3）。有趣的是，头发的颜色从使用盐酸所得从由乙酸得到的不同，尽管它们在pH值控制显然类似的作用。不同的发色也是由于氢氧化钠和氨。所有三个色彩参数（ 即，L *的范围从0（黑色）到100（白色）， 一个*范围从-100（绿色）到100（红）和b *的范围从-100（蓝色）到100（黄））我们的染发然后比较， 如图2B所示 。虽然ΔE值对于不同的染色条件差异仅轻微，颜色参数相对不同（ 图2B），与发束的不同可见颜色一致（ 图3）。
最后，染发的洗涤剂电阻检查。如在图4中所见，所有染发一般保持其16，E值对重复的SDS处理，表明有或没有聚合物染料媒染导致永久性的染色。当不经聚合的植物单体用的ΔE值是成反比的施加SDS处理（ 图4）的数量。相反，当单独或与硫酸亚铁聚合物染料用于染色更稳定。
图1.方案为基础的苯酚工厂高分子染料的合成及其在角蛋白染发的应用程序。一个简单而快速的方法，而使用环保和可再生植物来源的酚类化合物被证明染料的颜色深浅不同的角蛋白的头发。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2. 颜色染发的评估。（A）中的ΔE值（±标准差，N = 7）和（B）三种颜色参数（L *，a *和b *的 ）不同的反应条件下的分布。 请此处查看该图的放大版本。
图3.相不同的反应条件下染发剂的图像 （A）只处女灰色人类毛发。; （B）聚合染料; （C）聚合染料/ 硫酸亚铁; （D）的聚合染料/ 硫酸亚铁用乙酸; （E）聚合染料/ 硫酸亚铁在pH为11的水; （F）聚合染料/ 硫酸亚铁在pH值为3的水; （G）聚合染料/ 硫酸亚铁与氨; （H）的单体/ 硫酸亚铁。比例尺为0.5cm。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4. 颜色染发反复清洗剂处理的耐久性。直接染色（高分子染料）的较大的稳定作用和聚合产品媒染剂（高分子染料/ 硫酸亚铁），而不是用单体的媒染剂（单体/ 硫酸亚铁）均表现（ ±SD，N = 7）。 请点击这里查看LARGER版本这个数字。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
有趣的是，我们的方法减少花染的头发角蛋白具有天然酚类物质氧化引起的聚合反应的时间。它还通过聚合物染料的简单的操作，如改变pH值和施加媒染剂诱导的毛发颜色多样。
在头发角蛋白与植物酚类的漆酶催化氧化的原位培养过于需要很长的培育时间以达到有效的染色7。这种缓染动力学可能是由于植物酚类的差结合能力，并具有非常低的分子量，从而延缓实际染发的起始时间直到具有相对高的分子量的聚合物形成的初始低聚物。直接使用聚合产物时（ 图2A和4）强烈地支持上述假说快速染发和颜色耐久性观察。一个CHR的提高结合能力和状态omophore在聚合物可能已经永久性染发的速度快作出了贡献。尽管其它研究人员已经表明，一些单体酚类能够很好结合某些表面，在外部刺激的存在的结合耐久性尚不清楚，正如作者评估非常温和的条件10,11。此外，一个生色下的结合现象不存在测试的单体化合物中。因此，在该协议中最关键的步骤是使用后24小时温育的反应得到的产物，因为大量的高分子的重量，因而充分地形成表现出强烈结合特性五颜六色酚醛聚合物。
一些研究已经使用的金属离子-苯酚络合物染织物12,13有对这些染色现象两种可能的机制：金属离子-苯酚络合物作为发色团，或金属离子双向坐标苯酚和面传热下载到被染色，导致复合物的强附着。取决于Fe离子（ 图2B和4）的存在下发色的变化是与上述两个机构的一致，因为金属离子与聚合物的产品和单体的协调可导致颜色的变化和生成，分别。此外，详细的配位键合的结构可能已经由pH变化进行调制，如在药物传递系统14观察到。因此，它不适不合理的建议，媒染伴随pH变化会导致通过生色的结构转换不同颜色的变化。在一般情况下，媒染被认为是提高天然植物的染色能力提取13。然而，与无Fe离子（ 图2A）的聚合物染料的ΔE值的相似性表明，铁与染料主要变化的协调D中的发色团，从而产生不同颜色的染发，如在图3中 。高pH会导致染发的高的ΔE值，因为高pH剂如氨水已知会导致角蛋白纤维成为溶胀，从而增加了染料扩散速率8。当头发矩阵拧紧这样的扩散染料然后捕获。但是，染发的ΔE值变化不大高pH或氨，表明聚合物染料的能力结合在头发上表面更好地描述在此协议比确实角蛋白肿胀染发。
颜色耐久性是在染发非常重要的，并且在染色方法应该产生在外部刺激的存在耐用染料。特别是，每天洗头是变淡染发8是最显著的刺激。如在图4中所见，我们的染色方法是重复的SDS处理非常有抗性。越大站bilizing直接染色（聚合染料）的影响，并与聚合产物媒染（聚合染料/ 硫酸亚铁），而不是用单体媒染（单体/ 硫酸亚铁）， 如图4，也可能是由于聚合物中的较大分子量染料。与该金属离子桥连的聚合染料和角蛋白表面上的效率显然依赖于染料的平均分子大小。头发是由各种物质，包括黑色素，氨基酸，蛋白质和脂质15。进一步的研究应进行以确认该协议是否适用于各种人的头发类型的效果。此外，尽管我们的材料是从天然来源，需要以充分保证非毒性严格毒性试验对人细胞。
总体而言，我们在这里提供了一个良好定义的方法来诱导永久角蛋白毛发染色，使用COMMERC内环保材料时间ially接受短。根据我们的数据揭示直接结合聚合物染料的的属性角蛋白毛发，使我们的聚合物染料充当在商业基础的PPD-染发产品作为活性成分进一步的方法将得到发展。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium dodecyl Sulfate | Promega | H5114 | |
| Laccase from Trametes versicolor | Sigma | 38429-1G | Enzyme activity is denoted as 0.53 U/mg |
| (+)-catechin hydrate | Sigma | C1251-5G | |
| 1,2-dihydroxybenzene (catechol) | Sigma | 135011-5G | |
| Ammonia water | Duksan | 701 | Ammonia contents is denoted as 25 ~ 30% |
| Acetic acid, glacial | Duksan | 448 | |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | JUNSEI | 83380-1250 | |
| Ultracell 5 kDa | Amicon | PLCC06210 | |
| Stirred ultrafiltration cells | Millipore | Model 8200 | |
| Human gray hair | PheonixKorea | Not available | |
| Colorimeter | SPEC | JCS-10 | |
| Square dish | SPL | 10125 | 125 * 125 * 20 (mm) |
References
- Jeon, J. R., Chang, Y. S. Laccase-mediated oxidation of small organics: bifunctional roles for versatile applications. Trends Biotechnol. 31, 335-341 (2013).
- Kudanga, T., Nyanhongo, G. S., Guebitz, G. M., Burton, S. Potential applications of laccase-mediated coupling and grafting reactions: a review. Enzyme Microb Technol. 48, 195-208 (2011).
- Jeon, J. R., Le, T. T., Chang, Y. S. Dihydroxynaphthalene-based mimicry of fungal melanogenesis for multifunctional coatings. Microb. Biotechnol. 9, 305-315 (2016).
- Jeon, J. R., Baldrian, P., Murugesan, K., Chang, Y. S. Laccase-catalyzed oxidations of naturally occurring phenols: From in vivo biosynthetic pathways to green synthetic application. Microb. Biotechnol. 5, 318-332 (2012).
- Chung, K. T., et al. Mutagenicity and toxicity studies of p-phenylenediamine and its derivatives. Toxicol. Lett. 81, 23-32 (1995).
- Bai, Y. H., et al. p-aminophenol and p-phenylenediamine induce injury and apoptosis of human HK-2 proximal tubular epithelial cells. J. Nephrol. 25, 481-489 (2012).
- Jeon, J. R., et al. Laccase-catalyzed polymeric dye synthesis from plant-derived phenols for potential application in hair dyeing: Enzymatic colorations driven by homo- or hetero-polymer synthesis. Microb. Biotechnol. 3, 324-335 (2010).
- Franca, S. A., Dario, M. F., Esteves, V. B., Baby, A. R., Velasco, M. V. R. Types of hair dye and their mechanisms of action. Cosmetics. 2, 110-126 (2015).
- Ball, V., et al. Deposition mechanism and properties of thin polydopamine films for high added value applications in surface science at the nanoscale. BioNanoSci. 2, 16-34 (2012).
- Barrett, D. G., Sileika, T. S., Messersmith, P. B. Molecular diversity in phenolic and polyphenolic precursors of tannin-inspired nanocoatings. Chem. Commun. 50, 7265-7268 (2014).
- Sileika, T. S., Barrett, D. G., Zhang, R., Lau, K. H. A., Messersmith, P. B. Colorless multifunctional coatings inspired by polyphenols found in tea, chocolate, and wine. Agnew. Chem. 52, 10766-10770 (2013).
- Boonsong, P., Laohakunjit, N., Kerdchoechuen, O. Natural pigments from six species of Thai plants extracted by water for hair dyeing product application. J. Clean. Prod. 37, 93-106 (2012).
- Bechtold, T., Turcanu, A., Ganglberger, E., Geissler, S. Natural dyes in modern textile dyehouses - how to combine experiences of two centuries to meet the demands of the future. J. Clean. Prod. 5, 499-509 (2003).
- Zheng, H., Gao, C., Peng, B., Shu, M., Che, S. pH-responsive drug delivery system based on coordination bonding in a mesostructured surfactant/silica hybrid. J. Phys. Chem. C. 115, 7230-7237 (2011).
- Robbins, C. R. Chemical and physical behavior of human hair. , 5th, Springer. 105-176 (2011).
