Abstract
Effektiv hårfarvning gennem in situ inkubation af keratin hår med produkterne af fungal laccase-katalyseret polymerisation af plante- phenoler er tidligere blevet påvist. Imidlertid farveprocessen tager lang tid at gennemføre end kommercielle hår-farvning produkter,. For at overvinde denne flaskehals, præ-syntetiseret polymerprodukter ifølge den oxidative reaktion af Trametes versicolor laccase på catechin og catechol, enten med eller uden ætsende midler (f.eks FeSO4), blev her anvendt til at opnå permanent keratin hårfarvning i forskellige farver og nuancer . Laccasen indsats sure natriumacetatpuffer førte til en dyb sort farve efter kobling reaktioner mellem plante- phenoler. De farvede produkter til farvning blev dernæst afsaltet og koncentreret med ultrafiltrering. Farvestofferne med eller uden ætsende midler, forårsagede en signifikant stigning i AE-værdier (dvs. farveforskel værdi) i grå menneskehår witynde 2,5 timer. Desuden blev forskellige keratin farver og nuancer induceret afhængigt af mordanting og pH-ændringer. Den farvet hår udstillet også en stærk modstand mod vaskemiddel behandlinger, hvilket indikerer, at vores metoder kan give anledning til permanent hårfarvning. Samlet set vores arbejde har givet romanen indblik i udviklingen af miljøvenlige hår-farvning metoder som alternativer til kommercielle giftige diamin-baserede farvestoffer .
Introduction
Laccaser er oxidaser, der er aktive i retning af phenol- og polyphenolforbindelser. De er blevet identificeret i forskellige levende organismer, herunder planter, svampe, insekter og bakterier. Deres enzymatiske handlinger bidrager til flere morfogenetiske fænomener 1. Enzymerne katalyserer single-elektron oxidation af substraterne, hvilket resulterer i dannelsen af radikaler, der er yderligere koblet til små organiske og faste overflader. Sådanne koblingsprocesser fører til syntese af oligomerer og polymerer og til overfladen functionalizations 2, 3. Når laccase substrater er fra naturlige kilder, såsom plante- phenoler, de enzymatiske reaktioner er af stor betydning set grøn kemi. Her begge reaktanter og katalysatorer er fra naturlige kilder. Desuden er de resulterende produkter svarer til de naturlige produkter, da de samlede reaktioner efterligner in vivo syntese af naturlige phenolpolymerer-herunder anlæg lignin, poly (flavonoid), og humus-hvor lille plante phenolforbindelser er yderst tværbundet ved oxidase-induceret radikal kobling 4.
Produkter afledt af laccase-katalyserede koblingsreaktioner af plante-afledte phenoler kan bruges til at farve grå hår gennem in situ inkubation og kan udvikles som alternativer til kommercielt tilgængelige farvestoffer 1. Sådanne alternativer er vigtige, da kommercielle hår-farvning midler er baseret på p-phenylendiamin (PPD), PPD-relateret diaminforbindelser, og hydrogenperoxid, som har vist sig at være toksiske, carcinogene, og allergifremkaldende for mennesker 5, 6. I laccasegener--katalyserede koblingsreaktioner, de laccaser og planteprodukter phenoler funktionelt erstatte hydrogenperoxid og p-phenylendiamin, henholdsvis 7. Imidlertid farvning hastigheden af laccase-baserede systemer er meget langsommere end for den kommercielle. I almindelighed er de PPD-baserede farvning midler kræver mindre end en time for at opnåeffektiv farveændring i keratin hår, mens laccase-baserede reaktioner kræver en inkubation natten over 7. De langsomme farvning kinetik kunne forklares ved to mulige fænomener. Først anvendelsen af en lav-pH-puffer (f.eks pH 5) for at maksimere laccase aktivitet er blevet observeret at nedsætte graden af hævelse i keratin matricer, hvilket forhindrer dybe indtrængen af farvestoffer i matricerne. Faktisk har midler gør det muligt for farvning reaktioner at forløbe i høj pH-betingelser vist sig at være en integreret del af kommercielle hår-farvning produkter 8. For det andet er antallet af mulige kromoformolekyler udviser stærk adsorption til keratinøse overflader under polymerisationsreaktionen vist sig at være proportional med inkubationstiden (dvs. graden af polymerisation). For eksempel blev omdannelsen af dopamin til polydopamine vist at inducere en kraftig binding med mange overflader, der var samtidig med dannelsen af en sort farve 9. </ P>
I den nuværende arbejde, præ-syntetiserede polymere produkter fremstillet af T. versicolor laccase-katalyseret oxidation af catechin og catechol, blev anvendt til behandling af keratin hår til farvning. Vi antager, at adsorptionsevnen af polymererne ville være meget stærkere end de monomere plante- phenoler, og at de i første omgang ville danne lav molekylvægt oligomerer. Resultaterne viste, at, når der anvendes de forud syntetiserede polymerer, den enzymatiske oxidation magt ikke længere var nødvendigt. Dette indikerer, at pH kan kontrolleres, og at metalioner kan anvendes i hår-farvning behandlinger, uanset enzymaktivitet. Denne protokol giver en enkel og hurtig metode til at farve keratin hår i forskellige nuancer af farve, mens du bruger miljøvenlige og vedvarende plantebaserede fenoler (figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af Plant Phenol-afledte Polymere Farvestoffer
- Opløs catechol (0,1 g) og (+) - catechin hydrat (0,1 g) i 32 ml 100 mM natriumacetatpuffer (pH 5,0) og 8 ml absolut ethanol.
- Tilsæt 10 mg T. versicolor laccase til catechol- og catechin-holdig puffer. Bland kraftigt og hæld opløsningen i en firkant petriskål. Inkuber skålen ved stuetemperatur i en rysteinkubator (25 rpm) i 24 timer. Dramatisk farveændring af opløsningen fra transparent til mørk sort kan iagttages med det blotte øje efter laccase-induceret koblingsreaktioner.
- Centrifugeres opløsningen i 10 minutter ved 20.000 xg for at spinde ned uopløselige polymerpartikler. Brug den dybe sorte supernatant for yderligere afsaltning.
- Afsalte reaktionsopløsningen med en 5 kDa ultrafiltration disk. Efter koncentrering reaktionsvolumenet til 20 ml ved ultrafiltrering, udveksler reaktionen puffer ved tilsætning af 300 ml destilleret vand. Endelig giver filtrering koncentreres opløsningens volumen til 25 ml.
2. Farvning Løsninger til Gray Keratin hår
- Forbered følgende seks polymere løsninger: polymere farvestoffer, polymere farvestoffer / FeSO4, polymere farvestoffer / FeSO4 i pH 3 vand, polymere farvestoffer / FeSO4 i pH 11 vand, polymere farvestoffer / FeSO4 med eddikesyre, og polymere farvestoffer / FeSO 4 med ammoniak.
- For det polymere farvestof, blandes 5 ml destilleret vand med 1 ml Den afsaltede polymere farvestoffer (1.4).
- For de ætsende opløsninger, tilsættes 0,33 g FeSO4 til blandingen fra trin 2.1.1. Kraftigt vortex at opløse FeSO4 fuldstændigt.
- For pH 3 eller 11 vandopløsning, pH indstilles af 5 ml destilleret vand under anvendelse af 1 N HCI eller 1 N NaOH. Derefter tilsættes 1 ml af de afsaltede polymere farvestoffer (1,4) og 0,33 g FeSO4.
- For eddikesyre- eller ammoniak-behandlede opløsning, blandes 1,0 ml glacial eddikesyre eller 1,0 ml ammoniakvand med 5 ml destilleret vand. Derefter tilsættes 1 ml af de afsaltede polymere farvestoffer (1,4) og 0,33 g FeSO4.
- For de plantearter monomerer, bland catechol (0,1 g) og (+) - catechin hydrat (0,1 g) i 6 ml destilleret vand med eller uden 0,33 g FeSO4, at suge håret i.
- Så snart farvning løsninger fra trin 2.1 og 2.2 er forberedt, helt suge 5 cm lange grå menneskehår Lokker (0,2 g) i løsningerne. Inkubér hårlokker ved 32 ° C i en rysteinkubator (160 rpm) i 2,5 timer.
- Bagefter tage ud hårlokker og skyl dem med rindende vand. Anvende et elektronisk hårtørrer til at fjerne fugt. Farveændring forårsaget af de polymere farvestoffer kan visualiseres med det blotte øje.
- For at opnå de farveparametre (dvs. L *, a *, og b *), anvender en konventionel kolorimeter ifølge fabrikantens protokol. Krølle håret tresses til en kugle, hvilket giver dem mulighed for at blive målt med linsen af et colorimeter. Dette gentages ved en anden region af håret med kolorimeter linse.
- Måle farven parametre for hver farvet hårlok syv gange. Beregn gennemsnit og standardafvigelser af de parametre. Beregn AE ved hjælp af formlen: [(100 - L *) 2 + (a *) 2 + (b *) 2] 1/2.
3. Farve Holdbarhed Tests
- Opløs 200 mg af natriumdodecylsulfat (SDS) i 40 ml destilleret vand. Soak det farvede hår helt i SDS-holdige vand i 5 minutter ved stuetemperatur. Tag håret Lokker og derefter skylle dem med nok rindende vand for at fjerne de rengøringsmidler. Anvende et elektronisk hårtørrer til at fjerne fugt.
- For at opnå de farveparametre (dvs. L *, a *, og b *), anvender en konventionel kolorimeter ifølge Fabrikis protokol. Gentag iblødsætning beskrevet i trin 3.1 en gang mere med samme farvet hår og derefter måle parametrene igen.
- Opløs 800 mg SDS i 40 ml destilleret vand. Som beskrevet i trin 3.1, gentages neddypning to gange mere med den samme farvet hår. Samlet set behandle hver farvet hårlok med SDS-opløsning i alt fire gange.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Først blev farvning evne polymere farvestoffer sammenlignet med den af planteafledte monomerer (dvs. catechin og catechol). De polymere farvestoffer inducerede en signifikant ændring i farven på grå keratin hår (figur 2A og figur 3), mens den medfødte grå farve af hår forblev meget stabil med plante monomerer (data ikke vist). Virkningerne af mordanting agenter på farvning evner polymere produkter blev derefter evalueret. Som det ses i figur 2A, tilsætning af Fe-ioner medførte ingen stigning i AE værdien af gråt keratin hår. Imidlertid blev hårfarve ændret betydeligt ved anvendelse af Fe-ioner (figur 3). For at kontrollere om mordanting agenter kan fremkalde farve med plante phenolforbindelser monomerer blev Fe-ioner også føjet til de monomerer, uden oxidativ polymerisation. Så snart Fe-ioner blev opløst med monomererne i en acidic natriumacetat reaktionsbuffer, en dyb sort farve optrådte straks (data ikke vist). Desuden komplekser af Fe og plante monomere phenoler vist sig at være effektiv til farvning grå menneskehår, hvilket resulterer i en effektiv omdannelse af den grå farve til dyb sort (figur 3). Den AE-værdi som følge af Fe-anlægget phenol farvestof var højere end for de polymere farvestoffer (figur 2A).
At vurdere, om en ændring i pH påvirker farvning effektiviteten af keratin hår med Fe ion-polymere farvestof komplekser, lav pH (fra pH 3-justeret og eddikesyre indeholdende vand) og høj pH (fra pH 11-justeret og ammoniakholdige farvande) blev testet. Som det ses i figur 2A, førte disse pH-ændringer til lille ændring i AE-værdi, i modsætning til virkningen af polymere farvestoffer. Men de synlige farver fra farvet hår ændre markant afhængigt af hvilken pH-justerendemiddel blev anvendt (Figur 3). Interessant, hårfarve som følge af anvendelsen af HCI forskellig fra resultatet af eddikesyre, på trods af deres tilsyneladende lignende roller i pH-styring. Forskellige hårfarver resulterede også fra NaOH og ammoniak. Alle tre farve parametre (dvs. L * i området fra 0 (sort) til 100 (hvid), a * i området fra -100 (grøn) til 100 (rød), og b * i området fra -100 (blå) til 100 (gul )), i vores farvet hår blev derefter sammenlignet, som vist i figur 2B. Selvom AE værdier afveg kun lidt til de forskellige farvning betingelser, farven parametre var relativt uensartede (figur 2B), i overensstemmelse med de forskellige synlige farver af hårlokker (figur 3).
Endelig blev kontrolleret detergent modstand af farvet hår. Som det ses i figur 4, alle farvet hår generelt fastholdt deres16, E-værdier mod gentagne SDS behandlinger, hvilket indikerer, at de polymere farvestoffer med eller uden mordanting resulteret i permanent farvning. Når blev anvendt planten monomerer uden polymerisation, de AE-værdier var omvendt proportional med antallet af SDS behandling, der anvendes (figur 4). I modsætning hertil farvning var mere stabile, når de kun eller med FeSO4 polymere farvestoffer blev anvendt.
Figur 1. Ordning for planter phenol-baserede polymere farvestof syntese og dens anvendelse i keratin hårfarvning. En enkel og hurtig metode til at farve keratin hår i forskellige nuancer af farve, mens du bruger miljøvenlige og vedvarende plantebaserede fenoler er vist. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Color evaluering af farvet hår. (A) AE-værdier (± SD, n = 7) og (B) fordeling af de tre farve parametre (L *, a *, og b *) under forskellige reaktionsbetingelser. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Fotografiske billeder af hårfarver under forskellige reaktionsbetingelser (A) Virgin grå menneskelige kun hår.; (B) Polymere farvestoffer; (C) Polymere farvestoffer / FeSO4; (D) Polymere farvestoffer / FeSO4 med eddikesyre; (E) Polymere farvestoffer / FeSO4 i pH 11 vand; (F) Polymere farvestoffer / FeSO4 i pH 3 vand; (G) Polymere farvestoffer / FeSO4 med ammoniak; (H) Monomerer / FeSO4. Scale bar er 0,5 cm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Color holdbarhed farvet hår til gentagne vaskemiddel behandlinger. Jo større stabiliserende virkninger af direkte farvning (Polymere farvestoffer) og mordanting med polymere produkter (Polymer farvestoffer / FeSO4) snarere end mordanting med monomerer (monomerer / FeSO4) blev vist ( ± SD, n = 7). klik her for at se et larger version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Interessant, vores metode reduceret den tid det tog at farve keratin hår med oxidant-induceret polymerisationer af naturlige fenoler. Det inducerede også forskellige farver i håret gennem enkle manipulationer af de polymere farvestoffer, såsom ændring af pH og anvende bejdsemiddel.
In situ inkubation af keratin hår med laccase-katalyseret oxidation af plante fenoler kræver alt for lange inkubationstider at opnå effektiv farvning 7. Sådanne langsomme farvning kinetik kan skyldes de ringe bindende evner plante- phenoler og til de indledende oligomerer med meget lave molekylvægte og dermed forsinke starttidspunktet for faktiske hårfarvning indtil polymerer med relativt høje molekylvægte dannes. Den hurtige hårfarvning og farve holdbarhed observeret, når direkte ved hjælp af de polymere produkter (figur 2A og 4) stærkt støtte ovenstående hypotese. Den øgede binding evne og tilstedeværelsen af en chromophore i polymererne kan have bidraget til den hurtige hastighed af permanent hårfarvning. Selvom andre forskere har vist, at nogle monomere phenoler er i stand til at binde godt til visse overflader, den bindende holdbarhed i nærvær af eksterne stimuli er uklar, da forfatterne evaluerede de bindende fænomener under meget milde betingelser 10, 11. Hertil kommer, en chromophor ikke var til stede i de testede monomere forbindelser. Derfor er det mest kritiske skridt i denne protokol er at bruge produkter fremstillet efter 24 timers rugede reaktioner, fordi et stort antal af høj molekylvægt, er farverige phenolpolymerer udviser stærke bindende egenskaber således tilstrækkeligt dannet.
Adskillige undersøgelser har anvendt metal ion-phenol-komplekser til farve tekstiler 12, 13 Der er to mulige mekanismer for disse farvning fænomener:. Metalionen-phenol-komplekser fungere som chromoforer, eller metalionerne bidirektionalt koordinere phenoler og overflades som skal farves, hvilket fører til stærk binding af komplekserne. Variabiliteten i hårfarve afhængig af tilstedeværelsen af Fe-ioner (figur 2B og 4), er i overensstemmelse med begge de ovennævnte mekanismer, fordi samordningen af metalionerne med de polymere produkter og monomerer kan resultere i en ændring og generering af farve, henholdsvis . Derudover kan de detaljerede koordinering bonding strukturer er blevet moduleret af pH-ændringer, som observeret i lægemiddelafgivelsessystemer 14. Det er således ikke urimeligt at antyde, at mordanting samtidig med pH-ændringer vil resultere i forskellige farveændringer gennem strukturelle transformationer af kromoforen. Generelt mordanting menes at øge farvning evne naturlige planteekstrakter 13. Men ligheden mellem AE værdier af de polymere farvestoffer med og uden Fe-ioner (figur 2A) indikerede, at koordineringen af Fe med farvestofferne hovedsageligt ændred kromoforen, hvilket resulterer i farvet hår af forskellige farver, som ses i figur 3. High pH ville give højt AE værdier af farvet hår, fordi høje pH midler, såsom ammoniak vand er kendt for at forårsage keratinfibre bliver opsvulmet, hvilket øger farvestof diffusion satser 8. Sådanne spredte farvestoffer er derefter fanget når håret matricer efterspænde. Imidlertid AE værdier af farvet hår ændre lidt med høj pH eller ammoniak, hvilket indikerer, at evnen hos polymere farvestoffer til at binde på håret overflade bedre beskriver hårfarvning i denne protokol, end keratin hævelse.
Color holdbarhed er meget vigtigt i hårfarvning, og indfarvningsmetoder skal producere farvestoffer, der er holdbare i nærvær af ydre stimuli. Især daglig hårvask er den mest betydningsfulde stimulus, der svinder farvet hår 8. Som det ses i figur 4, vores indfarvningsmetoder var meget resistente over for gentagne SDS behandlinger. Jo større stabilizing virkninger af direkte farvning (Polymere farvestoffer) og mordanting med polymerprodukter (Polymere farvestoffer / FeSO4) snarere end mordanting med monomerer (monomerer / FeSO4), som vist i figur 4, kan have været på grund af de større molekylvægte på polymere farvestoffer. Den effektivitet, hvormed metalionerne bro det polymere farvestof og keratin overflade tilsyneladende afhang den gennemsnitlige molekylstørrelse af farvestoffet. Hår er sammensat af forskellige stoffer, herunder melanin, aminosyrer, proteiner og lipider 15. bør gennemføres yderligere undersøgelser for at bekræfte, om denne protokol er effektiv på en række humane hårtyper. Desuden, selv om vores materialer stammer fra naturlige kilder, er en streng toksicitetstest til humane celler kræves for fuldt ud at sikre ikke-toksicitet.
Generelt vi her forudsat en veldefineret metode til at inducere permanent keratin hårfarvning, hjælp miljøvenlige materialer inden for en commercially acceptabel kort periode. Baseret på vores data, der afslører egenskaberne af direkte binding af polymere farvestoffer til keratin hår, vil yderligere fremgangsmåder, der tillader vores polymere farvestoffer til at fungere som aktive bestanddele i kommercialiserede PPD-baserede hår-farvning produkter udvikles.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium dodecyl Sulfate | Promega | H5114 | |
| Laccase from Trametes versicolor | Sigma | 38429-1G | Enzyme activity is denoted as 0.53 U/mg |
| (+)-catechin hydrate | Sigma | C1251-5G | |
| 1,2-dihydroxybenzene (catechol) | Sigma | 135011-5G | |
| Ammonia water | Duksan | 701 | Ammonia contents is denoted as 25 ~ 30% |
| Acetic acid, glacial | Duksan | 448 | |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | JUNSEI | 83380-1250 | |
| Ultracell 5 kDa | Amicon | PLCC06210 | |
| Stirred ultrafiltration cells | Millipore | Model 8200 | |
| Human gray hair | PheonixKorea | Not available | |
| Colorimeter | SPEC | JCS-10 | |
| Square dish | SPL | 10125 | 125 * 125 * 20 (mm) |
References
- Jeon, J. R., Chang, Y. S. Laccase-mediated oxidation of small organics: bifunctional roles for versatile applications. Trends Biotechnol. 31, 335-341 (2013).
- Kudanga, T., Nyanhongo, G. S., Guebitz, G. M., Burton, S. Potential applications of laccase-mediated coupling and grafting reactions: a review. Enzyme Microb Technol. 48, 195-208 (2011).
- Jeon, J. R., Le, T. T., Chang, Y. S. Dihydroxynaphthalene-based mimicry of fungal melanogenesis for multifunctional coatings. Microb. Biotechnol. 9, 305-315 (2016).
- Jeon, J. R., Baldrian, P., Murugesan, K., Chang, Y. S. Laccase-catalyzed oxidations of naturally occurring phenols: From in vivo biosynthetic pathways to green synthetic application. Microb. Biotechnol. 5, 318-332 (2012).
- Chung, K. T., et al. Mutagenicity and toxicity studies of p-phenylenediamine and its derivatives. Toxicol. Lett. 81, 23-32 (1995).
- Bai, Y. H., et al. p-aminophenol and p-phenylenediamine induce injury and apoptosis of human HK-2 proximal tubular epithelial cells. J. Nephrol. 25, 481-489 (2012).
- Jeon, J. R., et al. Laccase-catalyzed polymeric dye synthesis from plant-derived phenols for potential application in hair dyeing: Enzymatic colorations driven by homo- or hetero-polymer synthesis. Microb. Biotechnol. 3, 324-335 (2010).
- Franca, S. A., Dario, M. F., Esteves, V. B., Baby, A. R., Velasco, M. V. R. Types of hair dye and their mechanisms of action. Cosmetics. 2, 110-126 (2015).
- Ball, V., et al. Deposition mechanism and properties of thin polydopamine films for high added value applications in surface science at the nanoscale. BioNanoSci. 2, 16-34 (2012).
- Barrett, D. G., Sileika, T. S., Messersmith, P. B. Molecular diversity in phenolic and polyphenolic precursors of tannin-inspired nanocoatings. Chem. Commun. 50, 7265-7268 (2014).
- Sileika, T. S., Barrett, D. G., Zhang, R., Lau, K. H. A., Messersmith, P. B. Colorless multifunctional coatings inspired by polyphenols found in tea, chocolate, and wine. Agnew. Chem. 52, 10766-10770 (2013).
- Boonsong, P., Laohakunjit, N., Kerdchoechuen, O. Natural pigments from six species of Thai plants extracted by water for hair dyeing product application. J. Clean. Prod. 37, 93-106 (2012).
- Bechtold, T., Turcanu, A., Ganglberger, E., Geissler, S. Natural dyes in modern textile dyehouses - how to combine experiences of two centuries to meet the demands of the future. J. Clean. Prod. 5, 499-509 (2003).
- Zheng, H., Gao, C., Peng, B., Shu, M., Che, S. pH-responsive drug delivery system based on coordination bonding in a mesostructured surfactant/silica hybrid. J. Phys. Chem. C. 115, 7230-7237 (2011).
- Robbins, C. R. Chemical and physical behavior of human hair. , 5th, Springer. 105-176 (2011).
