Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Syntes av växt Fenol-härledda polymera Färgämnen för direkt eller Mordant baserade Hårfärgning

doi: 10.3791/54772 Published: December 1, 2016

Abstract

Effektiv hårfärgning genom in situ inkubation av keratin hår med produkter av svamp lackas katalyserade polymerisationen av växt fenoler har tidigare visats. Emellertid tar lång tid att slutföra jämfört med kommersiella hår-färgningsprodukter färgningsprocessen. För att övervinna denna flaskhals, pre-syntetiserade polymera produkter av oxidativ reaktion av sidenticka lackas på catechin och katekol, antingen med eller utan betningsmedel (t.ex. FeSO 4), var här används för att uppnå permanent keratin hårfärgning i olika färger och nyanser . Lackas verkan i surt natriumacetatbuffert ledde till en djup svart färgning efter kopplingsreaktioner mellan de växt fenoler. De färgade ningsmedel därefter avsaltades och koncentrerades med ultrafiltrering. Färgämnena, med eller utan betningsmedel, orsakade en signifikant ökning av AE-värdena (dvs. färgdifferensvärde) i grått människohår witunna 2,5 timmar. Dessutom har olika keratin färger och nyanser inducerade beroende på mordanting och pH-förändringar. Det färgade håret uppvisade också en stark motståndskraft mot tvättmedels behandlingar, vilket tyder på att våra metoder kan ge upphov till permanent hårfärgning. Sammantaget vårt arbete har gett ny insikt i att utveckla miljövänliga hår-färgning metoder som alternativ till kommersiella giftiga diamin-baserade färgämnen .

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Lackaser är oxidaser som är aktiva mot fenol och polyfenolföreningar. De har identifierats i olika levande organismer, inklusive växter, svampar, insekter och bakterier. Deras enzymatiska åtgärder bidrar till flera morfogenetiska fenomen 1. Enzymerna katalyserar enkelelektronoxidering av substraten, vilket resulterar i bildning av radikaler som ytterligare är kopplade till små organiska och fasta ytor. Sådana kopplingsprocesser leder till syntes av oligomerer och polymerer och till ytan funktionalise 2, 3. När lackas substrat är från naturliga källor, såsom växtfenoler, de enzymatiska reaktionerna är av stort intresse när det gäller grön kemi. Här, både reaktanter och katalysatorer är från naturliga källor. Dessutom resulterande produkterna liknar de naturliga produkterna, eftersom de övergripande reaktioner härma synteser av naturliga fenol in vivo polymerer-inklusive växt lignin, poly (flavonoid), och humus vari små växtfenolföreningar är mycket tvärbundna genom oxidas-inducerad radikal kopplingen 4.

Produkter som härrör från lackaskatalyserade kopplingsreaktioner av vegetabiliska fenoler kan användas för att färga grått hår genom in situ inkubation och kan utvecklas som ett alternativ till kommersiellt tillgängliga färgämnen 1. Sådana alternativ är viktiga, eftersom kommersiella hår-färgningsmedel är baserade på p-fenylendiamin (PPD), PPD relaterade diaminföreningar, och väteperoxid, som har visat sig vara giftiga, cancerframkallande, och allergi för människor 5, 6. I lackas katalyserade kopplingsreaktioner, de lackaser och växt fenoler ersätta funktionellt väteperoxid och p-fenylendiamin, respektive 7. Emellertid är färgningshastigheten hos lackasbaserade system mycket långsammare än den hos den kommersiella ett. I allmänhet PPD-baserade färgning agenter kräver mindre än en timme för att uppnåeffektiv färgförändring i keratin hår, medan lackasbaserade reaktioner kräver en inkubation över natten 7. De långsamma färgnings kinetik kan förklaras av två möjliga fenomen. Först, användning av en låg pH-buffert (t.ex. pH 5) för att maximera lackasaktivitet har observerats att minska graden av svullnad i keratin matriser, vilket hämmar djup penetration av färgämnen in i matriserna. I själva verket har agenter gör det möjligt för färgning reaktioner att fortsätta i hög pH-betingelser har visat sig vara en integrerad del av kommersiella hår-färgning produkter 8. För det andra har antalet möjliga kromofora molekyler som uppvisar stark adsorption till keratinhaltiga ytor under polymerisationsreaktionen visat sig vara proportionell mot inkubationstiden (dvs graden av polymerisation). Till exempel, var omvandlingen av dopamin till polydopamine visat sig inducera en stark vidhäftning till många ytor som var samtidig med bildningen av en svart färg 9. </ P>

I det pågående arbetet, pre-syntetiserade polymera produkter som framställts av T. versicolor lackas oxidation av catechin och katekol användes för att behandla keratin hår för färgning. Vi antog att adsorptionen förmågan hos polymererna skulle vara mycket starkare än den för de monomera växt fenoler och att de initialt skulle bilda med låg molekylvikt oligomerer. Resultaten visade att vid användning av pre-syntetiserade polymerer, den enzymatiska oxidationen makt inte längre var nödvändig. Detta indikerar att pH-värdet kan kontrolleras och att metalljoner kan användas i hårfärgningsbehandlingar, oberoende av enzymaktivitet. Detta protokoll ger en enkel och snabb metod för att färga keratin hår i olika nyanser av färg när du använder miljövänliga och förnybara vegetabiliska fenol (Figur 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Framställning av växt Fenol-härledda polymera Färgämnen

  1. Upplösa katekol (0,1 g) och (+) - katekin-hydrat (0,1 g) i 32 ml av 100 mM natriumacetatbuffert (pH 5,0) och 8 ml absolut etanol.
  2. Tillsätt 10 mg T. versicolor lackas till catechol- och katekin-innehållande buffert. Blanda kraftigt och häll lösningen i en kvadrat petriskål. Inkubera skålen vid rumstemperatur i ett skakande inkubator (25 rpm) under 24 h. Dramatisk färgförändring av lösningen från transparent till mörkt svart kan observeras med blotta ögat efter lackas-inducerad kopplingsreaktioner.
  3. Centrifugera lösningen under 10 min vid 20000 x g för att spinna ner olösliga polymerpartiklar. Använd den djupa svarta supernatanten för ytterligare avsaltning.
  4. Avsalta reaktionslösningen med en 5 kDa ultrafiltreringsskiva. Efter koncentrering av reaktionsvolymen till 20 ml genom ultrafiltrering, byta ut reaktionsbuffert genom tillsats av 300 ml destillerat vatten. Slutligen, med hjälp av filtrering, koncentrera volymen av lösningen till 25 ml.

2. Färgning Lösningar för Gray Keratinhårbehandling

  1. Förbered följande sex polymera lösningar: polymera färgämnen, polymera färgämnen / FeSO 4, polymera färgämnen / FeSO 4 i pH 3 vatten, polymera färgämnen / FeSO 4 i pH 11 vatten, polymera färgämnen / FeSO 4 med ättiksyra, och polymera färgämnen / FeSO 4 med ammoniak.
    1. För det polymera färgämnet, blanda 5 ml destillerat vatten med 1 ml av den avsaltade polymera färgämnen (1,4).
    2. För de etsande lösningar, tillsätt 0,33 g FeSO 4 till blandningen från steg 2.1.1. Kraftigt virvel att upplösa FeSO 4 helt.
    3. För pH 3 eller 11 vattenlösningen, justera pH i 5 ml destillerat vatten med användning av en N HCl eller 1 N NaOH. Därefter tillsätts 1 ml av den avsaltade polymera färgämnen (1,4) och 0,33 g FeSO 4.
    4. För ättiksyra-eller ammoniak-behandlade lösningen, blanda 1,0 ml av glacial ättiksyra eller 1,0 ml av ammoniakvatten med 5 ml destillerat vatten. Därefter tillsätts 1 ml av den avsaltade polymera färgämnen (1,4) och 0,33 g FeSO 4.
  2. För växt monomerer, blanda katekol (0,1 g) och (+) - katekin-hydrat (0,1 g) i 6 ml destillerat vatten, med eller utan 0,33 g FeSO 4, för att suga håret i.
  3. Så snart färgning lösningar från steg 2,1 och 2,2 framställs helt blöt 5 cm långa grå människohår flätor (0,2 g) i lösningarna. Inkubera hårlockar vid 32 ° C i en skakinkubator (160 varv per minut) under 2,5 timmar.
  4. Efteråt, ta ut hårlockar och skölj dem med rinnande vatten. Använd en elektronisk hårtork för att ta bort fukt. Färgförändring som orsakas av de polymera färgämnena kan visualiseras med blotta ögat.
    1. För att erhålla de färgparametrar (dvs, L *, a * och b *), använda en konventionell kolorimeter enligt tillverkarens protokoll. Crumple håret tresses till en boll, så att de kan mätas med linsen av en kolorimeter. Upprepa denna process på en annan region i håret med kolorimeter linsen.
    2. Mäta färgen parametrarna för varje färgat hårlock sju gånger. Beräkna medelvärden och standardavvikelser av parametrarna. Beräkna AE med hjälp av formeln: [(100 - L *) 2 + (a *) 2 + (b *) 2] 1/2.

3. Färg beständighetsprov

  1. Lös upp 200 mg natriumdodecylsulfat (SDS) i 40 ml destillerat vatten. Blötlägg färgat hår fullständigt i SDS-innehållande vatten under 5 min vid rumstemperatur. Ta ut hårlockar och skölj dem med tillräckligt rinnande vatten för att avlägsna rengöringsmedel. Använd en elektronisk hårtork för att ta bort fukt.
  2. För att erhålla de färgparametrar (dvs, L *, a * och b *), använda en konventionell kolorimeter enligt manufacturrens protokoll. Upprepa blötläggning som beskrivs i steg 3,1 gång mer med samma färgat hår och sedan mäta parametrar igen.
  3. Lös upp 800 mg av SDS i 40 ml destillerat vatten. Såsom beskrivs i steg 3,1, upprepa blötläggning två gånger till med samma färgat hår. Övergripande, behandla varje färgat hår hårlock med SDS-lösningen totalt fyra gånger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Först var färgningsförmåga av polymera färgämnen jämfört med den för växthärledda monomerer (dvs., catechin och katekol). De polymera färgämnen inducerade en signifikant förändring i färgen grå keratin hår (Figur 2A och Figur 3), medan den medfödda grå färgen på håret förblev mycket stabil med växt monomerer (data visas ej). Effekterna av mordanting medel på färgning förmåga polymera produkter utvärderades sedan. Som ses i figur 2A, tillsats av Fe-joner ledde till någon ökning av AE-värdet av grått keratin hår. Emellertid var den hårfärg ändrats betydligt med användning av Fe-joner (Figur 3). För att kontrollera om mordanting medel kan framkalla färgning med växtfenol monomerer, var Fe-joner också till de monomerer utan oxidativ polymerisation. Så snart som de Fe-joner löstes med monomererna i en acidic natriumacetat reaktionsbuffert, verkade en djup svart färg omedelbart (data ej visade). Dessutom komplex av Fe och växtmono fenoler visat sig vara effektiva vid färgning grått människohår, vilket resulterar i en effektiv omvandling av grå färg till djupt svart (Figur 3). Den AE-värdet till följd av Fe-växtfenol färgämne var högre än den för de polymera färgämnen (Figur 2A).

För att utvärdera huruvida en förändring av pH-värdet påverkar färgningseffektiviteten av keratin hår med Fe-jon-polymera färgämneskomplex, lågt pH (från pH 3-justerade och ättiksyra-innehållande vatten) och högt pH (från pH 11-justeras och ammoniakinnehållande vatten) testades. Som ses i figur 2A, sådana pH-förändringar ledde till små förändringar i AE-värdet, i motsats till effekten av polymera färgämnen. Men de synliga färgerna från färgat hår ändras markant beroende på vilken pH-justerandemedel användes (figur 3). Intressant, hårfärg till följd av användningen av HCI skilde sig från den som följer av ättiksyra, trots deras till synes liknande roller i pH-kontroll. Olika hårfärger resulterade också från NaOH och ammoniak. Alla tre färgparametrar (dvs L * som sträcker sig från 0 (svart) till 100 (vitt), a * som sträcker sig från -100 (grön) till 100 (röd) och b * som sträcker sig från -100 (blå) till 100 (gul )) av vår färgade håret jämfördes sedan, såsom visas i figur 2B. Även om AE-värdena skilde bara något för de olika färgningsförhållanden färgparametrarna var relativt disparata (figur 2B), i linje med de olika synliga färgerna på hårlockar (Figur 3).

Slutligen tillsattes detergenten motståndet hos färgat hår kontrolleras. Som framgår av Figur 4, alla färgat hår i allmänhet behållit sin16, E-värdena mot upprepade SDS behandlingar, vilket indikerar att de polymera färgämnen med eller utan mordanting resulterat i permanent färgning. När anläggningen monomerer utan polymerisation användes, de AE-värdena var omvänt proportionell mot antalet SDS behandlingar som används (Figur 4). I motsats, av färgning var mer stabil när endast eller med FeSO 4 polymera färgämnen användes.

Figur 1
Figur 1. System för växtfenolbaserade polymera färg syntes och dess tillämpning i keratin hårfärgning. En enkel och snabb metod för att färga keratin hår i olika nyanser av färg när du använder miljövänliga och förnybara vegetabiliska fenoler visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.


Figur 2. Färg utvärdering av färgat hår. (A) AE-värdena (± SD, n = 7) och (B) fördelningen av de tre färgparametrar (L *, a * och b *) under olika reaktionsbetingelser. Please klickar här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. fotografiska bilder av hårfärgningsmedel under olika reaktionsbetingelser (A) Virgin grå mänskliga bara hår. (B) Polymera färgämnen; (C) Polymera färgämnen / FeSO 4; (D) Polymera färgämnen / FeSO 4 med ättiksyra; (E) Polymera färgämnen / FeSO 4 i pH 11 vatten; (F) Polymera färgämnen / FeSO 4 i pH 3 vatten; (G) Polymera färgämnen / FeSO 4 med ammoniak; (H) monomerer / FeSO 4. Skala bar är 0,5 cm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4. Färg hållbarhet färgat hår upprepade tvättmedels behandlingar. Ju större stabiliserande effekten av direkt färgning (Polymera färgämnen) och mordanting med polymera produkter (Polymer färgämnen / FeSO 4) snarare än mordanting med monomerer (monomerer / FeSO 4) visade ( ± SD, n = 7). klicka här för att se en larGER version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Intressant nog vår metod reduceras den tid det tog att färga keratin hår med oxiderande-inducerade polymerisationer av naturliga fenoler. Det inducerade också olika färger i håret genom enkla manipulationer av polymera färgämnen, såsom att förändra pH och tillämpa betningsmedel.

In situ inkubation av keratin hår med lackas oxidation av växt fenoler kräver alltför långa inkubationstider för att uppnå effektiv färgning 7. Sådana långsamma färgnings kinetik kan bero på de dåliga bindningsförmåga av växt fenoler och de initiala oligomerer med mycket låga molekylvikter, vilket fördröjer starttiden för färdiga hårfärgning tills polymerer med relativt höga molekylvikter bildas. Den snabba hårfärgning och färg hållbarhet observerades när direkt med hjälp av polymera produkter (figurerna 2A och 4) starkt stöd för hypotesen. Den ökade bindningsförmåga och närvaro av en chromophore i polymererna kan ha bidragit till den snabba hastigheten för permanent hårfärgning. Även andra forskare har visat att vissa mono fenoler kan binda väl till vissa ytor, är oklart bindande hållbarhet i närvaro av yttre stimuli, som författarna utvärderat bindningsfenomen under mycket milda betingelser 10, 11. Dessutom en kromofor var inte närvarande i de monomera föreningarna som testades. Därför är det mest kritiska steget i detta protokoll för att använda de produkter som framställts efter 24 tim inkuberade reaktionerna, eftersom ett stort antal av hög molekylvikt, är färgstarka fenolpolymerer uppvisar starka bindningsegenskaper således tillräckligt bildats.

Flera studier har använt metall jon-fenolkomplex färga textil 12, 13 Det finns två möjliga mekanismer för dessa färgningsfenomen:. Metalljonen-fenolkomplex fungerar som kromoforer eller metalljonerna dubbelriktat samordna fenoler och kan ytanes som skall färgas, vilket leder till en stark fastsättning av komplexen. Variationen i håret färg beroende på närvaron av Fe-joner (figurerna 2B och 4) är i överensstämmelse med båda ovanstående mekanismer, eftersom samordningen av metalljonerna med de polymera produkter och monomerer kan resultera i en förändring och generering av färg, respektive . Dessutom kan de detaljerade samordningsbindningsstrukturer har module av pH-förändringar, som observerats i läkemedelsleveranssystem 14. Det är därför inte orimligt att föreslå att mordanting samtidigt med pH-förändringar skulle resultera i olika färgförändringar genom strukturomvandlingar av kromoforen. I allmänhet är mordanting antas förbättra färgning förmågan hos naturliga växtextrakt 13. Men likheten mellan AE-värdena hos de polymera färgämnen med och utan Fe-joner (Figur 2A) visade att samordningen av Fe med färgämnen huvudsakligen förändringd kromoforen, vilket resulterar i färgat hår av olika färg, såsom framgår av fig 3. Högt pH skulle leda till höga AE-värdena av färgat hår, eftersom höga pH-medel, såsom ammoniak vatten är kända för att orsaka keratinfibrer svullnad, vilket skulle öka dye diffusionshastigheter 8. Sådana spridda färgämnen sedan fångas när håret matriser dra åt. Emellertid AE-värdena av färgat hår förändras lite med högt pH eller ammoniak, vilket indikerar att förmågan hos polymera färgämnen för att binda på håret ytan bättre beskriver hårfärgning i detta protokoll än vad keratin svullnad.

Färg hållbarhet är mycket viktig i hårfärgning och färgning Metoderna bör färgämnen som är hållbara i närvaro av yttre stimuli. I synnerhet, är daglig schamponering den mest betydande stimulus som bleknar färgat hår 8. Såsom framgår av fig 4, våra färgningsmetoder var mycket resistenta mot upprepade SDS behandlingar. Ju större stalisera effekterna av direkt färgning (Polymera färgämnen) och mordanting med polymera produkter (Polymera färgämnen / FeSO 4) snarare än mordanting med monomerer (monomerer / FeSO 4), som visas i figur 4, kan ha berott på de större molekylvikterna för polymer färgämnen. Den effektivitet med vilken metalljonerna överbryggade polymera färg och keratin yta tydligen berodde på den genomsnittliga molekylstorleken av färgämnet. Hår består av olika substanser, inklusive melanin, aminosyror, proteiner och lipider 15. Ytterligare studier ska genomföras för att bekräfta huruvida detta protokoll är effektiv på en mängd olika humana hårtyper. Dessutom, även om våra material härrör från naturliga källor, är ett test strikt toxicitet för humanceller krävs för att till fullo garantera icke-toxicitet.

Sammantaget här förutsatt att vi en väl definierad metod för att inducera permanent keratin hårfärgning, användning av miljövänliga material inom en commercially acceptabelt kort tidsperiod. Baserat på våra data avslöjar egenskaperna hos den direkta bindningen av polymera färgämnen till keratin hår kommer ytterligare metoder som möjliggör våra polymera färgämnen för att agera som aktiva komponenter i kommersialiserade PPD-baserade hår-färgning produkter utvecklas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium dodecyl Sulfate Promega H5114
Laccase from Trametes versicolor Sigma 38429-1G Enzyme activity is denoted as 0.53 U/mg
(+)-catechin hydrate Sigma C1251-5G
1,2-dihydroxybenzene (catechol) Sigma 135011-5G
Ammonia water  Duksan 701 Ammonia contents is denoted as 25 ~ 30%
Acetic acid, glacial Duksan 448
Iron(II) sulfate heptahydrate JUNSEI 83380-1250
Ultracell 5 kDa Amicon PLCC06210
Stirred ultrafiltration cells Millipore Model 8200
Human gray hair PheonixKorea Not available
Colorimeter SPEC JCS-10
Square dish SPL 10125 125 * 125 * 20 (mm)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jeon, J. R., Chang, Y. S. Laccase-mediated oxidation of small organics: bifunctional roles for versatile applications. Trends Biotechnol. 31, 335-341 (2013).
  2. Kudanga, T., Nyanhongo, G. S., Guebitz, G. M., Burton, S. Potential applications of laccase-mediated coupling and grafting reactions: a review. Enzyme Microb Technol. 48, 195-208 (2011).
  3. Jeon, J. R., Le, T. T., Chang, Y. S. Dihydroxynaphthalene-based mimicry of fungal melanogenesis for multifunctional coatings. Microb. Biotechnol. 9, 305-315 (2016).
  4. Jeon, J. R., Baldrian, P., Murugesan, K., Chang, Y. S. Laccase-catalyzed oxidations of naturally occurring phenols: From in vivo biosynthetic pathways to green synthetic application. Microb. Biotechnol. 5, 318-332 (2012).
  5. Chung, K. T., et al. Mutagenicity and toxicity studies of p-phenylenediamine and its derivatives. Toxicol. Lett. 81, 23-32 (1995).
  6. Bai, Y. H., et al. p-aminophenol and p-phenylenediamine induce injury and apoptosis of human HK-2 proximal tubular epithelial cells. J. Nephrol. 25, 481-489 (2012).
  7. Jeon, J. R., et al. Laccase-catalyzed polymeric dye synthesis from plant-derived phenols for potential application in hair dyeing: Enzymatic colorations driven by homo- or hetero-polymer synthesis. Microb. Biotechnol. 3, 324-335 (2010).
  8. Franca, S. A., Dario, M. F., Esteves, V. B., Baby, A. R., Velasco, M. V. R. Types of hair dye and their mechanisms of action. Cosmetics. 2, 110-126 (2015).
  9. Ball, V., et al. Deposition mechanism and properties of thin polydopamine films for high added value applications in surface science at the nanoscale. BioNanoSci. 2, 16-34 (2012).
  10. Barrett, D. G., Sileika, T. S., Messersmith, P. B. Molecular diversity in phenolic and polyphenolic precursors of tannin-inspired nanocoatings. Chem. Commun. 50, 7265-7268 (2014).
  11. Sileika, T. S., Barrett, D. G., Zhang, R., Lau, K. H. A., Messersmith, P. B. Colorless multifunctional coatings inspired by polyphenols found in tea, chocolate, and wine. Agnew. Chem. 52, 10766-10770 (2013).
  12. Boonsong, P., Laohakunjit, N., Kerdchoechuen, O. Natural pigments from six species of Thai plants extracted by water for hair dyeing product application. J. Clean. Prod. 37, 93-106 (2012).
  13. Bechtold, T., Turcanu, A., Ganglberger, E., Geissler, S. Natural dyes in modern textile dyehouses - how to combine experiences of two centuries to meet the demands of the future. J. Clean. Prod. 5, 499-509 (2003).
  14. Zheng, H., Gao, C., Peng, B., Shu, M., Che, S. pH-responsive drug delivery system based on coordination bonding in a mesostructured surfactant/silica hybrid. J. Phys. Chem. C. 115, 7230-7237 (2011).
  15. Robbins, C. R. Chemical and physical behavior of human hair. 5th, Springer. 105-176 (2011).
Syntes av växt Fenol-härledda polymera Färgämnen för direkt eller Mordant baserade Hårfärgning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Im, K. M., Jeon, J. R. Synthesis of Plant Phenol-derived Polymeric Dyes for Direct or Mordant-based Hair Dyeing. J. Vis. Exp. (118), e54772, doi:10.3791/54772 (2016).More

Im, K. M., Jeon, J. R. Synthesis of Plant Phenol-derived Polymeric Dyes for Direct or Mordant-based Hair Dyeing. J. Vis. Exp. (118), e54772, doi:10.3791/54772 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter