Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Hoge-resolutie optische kaart brengen van de Muis sinusknoop

Published: December 2, 2016 doi: 10.3791/54773
Automatic Translation
1, 1
1Department of Medicine, University of Wisconsin-Madison School of Medicine and Public Health

Summary

Hier presenteren we een protocol voor optische kaart brengen van de elektrische activiteit van de muis rechteratrium en vooral de sinusknoop, bij een hoge ruimtelijke en temporele resolutie.

Protocol

Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide voor de Zorg en gebruik van proefdieren (NIH Pub nr. 80-23). Alle methoden en protocollen die worden gebruikt in deze studies zijn door de Universiteit van Wisconsin Animal Care en gebruik Protocol goedgekeurd naar aanleiding van de Richtlijnen voor de Zorg en gebruik van proefdieren gepubliceerd door de NIH (publicatie nr 85-23, herzien 1996). Alle dieren die worden gebruikt in deze studie kregen humane zorg in overeenstemming met de Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren.

1. Hart verwijderen en Langendorff perfusie

  1. Vóór hart isolatie, warm Tyrode oplossing tot 37 ° C met een waterbad en een watermantel.
  2. Verdoven de muis met 5% isofluraan / 95% O2.
  3. Zorgen voor passende niveau van de anesthesie door het controleren van het verlies van de pijn reflex.
  4. Voer thoracotomie. Open de kist met behulp van gebogen 5.5 "Mayo schaar en 5.5" Kelly hemostatische voorceps een 1 cm gesneden op de voorkant van de thorax maken.
    1. Snel pak het hart uit de borstkas (binnen 30 sec). Gebruik 4 "gebogen Iris tang om het longweefsel grijpen en knip de longen, thymus en hart samen met het hartzakje met behulp van 4,3" Iris schaar. Heb het hart niet direct te grijpen.
    2. Wassen in geoxygeneerde (95% O2 / 5% CO 2), constante temperatuur (36,8 ± 0,4 ° C) gemodificeerde Tyrodes oplossing. Gebruik de volgende oplossing samenstelling (mM): NaCl 128,2, KCl 4,7, 1,19 NaH 2PO 4, 1,05 MgCl2, CaCl2 1,3, 20,0 NaHCO3 en 11,1 glucose (pH 7,35 ± 0,05).
  5. Terwijl gebaad in dezelfde oplossing, identificeren de long, thymus en vetweefsel. ontleden ze voorzichtig uit het hart. Gebruik gebogen 3 "Vannas-Tübingen schaar en 4,3" # 5 tang.
  6. identificeren dan de aorta en canule het op een op maat gemaakte 21 G canule. Gebruik twee gebogen 4,3 "# 5B krachtps.
  7. Na cannulatie gelijktijdig perfuseren (via de canule met een stroomsnelheid van ~ 5 ml / min; dit moet worden aangepast op basis van de aorta druk, zie hieronder) en superfuse (in het bad bij een stroomsnelheid van ~ 50 ml / min) het hart met verwarmde en gefilterd Tyrode oplossing in het gehele experiment. Voorbij de perfusievloeistof via een in-lijn 11 pm nylon filter om verstopping van de coronaire circulatie voorkomen.
  8. Met een drukomzetter (of manometer) via een 3-weg kraan Luer lock de perfusie lijn, bewaken de aortadruk en onderhouden tussen 60 en 80 mmHg. Stel perfusie snelheid indien nodig om de druk aorta binnen dit bereik te houden.

2. optische kaart brengen van de SAN uit de Langendorff-geperfuseerde Whole Heart

  1. Instrumentatie
    1. Plaats het hart horizontaal en speld de ventriculaire apex om het met silicium beklede bodem van de tank af met 0,1 mm diameter kunnen pRevent-stream-geïnduceerde beweging tijdens het experiment. 12
    2. Steek een kleine (0,012 "ID x 0,005") silicium buis in de linker ventrikel (LV) via de pulmonaire ader, de linker atria (LA) en de mitralisklep (MV). Bevestig de buis met een zijden hechtdraad (4-0) naar de klinkende bindweefsel.
    3. Plaats het hart met zijn achterste naar boven (Figuur 1A, linker paneel).
    4. Speld de rand van de RA appendage (RAA) aan het siliciumatoom bodem van de tank af met 0,1 mm diameter minutien pinnen. Pas de niveau om het achterste oppervlak van de vlakke RA, en begint deze te bevinden brandvlak van de camera. Dit optische metingen van de maximale oppervlakte van het atrium mogelijk.
    5. Lus superior (SVC) en inferior (IVC) vena cava door een zijden hechtdraad (4-0) uitstrekken en speld het andere uiteinde van de hechtdraad naar de bodem van een silicium beklede kamer (zie figuur 3A). Zorg ervoor dat de hechtingen niet blokkeren deoptische gezichtsveld.
    6. Plaats de op maat gemaakte stimulatie-elektrode aan de rand van de RAA. Elektroden maken gebruik siliconencoating 0,25 mm diameter zilverdraden met 0,5 mm elektrodeafstand en verstoken van siliconen voor een lengte van 1 mm aan het einde stimulatie. Plaats dan twee ECG 12 mm naald (29-gauge) monopolaire elektroden in de buurt van de basis van de rechter en linker ventrikels. Doe gemalen ECG-elektrode nabij de top van de ventrikels.
  2. kleuring
    1. Aangezien zowel fluorescerende kleurstoffen en elektro-mechanische ontkoppelrail blebbistatin zijn lichtgevoelig, voeren alle hieronder in een donkere kamer beschreven procedures. Maak eerst spanningsgevoelige kleurstof RH-237 of di-4-ANNEPS als voorraadoplossing, 1,25 mg / ml in dimethylsulfoxide (2,5 mM), deze hoeveelheid (30 pl elk) en de hoeveelheden opgeslagen bij -20 ° C.
    2. Verdun 5-10 pi kleurstof voorraadoplossing in 1 ml verwarmd (37 ° C) Tyrode oplossing en vervolgens injecteren in de coronaire perfusie lijngedurende 5-7 min onder toepassing van een in-line Luer injectiepoort.
    3. Bereid blebbistatin als stockoplossing (2 mg / ml in dimethylsulfoxide, 6,8 mM) vooraf en het op 4 ° C.
    4. Na 20 minuten stabilisatie, voeg 0,5 ml verwarmd (37 ° C) blebbistatin in het perfusaat en verdun 0,1 ml blebbistatin in 1 ml verwarmd (37 ° C) Tyrode oplossing. vervolgens geïnjecteerd in de coronaire perfusie lijn gedurende 5-7 min onder toepassing van een in-line Luer injectiepoort.

3. optische in kaart brengen van de SAN uit de geïsoleerde atriale Voorbereiding

  1. Instrumentatie
    1. Voor de geïsoleerde atriale bereiden, isoleren en canule het hart zoals hierboven beschreven in stappen 1.1-1.5 voor hele hartsvoorbereiding.
    2. Ontleden de ventrikels van het voorvlak. Zie figuur 1A, rechter paneel, gesneden # 1 voor details.
    3. Open de RA door te snijden door de tricuspid valve (TV) langs de TV-SVC as. Zie figuur 1A, rechter paneel, gesneden # 2 voor meer informatie.
    4. Snijd de mediale onderdeel van het crista terminalis de RAA openen. Zie figuur 1A, rechter paneel, knippen # 3.
    5. Open de voorste atriale vrije wand door het uitvoeren van een verlaging van de middellijn van het vorige cut # 3 naar de rand van de rechter benedenhoek van de RAA, plat en speld de atriale vrije wand naar de bodem van een silicium beklede kamer. Zie de richting aangegeven door de holle pijl in figuur 1A, gesneden # 4. Behoud van een rand van ventriculair weefsel voor de bereiding pinnen om schade aan de atria voorkomen.
    6. Voorts zullen open LA door snijden door de MV langs de MV-bovenhoek van de LA appendage (LAA).
    7. Het LAA, gesneden uit het midden van de geopende LAA door de voorste atriale vrije wand geopend tot nabij een midden rand van het LAA.
    8. Open de voorste atriale vrije wand along dezelfde richting, dan plat en speld aan de bodem van een Sylgard beklede kamer.
    9. Gedeeltelijk verwijder de interatriale septum weefsel. Dit verstrooiing van het optische signaal van weefsel dat is niet scherp reduceren. Derhalve zijn zowel de LA en RA en de SAN en atrioventriculaire junctie (AVJ) toegankelijk in dit preparaat (figuur 1B).
    10. Til het uiteindelijke preparaat ongeveer 0,5 mm van de bodem van het met silicium beklede kamer om superfusie zodat zowel epicardiale en endocardiale oppervlak.
    11. Superfuse het preparaat met voorverwarmde (37 ° C) Tyrode oplossing bij een constante snelheid van ~ 12 ml / min voor een gerichte stroming vlakbij het SVC en ~ 30 ml / min voor een bad superfusie.
    12. Plaats de op maat gemaakte stimulatie Ag / AgCl elektrode 2 (0,25 mm) aan de rand van de RAA ontleed. Plaats dan twee ECG 12 mm naald (29G) elektroden (monopolair) in de buurt van de RAA en LAA, respectievelijk. Plaats de grond ECG uitverkorenenreed in de buurt van de AVJ.
  2. kleuring
    1. Voer een directe toepassing van het voltage-gevoelige kleurstof (RH-237 of di-4-ANNEPS). Hiervoor verdunde 1-2 ul van de kleurstof voorraadoplossing in 1 mm verwarmde (37 ° C) Tyrode oplossing en rustig uit verdunde kleurstof op het oppervlak van het preparaat met behulp van een pipet 1 mm.
    2. Alternatief voeren atriale kleuring met spanningsgevoelige kleurstof door een coronaire perfusie van het Langendorff-geperfuseerde hart overeenkomstig aan die boven beschreven voor de gehele hartsvoorbereiding (stappen 2.2.1-2.2.2).
      1. Na de coronaire perfusie kleuring, isoleer het atriale preparaat beschreven. Voer extra oppervlak vlekken als dat nodig is om een ​​bevredigend fluorescentie niveau te bereiken. Snelle atriale isolatie niet bleken de kleurstof en heeft geen invloed op de kwaliteit van de kleuring.
    3. Immobiliseren het preparaat met de elektro-mechanische ontkoppelrail, blebbistatin. Verdun 3-5 ul blebbistatin voorraadoplossing in de verwarmde (37 ° C) Tyrode oplossing en rustig uit verdunde blebbistatin op het oppervlak van het preparaat en de omringende oplossing. Aangezien blebbistatin is aangetoond lichtgevoelige 13,14 vermijden lange blootstelling aan licht tijdens de bereiding en te kleuren.
    4. Voer aanvullende blebbistatin toepassing zoveel als nodig is om krimp te onderdrukken. Gewoonlijk tot 3 extra toepassingen (3-5 gl per elke toepassing) kan worden gebruikt om bewegingsartefacten voldoende te onderdrukken om nauwkeurig reconstrueren SAN en atriale activering.
    5. Voeg extra 0,5 ml verwarmd blebbistatin in het perfusaat. Tijdens deze procedure onderbreekt de superfusie gedurende 30 seconden om de kleurstof / blebbistatin het atriale weefsel te kleuren.

4. Optical Mapping Set Up

Opmerking. Een gedetailleerde beschrijving van het optische mapping systeem elders 12

  1. Gebruik een camera met een temporal resolutie van 2000 frames / sec of hoger, en een aantal lenzen condensor ruimtelijke resolutie van 100 um / pixel of hoger bereiken. Dit is nodig om SAN activatie en intranodale vermeerdering reconstrueren.
  2. Om beweging artefact terug te brengen van de trillende oplossing, vast te stellen een kleine dekking van glas op het oppervlak van de oplossing over het hart / geïsoleerde atriale voorbereiding.
  3. Gebruik excitatielicht (520 ± 45 nm golflengte) geleverd door een constante stroom, geluidsarme halogeenlamp. Richt de gefilterde lichtstraal op de voorbereiding door het gebruik van een flexibele gevorkte lichtgeleider.
  4. Filter de uitgestraalde fluorescentie door een lange-doorlaatfilter (> 715 nm). Verzamelen, digitaliseren en opslaan van de verworven tl-signaal op een computer met behulp van software die door de fabrikant van camera.

5. Data Processing

OPMERKING: Optische kaartgegevens verzameld en opgeslagen als een reeks matrices van fluorescentie-intensiteit op verschillende tijdstippen. Elke pixel represents een maat fluorescentie-intensiteit vanuit een specifieke locatie op het weefsel preparaat op een bepaald tijdstip. Achtergrondfluorescentie wordt automatisch verwijderd per pixel om een ​​betere visualisatie van fluorescentieveranderingen door membraan spanningswisselingen en ondersteboven te komen met actiepotentialen (AP's) gemeten met micro-elektrode systemen. Details van de verschillende stappen in de verwerking van optische beeldgegevens, waaronder beeldsegmentatie, ruimtelijke filtering, filtering en basislijnafwijking verwijderen, worden in de gefocusseerde beoordeling. 15

  1. Handmatig of via een speciaal algoritme (bijvoorbeeld een drempelwaardebepaling en grenslijndetectie) 15 aan weefsel grenzen bepalen, maakt een binair masker van 1 (inbegrepen pixels) en 0 (exclusief pixels) en het masker gelden voor elk frame in de reeks. Dit proces zorgt voor een binair beeld dat de gebieden van belang voor verdere verwerking benadrukt.
  2. Om de signaal-ruisverhouding van de opt verbeterensche gegevens, filteren de signalen binnen de geselecteerde gebieden van belang. Gebruik hiervoor ruimtelijke (dwz middelen van aangrenzende fluorescerende pixels zoals gedefinieerd door een gewenst convolutie bak of kernel bijvoorbeeld 3 x 3 of, voor luidruchtige data, 5 x 5) en / of temporele filtering (bijvoorbeeld, Butterworth, Chebyshev Type 1, Chebyshev Type 2, elliptisch enz.) (figuur 2). Houd rekening met de mogelijkheid van gefilterde geïnduceerde artefacten bij de interpretatie van de gegevens. Voor meer details, zie beoordeling. 15
  3. Verwijderen drift van de basislijn optische opnames wanneer nodig (met hoogdoorlaatfiltering of polynoom passend bij het oorspronkelijke signaal) en vervolgens normaliseren elke pixel signaal van 0 (minimum fluorescentie) tot 1 (maximum fluorescentie).
  4. Selecteer een tijdvenster dat de activeringstijden van alle pixels van één AP vermeerdering omvat. Wijs aan elke pixel de activering tijd als de tijd van de maximale opwaartse slag derivaat (dF / dt max, waarbij F fluorescence intensiteit). Met behulp van alle pixel activering tijden, reconstrueren de isochrone activering kaart. Elke isochron zal dus tonen de pixels geactiveerd tegelijkertijd.
  5. De AP (APD) distributietoewijzing reconstrueren, voor elke pixel berekenen van de tijdsduur tussen de activeringstijd en de tijd op een bepaald niveau van repolarisatie (bijvoorbeeld bij 80% van repolarisatie, APD 80). Met behulp van alle pixel APD waarden, reconstrueren de APD distributie isochrone kaart. Elke isochron zal dus tonen de pixels met dezelfde APD.
  6. Om geleidingssnelheid AP vermeerdering berekenen, dient een oppervlak van het preparaat op de activeringstijd gegevens berekend 5,4. Gebruik hiervoor polynoom oppervlak aanbrengen of lokale kernel oppervlak smoothing en dan berekenen lokale geleidingssnelheid vectoren van het verloop van de gemonteerde oppervlak.
  7. Om de repolarisatie kaart te maken, toe te wijzen elke pixel zijn repolarisatie tijd, gedefinieerd als de maximale tweede afgeleide (d 2 F / dt2) van het optische signaal aan het einde van de OAP of het tijdstip van 90% repolarisatie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Optische kaart brengen van de Intact SAN uit de Langendorff-geperfuseerde Heart
Een typisch voorbeeld van een RA activatie hoogtekaart gereconstrueerd spontane sinusritme getoond in figuur 3 voor een Langendorff-geperfuseerde muizenhart. De vroege activatie punt ligt in het gebied nabij de intercaval SVC waarbij de SAN anatomisch gedefinieerd. 3,16 Twee RA activatie contourkaarten verworven 1,0 en 0,5 msec bemonsteringssnelheid zijn getoond in Figuur 3B.

SAN werking evalueren we het SAN hersteltijd (SANRT). Na 9 RAA stimulatie gedurende ten minste 1 min gemeten bij 10-12 Hz, werd de elektrische stimulatie gestopt en SANRT werd berekend als het tijdsinterval tussen de laatst opgenomen AP en de eerst spontane AP (Figuur 3C). De SANRT werd gecorrigeerd om de hartslag (dwz SANRT <sub> c) berekenen van het verschil tussen de SANRT en basis cycluslengte. Bovendien, de locatie van de eerste post-stimulatie pacemaker geïdentificeerd. Voor dit voorbeeld de SANRTc ongeveer 49 msec.

Geïsoleerde Atria en SAN Activation
De activering van de geïsoleerde atriale preparaat bij spontane sinusritme getoond in figuur 4A. Het is ontstaan in de anatomisch gedefinieerde SAN buurt van de SVC met een brede golf front dat anisotroop de hele RA verspreiden, met twee preferentiële geleiding richtingen in de buurt van de superieure en inferieure SAN randen en volledige blok aan het septum richting (gemarkeerd activering kaarten in Figuur 4A) . De activering kaart verworven op 1 ms sampling rate laat een uitgestrekt gebied van de vroege activering. Een verhoging van de bemonsterfrequentie voor 0,5 msec en 0,3 msec kunnen we de precieze gebied van de leidende pacemaker locatie identificeren. we waargenomen een typische, beat-to-beat stabiele monofocale positie van de toonaangevende pacemaker die overeenkwam met de primaire pacemaker gebied eerder elektrofysiologisch gekenmerkt door glas micro-elektroden 17 en optische mapping 8-11,18,19 alsmede door immunokleuring voor connexin45 en HCN4 . 6,16

Zoals eerder aangetoond, de SAN optische actiepotentiaal bestaat uit een twee-fasesignaal waarvan twee afzonderlijke onderdelen omvat: de langzaam oplopende SAN component en de snel stijgende opgaande het atriale myocardium (atriaal component) (figuur 4B) 20 Door lichtverstrooiing. processen, OAP vertegenwoordigt een gemiddelde elektrische activiteit die voortkomen uit meerdere lagen van de cellen in het weefsel. De verstrooiing diepte en breedte wordt bepaald door een spatie constante, die wordt bepaald door lichtverstrooiing en absorptie-eigenschappen en kan oplopen tot 1,5-2 mm. Vanwege de SAN conductie vertraging, de SAN AP voorafgaat altijd atriale activiteit tijdens de fysiologische activering (Figuur 4B). Om de overgang van de SAN naar het atrium berekenen (bijvoorbeeld SAN geleidingstijd, Sanct), gebruikten we zowel het tijdstip wanneer een dubbele-component SAN signaal 50% van de SAN component amplitude of de eerste piek van de twee-piek bereikt OAP eerste afgeleide (dF / dt). De Sanct uit het gebied van de eerste SAN activering was de RA ~ 5 msec, vergelijkbaar met die gemeten met glas micro-elektroden.

SAN Recovery Time
Evenzo werd de SANRT gemeten in de geïsoleerde atriale preparaat (figuur 4D). Hiervoor werden atriale preparaten gestimuleerd met 12 Hz via een stimulatie-elektrode op de hoek van de RAA gedurende ten minste 1 min. 9 In dit voorbeeld, de SANRTc ongeveer 34 msec, vergelijkbaar met die gemeten in de Langendorff-geperfuseerde hart (Figuur 3C). Bovendien, de locatie van de eerste post-stimulatie pacemaker geïdentificeerd.

Heart Rhythm en TL-signaal stabiliteit in de tijd
Als de operatie en dye laden procedures op de juiste wijze worden opgevolgd, mag er geen significante verandering in de fysiologische kenmerken van het atrium zijn. In figuur 5 geven we het hartritme gemeten voor en na de atriale isolatie en gedurende de 3 uur perfusie. Geen significante veranderingen van de hartslag waargenomen hetzij tijdens atrium isolatie of na dye laden.

Hoewel arteriële kleuring een grotere hoeveelheid kleurstof vereisen, wordt de stabiliteit van het fluorescentiesignaal in de SAN omgeving weefsel beter met deze loading methode. In figuur 6 geven we signaalintensiteit decay tijd voor zowel coronaire en oppervlakte kleuring. in t Hij SAN weefsel IC 50 (dat de periode waarin signaalintensiteit overleden is tot 50% is) is ongeveer 107 minuten na coronaire kleuring, bijna twee keer zo lang als die oppervlakte kleuring.

Figuur 1
Figuur 1:. Isolatie van de Muis atriale Voorbereiding (A) Chirurgische ingrepen uitgevoerd om de muis atriale voorbereiding isoleren. De dorsaal aanzicht van het hart wordt weergegeven. Alle bezuinigingen worden getoond door gestippelde rode lijnen en gelabeld met nummers in de volgorde uitgevoerd. Zie details in de tekst. (B) De schematische schets van de geïsoleerde muis atriale preparaat waarin de belangrijkste anatomische kenmerken, zoals de trabeculaire structuur van de linker en rechter atriale appendages en de locatie van de sinusknoop (SAN, gelabeld met een grijs ovaal). Alle afkortingen worden in de figuur.tp_upload / 54773 / 54773fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2:. Ruw en bewerkt Signalen Opgenomen in 0,3, 0,5 en 1 msec / beeld Raw signalen worden verzameld uit een enkele pixel. Na 3 x 3 binning, worden de signalen gefilterd met behulp van de low-pass Butterworth algoritme. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3: Whole-hart Optische kaart brengen van de SAN (A) links, foto van een typisch preparaat voor het in kaart brengen van de SAN uit de intacte hart.. Het blauwe vierkant geeft het optische gebied vanview (6 mm bij 6 mm). Rechts, optische gezichtsveld vastgelegd door de camera en bovenop met anatomische oriëntatiepunten. SVC en IVC: superieure en inferieure vena cava; RAA: rechter hartoor; RV en LV: rechter en linker ventrikels; PV: pulmonaire aders. (B) Kleur contour activering kaarten verworven met 1,0 msec (links) en 0,5 msec (rechts) sampling rate. Aan de rechterkant van elke kaart, de corresponderende kleur tijdschaal aangeeft atriale activering tijd (vanaf de vroegste activatie punt in blauw, om de laatste activering punt in rood) wordt weergegeven. De vroegste atriale activeringsplaats gelabeld door een sterretje. (C) SAN hersteltijd (SANRT), gemeten in het hele hart voorbereiding. Representatieve voorbeelden van de atriale activering contourkaarten gereconstrueerd laatste stimulatiepuls (S1) en de eerste post-stimulatie atriale slag (A1) getoond gedurende de op de representatieve OAP spoor geplaatst beats.Plaatsen van de eerste atriale activering worden gelabeld met een sterretje. BCL:. Basic cycluslengte Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 4
Figuur 4: High-resolution Optical in kaart brengen van de Muis sinusknoop (SAN) van de endocardiale oppervlak van de geïsoleerde Atria (A) Foto van een typische muis SAN voorbereiding (6 mm x 6 mm) en de bijbehorende activering contour kaarten. verkregen bij 1,0 msec, 0,5 msec en 0,3 msec sampling rates. SAN en een buurman blok zone worden weergegeven door pijlen. Kleur tijdschalen geven atriale activering tijd. Het sterretje geeft de locatie van de leidende pacemaker. RAA: rechter hartoor, SVC en INC: superieure en inferieure vena cava, RV: rechter ventrikel, AVJ: atrio-ventricul ar junction, CT: crista terminalis, IAS: inter-atriale septum. (B) Mechanisme van de dubbele onderdelen van de OAP-opname van de muis SAN omgeving. Zie details in de tekst. . (C) OAPs opgenomen van het centrum van de SAN-omgeving (blauw), de vroegste atriale excitatie website (groen) en de nieuwste RA activering website (rood) Inlegwerk: overgang van nodale atriale golfvorm met een totale geleidingstijd gelijk aan 5 msec. Vergelijk het met de vertraging voor de totale RA activering gelijk aan 11 msec. (D) SAN hersteltijd (SANRT) gemeten in de geïsoleerde atriale voorbereiding. Representatieve voorbeelden van de atriale activering contourkaarten gereconstrueerd laatste stimulatiepuls (S1) en de eerste post-stimulatie atriale slag (A1) getoond. Een plaats van de eerste atriale activering wordt aangeduid door een sterretje. BCL - basic cycluslengte.k "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 5
Figuur 5: Heart Rhythm gemeten voor en na de atriale Isolation Procedure (A) en Tijdens de 3 uur perfusie (B). (A) Spontaan kloppende hartslag wordt getoond voor en na atriale afzondering voor twee types van atriale kleuring: oppervlakte vlekken na isolatie (geen voorafgaande coronaire kleuring) en coronaire vlekken voordat atriale isolement. (B) Spontaan kloppende hart ritme van de prijsstabiliteit op de 3 uur perfusie wordt getoond voor niet-gekleurde atriale voorbereidingen en voor fluorescerende kleurstof en blebbistatin gebrandschilderde atriale preparaten. De gegevens worden getoond als gemiddelde ± SEM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 6
Figuur 6:. Intensiteit van het signaal Decay verloop van tijd de intensiteiten van de signalen van beide laadmethoden (coronaire laden aangegeven in het rood, en de oppervlakte lading in blauw aangegeven) werden gemeten en uitgezet in de tijd. Het signaal intensiteiten werden gemiddeld een 7 bij 7-pixel gebied op vier typische locaties in de rechterboezem: trabecula (Trab), sinusknoop (SAN), rechter atrium aanhangsel (RAA) en coronaire sinus (CS). IC50 waarden werden vervolgens berekend en geëtiketteerd alle uitklinkcurves. Het signaal intensiteit verval van zowel laadmethoden was vergelijkbaar in Trab en RAA. De IC 50 van arteriële lading in CS was ongeveer 20 minuten langer. In de SAN, deze waarde arteriële laden bijna twee maal groter dan bij oppervlaktebelasting, hetgeen aangeeft dat arteriële laadmethoden resulteerde in betere stabiliteit van de kleurstof in de SAN tissUE na verloop van tijd. De gegevens worden getoond als gemiddelde ± SEM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hier presenteerden wij twee soorten muizen SAN preparaten: 1) intact SAN in het Langendorff-geperfuseerde hele hart, en 2) SAN in het geïsoleerde, open atriale preparaat. Deze twee types van de voorbereiding dienen verschillende experimentele doeleinden. In de Langendorff-geperfuseerde hele hartsvoorbereiding, wordt de intacte atriale structuur behouden waardoor het mogelijk complexe atriale aritmieën zoals atriumfibrillatie en interacties tussen de SAN en atrium bestuderen bij inspringende tachycardie. 6 daarentegen in de geïsoleerde atriale preparaat het atrium wordt geopend en afgeplat tot een pseudo tweedimensionale structuur waarin de drie-dimensionale anatomische bundels worden verstoord. Dit kan de anatomie van reentrant routes die het geïsoleerde atriale voorbereiding niet ideaal voor het bestuderen van atriale aritmieën maakt beïnvloeden. Echter, het gebruik van dit soort preparaat, de locatie van de toonaangevende pacemaker (s) plaatsen, intranodale geleiding en AP voortplanting pattern nauwkeurig worden gevisualiseerd en in detail onderzocht. Bovendien intact atria lijken beperkt door een achteraanzicht terwijl in het geïsoleerde preparaat, het gehele atriale oppervlak beschikbaar is voor optische mapping.

Bovendien geïsoleerde atriale bereiden voor structureel-functionele kaart brengen van het atrium door het oplossen van het complex microstructuur van het trabeculaire netwerk zoals te zien in figuur 4. Hiervoor hoge ruimtelijke (100 um / pixel of hoger) en temporele (2000 fps of hoger) resoluties worden gebruikt omdat het essentieel om zowel atriale als SAN activeringspatronen, die verder kunnen worden overlapt met corresponderende structuren specificeren. Terwijl 1000 bps tijdsresolutie minimaal zou zijn om atriale activering (die duurt 10-20 msec) reconstrueren moeten 2000 bps worden beschouwd als een minimum temporele resolutie voor intranodale geleiding (die duurt ~ 5 ms en dus niet wordt gehaald bij lagere resoluties) en SAN-activation metingen zoals blijkt uit figuur 4. Dit kan de lokalisatie van aritmogene "hot spots" (zoals ectopische foci of verankerd reentry) tijdens atriale fibrillatie / flutter die kunnen voortkomen uit de superpositie van gebieden van aanzienlijke functionele remodeling met die verhoogde fibrose mogelijk en / of verminderde cel-cel koppelen. 21,22 Bovendien kan de beschreven benadering worden gebruikt voor elektrofysiologische mechanismen van SAN afwijkingen, waaronder SAN uitgang blokken, pauzes, tachycardie-bradycardie aritmie, sick sinus syndroom etc bestuderen.

Door een tweede (of derde) fluorescente probe, zal het mogelijk zijn om multi-parametrische optische kaart brengen van de elektrische activiteit uit te voeren in samenwerking met calciumhuishouding en metabole en andere veranderingen. Verschillende combinaties van kleurstoffen kan worden gebruikt voor gelijktijdige voltage-calcium, ratiometrische voltage / calcium of mitochondriale potentiële beeldvorming.

Voor hoge tijdsresolutie optische mapping, door de kortere fluorofoor verzamelperiode, kunnen de signalen van een zwakker signaal-ruisverhouding worden gesteld. Daarom wordt een middeling veredeling toegepast op de sinus hartritme signalen of de pacing-serie signalen als dat nodig is. De dF / dt max gedetecteerd elk signaal in een lange periode opname. Deze activering tijdstippen worden dan uitgelijnd. Een instelling periode van opname middelpunt op deze tijdstippen wordt gesneden en het gemiddelde van alle of geselecteerde Aps, indien nodig.

Accurate gebruik van instrumenten en de goede kleuring procedure, worden atriale elektrofysiologische parameters waaronder geleidingssnelheid (vergelijk figuren 3C en 4D S1 activeringskaarten), spontane SAN ritme en de levensduur van de SAN preparaat (figuur 5) niet beïnvloed, die stabiel blijven 3 of meer uren. Belangrijk is dat de continue monitOring van ECG te worden gemaakt via kleuring gehele procedure normale elektrische functie van het hart te verzekeren. De toepassing van blebbistatin een overgangsvorm hartslag vertraagt induceren, maar anders dan dat, bevat het geen verschuivingen in het leiden pacemaker sites of veranderingen in morfologie AP zoals ook eerder beschreven induceren. 13

Oppervlak kleuring van de geïsoleerde atriale preparaat een kritische stap. Hiertoe moet snelle toepassing van de verdunde kleurstof op het oppervlak van het weefsel worden vermeden; plaats de kleurstof moet vrij vallen op het preparaat door de hogere dichtheid van DMSO, die voor zowel kleurstof en blebbistatin verdunningen. De juiste totale belasting hoeveelheid en snelheid moet worden aangepast om zo niet dramatisch hartslag veranderingen veroorzaken. De kleuring procedure kan meerdere keren worden toegepast totdat het signaal een redelijk niveau bereikt. Opgemerkt wordt dat de directe toepassing van de kleurstof SAN weefsel beschadigen en beïnvloeden de PacemOpnamen. Derhalve moet de kleurstof worden verdund en de aangebrachte hoeveelheid zorgvuldige controle. Geschikte oppervlak kleuring moet de voorbereiding of SAN 23 die wordt beoordeeld door een vergelijkbare hartslag en geleidingssnelheid niet beschadigen.

Alternatief kleuringsprotocollen moet worden overwogen. Deze kunnen bestaan uit ofwel een 10-15 min superfusie van de SAN / atriale preparaat met de spanningsgevoelige kleurstof (RH-237 of di-4-ANEPPS) bij 35 ± 1 ° C 10,19 of 30 min incubatie van het preparaat bij kamertemperatuur (20-22 ° C) in een Tyrode oplossing die de spanning-gevoelige indicator. 11

Voor optische kaart brengen van het SAN uit de Langendorff-geperfuseerde hele hart, instrumentatie belangrijke stappen omvatten het inbrengen van het buisje in de LV en de sluiting van SVC en IVC. Eerstgenoemde voorkomt drukverhoging uit oplossing congestie bij langdurige experimenten en daaropvolgende ischemia ontwikkeling na de onderdrukking van ventriculaire contracties door blebbistatin en verzuring van de perfusie-oplossing. Het laatste maakt de RA een zekere mate van intra-atriale druk te houden waardoor het atrium met perfusievloeistof vullen en afvlakking van de intercaval regio om het gehele SAN gebied voor optische mapping ontdekken.

Tenslotte coronaire kleuring, behalve kleurstof laadvlak, zou een belangrijke intensiteit van de SAN OAPs die langer kan duren in vergelijking met zuiver oppervlak kleuring bij eerdere studies. 8,9

Gebruik van blebbistatin heeft meerdere voordelen ten opzichte van andere elektromechanische ontkoppelrails waaronder lage toxiciteit, minder uitgesproken bijwerkingen en bestand tegen het wegspoelen bij gebruik met voorzichtigheid. Blebbistatin precipiteert wanneer het wordt opgelost bij een temperatuur lager dan 37 ° C. 14 Blebbistatin kristallen kunnen normale vasculaire stroom onderbreken en daardoor induceren lokaleischemie en provoceren aritmische evenementen. 24 Daarnaast is in studies die GFP of andere groene / gele kleurstoffen gebruikt, kan blebbistatin neerslag verward met gemerkte cellen die in aanmerking moeten worden genomen. Voorkomen blebbistatin precipitatie is eenvoudig, dat wil zeggen, men blebbistatin lossen in een voorverwarmde (37 ° C en hoger) en krachtig geroerd media.

APD, een hoge concentratie blebbistatin (tot 10 uM) worden gebruikt. 13,14,25 analyseren. Evenzo, als enig geneesmiddel dat contractie verhoogt worden gebruikt, aanvullende aanvraag van blebbistatin aanbevolen.

Als een alternatieve techniek om de muis SAN elektrische activiteit, lage resolutie multi-elektrode array (64 afzonderlijke elektroden in een vierkant 8 x 8, configuratie met een inter-elektrode afstand van 0,55 mm), 26 en opeenvolgende glas micro-elektrode opnames gemaakt op korte afstand tussen studeren impalements vs. tot 50 um / pixel voor optische mapping) en kan niet worden gebruikt om AP morfologie of meerdere parametrische imaging (zoals gelijktijdige spannings- en calcium optische mapping) geanalyseerd. Hoewel glas micro-elektrode opnames geven meer informatie over AP morfologie, inclusief absolute waarden van AP amplitude en rustpotentiaal wordt ook beperkt door een lage ruimtelijke resolutie. Daarom kan het alleen worden gebruikt voor een stabiele ligging van de toonaangevende pacemaker en is niet van toepassing op beat-to-beat veranderingen vast te leggen in het toonaangevende pacemaker locatie. Tegelijkertijd, als eerder aangetoond 3,20 en gemarkeerd in de huidige studie, de SAN OAP consists van een twee-fasesignaal whichincludes zowel SAN en atriale myocardium AP componenten (Figuur 4B). Daarmee wordt het moeilijk om een ​​zuivere SAN extraheren en nauwkeurig schatten AP morfologie in het SAN. Hiertoe dient glas micro-elektroden 17 of de huidige aanpak klem op geïsoleerde SAN myocyten worden beschouwd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
water jacket Radnoti 1660 Series Tissue Bath for Large Organ or Single Cell Isolation Procedures
water bath / circulator Fisher Scientific 1016S
pressure amplifier AD Instruments MLT0670
EMD Millipore Nylon Net Filters Fisher Scientific NY1102500
Pressure transducer AD Instruments MLT0670
Stainless Steel Minutien Pins - 0.1 mm Diameter Fine Science Tools 26002-10 
Perfusion pump World Precision Instruments PERIPRO-4LS
Superfusion pump World Precision Instruments PERIPRO-4HS
Vannas Tubingen scissors  World Precision Instruments 503379
Dumont forceps World Precision Instruments 501201, 500085
Mayo scissors World Precision Instruments 501750
Kelly hemostatic forceps World Precision Instruments 501241
Iris forceps World Precision Instruments 15917
Iris scissors World Precision Instruments 501263
ECG 12 mm needle (29-gauge) electrodes (monopolar)  AD Instruments MLA1203
in-line Luer injection port Ibidi 10820
Ultima-L CMOS camera  SciMedia MiCAM-05 
halogen lamp Moritex USA Inc MHAB-150W
NaCl Fisher Scientific S271-1
CaCl2 (2H2O) Fisher Scientific C79-500
KCl Fisher Scientific S217-500
MgCl2 (6H2O) Fisher Scientific M33-500
NaH2PO4 (H2O) Fisher Scientific S369-500
NaHCO3 Fisher Scientific S233-3
D-Glucose Fisher Scientific D16-1
Blebbistatin Tocris Bioscience 1760
RH237 ThermoFisher Scientific S1109
Dimethyl sulphoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical imaging of the heart. Circ Res. 95 (1), 21-33 (2004).
  2. Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues. Circ Res. 110 (4), 609-623 (2012).
  3. Fedorov, V. V., Glukhov, A. V., Chang, R. Conduction barriers and pathways of the sino-atrial pacemaker complex: their role in normal rhythm and atrial arrhythmias. Am J Physiol Heart Circ Physiol. , (2012).
  4. Boyett, M. R., Honjo, H., Kodama, I. The sinoatrial node, a heterogeneous pacemaker structure. Cardiovasc Res. 47 (4), 658-687 (2000).
  5. Glukhov, A. V., et al. Sinoatrial Node Reentry in a Canine Chronic Left Ventricular Infarct Model: The Role of Intranodal Fibrosis and Heterogeneity of Refractoriness. Circ Arrhythm Electrophysiol. , (2013).
  6. Glukhov, A. V., et al. Calsequestrin 2 deletion causes sinoatrial node dysfunction and atrial arrhythmias associated with altered sarcoplasmic reticulum calcium cycling and degenerative fibrosis within the mouse atrial pacemaker complex. Eur Heart J. 36 (11), 686-697 (2015).
  7. John, R. M., Kumar, S. Sinus Node and Atrial Arrhythmias. Circulation. 133 (19), 1892-1900 (2016).
  8. Swaminathan, P. D., et al. Oxidized CaMKII causes cardiac sinus node dysfunction in mice. J Clin Invest. 121 (8), 3277-3288 (2011).
  9. Glukhov, A. V., Fedorov, V. V., Anderson, M. E., Mohler, P. J., Efimov, I. R. Functional anatomy of the murine sinus node: high-resolution optical mapping of ankyrin-B heterozygous mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 299 (2), H482-H491 (2010).
  10. Egom, E. E., et al. Impaired sinoatrial node function and increased susceptibility to atrial fibrillation in mice lacking natriuretic peptide receptor C. J Physiol. 593 (5), 1127-1146 (2015).
  11. Torrente, A. G., et al. Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (31), 9769-9774 (2015).
  12. Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart. J Vis Exp. (55), e3275 (2011).
  13. Fedorov, V. V., et al. Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts. Heart Rhythm. 4 (5), 619-626 (2007).
  14. Swift, L. M., et al. Properties of blebbistatin for cardiac optical mapping and other imaging applications. Pflugers Arch. 464 (5), 503-512 (2012).
  15. Laughner, J. I., Ng, F. S., Sulkin, M. S., Arthur, R. M., Efimov, I. R. Processing and analysis of cardiac optical mapping data obtained with potentiometric dyes. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 303 (7), H753-H765 (2012).
  16. Liu, J., Dobrzynski, H., Yanni, J., Boyett, M. R., Lei, M. Organisation of the mouse sinoatrial node: structure and expression of HCN channels. Cardiovasc Res. 73 (4), 729-738 (2007).
  17. Verheijck, E. E., et al. Electrophysiological features of the mouse sinoatrial node in relation to connexin distribution. Cardiovasc Res. 52 (1), 40-50 (2001).
  18. Krishnaswamy, P. S., et al. Altered parasympathetic nervous system regulation of the sinoatrial node in Akita diabetic mice. J Mol Cell Cardiol. 82, 125-135 (2015).
  19. Nygren, A., Lomax, A. E., Giles, W. R. Heterogeneity of action potential durations in isolated mouse left and right atria recorded using voltage-sensitive dye mapping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (6), H2634-H2643 (2004).
  20. Efimov, I. R., Fedorov, V. V., Joung, B., Lin, S. F. Mapping cardiac pacemaker circuits: methodological puzzles of the sinoatrial node optical mapping. Circ Res. 106 (2), 255-271 (2010).
  21. Aschar-Sobbi, R., et al. Increased atrial arrhythmia susceptibility induced by intense endurance exercise in mice requires TNFalpha. Nat Commun. 6, 6018 (2015).
  22. Hansen, B. J., et al. Atrial fibrillation driven by micro-anatomic intramural re-entry revealed by simultaneous sub-epicardial and sub-endocardial optical mapping in explanted human hearts. Eur Heart J. 36 (35), 2390-2401 (2015).
  23. Lang, D., Petrov, V., Lou, Q., Osipov, G., Efimov, I. R. Spatiotemporal control of heart rate in a rabbit heart. J Electrocardiol. 44 (6), 626-634 (2011).
  24. Kanlop, N., Sakai, T. Optical mapping study of blebbistatin-induced chaotic electrical activities in isolated rat atrium preparations. J Physiol Sci. 60 (2), 109-117 (2010).
  25. Glukhov, A. V., Flagg, T. P., Fedorov, V. V., Efimov, I. R., Nichols, C. G. Differential K(ATP) channel pharmacology in intact mouse heart. J Mol Cell Cardiol. 48 (1), 152-160 (2010).
  26. Wu, J., et al. Altered sinoatrial node function and intra-atrial conduction in murine gain-of-function Scn5a+/DeltaKPQ hearts suggest an overlap syndrome. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302 (7), H1510-H1523 (2012).

Tags

Biofysica optische mapping sinusknoop muis hart actiepotentiaal
Hoge-resolutie optische kaart brengen van de Muis sinusknoop
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lang, D., Glukhov, A. V.… More

Lang, D., Glukhov, A. V. High-resolution Optical Mapping of the Mouse Sino-atrial Node. J. Vis. Exp. (118), e54773, doi:10.3791/54773 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter