Summary
We presenteren een protocol voor de toepassing van interferometrische Photoactivated Localization Microscopy (iPALM), een 3-dimensionale single-molecule lokalisatie super resolutie microscopie methode, aan de beeldvorming van het actine cytoskelet in hechtende zoogdiercellen. Deze aanpak maakt het mogelijk op basis van licht visualisatie van nanoschaal structurele kenmerken die anders onopgelost zouden blijven door middel van conventionele diffractie beperkt optische microscopie.
Abstract
Fluorescentiemicroscopie maakt directe visualisatie van specifieke biomoleculen in cellen. Voor conventionele fluorescentiemicroscopie de ruimtelijke resolutie beperkt door diffractie tot ~ 200 nm in het beeldvlak en> 500 nm langs de optische as. Daardoor fluorescentiemicroscopie al lang ernstig beperkt in de waarneming van ultrastructurele kenmerken in cellen. De recente ontwikkeling van super-resolutie microscopie methoden heeft deze beperking te omzeilen. Met name de komst van photoswitchable fluoroforen maakt lokalisatie-based super resolutie microscopie, die oplossend vermogen het naderen van de moleculaire lengte schaal biedt. Hier beschrijven we de toepassing van een drie-dimensionale super-resolutie microscopie methode op basis van single-molecule lokalisatie microscopie en multifase interferometrie, genaamd interferometrische Photoactivated Localization Microscopy (iPALM). Deze methode biedt bijna isotrope resolutie over deorde van 20 nm in alle drie dimensies. Protocollen voor het visualiseren van de filamenteuze actine cytoskelet, waaronder prepareren en de werking van het instrument iPALM, worden hier beschreven. Deze protocollen zijn ook gemakkelijk aan te passen en leerzaam voor de studie van andere ultrastructurele functies in cellen.
Introduction
De visualisatie van complexe celstructuren is al lang een integraal onderdeel van de biologische inzichten en ontdekking. Hoewel fluorescentie microscopie afbeeldingscellen met hoog moleculair specificiteit, het oplossend vermogen wordt beperkt door diffractie tot ~ 200 nm in het beeldvlak (x, y, of dwarsafmeting) en> 500 nm langs de optische as (z of axiale afmeting) 1,2. Vandaar dat de observatie van ultrastructurele kenmerken van oudsher beperkt tot elektronenmicroscopie (EM). Gelukkig heeft de recente ontwikkeling van super-resolutie microscopie deze limiet omzeild, waardoor ruimtelijke resolutie in de 10-100 nm 1-6. In het bijzonder, benaderingen super resolutie op basis van één molecuul lokalisatie, bekend onder acroniemen zoals PALM (Photoactivated Localization Microscopy) 4, FPALM (Fluorescence Photoactivated Localization Microscopy) 5 (d) STORM (direct Stochastic Optical Wederopbouw Microscopy) 6,7, PAINT ( point accumulatie for Imaging Nanoscale Topografie) 8, GSDIM (grondtoestand Uitputting Microscopy, gevolgd door individuele moleculaire return) 9 of SMACM (single-molecule Active-Control Microscopy) 10, evenals hun 3-dimensionale (3D) implementaties, zoals interferometrische PALM (iPALM) 11 of 3D-STORM 12, zijn waardevol in het onthullen van nieuwe inzichten in de nanoschaal organisatie van een groot aantal biologische structuren, met inbegrip van neuronale axonen en synapsen 13, focale adhesies 14,15, cel-cel kruispunten 16, nucleaire poriën 17 en centrosomes 18-20, een paar te noemen.
Een andere ultrastructurele functie in cellen voor die super-resolutie microscopie is potentieel bruikbaar is het actine cytoskelet. Het complex maaswerk van filamenteuze (f) actine in de cel cortex speelt een essentiële rol in de controle van celvorm en mechanische eigenschappen 21. De organisatie of f-actine wordt actief en dynamisch geregeld al tal van regulerende eiwitten die sterk beïnvloeden polymerisatie, verknoping, omzet, stabiliteit en netwerktopologie 22. Hoewel de karakterisering van F-actine maaswerk architectuur is belangrijk mechanistische inzichten in een diversiteit aan cellulaire processen, de kleine (~ 8 nm) van de f-actine filamenten belemmert de waarneming door gebruikelijke buigingsbegrensde lichtmicroscopie; dus de visualisatie van actine fijne structuur tot nu toe uitsluitend uitgevoerd door EM. Hier beschrijven we protocollen voor het visualiseren van de f-actine cytoskelet in hechtende zoogdiercellen, met behulp van de iPALM super resolutie microscopie techniek om te profiteren van de zeer hoge precisie capaciteit te nemen in 3D 11,23. Hoewel de iPALM instrument sterk gespecialiseerd heeft instructies over het opzetten van een dergelijk instrument is beschreven onlangs 23, terwijl de toegang tot de iPALM microscoop georganiseerd door de Howard Hughes Medical Institute is ook ter beschikking gesteld van de onderzoeksgemeenschap met minimale kosten. Bovendien, het prepareren hierin beschreven werkwijzen zijn direct toepasbaar op alternatieve 3D superresolutie benaderingen, zoals die gebaseerd op astigmatisch onscherpte in de puntspreidingsfunctie (PSF) 12 of bi-plane detectie 24, die breder beschikbaar zijn.
We merken op dat een noodzakelijk ingrediënt voor single-molecule lokalisatie-based super resolutie microscopie in het algemeen is de photoswitchable fluorofoor 25, waarin de drie kritische eisen voor single-molecule lokalisatie-based super resolutie microscopie maakt het mogelijk moet worden voldaan: i) high single-molecule helderheid en contrast ten opzichte achtergrondsignalen; ii) spaarzame distributie van enkele moleculen in een gegeven beeldframe; en iii) hoge ruimtelijke dichtheid etikettering voldoende om het profiel van de onderliggende structuur (ook bekend als Nyquist-Sha vangennNiet sampling criterium) 26. Zo bevredigende resultaten nadruk liggen eveneens op zowel de goede voorbereiding van monsters geplaatst fluorofoor photoswitching optimaliseren en de onderliggende ultrastructuur behouden, evenals de instrumentatie en verwervingsprocessen van de experimenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Imaging Specimen Voorbereiding
- Sinds achtergrond fluorescentie signalen interfereren met fluorescentie van fluorofoor labels, het reinigen van de coverglasses door ze eerst in gedeïoniseerd water spoelen (DDH 2 O) en vervolgens aan de lucht drogen ze met behulp van perslucht. Vervolgens voeren plasma-etsen in een plasma reiniger voor 15 sec of langer indien nodig.
- Om drift correctie en iPALM kalibratie mogelijk te maken, gebruiken # 1.5 round (22-mm diameter) pre-gereinigd coverglasses ingebed met fluorescerende nanodeeltjes als vaste merktekens, die als zeer fotostabiele fiducials voor een betrouwbare calibratie en drift correctie dienen. Vanwege de lange acquisitietijd dienen een voldoende dichtheid fluorofoor accumuleren (> 15-30 min), sample drift onvermijdelijk.
- Plaats elke fiducialed dekglaasje in een 6-well weefselkweek plaat. Gesteriliseerd door ultraviolette (UV) straling in een laminaire stroming kap voor 15 minuten.
- In een steriele laminaire stroming kap, voor te bereiden fibroNectin oplossing dekglaasje coaten door verdunnen van 1 mg / ml fibronectine voorraadoplossing in steriele Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) tot een eindconcentratie 2-10 ug / ml. Spoel elk dekglaasje drie keer met DPBS en geïncubeerd met 2 ml van de fibronectine oplossing overnacht bij 4 ° C. Vervolgens, zuigen de fibronectine-oplossing en een keer spoelen met DPBS.
- Spoel de cellen kort met DPBS. Incuberen met 1 - 2 ml trypsine gedurende enkele minuten bij 37 ° C totdat de cellen los en blussen met ~ 10 ml vers serumhoudend celkweekmedium. Bijvoorbeeld, voor humane navelstreng endotheelcellen (HUVEC), gebruiken grote vaten endotheliale kweekmedium aangevuld met grote vaten endotheliale factoren en penicilline en streptomycine.
- Replate de cellen op de met fibronectine gecoate dekglaasje (voor ijle dichtheid, plaat <50.000 cellen per dekglaasje) en onderhouden van de cultuur in een incubator ingesteld op 95% vochtigheid, 5% CO2 en 37 & #176; C.
- Voor een goede bewaring van de fijne structuren van F-actine cytoskelet Gebruik bufferoplossingen basis van Good's buffer 27 reagentia.
- Zij bijvoorbeeld PHEM buffer als 2x voorraadoplossing (120 mM PIPES, 50 mM HEPES, 20 mM EGTA, 4 mM MgCl2, pH 7,0 met KOH) door het oplossen van 6,5 g HEPES, 3,8 g EGTA en 190 mg MgCl2 in ~ 300 ml DDH 2 O, met de pH aangepast tot 7,0 door druppelsgewijze toevoeging van geconcentreerde KOH-oplossing; vervolgens toevoegen DDH 2 O om het volume op 500 ml te brengen. Steriliseer het buffer met een 0,22 urn filter, opslaan bij 4 ° C, en verdun het 1: 1 met DDH 2 O voor gebruik.
- Voor de beste resultaten met een hoge dichtheid kenmerken van f-actine, gebruik falloïdine geconjugeerd met organische fluoroforen, zoals Alexa Fluor 647. Op het gewenste tijdstip na cel replating, zet de cellen als volgt:
- Zuig het medium van elke cultuur putje met de cell exemplaar. Voorzichtig maar snel afzien 2 ml warm (37 ° C) extractie fixatieven die 0,25% glutaaraldehyde in PHEM-buffer met 0,25% Triton X-100. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1-2 min. Voor daaropvolgende stappen gebruikt 2 ml lijm of blussen buffer per dekglaasje, tenzij anders aangegeven.
- Vervang het fixeermiddel extractie met een 2,5% glutaaraldehyde fixeermiddel in PHEM-buffer en laat de monsters incubeer gedurende 10 - 12 min. Dit en volgende stappen worden allen in kamertemperatuur.
- Aspireren de fixatieven en voorzichtig te vervangen door PHEM buffer. Tilt en werveling zacht, en dan weer wassen met PHEM. Herhaal dit twee keer.
- Om autofluorescentie van glutaaraldehyde, die signalen van de gewenste fluoroforen kunnen overweldigen, incubeer de monsters met een vers bereide quenching buffer met NaBH4 in een massaconcentratie van 0,1% in PHEM blussen. Profuse belletjes zal worden waargenomen. tikt u zo nu en dan het monster schotel voorzichtig aan op dislodge de bubbels. Laat het incubeer gedurende 5-10 min.
- Aspireren uit het doven buffer en voorzichtig te vervangen door PHEM buffer. Spoel een paar keer om de bubbels weg te ruimen. Pipet 2 ml PHEM buffer en laat het incubeer in het donker gedurende 5 min. Herhaal dit twee keer en laat het monster rust in PHEM buffer als u klaar bent.
- Bereid een vochtige kamer voor Phalloidin incubatie met behulp van een grote plastic petrischaal opgevuld met een stuk papier handdoek royaal bevochtigd met 5-10 ml van DDH 2 O. Leg een groot vel schone Parafilm bovenop het natte papieren handdoek.
- Vanwege de relatief hoge kosten van gelabelde phalloidin met een kleine volume per labeling. Voor de etikettering hoge dichtheid, te beginnen met een concentratie van 0,3 uM. Bereid ~ 60 ul per dekglaasje behulp falloïdine-Alexa Fluor 647 in PHEM-buffer.
- Pipette 55-60 ul van de phalloidin oplossing op de Parafilm blad in de vochtige kamer. Met behulp van fijne tang, verwijder voorzichtig het monster covergdeerntje. Wees voorzichtig om op te merken de juiste-cel met gezicht.
- Snel en zachtjes tikken overtollige buffer door het aanraken van de rand van het dekglaasje met een opgevouwen stuk delicate absorberend papier, en plaats dan de dekglaasje cel kant naar beneden op de druppel phalloidin oplossing op de Parafilm. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen gevangen door de dekglaasje.
- Plaats het deksel op de vochtige kamer. Wikkel de kamer in aluminiumfolie om deze te beschermen tegen omgevingslicht, en laat het monster incubeer overnacht bij 4 ° C. Het monster kan in deze toestand gehouden gedurende enkele dagen. Zorg ervoor dat de vochtige kamer blijft vochtig als lange bewaring wordt gepland.
- Voorafgaand aan beeldvorming plaats voorzichtig het dekglaasje cel naar boven op een nieuwe 6-well plaat met 2 ml PHEM buffer per putje.
- Bereid zuurstof weggevangen-thiol-based imaging buffers met behulp van de volgende stockoplossingen: 1 M glucose, 1 M cysteamine en 100x glucoseoxidase / catalase enzym mixture (4 mg katalase en 10 mg glucoseoxidase in 100 pl buffer PHEM, en door vortexen gemengd) 28. Vlak voor imaging, meng 75 ul van 1 M glucose-oplossing, 30 ul van 1 M cysteamine-oplossing, en 3 pl 100x voorraad enzymmengsel. Zet het volume op 300 pi met PHEM buffer en gebruik onmiddellijk na het mengen om het monster te monteren.
- Voor iPALM, de voorbereiding van de beeldvorming monster met behulp van een vooraf gereinigd # 1.5 dekglaasje (22-mm diameter).
- U kunt ook gebruik maken van een glasplaatje (3 "x 1") met een dubbelzijdige kleefband spacer om te helpen bij de assemblage if-astigmatisme gebaseerde 3D-STORM 12 is in plaats daarvan worden gebruikt.
- Om de beeldvorming monster samen te stellen, gebruik fijne tang om voorzichtig verwijderen van het monster dekglaasje uit de buffer ook. Dan, snel en zachtjes tikken overtollige buffer door het aanraken van de rand van het dekglaasje met gevouwen absorberend papier.
- Plaats het dekglaasje cel kant naar boven op een stuk van schone lens papier. Spoel het monsterdoor het plaatsen van 30-50 ul van imaging buffer op het monster, en verwijder overtollig buffer door het kantelen en te tikken met gevouwen absorberend papier.
- Herhaal het spoelen stap een paar keer, en plaats dan 30-50 ul van imaging buffer op het monster. Blot droog de rand van het dekglaasje en plaats van meerdere kleine puntjes van snel uithardende epoxy op de gedroogde gebied.
- Langzaam lager andere vooraf gereinigd # 1.5 dekglaasje (normaal, rond dekglaasje, 18-mm diameter) op het midden van de celbevattende 22 mm dekglaasje. Laat de imaging buffer nat zowel coverglasses door capillaire werking. De kleine puntjes van snel uithardende epoxy moeten zich houden aan beide coverglasses.
- Druk voorzichtig op de verzamelde monster met behulp van gevouwen absorberend papier om de druk gelijkmatig verdeeld. Gebruik voldoende druk om de monstercel dun en zelfs (<15 pm), maar niet zo veel als de cellen verpletteren. Peilen naar de juiste dikte door het observeren van de Newton's ringen patroon. Zorg er ook voor om deze st uit te voerenep voorzichtig om luchtbellen te minimaliseren. Indien nodig, oefenen met lege coverglasses meerdere malen op voorhand.
- Verzegelen van het monster met gesmolten vaseline-lanoline-paraffine (valap, stock bereid van 100 g elk van vaseline, lanoline, en paraffine, smolt samen) 29, spoel de verzegeld monster met DDH 2 O, en blaas droog met perslucht. Het monster is nu klaar voor montage op de microscoop voor beeldvorming.
2. Sample Placement en iPALM Alignment
- Verplaats de veerbelaste top objectieflens omhoog zodat de verwijdering van de monsterhouder. Plaats de verzegelde monster bereid in stap 1.10 op het monster houder en bevestig met een aantal kleine zeldzame aardmetalen magneten. Toepassen immersie olie aan weerszijden van de imaging monster. Het monster houder terug in het optische pad en laat de top objectief.
- Schakel de excitatie lasers. Zet de Electron vermenigvuldigen Charge-Coupled Device (EMCCD) camera in frame-transfer mode.
- Draaien in de juiste emissiefilters. Activeer een mechanische sluiter aan de bovenbalk pad (Figuur 1A) te blokkeren en open de onderbalk pad. Breng de onderste objectief in beeld door translatie in kleine stappen met behulp van de piëzo-actuator.
- Zodra het referentiemerkteken is scherpgesteld, open de stralengang tijdens blokkeren van de onderbalk weg en breng de bovenste objectieflens scherp op soortgelijke wijze. Bewaken van de breedte van het referentiemerkteken op het beeldscherm voor optimale scherpstelling.
- Voor een goede centratie, geopend zowel de bovenste en onderste balk paden. Stel handmatig boven objectieflens terwijl de onderste doel constant gehouden met behulp van een paar microfijne stelschroeven totdat de vaste beelden zo dicht mogelijk overlappen, idealiter binnen één pixel.
- Vervolgens voeren fijne aanpassingen, zodat de vaste beelden in stap 2.3 overlap binnen een tiende van een EMCCD pixel. Pas de top2-as-piezo gemonteerde spiegels via de besturingssoftware terwijl zowel objectieve lenzen en de onderkant reflectie spiegels constant. Vergelijk de middelpunten van de ijkpunten van de bovenste en onderste doelstelling uitzicht via het beeldscherm om het proces te begeleiden.
3. Kalibratie van de iPALM Setup
OPMERKING: Aangezien fluorescentie-emissie is incoherent voor inmenging in iPALM worden waargenomen lengtes het pad door de bovenste en onderste doelstellingen moeten dicht bij elkaar, binnen enkele micron. Dit kan als volgt worden bereikt:
- De lasers op de camera continu streaming, en zowel de bovenste en onderste stralengangen geopend, oscilleren de monsterhouder z-piëzo met een sinusvormige golfvorm gegenereerd door de besturingssoftware voor een continue z-as oscilleren over een omvang van 400 nm .
- Door gebruik te maken van het feit dat, wanneer u niet op optimale afstemming, de vaste intensiteit varieert weinig met tHij oscillatie handmatig gemotoriseerde bundeldeler samenstel vertalen omhoog of omlaag tot de intensiteit van de vaste oscilleert door de gewenste enkel-foton interferentie effect. Dit betekent de nauwe afstemming van de lengtes optische pad. Een piek-tot-dal-verhouding van> 10 kan op optimale geval (figuur 1D).
- Om ervoor te zorgen dat zowel de amplitude en fase bij elk oppervlak zo uniform mogelijk over het veld, aan te passen aan de onderkant spiegel van de bundelsplitser assemblage in kleine stapjes te fine-tunen van de kloof en de kantelhoeken. Voer bundelsplitser fijne afstemming van het monster in 8 nm z-stappen vertalen van meer dan 800 nm.
- Bewaak de vaste sterkte tussen camera # 1 - 3. Regel de hoogte, positie en kanteling van de onderste spiegel binnen de bundeldeler samenstel in kleine stappen, zodanig dat de oscillatie fase van camera # 1 ten opzichte camera # 2 is gemaximaliseerd, idealiter bij 120 ° (Figuur 1B-D).
- Zodra de eersteuitlijning voltooid, vertalen het monster te scannen naar een geschikt gebied van mening dat beide cellen om het beeld en meerdere fiducials nabijgelegen bevat. Plaats een omheining rond het systeem om strooilicht en ambient verstoringen te blokkeren. Zodra de beeldvorming gebied is gevonden, voert u de procedure in stap 3.4 weer, en noteer de kalibratiecurve voor gebruik in de daaropvolgende z-coördinaat extracties met het commando "Verwerven Calibration Scans vs Sample Piezo Position" in het hoofdmenu.
4. Data Acquisition
- Zodra een gewenste gebied wordt gevonden en de kalibratiekromme wordt verkregen, voert u de juiste bestandsnamen in de software. Open zowel de bovenste en onderste balk paden. Verhoog de excitatie energie van de 642-nm laser maximum. Voor Alexa Fluor 647, kan een eerste periode van fluorofoor uitschakelen nodig (Figuur 2A).
- Expose met een constante 642 nm-excitatie gedurende 5 minuten of langer indien nodig, tot single molecuul knipperen waargenomen (figuur 2B). De software maakt een automatische toename van 405-nm photo activatie tijdens de overname. Grote aantallen van verwerving frames zijn meestal vereist voor draadvormige functies om duidelijk zichtbaar zijn (> 50.000 frames). Als u klaar bent, begint het verwerven van grondstoffen afbeelding sets met de opdracht "Start iPALM Acquisition" in het hoofdmenu.
- Tijdens de overname tunen fotoactivatie gecorrigeerd tot de intensiteit van de 405-nm laser om de juiste knipperende dichtheid handhaven nodig (zie voorbeelden in figuur 2B).
LET OP: Als de overname is afgerond, zal de software automatisch de beeldbestanden om te zetten in de juiste binair formaat. De dataopslag in de berekening server is aangebracht als een netwerkstation, waardoor gegevens daar direct worden gekopieerd voor verdere verwerking.
5. Data Processingen Analyse
- Voeren lokalisatie analyse met een speciaal ontwikkelde software best-fit parameters extract voor individuele moleculen en voor de fiducials 11,15,23. Dit levert niet alleen de x, y-coördinaat, maar ook de intensiteit die wordt gebruikt voor de kalibratie curve analyse.
- Importeer de ruwe kalibratie data verkregen in stap 3.5 met behulp van het commando "Extract Peaks Meerdere labels" onder het menu "Bestand" om de single-molecule lokalisatie uit te voeren. Na de eerste lokalisatie analyse coördinaten verkregen van camera # 1-3 aanwezig in rode, groene en blauwe kanalen, respectievelijk, en kan in worden opgeslagen voor verdere analyse met het commando "(.sav) Tenzij verwerkt als IDL" het " file menu ".
- Om gegevens van camera's # 1 te brengen - 3 in de registratie met behulp van de fluorescerende fiducials ingesloten op de dekglaasjes, selecteert een aantal felle fiducials om de dekking van het centrale beeld te bieden (bijvoorbeeldFiguur 1B) met behulp van het commando "Anchor Fiducial Points" onder het menu "Image Transformaties". Gebruik de drievoudige sets lokalisatiecoördinaten van camera's # 1 - 3 verkregen uit de heldere ijkpunten in stap 5.1 de rotatie en schaling matrix die brengt camera's # 1 en # 3 in register met camera # 2 te berekenen. Met een voldoende groot aantal fiducials kunnen hogere orde polynoom kromtrekken worden uitgevoerd beter past.
- Zodra de transformatiematrix wordt berekend, transformeren de ruwe gegevens van camera # 1-3 tezamen met de gesommeerde ruwe data te verkrijgen. Voer een nieuwe ronde van lokalisatie analyse om een nauwkeuriger x opleveren, y-coördinaat en de relatieve bijdrage van elke camera kanaal om de opgetelde ruwe data te bepalen; Gebruik de opdracht "Transform Rauw, Save en Save Sum (.dat)" onder het menu "Beeld Transformaties". Dit intensiteitsverhouding bevat de z-coördinaten.
- Kies een heldere de vaste en uit te voeren z-kalibratie montage met de functie "Test Punt van de wind 3D" in het pop-up venster door te klikken op "Z-coördinaat Operations" onder het menu "Speciale functies". Dit past 3-sinusoïdale functies om de intensiteiten van de 3 camerakanalen om de kalibratiecurve te bepalen. De kalibratie-bestand wordt vervolgens opgeslagen voor verder gebruik op de belangrijkste datasets.
- Om de kwaliteit van de kalibratiecurve testen uitvoeren z-coördinaat extractie, zoals eerder 23 beschreven. Voor goed gedragen fiducials in een goed gekalibreerd systeem moet de z-coördinaat lineaire schaal, aangezien de calibratie datasets worden genomen met een lineaire zwaai in z-positie. Bovendien moet de z-posities van alle fiducials schaal met dezelfde helling.
- Zodra een bevredigende kalibratie wordt verkregen, uit te voeren lokalisatie en transformatie-analyse voor het ruwe beeld datasets verworven in stap 4 na dezelfde procedure beschreven in stappen 5,1-5,3. Als je klaar bent, plaatst u de kalibratie-bestand uit stap 5.4 en het uitvoeren van z-coördinaat extractie met behulp van de functies "Pick WND File" en "Extract Z-coördinaat" in het pop-up venster door te klikken op "Z-coördinaat Operations" onder het menu "Speciale functies".
OPMERKING: Aangezien de acquisitietijd is> 15 min, mechanische drift te verwachten. - Drift correctie in te voeren x, y, selecteer een heldere de vaste van de lokalisatie coördinaten. Dat de vaste moet aanwezig zijn in alle frames zijn. Gebruik vervolgens de x, y-coördinaat drift van de vaste aan alle andere coördinaten af te stemmen binnen hetzelfde frame terug in de registratie (figuur 3A-B) met behulp van de functie "Test / Schrijf Guide Star" onder het menu "Image Transformaties". Z-coördinaat registratie kan op dezelfde manier worden uitgevoerd door de toegang tot de "Test Guide Star" en "Write Guide Star" functies in het pop-up venster door te klikken op "Z-coördinaat Operations" onder het menu "Speciale functies".
- Als het monster lichte tilt kan vertonen, uit te voeren tilt correctie door het verstrekken van de x, y, z-coördinaten van 3 referentiepunten het definiëren van het vliegtuig dat moet worden ingesteld niveau met behulp van de functie "Verwijder XYZ Kantelen 'in het pop-up venster door te klikken op" Z-coördinaat Operations "onder het menu" Speciale functies ".
- Na de drift en tilt correcties, sparen de lokalisatie coördinaten. Reconstrueren afbeelding een super resolutie voor verdere analyse (Figuur 4A-D) met behulp van het commando "Render" op de belangrijkste interface. Kleur kan worden aangegeven de z-coördinaat. Als alternatief kan een zijaanzicht van het geselecteerde gebied kan ook worden gemaakt. De lokalisatie coördinaten kan als tekstbestanden worden geëxporteerd voor verdere kwantificering of de gereconstrueerde afbeelding kan worden opgeslagen als een TIF-bestand.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kritieke vereisten voor iPALM zijn de uitlijning, registratie en kalibratie van de optische systemen. Deze zijn nodig om de juiste storing binnen de 3-way bundelsplitser vereiste garanderen voor de z-coördinaat extractie. Om continue monitoring mogelijk te maken, constant puntbronnen van fluorescentie nodig. Dit kan worden bereikt met fluorescerende Au of bi-metallische nanodeeltjes 23 waarvan de fotoluminescentie voortvloeien uit plaatselijke surface plasmon resonance (LSPR). Ze fungeren als een stabiele gemeenschappelijke dipool bij belichting en kan meestal worden gelokaliseerd met 5 - precisie 10 nm. Deze commercieel verkrijgbaar nanodeeltjes geven een helderheid binnen het bereik van de meeste single-molecule fluoroforen, zodat zowel de fluoroforen en de ijkpunten kunnen worden afgebeeld met gelijke excitatie- intensiteit en versterkingsinstellingen de EMCCD camera zonder verzadiging (Figuur 1B). Bovendien zijn deze fiducials ook sterk facilitate gericht, waarbij de schijnbare breedte van de ijkpunten tijdens de scherpstelling kan worden gecontroleerd. Ook stringente reinigen van het dekglaasje oppervlak, zoals door Piranha etsen of plasma reiniging, is ook vereist, omdat valse achtergrondfluorescentie ongereinigde of slecht schoongemaakt coverglasses eenvoudig werkende moleculen signalen kan overweldigen, zoals eerder beschreven.
iPALM voert meerfasige interferometrie inschakelen hoge precisie z-coördinaat meting gelijktijdig met PALM (voor x, y). In de iPALM instrument, kan elke uitgestoten fluorescentie foton worden overwogen om zich te verspreiden door middel van zowel optische paden, die vervolgens zelf mengen in een op maat vervaardigde 3-weg beam splitter. De z-coördinaat wordt dus gecodeerd in de fase van het mengde foton. De onderlinge faseverschillen van ~ 120 ° van de output balken uit de 3-way bundelsplitser resultaat in de intensiteit variatie van de single-molecule beelden tussen de 3 camerzoals, waardoor z - coördinaat extractie uit een ijkkromme. Op basis hiervan de iPALM monsterhouder opbouw is een essentiële component, omdat het is voorzien van een paar piëzo-elektrische actuatoren die nm-precisie translatie in Z die kunnen worden uitgelijnd zijn en ijken.
Op het juiste scherpstelling en uitlijning, de vertaling van het monster langs de z-as een interferentie effect genereren. Dit manifesteert zich als de oscillatie van de vaste sterkte tussen de drie camerakanalen (figuur 1C-D). Deze trillingen geven ook aan dat de bovenste en onderste optische bundelbanen nagenoeg overeenkomen, zodat één-foton interferentie. Gewoonlijk, bij draaien van het instrument, de eerste fasen van elke camera zal niet optimaal zijn en de scan van z-plaats nodig als diagnostisch hulpmiddel voor kalibratie en uitlijning. Te komen tot de optimale fasen, de onderste spiegel van de bundeldeler(Figuur 1A) kan worden aangepast met de piëzo-elektrische tip-tilt het podium. De kalibratie scan van z-positie wordt na elke kleine 10-20 nm aanpassing. De intensiteit van het referentiemerkteken in elk kanaal wordt dan bepaald door lokalisatie analyse (dwz past met een 2D Gaussische functie). De intensiteit genormaliseerd door de totale intensiteit kan worden benaderd door een sinusvormige golfvorm, waardoor de term fase worden berekend; Aldus kan de fase overeenkomt met elke camera worden bepaald, zoals in figuur 1C. Wij merken op dat de single-photon interferentie principe gebruikt in iPALM ook kan worden aangetoond met behulp van een veel eenvoudiger 2-weg beam splitter. Echter, een 2-weg bundelsplitser onpraktisch voor 3D superresolutie microscopie omdat op of nabij de grens van destructieve interferentie, het signaal in één kanaal is minimaal, wat resulteert in lawaaierige ramingen intensiteit en lokalisatie coördinaten, die effectief beperken de z-coördinaat vastberadenheid om de range waar beide camera's hebben aanzienlijke intensiteit (<100 nm). Het minimale aantal kanalen nodig om dit effect te overwinnen is drie, en 3- en 4-weg projectiesystemen zijn beschreven in de literatuur 11,30.
Onder optimale omstandigheden voor een 3-weg bundeldeler, de faseverschillen tussen de 3 camera moet ongeveer 120 °. De 3-weg beam splitter voor iPALM bevat 3 reflecterende interfaces, zoals schematisch weergegeven in figuur 1A. De bundeldeler boven een vlakke dielektrische spiegel geplaatst, met een dunne spleet gevuld met bijpassende brekingsindex-olie, zodat fijnafstelling van weglengten in de bundeldeler en optimale faseverschillen bereiken. Zoals getoond in Figuur 1C-D, in de juiste uitlijning voor iPALM, de camera's dicht bij een 120 ° onderling faseverschil. In de praktijk, een faseverschil groter is dan 105 ° is algemeen aanvaardbaar. Dergelijke kalibratie zowel indicates dat het systeem goed uitgelijnd en dat zal worden gebruikt voor de volgende z-coördinaat extractie. Het is ook nuttig om de kalibratiekromme gegenereerd met verschillende fiducials evalueren. De meeste fiducials met matige helderheid over het algemeen uitzenden als een enkele dipool, wat goed opgevoede kalibratie curves. Echter, kunnen incidenteel aggregaten van fiducials (vaak mensen met extreme helderheid) gedragen op een afwijkende manier, waardoor onbetrouwbare kalibreringskrommen. Het is ook raadzaam om fiducials kiezen bij het centrum van het beeldveld en nabij het gebied van biologisch belang (Figuur 1B), te meer daar de hoge NA doelstellingen lens in de iPALM setup niet vlak veld gecorrigeerd. De effectieve field-of-view is beperkt tot het centrale gebied, blijkt uit de grotere breedten betrouwbaarheidsgrenzen naar de rand van het veld.
Na de aanvankelijke uitlijning van de velden gezichtsvelden bevattende cellen met gewenste morphology en meerdere fiducials om een goede kalibratie te garanderen worden gekozen voor de beeldvorming. Dit kan worden bereikt door langzaam het vertalen van de monsterhouder via 2-assen servomotoren. Vertaling van het monster zal resulteren in enige onscherpte, omdat het monster niet altijd perfect vlak. Daarom moet de focus voortdurend worden bijgesteld tijdens de vertaling. Zodra het beeldveld is gekozen, een nieuwe ronde van kalibratie optimaliseren kalibratiecurve wordt vervolgens naar verfijnen verricht het systeem uitlijning en de werkelijke ijkcurve te bepalen. Belangrijkste is dat gebieden onder de kern of nabij gebieden met heterogene brekingsindex (bijvoorbeeld luchtbellen) worden vermeden in het algemeen, aangezien deze aanzienlijke verandering van het relatieve pad leiden lengten, verstoren de z-coördinaat.
Etikettering hoge dichtheid, kan fluorescentie signalen van organische fluoroforen zoals Alexa Fluor 647 extreem helder zijn. Zoals getoond in Figuur 2A, met de juiste buffer preparaat dat een hoge concentratie van thiol (-SH) groepen 31, de fluorofoor worden snel uitgeschakeld onder hoog excitatiebelichting. Dit resulteert in de onderdrukking van de fluorescentiesignalen van de meerderheid van de moleculen. In een bepaald geval, een zeer kleine minderheid van fluoroforen stochastisch terug naar de "aan" -toestand. Deze verwachting spaarzaam verdeeld en kan dus worden gevisualiseerd als afzonderlijke moleculen één of enkele frames voordat u "off." De photoswitching dynamiek sterk afhankelijk van de excitatie-intensiteit en de concentratie van -SH, en dus voor een bepaald systeem, zorg moet worden genomen om het etiket dichtheid optimaliseren, met name omdat een relatief hoge excitatie-intensiteit (640-647 nm) had een meerderheid van Alexa Fluor 647 moleculen uit te schakelen. Indien de excitatie onvoldoende sterk is, een aanzienlijk deel van A. Fluor 647 wilblijven in de "on" staat, wat resulteert in hoge achtergrond, moeilijkheden bij de naleving enkel molecuul fluorescentie, en, uiteindelijk, slechte kwaliteit single-molecule lokalisatie resultaten. Onder een goed gebalanceerde toestand, moet één molecuul ruwe gegevens een voldoende groot aantal moleculen (honderden) per frame (figuur 2B) bevat, terwijl elk molecuul dun genoeg ondubbelzinnige detectie en lokalisatie analyse mogelijk. Het is ook vermeldenswaard dat voor iPALM, de principes van photoswitching zijn identiek aan die van PALM of STORM, en dus kunnen de monsters goed voorbereid voor iPALM direct worden gebruikt op de eenvoudiger 3D-PALM of 3D-STORM-systemen. Om een voldoende hoge dichtheid van moleculen te verwerven om Nyquist sampling voldoen, meestal 50.000 of meer frames van ruwe gegevens nodig zijn (dat wil zeggen, 150.000 totale frames voor de 3 camera's). De verwerving vordert, kan een groter deel van fluoroforen worden uitgeput door destructieve fotobleken, waardoor sparser enkel molecuul dichtheid. Om dit te compenseren, kan korte pulsen van 405 nm blauw licht (405 nm) worden verlicht op het monster met tussenpozen aan fluorofoor activering te promoten.
Vanwege de lange overname tijd die nodig is, optimaal resultaat voor iPALM (of single-molecule lokalisatie microscopie in het algemeen) vereisen lage monster drift en / of goede drift correctie. Bijvoorbeeld met behulp van de belichtingstijd van 50 msec in frame overdrachtmodus (20 Hz framesnelheid), de totale acquisitietijd voor 50.000 frames 42 min. Gedurende deze periode wordt de mechanische drift over tientallen nm verwacht. Inderdaad, naast de hoge lokalisatie precisie en hoge dichtheid kenmerken, de resolutie ook afhankelijk drift correctie kwaliteit. Er zijn meerdere oorsprong van deze afwijkingen met thermische schommelingen zijn een belangrijke oorzaak. Door deze overweging, indien mogelijk, worden delen iPALM maat bewerkt met behulp Invar, een lage thermische uitzetting legering of roestvrij staal,die beide veel lagere thermische uitzetting eigenschappen dan messing of aluminium. Helaas stelt ook extra kosten ten opzichte van aluminium, dat is een gebruikelijke metalen onderdelen voor microscopen, die veel goedkoper en eenvoudiger te bewerken. Andere bronnen van drift kan worden mechanische trillingen van randapparatuur, ambient omgevingen of luchtstromen. Deze moeten worden geminimaliseerd door het plaatsen van het systeem in een geschikte behuizing en ombuigen de luchtstroomrichting in de microscoop gebied. De installatie moet worden gebouwd op een research-grade optische tafel en, indien mogelijk, ventilator-componenten bevat van de optische tafel moet worden gelegd. Ondanks alle voorzorgen, is enige mate van drift blijft. Kritisch, moeten deze afwijkingen zodanig worden geminimaliseerd dat het beeld scherp blijft gedurende de acquisitie tijd. In onze systemen, deze passieve methoden volstaan om drift tot een aanvaardbaar niveau te beperken. Het moet echter mogelijk zijn actieve drift com implementerencompensatie methoden om de lange termijn en hoge precisie beeldvorming 32 mogelijk te maken.
Na verwerking van de ruwe gegevens, kan 3D lokalisatiecoördinaten verkrijgbaar typisch 5-10.000.000 individuele molecuul pieken per dataset. Zoals getoond in figuur 3, kan de drift als functie van de tijd worden gevisualiseerd door de lokalisatie van de coördinaten fiducials. Meerdere fiducials kan worden gebruikt om de gemiddelde drift correctie bal (Figuur 3A-B) te berekenen. Ook is het gebruikelijk om te filteren pieken die slecht passen aan de 2D-Gaussische functie tijdens lokalisatie analyse. Dit zou te wijten zijn aan valse geluiden of gedeeltelijk overlappende single-molecule pieken en kunnen worden onderscheiden door de grote resterende vierkante fout berekend tijdens de montage proces. Pieken met lage helderheid (zoals aangegeven door de foton telling) en derhalve grotere onzekerheid (dwz groter dan ~ 25 nm) worden eveneens uitgefilterd, eens die waarschijnlijk voortkomen uit aspecifieke achtergrondfluorescentie. Evenzo pieken waarvan de intensiteiten van de 3 camerakanalen slecht passen om de kalibratiecurve worden afgewezen, omdat de z-coördinaten verkregen onbetrouwbaar. Opgemerkt wordt dat de volledige informatiegehalte van iPALM (en lokalisatie microscopie in het algemeen) is enorm, omdat de analyseresultaten niet alleen in het fluorofoor coördinaten, maar ook in diverse andere parameters zoals sterkte, breedte, helderheid, etc. Echter, in de praktijk, omdat relatief weinig computationele gereedschappen beschikbaar voor analyse in het coördineren van de ruimte, zijn lokalisatie coördinaten meestal gesmolten of omgebouwd tot pixel-based beelden voor verdere analyse.
De meest gebruikte aanpak voor het iPALM reconstructie is te vertegenwoordigen elk lokalisatie coördineren met een genormaliseerde 2D Gauss-functie, met de lokalisatie onzekerheid te stellen als de Gaussian breedte 33. Zo is de hoge precisie coördinaten (meestal single-molecule pieken met een hoge helderheid tegen lage achtergrond) verschijnen als scherp en smalle pieken, terwijl de lage-precisie coördinaten (meestal lage helderheid of hoge achtergrond single-molecule pieken) verschijnen als dimmer en bredere pieken. Op deze wijze elk molecuul draagt evenveel intensiteit de afbeelding. Voor een 3D-dataset, kan de z-coördinaat worden weergegeven met behulp van kleur, meestal gebaseerd op een tint schaal (figuur 4C-D). Als alternatief kunnen de beelden worden weergegeven als een zijaanzicht (x, z en y, z) projectie of volumes. Een aantal algemeen beschikbare software kan worden gebruikt om dergelijke data 34 visualiseren.
Zoals getoond in figuren 4-6, iPALM beelden leveren een aanzienlijke verbetering ten opzichte buigingsbegrensd fluorescentie microscopie. De f-actine architectuur in HUVEC cellen kunnen worden gevisualiseerd met veel verbeterde ruimtelijke Resolutie. In gebieden van de cortex, kunnen netwerken met afzonderlijke filamenten te zien, terwijl in stressvezels, bundels en lamellipodia de dichtgepakte f-actine netwerken waargenomen dat een filamenteuze structuur hebben, hoewel individuele filamenten niet te onderscheiden. Dit is waarschijnlijk te wijten aan de beperkingen die zowel de helderheid van de fluoroforen en de lokalisatie precisie. De aanwezigheid van afzonderlijke corticale filamenten stelt de ultrastructuur van het f-actine netwerk zodanig is behouden; dus kon iPALM een nuttig instrument voor het karakteriseren van de corticale architectuur zijn. In figuur 5 wordt een sub-gebied van een HUVEC cel weergegeven profielen van een actine filament gekwantificeerd. Te zien is dat de z-histogram van een filament ongeveer 15 nm breed, relatief klein in vergelijking met ~ 45 nm voor de transversale (x, y) aanzicht, waaruit blijkt dat iPALM levert een aanzienlijke verbetering resolutie z-resolutie ten opzichte de x, y-vlak, zoals verwacht. Aangezien de actual diameter van F-actine is ~ 8 nm, is het onduidelijk of de waargenomen filament elk filament of een bundel van enkele filamenten. Correlatieve beeldvorming met behulp iPALM en EM kan een nuttige strategie voor verdere karakterisering van F-actine architectuur, hoewel deze benadering niet toegepast op f-actine nog 23 bestuderen.
Figuur 1: Schematische weergave van iPALM 3-D Super Resolution Microscopie. A) Schema van iPALM optica. De dubbele objectieven (Nikon, NA 1,49 60X) kan elke uitgezonden fluorescentie foton te verspreiden door middel van zowel de bovenste en onderste optische bundel paden, en ze worden doorgestuurd om in te grijpen in de bundelsplitser door een paar spiegels gericht op 22,5 °. De fase van de zelf-foton verstoord is recht evenredig met Az, waardoor codeert de z-coördinaat van de fluorofoor, en kunnen ons metening een 3-weg beam splitter met onderlinge faseverschillen van ~ 120 ° tussen de drie uitgang balken. Ze zijn gericht door de buis lenzen (L1-L3, f = 400 nm) en gefiltreerd door emissiefilter (F1 - F3). Elke afzonderlijke molecule blijkt derhalve met verschillende intensiteiten tussen camera (EMCCD1-3) maar vergelijkbaar x, y-coördinaten. (A) wordt weergegeven en veranderd van Ref. 11. (B)-diffractie beperkt beeld van HUVEC-cellen gelabeld voor f-actine met Alexa Fluor 647. De heldere vlekken duiden Au nanodeeltje fiducials. De fasehoeken voor camera # 1-3 worden weergegeven door rode, groene en blauwe lijnen respectievelijk gecentreerd op elke betrouwbaarheidsgrenzen, met het faseverschil tussen camera # 1-3 aangegeven. Schaal bar:. 5 micrometer (C) Fiducial beelden die de interferometrische effecten. Beelden van een Au nanodeeltje de vaste voor elke camera (CCD1-3) of totaal (som), genomen als de z-positie (in nm, op onderste rij) wordt gescand voor de kalibratie. De intensiteit binnen each camera zichtbaar oscilleren met een faserelatie, zoals in (B). (D) iPALM kalibratiecurve. Het monster wordt omgezet langs de z-as. De intensiteiten van een Au nanodeeltje de vaste voor de EMCCD1-3 zijn te zien zijn als rode, groene en blauwe lijnen, respectievelijk (top). Deze worden vervolgens genormaliseerd en bevestigd aan de faseverschillen (onder) te bepalen. Tijdens het uitlijnen, wordt het systeem aangepast aan de maximale faseverschillen tussen de drie camera's te bereiken. De kalibratiekromme wordt op elke imaging ter plaatse genomen om te gebruiken in de winning van de z-coördinaat van elke single molecule. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Single Molecule beeldvorming van photoswitching AlEXA Fluor 647-phalloidin als actine Labels. (A) Initiële photoswitching stap. F-actine in gefixeerde cellen gelabeld met een hoge dichtheid van phalloidin geconjugeerd met Alexa Fluor 647. Hoge intensiteit verlichting in een thiol bevattende afbeeldingsbuffer resulteert in een snelle uitschakeling van de meeste fluoroforen. (B) Representatieve beelden van ruw single-molecule frames. Bij steady-state knipperen, moet de geactiveerde Alexa Fluor 647 voldoende dun dat individuele enkele moleculen verschijnen als een PSV-sized plek. Beelden van dezelfde cellen getoond in (A) weergegeven met inverse contrast. Schaal bars in A en B:. 5 micrometer Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Drift correctie met behulp van Multip. le Fiducials lokalisatiecoördinaten vier ijkpunten (A, x-coördinaat, B, y-coördinaat) gebruikt om drift behulp polynoom fittings berekenen (5 Ode orde, fit parameters rechtsboven). De gemiddelde drift traject maakt correctie van de drift met sub-5 nm precisie (x: 3.085 nm, y: 3,606 nm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Visualisatie van 3-D f-actine Architectuur per iPALM. (A) buigingsbegrensd beeldveld van HUVEC cellen met F-actine gelabeld met Alexa Fluor 647-phalloidin (overeenkomend met deelgebieden van de cel in figuur 2). Het lichtpuntje is te wijten aan de Au nanodeeltjes fiducials.
Figuur 5: nanoschaal Dimensie van de f-actine gevisualiseerd door iPALM. (A) het gereconstrueerde iPALM HUVEC cellen met f-actine gelabeld b y Alexa Fluor 647-phalloidin. De kleur geeft de z-coördinaat volgens de kleurenbalk. Schaalbalk. 1 urn (B) dwarsdoorsnede histogram van x, y-lokalisatiecoördinaten langs de lengteas van de omkaderde gebied (A). Het histogram verkrijgen worden de coördinaten geprojecteerd op de lange as van de doos en weggegooid met een 5-bin nm grootte. De grijze curve geeft een Gauss beste past op het histogram, met een breedte op halve hoogte (FWHM) van 43,88 nm. (C) Histogram van de z-positie van lokalisatiecoördinaten in de omkaderde gebied (A). De z-posities worden weggegooid met een bak grootte van 1 nm. De grijze curve geeft een Gauss best geschikt om de histogram, met een FWHM van 17.50 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
/files/ftp_upload/54774/54774fig6.jpg "/>
Figuur 6:. Vergelijking van iPALM beeldvorming van F-actine gebruik van verschillende Labeling Reagentia gereconstrueerde iPALM afbeeldingen f-actine gelabeld met Alexa Fluor 647-geconjugeerd phalloidin (A), Alexa Fluor 568-geconjugeerd phalloidin (B), of door transfectie met actine -mEos2 fusie-eiwit expressievector (C). Schaal bars (AC):. 1 micrometer Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het optische systeem iPALM is gebaseerd op een 4-π dual-tegen objectief ontwerp, zoals weergegeven in figuur 1A. De instellingen worden geconstrueerd met zowel maat gefreesd en commerciële opto-mechanische onderdelen, zoals eerder beschreven 23 en in tabel 1. In aanvulling op onze opstelling, het Howard Hughes Medical Institute (HHMI) biedt onderdak aan een systeem dat toegankelijk is voor de wetenschappelijke wereld op het Advanced Imaging Center van de Janelia Research Campus is. Voor de volledige mechanische tekeningen, controle schema's en software, wordt de lezer aangemoedigd om contact op met Harald Hess bij HHMI voor meer informatie. Een belangrijk voordeel voor het gebruiken iPALM en andere werkende moleculen lokalisatie microscopie methoden voor het visualiseren f-actine is het relatieve gemak van monstervoorbereiding opzichte van EM technieken, die in het algemeen vereist harde monster verwerking, moeizame bereiding, en goed getraind beoefenaars 3,23 . Additionally, fluorescentie natuurlijk vatbaar voor multichannel beeldvorming, die moeilijk EM blijft. Niettemin, zoals hieronder beschreven, zijn er verschillende huidige beperkingen voor de aanpak zowel wat prepareren en beeldvormingsproces. Ten eerste, zoals het geval is voor EM monstervoorbereiding voorzichtigheid geboden om goede ultrastructurele behoud van de monsters 35 garanderen, aangezien een protocol geschikt voor een buigingsbegrensde resolutieniveau kan ernstige verstoringen op nanoschaal niveau veroorzaken. Voor actine imaging, goede fixatie van de cellen is een belangrijke factor voor specimen kwaliteit. Glutaaraldehyde is een geprefereerde fixeermiddel aangezien behoudt het cytoskelet en membraan zeer goed, maar in het geval van co-kleuring met antilichaam kan epitoopplaatsen worden beïnvloed. In dat geval kan paraformaldehyde een aanvaardbaar compromis bieden, omdat deze dan beter behouden antilichaamepitoop sites. Belangrijk voor single-molecule lokalisatie microscopie, deze fixeermiddelen hebben de neigingnaar achtergrond autofluorescentie genereren; aldus, na fixatie quenching door boorhydride is noodzakelijk, met name bij glutaaraldehyde.
Bovendien is de juiste keuze van fluoroforen en etikettering strategieën behoren tot de belangrijkste factoren voor een succesvolle experimenten. Door nanoschaal dimensie van f-actine, worden hoge dichtheden van labels nodig is om de onderliggende netwerken filamenteuze vangen, zoals bepaald door het Nyquist theorema bemonstering 36. Voor actine, falloïdine maakt labeling zeer hoge dichtheid, met een groot aantal organische fluoroforen verkrijgbaar bij vele fabrikanten. Aangezien falloïdine toxisch, cel fixatie en permeabilisatie vereist. Alternatieve strategieën voor live-cell-compatibele actine labeling omvatten het gebruik van fusie van fluorescerende eiwitten (FP), hetzij met monomeer actine of met een klein-actine-bindende polypeptiden. Toch vonden we dat deze de neiging om een lagere etikettering dichtheid opleveren in vergelijking met phalloidin (
39. Dit geldt evenzeer voor de voordelen en beperkingen van iPALM. Vergeleken met andere 3-dimensionale superresolutie microscopietechnieken heeft iPALM de hoogste oplossen optische benadering meer gewijzigd, met name langs de z-as, de z-resolutie bijna 2 keer beter dan de x, y-resolutie 11. Echter, de afhankelijkheid van iPALM op interferometrie voor een hoge z-resolutie legt ook een beperking van de beeldvorming diepte, omdat de kalibratie curve is een periodieke. Met andere woorden, z-coördinaten herhalen elke 250 nm of zo (bij ~ 700 nm emissiegolflengte van Alexa Fluor 647). In de praktijk kan dit worden verholpen door gebruik TIRF verlichting, waarbij de excitatiezone binnen het verdwijnende veld diepte beperkt tot <200 nm van het dekglaasje. Zo fluoroforen dieper in het model zijn niet opgewonden en blijven onzichtbaar. Echter, dit beperkt ook de biologische structuren die kunnen worden afgebeeld die in de nabijheid van het dekglaasje, zoals focale adhesies, corticale cytoskelet en ventrale plasmamembraan, terwijl meer inwendige structuren buiten bereik. Voor vaste specimen, een remedie is om uit te voeren cryosectioning 40. Echter, een dergelijke benadering is zeer bewerkelijk en vergt gespecialiseerde kennis die niet algemeen beschikbaar.
Als alternatief kan iPALM worden aangepast voor een langere z-bereik door het combineren van interferometrie met de astigmatische-onscherp regeling 12 gebruikt in 3D-STORM. Deze benadering levert dubbele z-coördinaat uitlezingen, de eerste door interferometrie, die hoge precisie, maar periodiek, en de tweede door astigmatische onscherpte, die minder nauwkeurig, maar niet-periode. Laatstgenoemde kan vervolgens worden gebruikt om "uitpakken" of breken de degeneratie vande interferometrische z-coördinaten, waardoor de verdrievoudiging van de iPALM imaging diepte ~ 750 nm, effectief het naderen van de intrinsieke scherptediepte van hoge NA objectieven. Met fase uitpakken is iPALM gebruikt om beeld structuren diep in de monsters, zoals mitochondriën, zij het met iets lagere precisie in alle 3 dimensies door de extra defocussering 40.
Een andere intrinsieke beperking van iPALM is de imaging snelheid. Omdat grote aantallen frames moeten een hoge dichtheid van lokalisatiecoördinaten verkrijgen, de camera snelheid is meestal de limiet op de opnamesnelheid. Met de huidige EMCCD camera loopt op 10-20 MHz uitlezing prijzen, zijn tientallen minuten vereist voor een voldoende aantal frames. Dergelijke lange tijdschalen vereisen dat het monster worden vastgesteld. Hier, recente ontwikkelingen in de camera-technologie, zoals de veel snellere wetenschappelijke Complementary Metal Oxide Semiconductor (sCMOS) camera, kan een snelle toename van im mogelijk te makenaging snelheid 41, hoewel dit niet voor iPALM nog niet geïmplementeerd. Voor sommige single-molecule lokalisatie microscopie benaderingen, kan een dichte single-molecule veld worden geanalyseerd met behulp van een aangepaste algoritme 42 of gecomprimeerd sensing 43. De aanpassing van deze strategieën kan ook de snelheid van iPALM doordat dichter enkel-molecuul beelden en dus minder frames.
Met beperkingen in snelheid en beeldvorming bereik en sterke punten in de ruimtelijke resolutie, een belangrijke toepassing voor iPALM is als een ultrastructurele methode die de voordelen van fluorescente labeling benut om nanoschaal organisatie van specifieke eiwitten 14,15,44 onthullen. Verdere verbetering, zowel in termen van de optica en fluorofoor technologieën, moet verdere verbetering in iPALM ruimtelijke resolutie mogelijk te maken. Bijvoorbeeld iPALM beeldverwerking telt momenteel een relatief eenvoudige eerste-orde benadering aanpak, waarbij elk enkel molecuul gemodelleerd door een 2D-Gauss-functie en alsgeconsumeerd om een isotoop zijn gemiddeld dipool. Dit kan worden uitgebreid met recente methoden, die een nauwkeurig model van de point-spread functie en dipool oriëntatie of expliciete behandeling van optische aberraties in het gezichtsveld toepassen om aanzienlijke verbetering ruimtelijke resolutie. Evenzo is photocaging gemeld, die de helderheid fluorofoor door ordes van grootte 45 verbetert. Sterker nog, omdat de belangrijkste elementen van hun ultrastructurele organisatie zijn goed gekarakteriseerd, de f-actine cytoskelet kan een zeer waardevol modelsysteem voor het testen van verdere methodologische ontwikkelingen in iPALM zijn. Het vermogen om eiwitten organisatie analyseren met lichtmicroscopie met echte EM-niveau oplossend vermogen naar verwachting sterk verbeteren ons begrip van talloze aspecten van de cellulaire structuur en functie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
YW en PK zeer erkentelijk voor financiële steun van de Singapore National Research Foundation, toegekend aan PK (NRF-NRFF-2011-04 en NRF2012NRF-CRP001-084). We danken ook de MBI geopende lab en microscopie kernfaciliteiten voor ondersteunende infrastructuur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| optical table | Newport, CA | RS4000 | iPALM, installed on 4 Newport Stabilizer vibration isolators |
| vibration isolator for optical table | Newport, CA | S-2000 | |
| laser-642 | Newport, CA | 1185055 | output power=100 mw |
| laser-561 | Newport, CA | 1168931 | output power=200 mw |
| laser-488 | Newport, CA | 1137970 | output power=200 mw |
| laser-405 | Newport, CA | 1142279 | output power=100 mw |
| broadband dielectric mirrors | Thorlabs, NJ | BB1-E02 | laser combiner |
| dichroic beamsplitter | Semrock, NY | LM01-427-25 | |
| acousto-optic tunable filter | AA Opto-Electronic, France | AOTFnC-VIS-TN | |
| Linear polarizer | Newport, CA | 05LP-VIS-B | |
| baseplate | local workshop | customized | |
| turning mirror (22.5°) | Reynard Corpporation, CA | customized | 22.5° mirror |
| motorized optic mounts | New Focus, CA | 8816 | |
| motorized XYZ translation stage | Thorlabs, NJ | MT3/M-Z6 | sample holder |
| T-Cube DC servo motor controller | Thorlabs, NJ | TDC001 | |
| Piezo Phase Shifter | Physik Instrumente, Germany | S-303.CD | |
| objective lens | Nikon, Japan | MRD01691 | objective. Apo TIRF 60X/1.49 oil |
| translation stage | New Focus, CA | 9062-COM-M | |
| Pico Motor Actuator | New Focus, CA | 8301 | |
| rotary Solenoid/Shutter | DACO Instruments, CT | 5423-458 | |
| 3-way beam splitter | Rocky Mountain Instruments, CO | customized | beamsplitter |
| Piezo Z/Tip/Tilt scanner | Physik Instrumente, Germany | S-316.10 | |
| motorized five-axis tilt aligner | New Focus, CA | 8081 | |
| Picmotor ethernet controller | New Focus, CA | 8752 | |
| Piezo controllers/amplifier/digital operation module | Physik Instrumente, Germany | E-509/E-503/E-517 | |
| band-pass filter | Semrock, NY | FF01-523/20 | filters |
| band-pass filter | Semrock, NY | FF01-588/21 | |
| band-pass filter | Semrock, NY | FF01-607/30 | |
| band-pass filter | Semrock, NY | FF01-676/37 | |
| notch filter | Semrock, NY | NF01-405/488/561/635 | |
| motorized filter wheel with controllter | Thorlabs, NJ | FW103H | |
| EMCCD | Andor, UK | DU-897U-CSO-#BV | 3 sets |
| Desktop computers for controlling cameras and synchronization | Dell | Precision T3500 | PC, 4 sets |
| coverslips with fiducial | Hestzig, VA | 600-100AuF | sample preparation. fiducial marks with various density and spectra available |
| fibronectin | Millipore, MT | FC010 | |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences, PA | 15710 | fixation. 16% |
| glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences, PA | 16220 | 25% |
| triton X-100 | Sigma aldrich, MO | T8787 | |
| HUVEC cells | Life Technologies, CA | C-015-10C | |
| Medium 200 | Life Technologies, CA | M-200-500 | |
| Large Vessel Endothelial Factors | Life Technologies, CA | A14608-01 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | 14190367 | ||
| Pennicillin/Streptomycin | 15140122 | ||
| Trypsin/EDTA | Life Technologies, CA | 25200056 | |
| PIPES | Sigma aldrich, MO | P1851 | PHEM |
| HEPES | 1st base, Malaysia | BIO-1825 | |
| EGTA | Sigma aldrich, MO | E3889 | |
| MgCl2 | Millipore, MT | 5985 | |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Invitrogen, CA | A22287 | staining |
| sodium borohydride (NaBH4) | Sigma aldrich, MO | 480886 | quenching |
| glucose | 1st base, Malaysia | BIO-1101 | imaging buffer |
| glucose oxidase | Sigma aldrich, MO | G2133 | |
| catalase | Sigma aldrich, MO | C9322 | |
| cysteamine | Sigma aldrich, MO | 30070 | |
| Epoxy | Thorlabs, NJ | G14250 | |
| vaseline | Sigma aldrich, MO | 16415 | sample sealing |
| lanolin | Sigma aldrich, MO | L7387 | |
| parafin wax | Sigma aldrich, MO | 327204 | |
| Immersion oil | Electron Microscopy Sciences, PA | 16915-04 | imaging. Cargille Type HF |
References
- Kanchanawong, P., Waterman, C. M. Localization-based super-resolution imaging of cellular structures. Methods Mol Biol. 1046, 59-84 (2013).
- Bertocchi, C., Goh, W. I., Zhang, Z., Kanchanawong, P. Nanoscale imaging by super resolution fluorescence microscopy and its emerging applications in biomedical research. Crit Rev Biomed Eng. 41, 281-308 (2013).
- Kanchanawong, P., Waterman, C. M. Advances in light-based imaging of three-dimensional cellular ultrastructure. Curr Opin Cell Biol. 24, 125-133 (2012).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys J. 91, 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3, 793-795 (2006).
- Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angew Chem Int Edit. 47, 6172-6176 (2008).
- Sharonov, A., Hochstrasser, R. M. Wide-field subdiffraction imaging by accumulated binding of diffusing probes. P Natl Acad Sci USA. 103, 18911-18916 (2006).
- Fölling, J., Bossi, M., Bock, H., Medda, R., Wurm, C. A., Hein, B., Jakobs, S., Eggeling, C., Hell, S. W. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat Methods. 5, 943-945 (2008).
- Biteen, J., et al. Single-moldecule active-control microscopy (SMACM) with photo-reactivable EYFP for imaging biophysical processes in live cells. Nat Methods. 5, 947-949 (2008).
- Shtengel, G., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. P Natl Acad Sci USA. 106, 3125-3130 (2009).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
- Dani, A., Huang, B., Bergan, J., Dulac, C., Zhuang, X. Super resolution imaging of chemical synapses in the brain. Neuron. 68, 843-856 (2010).
- Liu, J., et al. Talin determines the nanoscale architecture of focal adhesions. P Natl Acad Sci USA. 112 (35), E4864-E4873 (2015).
- Kanchanawong, P., et al. Nanoscale architecture of integrin-based cell adhesions. Nature. 468, 580-584 (2010).
- Wu, Y., Kanchanawong, P., Zaidel-Bar, R. Actin-delimited adhesion-independent clustering of e-cadherin forms the nanoscale building blocks of adherens junctions. Dev Cell. 32 (2), 139-154 (2015).
- Szymborska, A., et al. Nuclear Pore Scaffold Structure Analyzed by Super-Resolution Microscopy and Particle Averaging. Science. 341, 655-658 (2013).
- Lawo, S., Hasegan, M., Gupta, G. D., Pelletier, L. Subdiffraction imaging of centrosomes reveals higher-order organizational features of pericentriolar material. Nat Cell Biol. 14, 1148-1158 (2012).
- Mennella, V., Agard, D. A., Huang, B., Pelletier, L. Amorphous no more: subdiffraction view of the pericentriolar material architecture. Trends Cell Biol. 24, 188-197 (2014).
- Mennella, V., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence microscopy reveals a domain of the centrosome critical for pericentriolar material organization. Nat Cell Biology. 14, 1159-1168 (2012).
- Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463, 485-492 (2010).
- Salbreux, G., Charras, G., Paluch, E. Actin cortex mechanics and cellular morphogenesis. Trends Cell Biol. 22, 536-545 (2012).
- Shtengel, G., et al. Imaging cellular ultrastructure by PALM, iPALM, and correlative iPALM-EM. Method Cell Biol. 123, 273-294 (2014).
- Juette, M. F., et al. Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples. Nat Methods. 5, 527-529 (2008).
- Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging. Trends Cell Biol. 19, 555-565 (2009).
- Shannon, C. Communication in the presence of noise. Proc. IRE. 37, 10-21 (1949).
- Good, N. E., et al. Hydrogen ion buffers for biological research. Biochemistry. 5, 467-477 (1966).
- Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophys J. 94, 1826-1835 (2008).
- Shin, W. D., et al. Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. Goldman, R. D., Swedlow, J. R., Spector, D. L. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2010).
- Aquino, D., et al. Two-color nanoscopy of three-dimensional volumes by 4Pi detection of stochastically switched fluorophores. Nat Methods. 8, 353-359 (2011).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8, 1027-1036 (2011).
- Pertsinidis, A., Zhang, Y., Chu, S. Subnanometre single-molecule localization, registration and distance measurements. Nature. 466, 647-651 (2010).
- Baddeley, D., Cannell, M. B., Soeller, C. Visualization of Localization Microscopy Data. Microsc Microanal. 16, 64-72 (2010).
- El Beheiry, M., Dahan, M. ViSP: representing single-particle localizations in three dimensions. Nat Methods. 10, 689-690 (2013).
- Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nat Methods. 9, 152-158 (2012).
- Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics. Nat Methods. 5, 417-423 (2008).
- Yamashiro, S., et al. New single-molecule speckle microscopy reveals modification of the retrograde actin flow by focal adhesions at nanometer scales. Mol Biol Cell. 25, 1010-1024 (2014).
- Shroff, H., et al. Dual-color super resolution imaging of genetically expressed probes within individual adhesion complexes. P Natl Acad Sci USA. 104, 20308-20313 (2007).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346, (2014).
- Brown, T. A., et al. Super resolution fluorescence imaging of mitochondrial nucleoids reveals their spatial range, limits, and membrane interaction. Mol Cell Biol. 31, 4994-5010 (2011).
- Huang, F., et al. Video-rate nanoscopy using sCMOS camera-specific single-molecule localization algorithms. Nat Methods. 10, 653-658 (2013).
- Daostorm, S. DAOSTORM: an algorithm for high-density super-resolution microscopy. Nat methods. 8, 279 (2011).
- Zhu, L., Zhang, W., Elnatan, D., Huang, B. Faster STORM using compressed sensing. Nat Methods. 9, 721-723 (2012).
- Van Engelenburg, S. B., et al. Distribution of ESCRT machinery at HIV assembly sites reveals virus scaffolding of ESCRT subunits. Science. 343, 653-656 (2014).
- Vaughan, J. C., Jia, S., Zhuang, X. Ultrabright photoactivatable fluorophores created by reductive caging. Nat Methods. 9, 1181-1184 (2012).
