Summary
Vi presenterer en protokoll for anvendelse av interferometriske PhotoActivated Localization Mikroskopi (iPALM), en tre-dimensjonal enkelt-molekyl lokalisering super oppløsning mikroskopi fremgangsmåte til avbildning av aktin cytoskjelettet i adherente pattedyrceller. Denne fremgangsmåten gjør det mulig for lys-basert visualisering av nanoskala strukturelle trekk som ellers ville forbli uløst ved konvensjonell diffraksjon begrenset optisk mikroskopi.
Abstract
Fluorescensmikroskopi muliggjør direkte visualisering av spesifikke biomolekyler i cellene. Men for konvensjonelle fluorescens mikroskopi, er den romlige oppløsningen begrenset av diffraksjon til ~ 200 nm i bildeplanet og> 500 nm langs den optiske aksen. Som et resultat av fluorescens mikroskopi har lenge vært sterkt begrenset i observasjon av ultrastrukturelle egenskaper i cellene. Den siste utviklingen av super oppløsning mikroskopi metoder har overvunnet denne begrensningen. Særlig bruk av photoswitchable fluoroforer muliggjør lokaliseringsbasert super oppløsning mikroskopi, noe som gir oppløsningsevne som nærmer seg den molekylære lengdeskala. Her beskriver vi anvendelse av en tre-dimensjonal super oppløsning mikroskopi metode basert på enkelt-molekyl lokalisering mikroskopi og flerfase interferometri, kalt interferometrisk PhotoActivated Localization Mikroskopi (iPALM). Denne metoden gir nesten isotrop oppløsning påorden 20 nm i alle tre dimensjoner. Protokoller for å visualisere det trådformede aktin cytoskjelettet, inkludert prøven forberedelse og drift av iPALM instrumentet, blir beskrevet her. Disse protokollene er også lett tilpasses og rikt for studiet av andre ultra funksjoner i celler.
Introduction
Visualisering av komplekse cellulære strukturer har lenge vært en integrert del av biologiske innsikter og funn. Selv om fluorescens mikroskopi kan bildet celler med høy molekyl spesifisitet, dets oppløsningsevne er begrenset av diffraksjon til ~ 200 nm i bildeplanet (x, y, eller tverrdimensjon) og> 500 nm langs den optiske aksen (z, eller aksial dimensjon) 1,2. Derfor har observasjon av ultrastrukturelle egenskaper historisk sett vært begrenset til elektronmikroskopi (EM). Heldigvis har den siste utviklingen av super oppløsning mikros omgått denne grensen, slik romlig oppløsning på 10-100 nm range 1-6. Spesielt tilnærminger super oppløsning basert på enkelt molekyl lokalisering, kjent av akronymer som PALM (PhotoActivated Lokalisering Mikros) 4, FPALM (Fluorescence PhotoActivated Lokalisering Mikros) 5 (d) STORM (direkte Stochastic Optical Rekonstruksjon mikroskopi) 6,7, maling ( Point Opphopning for Imaging nanoskala Topografi) 8, GSDIM (Ground State Nedbryting Mikrosetterfulgt av individuell molekylær retur) 9, eller SMACM (Single-Molecule Active-Control Mikroskopi) 10, samt deres 3-dimensjonale (3D) implementeringer, for eksempel interferometrisk PALM (iPALM) 11 eller 3D-STORM 12, har vært verdifulle i å avsløre ny innsikt i nanoskala organiseringen av mange biologiske strukturer, inkludert nevronale aksoner og synapser 13, fokale sammenvoksninger 14,15, celle-celle veikryss 16, kjernekraft porer 17 og centrosomes 18-20, for å nevne noen.
En annen ultrastructural funksjon i celler som super oppløsning mikroskopi er potensielt nyttig er aktin cytoskjelettet. Komplekset nettvaren av filamentøse (f) p-aktin i cellen cortex spiller en vesentlig rolle i kontrollen av celle form og mekaniske egenskaper 21. Organisasjonen of f-aktin er aktivt og dynamisk regulert om mange regulatoriske proteiner som sterkt påvirker polymerisering, kryssbinding, omsetning, stabilitet og nettverkstopologi 22. Men selv om karakterisering av f-aktin nettvaren arkitekturen er viktig for mekanistiske innsikt i et variert utvalg av cellulære prosesser, den lille størrelse (~ 8 nm) av F-aktin filamenter vanskeliggjør deres observasjon ved konvensjonell diffraksjon begrensede lysmikroskopi; således, visualiseringen av aktin fin struktur har hittil vært utelukkende utført ved EM. Her beskriver vi protokollene for å visualisere f-aktin cytoskjelettet i heftpattedyrceller, bruker iPALM super oppløsning mikroskopi teknikk for å dra nytte av sin svært høy presisjon evne i 3D 11,23. Selv om iPALM instrumentet er svært spesialiserte, har instruksjon om å sette opp et slikt instrument er beskrevet nylig 23, mens tilgang til iPALM mikroskop arrangert av Hosengepost Hughes Medical Institute har også blitt gjort tilgjengelig for forskersamfunnet med minimal kostnad. I tillegg er prøvefremstillingsmetoder som er beskrevet her, er direkte anvendelige for alternative 3D superoppløsningsfremgangsmåter, slik som de basert på astigmatiske defokusering av punktspredefunksjonen (PSF) 12 eller bi-plan deteksjons 24, som er mer bredt tilgjengelig.
Vi merker oss at en nødvendig ingrediens for enkelt-molekyl lokalisering basert super oppløsning mikroskopi generelt er photoswitchable fluorophore 25, noe som gjør at de tre kritiske krav til enkelt-molekyl lokalisering basert super oppløsning mikros være oppfylt: i) høy enkelt-molekyl lysstyrke og kontrast i forhold til bakgrunnssignaler; ii) sparsom distribusjon av enkle molekyler i et gitt bilde ramme; og iii) med høy romlig tetthet av merking tilstrekkelig til å fange profilen til den underliggende strukturen (også kalt Nyquist-ShanIkke sampling kriterium) 26. Således kan tilfredsstillende resultater, bør det legges vekt likt på både den riktige fremstillingen av prøver for å optimalisere fluoroforen photoswitching og for å bevare de underliggende ultrastruktur, så vel som på de instrumentering og anskaffelses aspekter av eksperimentene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Imaging Specimen Forberedelse
- Siden bakgrunn fluorescens signaler forstyrrer fluorescens fra fluoroforen etiketter, rengjøre dekkglass ved først å skylle dem i de-ionisert vann (DDH 2 O) og deretter luft-tørke dem ved hjelp av trykkluft. Deretter utfører plasmaetsing i en plasmarenser i 15 sekunder, eller lenger om nødvendig.
- For å aktivere korreksjon av drifting og iPALM kalibrering, bruk # 1,5 runde (22 mm diameter) pre-renset dekkglass innebygd med fluorescerende nanopartikler som fiducial merkene, som fungerer som svært fotostabile fiducials for pålitelig kalibrering og drift korreksjon. På grunn av den lange innhentingstiden som kreves for å bygge opp tilstrekkelig fluoroforen tetthet (> 15-30 min), er prøven drift uunngåelig.
- Plasser hver fiducialed dekkglass i en 6-brønners vevkulturplate. Sterilisere dem ved ultrafiolett (UV) stråling i en laminær strømningshette i 15 minutter.
- I en steril laminær hette, forberede fibronectin løsning for dekkglass belegg ved fortynning av 1 mg / ml fibronektin stamløsning i steril Dulbeccos fosfatbufret saltløsning (DPBS) til en sluttkonsentrasjon 2-10 ug / ml. Skyll hver dekkglass tre ganger med DPBS og inkubert med 2 ml av den fibronektin-løsning over natten ved 4 ° C. Deretter aspirer ut fibronectin og skyll en gang med DPBS.
- Skyll cellene kort med DPBS. Inkuber med 1 - 2 ml trypsin til noen få minutter ved 37 ° C inntil cellene løsner og slukke med ~ 10 ml frisk serum-inneholdende cellekulturmedium. For eksempel for human umbilical vene endotel-celler (HUVEC) ved å bruke stort fartøy endotelial dyrkingsmedium supplert med store kar endoteliale faktorer og penicillin eller streptomycin.
- Replate cellene bort på fibronektin-belagte dekkglass (for sparsom densitet, plate <50.000 celler pr dekkglass) og opprettholde kulturen i en inkubator innstilt ved 95% fuktighet, 5% CO2, og 37 & #176, C.
- For riktig bevaring av de fine strukturer av f-aktin cytoskjelettet, bruke bufferløsninger basert på gode buffer reagenser 27.
- For eksempel, fremstille cefem-buffer som en 2x forrådsoppløsning (120 mM PIPES, 50 mM HEPES, 20 mM EGTA, 4 mM MgCl2, pH 7,0 med KOH) ved å løse opp 6,5 g av HEPES, 3,8 g EGTA, og 190 mg av MgCl2 i ~ 300 ml DDH 2 O, med pH justert til 7,0 ved dråpevis tilsetning av konsentrert KOH oppløsning; deretter, legger DDH 2 O for å bringe volumet til 500 ml. Steriliser buffer ved hjelp av en 0,22-mikrometer filter, må den oppbevares ved 4 ° C, og spe den 1: 1 med DDH 2 O før bruk.
- For best resultat med merking høy tetthet av f-aktin, bruk phalloidin konjugert med organiske fluoroforer, slik som Alexa Fluor 647. Ved ønsket tidspunkt etter celle replating, fikse cellene som følger:
- Aspirer media fra hver kultur vel som inneholder cell prøven. Forsiktig, men raskt dispense 2 ml varm (37 ° C) utvinning fiksativ inneholdende 0,25% glutaraldehyd i cefem-buffer med 0,25% Triton X-100. Inkuber ved romtemperatur i 1 - 2 minutter. For etterfølgende trinn, bruke 2 ml fiksativ eller slukke buffer per dekkglass, med mindre annet er angitt.
- Bytt utvinning fiksativ med 2,5% glutaraldehyd fiksativ i cefem buffer og la prøvene inkuberes i 10-12 min. Dette og følgende trinn utføres alle ved romtemperatur.
- Aspirer ut fiksativ og forsiktig erstatte dem med cefem buffer. Tilt og swirl forsiktig, og vask deretter igjen med cefem. Gjenta to ganger.
- Å slukke autofluorescens fra glutaraldehyd, som kan overvelde signaler fra de ønskede fluoroforer, inkubere prøvene med en nylaget bråkjøling buffer inneholdende NaBH4 ved en massekonsentrasjon på 0,1% i cefem. Rikelig bobler vil bli observert. Av og trykk på prøven fatet forsiktig til Dislodge boblene. La det inkuberes i 5-10 min.
- Aspirer ut leskende buffer og forsiktig erstatte den med cefem buffer. Skyll noen ganger for å fjerne boblene. Pipette i 2 ml cefem-buffer og la det inkuberes i mørket i 5 min. Gjenta to ganger og la prøven resten i cefem buffer når du er ferdig.
- Utarbeide en fuktighet kammer for phalloidin inkubasjon ved hjelp av en stor plast petriskål polstret med et stykke papir håndkle sjenerøst fuktet med 5 - 10 ml DDH 2 O. Plasser et stort stykke ren Parafilm på toppen av den våte papirhåndkle.
- På grunn av den relativt høye kostnaden av merket phalloidin, bruke et lite volum for hver merking. For merking høy tetthet, starter med en konsentrasjon på 0,3 mikrometer. Forbered ~ 60 mL per dekkglass ved hjelp phalloidin-Alexa Fluor 647 i cefem buffer.
- Pipette 55 - 60 ul av den phalloidin løsning på Parafilm arket i fuktighetskammeret. Bruke fin pinsett, forsiktig fjerne prøven CoverGlass. Vær nøye med å merke riktig celleholdige ansikt.
- Raskt og banke forsiktig bort overflødig buffer ved å berøre kanten av dekkglass med en foldet stykke delikat absorberende papir, og deretter plassere dekkglass cellen siden ned på dråpe phalloidin løsning på Parafilm. Pass på at det ikke er noen bobler fanget av dekkglass.
- Sett dekselet på fuktighetskammeret. Pakk kammeret i aluminiumsfolie for å beskytte den mot lys fra omgivelsene, og la prøven inkuberes over natten ved 4 ° C. Prøven kan oppbevares i denne tilstand i flere dager. Pass på at luftfuktigheten kammeret forblir fuktig dersom lang lagring er planlagt.
- Før bildebehandling, plasserer forsiktig dekkglass cellen siden opp på en ny seks-brønns plate som inneholder 2 ml cefem buffer per brønn.
- Forbered oksygen ryddet vekk tiol-baserte bilde buffere ved hjelp av følgende stamløsninger: 1 M glukose, 1 M cysteamin, og 100x glukose oksidase / katalaseenzymet mixture (4 mg av katalase og 10 mg glukose oksydase i 100 ul cefem-buffer, blandet godt ved omrøring) 28. Rett før avbildning, bland 75 ul av 1 M glukoseløsning, 30 pl av 1 M cysteamin oppløsning, og 3 ul 100x lager enzymblanding. Juster volumet til 300 mL med cefem buffer og bruke umiddelbart etter blanding for å montere prøven.
- For iPALM, forberede bilde prøven ved hjelp av en pre-renset # 1,5 dekkglass (22 mm diameter).
- Alternativt kan du bruke en glassplate (3 "x 1") med en tosidige selvklebende spacer for å hjelpe til forsamlingen om astigmatisme-baserte 3D-STORM 12 er å bli brukt i stedet.
- For å montere bilde prøven, bruker fine tang til å forsiktig fjerne prøven coverglass fra buffer godt. Deretter raskt og banke forsiktig bort overflødig buffer ved å berøre kanten av dekkglass med brettet absorberende papir.
- Plasser dekkglass cellen siden opp på et stykke ren linsepapir. Skyll prøvenved å plassere 30 - 50 mL av bildebuffer på prøven, og fjerne overflødig buffer ved å vippe og tappe med brettet absorberende papir.
- Gjenta rensetrinnet et par ganger, og deretter plassere 30 - 50 mL av bildebuffer på prøven. Blot tørke kanten av dekkglass og plassere flere svært små prikker av rask herding epoxy på den tørkede området.
- Sakte senke en annen pre-renset # 1,5 dekkglass (vanlig, runde dekkglass, 18 mm diameter) på midten av cellen inneholdende 22 mm dekkglass. La bildebufferen våt begge dekkglass ved kapillær virkning. De små prikker av rask herding epoxy bør holde seg til begge dekkglass.
- Trykk forsiktig på den sammensatte utvalget ved hjelp av brettet tørkepapir for å fordele trykket jevnt. Bruk tilstrekkelig trykk til å lage prøvecellen-tynt og jevnt (<15 um), men ikke så mye som å knuse cellene. Gauge riktig tykkelse ved å observere Newtons ringer mønster. Sørg også for å utføre denne step forsiktig for å minimere luftbobler. Hvis det er nødvendig, øve med tomme dekkglass flere ganger på forhånd.
- Tett prøven med smeltet vaselin-lanolin-parafin (VALAP, lager fremstilt fra 100 g hver av vaselin, lanolin, og parafin, smeltet sammen) 29, skyll den forseglede prøven med DDH 2 O, og blås tørr med trykkluft. Prøven er nå klar for montering på mikroskopet for avbildning.
2. Prøve Plassering og iPALM Alignment
- Bevege den fjærbelastede topp objektivlinsen oppover for å tillate fjerning av prøveholderen. Plasser de forseglede prøven utarbeidet i trinn 1.10 på prøveholderen og fest med flere små rare-earth magneter. Gjelder nedsenking olje på begge sider av bilde prøven. Plasser prøven holderen tilbake i den optiske banen og senk toppen objektiv.
- Slå på eksitasjon lasere. Slå på Electron multiplisere CCD (EMCCD) kamera i ramme-overføringsmodus.
- Rotere i riktig emisjonsfiltre. Aktivere en mekanisk lukker for å blokkere den øvre strålebanen (figur 1A), og åpne den nedre strålebanen. Ta bunnen objektiv i fokus ved omregning i små trinn ved hjelp av piezo aktuator.
- Når avlesnings er i fokus, åpne toppstrålebanen mens den blokkerer den nedre strålebanen og bringe den øverste objektivlinsen i fokus på en lignende måte. Overvåk bredden av avlesnings på datamaskinens skjerm for optimalt fokus.
- For riktig sentrering, åpent både topp- og bunntrålen baner. manuelt justere toppen objektivlinsen, mens den nederste målet blir holdt konstant ved hjelp av et par av mikrofine settskruer, inntil avlesnings bildene overlappes så tett som mulig, ideelt i en piksel.
- Deretter utføre finjusteringer slik at fiducial bildene i trinn 2.3 overlapping innenfor en tidel av en EMCCD piksel. Juster toppen2-akse piezo montert speil via kontroll programvare mens du holder både objektiv og bunnen refleksjon speil konstant. Sammenligne sentrene av fiducials av toppen og bunnen objektive synspunkter via dataskjermen for å lede prosessen.
3. Kalibrering av iPALM Setup
MERK: Siden fluorescensemisjonsmaksimum er usammenhengende, for interferens å bli observert i iPALM, lengder banen gjennom toppen og bunnen målsettingene må være nær hverandre, i løpet av noen få mikrometer. Dette kan oppnås som følger:
- Med lasere på, kameraene kontinuerlig streaming, og både de øvre og nedre bjelke baner åpen, oscillerer prøveholderen z-piezo ved hjelp av en sinusformet spenningsbølgeform som genereres av styreprogramvare for en kontinuerlig z-aksen oscillasjon i løpet av en størrelsesorden på 400 nm .
- Å ta fordel av det faktum at, når ute av optimal innretting, varierer i avlesnings intensitet lite med than oscillasjon, manuelt oversette den motordrevne strålesplittsammenstillingen opp eller ned inntil intensiteten av avlesnings svinger på grunn av den ønskede single-photon interferenseffekt. Dette betyr tett tilpasning av de optiske veilengder. En topp-til-dal-forhold på> 10 kan oppnås i optimale tilfeller (figur 1D).
- For å sikre at både amplitude og fase på hver overflate er så jevn som mulig på tvers av feltet, juster bunnen speil av strålesplitt montering i små skritt for å finjustere gap og vinkler. Utfør stråledeler fine justering ved å oversette prøven i 8 nm z-trinn over 800 nm.
- Overvåk fiducial intensiteten blant kameraer # 1 - 3. Juster høyde, posisjon, og tilt av bunnen speil i stråleenheten i små skritt, slik at pendling fasen av kamera # 1 i forhold til kamera # 2 er maksimert, ideell ved 120 ° (figur 1 B-D).
- Når førstejusteringen er fullført, oversette prøven til å søke etter en passende synsfelt som inneholder både celler til bilde og flere fiducials nærheten. Plasser en innhegning rundt i systemet for å blokkere strølys og omgivelses forstyrrelser. Når bildeområdet er funnet, gjennomføre prosedyren i trinn 3.4 igjen, og ta opp kalibreringskurven for bruk i senere z-koordinat extractions ved hjelp av kommandoen "Hent Kalibrerings Skanner vs Sample Piezo Position" i hovedgrensesnittet.
4. Data Acquisition
- Når et ønsket område er funnet og kalibreringskurven er oppnådd, angir de aktuelle filnavnene i programvaren. Åpne både topp- og bunntrålen baner. Øk eksitasjon kraften i 642-nm laser til maksimum. For Alexa Fluor 647, kan en innledende periode på fluorophore utkobling være nødvendig (Figur 2A).
- Eksponere med et konstant 642 nm eksitasjon i 5 min, eller lenger om nødvendig, inntil single molekyl blinker er observert (figur 2B). Programvaren tillater en automatisk økning på 405-nm bilder aktivisering i løpet av oppkjøpet. Et stort antall oppkjøp rammer er vanligvis nødvendig for trådformede funksjoner for å være godt synlig (> 50.000 rammer). Når du er klar, starter oppkjøpet av rå bildesett ved hjelp av kommandoen "Start iPALM Acquisition" i hovedgrensesnittet.
- Under innhentingen, justere fotoaktivering nivå ved å justere intensiteten av den 405-nm laser for å opprettholde riktig blinkende tetthet etter behov (se eksempler i figur 2B).
MERK: Når kjøpet er fullført, vil programvaren automatisk konvertere bildefiler til riktig binært format. Den dataregister i beregningen serveren er montert som et nettverk kjøre, slik at data kan kopieres direkte der for videre behandling.
5. Behandling av dataog analyse
- Utfør lokalisering analyse ved hjelp av en spesialutviklet programvare for å trekke best tilpasning parametere for alle enkle molekyler så vel som for de fiducials 11,15,23. Dette gir ikke bare den x, y-koordinat, men også intensiteten som brukes for kalibreringskurve analyse.
- Importer rå kalibreringsdataene ervervet i trinn 3,5 ved hjelp av kommandoen "Extract Peaks flere etiketter" under "Fil" menyen for å utføre enkelt-molekyl lokalisering. Etter den første lokalisering analyse, koordinater hentet fra kameraene # 1-3 er til stede i røde, grønne og blå kanaler, henholdsvis, og kan lagres for videre analyse ved hjelp av kommandoen "lagre Behandlet som IDL (.sav)" under " fil "-menyen.
- Å bringe data fra kameraer # 1-3 til registrering ved hjelp av fluorescerende fiducials innebygd på glassene, velge flere lyse fiducials å gi dekning av sentrale bildet (f.eksFigur 1B) ved hjelp av kommandoen "Anchor fiducial Points" under "Bilde Transformations" -menyen. Bruk trippel sett av lokaliseringskoordinater fra kameraene # 1 - 3 oppnås fra de lyse fiducials i trinn 5.1 for å beregne rotasjon og skalering matrise som vil bringe kameraer # 1 og # 3 inn i register med kamera # 2. Med et tilstrekkelig stort antall fiducials, kan høyere-ordens polynom fordreining bli utført for bedre passer.
- Når transformasjonsmatrise er beregnet, omforme rådataene kameraer # 1 - 3 sammen for å oppnå de summerte rådata. Utføre en ny runde av lokalisering analyse for å gi en mer presis x, y-koordinat og for å bestemme den relative bidrag av hvert kamera kanal til den summerte rådata; bruke kommandoen "Transform Raw, lagre og lagre Sum (DAT)" under "Bilde Transformations" -menyen. Dette intensitetsforholdet inneholder den z-koordinat informasjon.
- Velg en lys fiducial og utføre z-kalibrering montering ved hjelp av funksjonen "Test Wind Point 3D" i pop-up dialog ved å klikke på "Z-koordinat Operations" under "Spesialfunksjoner" -menyen. Dette vil passe 3-sinusfunksjoner til intensitetene av de 3 kamerakanaler for å bestemme kalibreringskurven. Kalibrerings fil blir lagret for videre bruk på de viktigste datasettene.
- For å teste kvaliteten av kalibreringskurven, utfører z-koordinat ekstrahering, som tidligere beskrevet 23. For veloppdragne fiducials i en godt kalibrert system, bør z-koordinat skalere lineært, siden kalibreringsdatasettene er tatt med en lineær sveip i z-posisjon. Videre bør z-posisjonene til alle fiducials skaleres med en tilsvarende skråning.
- Når en tilfredsstillende kalibrering er oppnådd, utføre lokalisering og transformasjon analyse for rå bilde datasett ervervet i trinn 4 etter samme prosedyre beskrevet i trinn 5,1-5,3. Når du er ferdig, legger kalibreringsfilen fra trinn 5.4 og utføre z-koordinat ekstraksjon ved hjelp av funksjonene "Pick WND Fil" og "Extract Z Koordinere" i pop-up dialog ved å klikke på "Z-koordinat Operations" under "Spesialfunksjoner" -menyen.
MERK: Siden oppkjøpet tid er> 15 min, er mekanisk drift forventes. - For å utføre drift korreksjon i x, y, velg en lys fiducial fra lokalisering koordinater. Dette fiducial bør være til stede i alle rammer. Bruk deretter x, y-koordinat drift av fiducial å justere alle andre koordinater innenfor samme ramme tilbake i registrering (figur 3A-B) ved hjelp av funksjonen "Test / Skriv Guide Star" under "Bilde Transformations" -menyen. Z-koordinat kan registreres på samme måte ved å gå til "Test Guide Star" og "Skriv guide stjerne" på den pop-up dialog ved å klikke på "Z-koordinat Operations" under "Spesialfunksjoner" -menyen.
- Som prøven kan utvise liten vipp, utføre tilt korreksjon ved å gi de x, y, z-koordinatene til 3 referansepunkter som definerer flyet som bør settes nivå ved hjelp av funksjonen "Fjern XYZ Tilt" i pop-up dialog ved å klikke på " Z-koordinat Operations "under" Spesialfunksjoner "-menyen.
- Etter de drift og tilt rettelser, lagre lokaliserings koordinater. Rekonstruere en super oppløsning for videre analyse (figur 4A-D) ved å bruke "Render" kommandoen på hovedgrensesnittet. Farge kan brukes til å indikere den z-koordinaten. Alternativt kan en side-visning av det valgte området også bli gjengitt. Lokaliseringen koordinater kan eksporteres som tekstfiler for ytterligere kvantifisering, eller den rekonstruerte bildet kan lagres som en TIF-fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kritiske krav til iPALM er justering, registrering og kalibrering av optiske systemer. Dette er nødvendig for å sikre riktig inngrep i tre-veis strålesplitter nødvendig for z-koordinaten ekstraksjon. For å aktivere kontinuerlig overvåking, konstant punktkilder for fluorescens er nødvendig. Dette kan oppnås ved hjelp av fluorescerende Au eller bi-metallholdige nanopartikler 23 som har photoluminescence oppstår fra lokal overflate-plasmonresonans (LSPR). De fungerer som en stabil enkelt dipol ved belysning og kan typisk være lokalisert med 5-10 nm nøyaktighet. Disse kommersielt tilgjengelige nanopartikler avgir en lysstyrke innenfor området de fleste single-molekyl fluoroforer, slik at både fluorophores og fiducials kan avbildes med lignende eksitasjon intensitet og forsterkning på EMCCD kameraer, uten metning (figur 1B). Videre disse fiducials også sterkt facilitate fokus, der den tilsynelatende bredden på fiducials kan overvåkes i løpet av fokusjustering. Også strenge rengjøring av dekkglass overflate, for eksempel ved Piranha etsing eller plasma rengjøring, er også nødvendig, ettersom falsk bakgrunn fluorescens av ikke rengjort eller dårlig renset dekkglass lett kan overvelde enkelt-molekyl signaler, som beskrevet tidligere.
iPALM er avhengig av flerfase interferometri for å muliggjøre høy presisjon z-koordinaten måling samtidig med PALM (for x, y). I iPALM instrument, kan hver emittert fluorescens foton anses for å forplante seg gjennom begge de optiske baner, som deretter selv-blande seg inn i et tilpasset fremstille 3-veis stråledeler. Den z-koordinaten blir således kodet i fase av forstyrrede foton. De innbyrdes faseforskjeller på ~ 120 ° av utgangsstråler fra den tre-veis stråledeler resultat i intensiteten variant av enkelt-molekyl-bilder mellom 3 camersom, slik z - koordinaten ekstraksjon fra en kalibreringskurve. Basert på dette, er det iPALM Prøveholdersammenstillingen en vesentlig komponent, ettersom det er utstyrt med et par av piezoelektriske aktuatorer som gjør det mulig nm presisjon oversettelse i z som kan brukes til justering og kalibrering.
Ved riktig fokus og innretting, vil oversettelsen av prøven langs z-aksen generere en forstyrrelse effekt. Dette er manifestert som svingningen av avlesnings intensitet mellom de tre kamerakanaler (figur 1C-D). Disse svingninger indikerer også at både den øvre og nedre optiske strålebaner er nesten avstemt at ett-foton forstyrrelser. Vanligvis, ved å slå på instrumentet, de innledende fasene av hvert kamera vil ikke være optimal og skanning av z-posisjon er nødvendig som et diagnostisk verktøy for kalibrering og justering. For å komme frem til de optimale faser, den nedre speil i strålesplitteren(Figur 1A) kan justeres ved hjelp av den piezoelektriske tip-tilt scenen. Kalibreringen skanning av z-stillingen er tatt etter hver liten 10 - justering av 20 nm. Intensiteten av avlesnings i hver kanal blir så bestemt ved lokalisering analyse (dvs., passer med en 2D-gaussisk funksjon). Intensiteten normalisert ved total intensitet kan approksimeres ved en sinusformet bølgeform, slik at fase betegnelsen skal beregnes; således kan fase som svarer til hvert kamera bli bestemt, som vist i figur 1C. Vi merker oss at den enkelt-foton innblanding prinsipp anvendes i iPALM kan også bli demonstrert ved anvendelse av en mye enklere to-veis stråledeler. Imidlertid er en to-veis strålesplitter upraktisk for 3D superoppløsningsmikroskopi siden på eller nær grensen for destruktiv interferens, signalet i en kanal er minimal, noe som resulterer i støyende estimater av intensitet og lokaliseringskoordinater, som effektivt hindrer at z-koordinaten besluttsomhet til range der begge kameraene har høy intensitet (<100 nm). Det minste antall kanaler som er nødvendig for å overvinne denne virkning er tre, og 3- og 4-veis projeksjonssystemer er blitt beskrevet i litteraturen 11,30.
Under optimale forhold for en tre-veis strålesplitteren, bør faseforskjeller mellom 3 kameraer være omtrent 120 °. Den tre-veis strålesplitter for iPALM inneholder 3 reflekterende grenseflater, som vist skjematisk i Figur 1A. Stråledeleren er plassert over en flat dielektrisk speil, med en tynn gap er fylt med refraktiv indeks-tilpasningsolje, for å tillate fininnstilling av veilengder i strålesplitteren, og for å oppnå optimale faseforskjeller. Som vist i figur 1C-D, ved riktig justering for iPALM, kameraene er nær en 120 ° innbyrdes faseforskjell. I praksis er en faseforskjell som er større enn 105 ° er generelt akseptabelt. En slik kalibrering både indicates at systemet er godt justert, og at det vil bli brukt for senere z-koordinat utvinning. Det er også nyttig for å evaluere kalibreringskurve dannet ved anvendelse av forskjellige fiducials. De fleste fiducials med moderat lysstyrke generelt avgir som en enkelt dipol, noe som gir veloppdragne kalibreringskurver. Imidlertid kan det enkelte ganger aggregater av fiducials (ofte de med ekstrem lysstyrke) oppfører seg på en unormal måte, noe som gir upålitelige kalibreringskurver. Det er også lurt å velge fiducials nær sentrum av bildefeltet og i nærheten av området av biologisk interesse (figur 1B), spesielt siden den høye NA mål objektivet som brukes i iPALM oppsettet er ikke flat-feltet korrigert. Den effektive felt-of-view er begrenset til det sentrale området, fremgår av større fiducial bredder mot kanten av feltet.
Etter den første justering, den felt-of-view som inneholder celler med ønskelig morphology og flere fiducials å sikre god kalibrering er valgt for bildebehandling. Dette kan oppnås ved langsomt å oversette prøveholderen ved bruk av to-akseservomotor stasjoner. Oversettelse av prøven vil resultere i noen defokusering, siden utvalget er ikke alltid helt flat. Derfor må fokuset være kontinuerlig justeres under oversettelse. Når bildefeltet er valgt, til en ny runde med kalibrering optimalisere kalibreringskurven blir så utført for å finjustere systemet innretting og for å få selve kalibreringskurve. Viktigere, bør områder under kjernen eller i nærheten av områder med heterogene brytningsindeks (f.eks luftbobler) unngås generelt, siden disse vil føre til vesentlig endring av den relative banen lengder, forvrenge z-koordinat.
Med merking høy tetthet, kan fluorescens signaler fra organiske fluoroforer som Alexa Fluor 647 være svært lyse. Som vist in figur 2A, med riktig buffer preparat inneholdende en høy konsentrasjon av tiol (-SH) grupper 31, fluoroforen bør være hurtig slås av under høyt eksitasjon belysning. Dette resulterer i undertrykkelse av fluorescens-signaler fra de fleste av molekylene. På et gitt tilfelle, en svært liten minoritet av fluorophores stokastisk tilbake til "på". Disse forventes å bli tynt fordelt og dermed kan visualiseres som enkle molekyler til en eller noen få rammer før den slås "av". De photoswitching dynamikk er sterkt avhengig av magnetisering intensitet og konsentrasjonen av -SH, og således, for et gitt system, forsiktighet må utvises for å optimalisere den riktige merking tetthet, spesielt siden en forholdsvis høy magnetisering intensitet (640-647 nm) for å slå av et flertall av Alexa Fluor 647 molekyler. Ved magnetisering ikke er tilstrekkelig sterk, en betydelig andel av Alex Fluor 647 vilforbli i "på", noe som resulterer i høy bakgrunn, vanskeligheter med å observere enkelt molekyl fluorescens, og, til slutt, dårlig kvalitet single-molekyl lokalisering resultater. Under en riktig balansert tilstand, bør enkelt-molekyl rådata inneholde et tilstrekkelig stort antall molekyler (hundrevis) per bilde (figur 2B), mens hvert molekyl er tynt nok til å tillate entydig deteksjon og lokalisering analyse. Det er også verdt å merke seg at for iPALM, prinsippene for photoswitching er identiske med de av PALM eller STORM, og dermed kan prøvene skikkelig forberedt for iPALM brukes direkte på de enklere 3D-PALM eller 3D-storm systemer. For å få en høy nok tetthet av molekyler for å tilfredsstille Nyquist sampling, vanligvis 50.000 eller flere rammer av rådata er nødvendig (dvs. 150.000 totale rammer for de 3 kameraer). Som oppkjøpet utvikler seg, kan en økende andel av fluorophores bli oppbrukt av destruktiv fotobleking, noe som resulterer i sparser enkelt molekyl tetthet. For å kompensere for dette, kan korte pulser av 405 nm blått lys (405 nm) belyses på prøven ved intervaller for å fremme fluoroforen aktivering.
På grunn av den lange oppkjøpet tiden som kreves, optimale resultater for iPALM (eller enkelt-molekyl lokalisering mikroskopi generelt) krever lite prøve drift og / eller god korreksjon av drifting. For eksempel bruke eksponeringstid på 50 ms i ramme overføringsmodus (20 Hz bildefrekvens), total anskaffelses tid for 50.000 rammer er 42 min. I denne perioden er mekanisk drift i løpet av titalls nm forventet. Faktisk, i tillegg til den høye lokalisering presisjon og høy tetthet merking, oppløsningen avhenger også av drift korreksjon kvalitet. Det er flere opprinnelsen til disse fonner med termisk svingning å være en vesentlig årsak. På grunn av dette hensynet, der det er mulig, er iPALM deler custom-maskinert ved hjelp Invar, lav termisk ekspansjon legering, eller rustfritt stål,som begge har mye lavere termiske ekspansjonsegenskaper enn messing eller aluminium. Dessverre medfører dette også ekstra kostnader i forhold til aluminium, som er en mer vanlig brukt metall for-mekaniske komponenter, som er meget billigere og lettere å maskinere. Andre kilder for avdrift kan være mekaniske vibrasjoner fra periferutstyr, omgivende miljø, eller luftstrømmer. Disse bør minimaliseres ved å plassere systemet i en passende kabinett og ved å omdirigere luftstrømmen retning i mikroskop området. Oppsettet bør bygges på en forsknings klasse optisk bord og, hvis mulig, vifteholdige komponenter skal plasseres utenfor den optiske bordet. Likevel, til tross for alle forholdsregler, vil noen mengde drift forbli. Kritisk, må disse driver minimeres slik at bildet er i fokus gjennom oppkjøpet tid. I våre systemer, disse passive metoder for tilstrekkelig å redusere glidningen til akseptable nivåer. Imidlertid bør det være mulig å gjennomføre aktiv drift comerstatning metoder for å aktivere langsiktig og høy presisjon bildebehandling 32.
Etter behandlingen av de rå data, kan 3D-lokaliseringskoordinater oppnås med typisk 5-10 millioner enkelt-molekyl topper pr datasett. Som vist i figur 3, kan driften som en funksjon av tid bli visualisert fra lokaliserings koordinatene til fiducials. Flere fiducials kan brukes til å beregne den gjennomsnittlige driftkorreksjonsbanen (figur 3A-B). Dessuten er det vanlig å filtrere ut topper som passer dårlig til 2D-gaussiske funksjonen under lokalisering analyse. Dette kan være på grunn av uønskede lyder eller delvis overlappende enkelt-molekyl topper og kan skilles fra hverandre ved den store restkvadratfeilen beregnes under tilpasningsprosessen. Topper med lav lysstyrke (som indikert av fotontelling) og således høyere usikkerhet (dvs. større enn ~ 25 nm) blir også filtrert ut, ens disse sannsynligvis skriver seg fra ikke-spesifikk bakgrunn fluorescens. Tilsvarende er topper for hvilke intensiteter fra de 3 kamera kanalene passer dårlig til kalibreringskurven også forkastet, da z-koordinatene oppnås er upålitelig. Det bør bemerkes at den fulle informasjonsinnholdet i iPALM (og lokalisering mikros generelt) er massiv, ettersom analyseresultatene ikke bare i fluoroforen koordinater, men også i flere andre parametere som intensitet, bredde, lysstyrke etc. Imidlertid i praksis, siden relativt få dataverktøy er for tiden tilgjengelig for analyse i koordinatsystemet plass, er lokaliseringskoordinater vanligvis gjengitt eller ombygd til pikselbaserte bilder for videre analyse.
Den brukte tilnærming for iPALM bilde rekonstruksjon er å representere hver lokalisering koordinere med en normalisert 2D Gaussisk funksjon, med lokalisering usikkerhet angitt som Gaussian bredde 33. Dermed blir høy presisjon koordinater (typisk single-molekyl topper med høy lysstyrke mot lave bakgrunn) vises som skarpe og trange topper, mens lav presisjon koordinater (typisk lav lysstyrke eller høy bakgrunn single-molekyl topper) vises som dimmer og bredere topper. På denne måte bidrar hvert molekyl samme mengde av intensiteten av bildet. For en 3D datasett, kan z-koordinat representeres ved hjelp av farger, typisk basert på en nyanse skala (figur 4C-D). Alternativt kan bildene bli vist som en side-visning (x, z eller y, z) projeksjon eller som volumer. En rekke offentlig tilgjengelig programvare kan brukes til å visualisere slike data 34.
Som vist i figurene 4-6, iPALM bilder gi en betydelig forbedring i forhold til diffraksjons-begrenset fluorescens mikroskopi. F-aktin arkitektur i HUVEC celler kan visualiseres med mye forbedret romlig resooppløsning. I deler av hjernebarken, kan nettverk av adskilte filamenter sees, mens det i spennings fibre, bunter, og lamellipodia, blir de tett pakkede f-aktin-nettverk observert å ha en trådformet struktur, selv om individuelle filamenter er ikke skjelnes. Dette er sannsynligvis på grunn av begrensninger i både lysstyrken på fluorophores og lokalisering presisjon. Tilstedeværelsen av distinkte kortikale filamenter tyder på at ultra av den f-aktin nettverk er tilstrekkelig godt bevart; dermed iPALM kan være et nyttig verktøy for å karakterisere cortical arkitektur. På figur 5, er en sub-region fra et HUVEC celle vises med profilene til et filament aktin kvantifisert. Det kan sees at den z-histogram av et filament er omtrent 15 nm i bredde, forholdsvis liten i forhold til ~ 45 nm for de tverrgående (x, y) syn, som viser at iPALM gir en betydelig forbedring av oppløsning i z-oppløsning i forhold til x, y-planet, som forventet. Men siden actual diameter på f-aktin er ~ 8 nm, er det uklart hvorvidt den observerte filament er et enkelt filament eller en bunt av noen få filamenter. Samsvar avbildning ved hjelp iPALM og EM kan være en nyttig strategi for videre karakterisering av f-aktin arkitektur, men denne tilnærmingen ikke har blitt brukt til å studere f-aktin ennå 23.
Figur 1: Skjematisk fremstilling av iPALM 3-D Super Resolution Mikros. A) Skjematisk av iPALM optikk. Den doble objektiv (Nikon, NA 1,49 60X) lar hver emittert fluorescens foton til å forplante seg gjennom både den øvre og nedre optiske stråleveier, og de blir omdirigert å gripe inn i stråledeler av et par speil orientert på 22,5 °. Fasen av den selv forstyrret foton er direkte proporsjonal med Az, og dermed koder for z-koordinaten for fluoroforen, og kan måles ossing en 3-veis stråledeler med innbyrdes faseforskjeller på ~ 120 ° mellom de tre utgangsstråler. De er fokusert av røret linser (L1-L3, f = 400 nm) og filtrert av utslipp filter (F1 - F3). Hver enkelt molekyl synes derfor med forskjellige intensiteter mellom kameraer (EMCCD1-3), men ved tilsvarende x, y-koordinatene. (A) er gjengitt og modifisert fra Ref. 11. (B) Diffraksjon begrenset bilde av HUVEC celler merket for f-aktin med Alexa Fluor 647. Lyspunkter betegne Au nanopartikkel fiducials. De fasevinkler for kameraene # 1 - 3 er representert av røde, grønne og blå linjer, henholdsvis sentrert på hver avlesnings, med faseforskjellen mellom kameraene # 1 - 3 er angitt. Skala:. 5 um (C) avlesnings bilder som viser interferenseffekter. Bilder av en Au nanopartikkel fiducial for hvert kamera (CCD1-3) eller total (sum), tatt som z-posisjon (i nm, på nederste rad) skannes for kalibreringen. Intensiteten i each kamera kan ses å oscillere med en faseforhold, som vist i (B). (D) iPALM kalibreringskurve. Prøven blir overført langs z-aksen. Styrken på en Au nanopartikkel fiducial for EMCCD1-3 er showet som røde, grønne og blå linjer, henholdsvis (øverst). Disse er da normalisert og passer for å bestemme faseforskjellene (nederst). Under justeringen, er systemet justeres for å oppnå de maksimale faseforskjeller mellom alle de tre kameraer. Kalibreringskurven er tatt på hvert bilde stedet for å bruke i utvinning av z-koordinat for hver enkelt molekyl. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Single Molecule Imaging av Photoswitching Alexa Fluor 647-phalloidin som Actin etiketter. (A) Initial photoswitching trinn. F-aktin i faste celler er merket med en høy tetthet av phalloidin konjugert til Alexa Fluor 647. Høy intensitet belysning i en tiol-holdig bilde buffer fører til hurtig utkobling av de fleste fluoroforer. (B) Representative rammer av rå single-molekyl rammer. Ved steady-state blinker, skal aktiveres Alexa Fluor 647 være tilstrekkelig sparsom at enkelte enkle molekyler fremstå som et PSF-sized spot. Bilder av de samme cellene som er vist i (A), vist med inverse kontrast. Skala barer i A og B: 5. Mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Drift Korreksjon hjelp Multip. le fiducials Lokalisering koordinater for fire fiducials (A, x-koordinat, B, y-koordinat) ble brukt til å beregne drift ved hjelp av polynomfunksjoner beslag (5 th orden, fit parametere på øverst til høyre). Den gjennomsnittlige drivbanen tillater korrigering av drift med sub-5 nm presisjon (x: 3,085 nm, y: 3,606 nm). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Visualisering av 3-D f-aktin Arkitektur etter iPALM. (A) Diffraction begrenset bilde av HUVEC-celler med f-aktin merket med Alexa 647 Fluor-phalloidin (tilsvarende delområder av cellen i figur 2). Lyspunktet er på grunn av Au nanopartikkel fiducials.
Figur 5: nanoskala dimensjon på f-aktin visualisert ved iPALM. (A) Rekonstruert iPALM bilde HUVEC celler med f-aktin merket b y Alexa Fluor 647-phalloidin. Fargen indikerer z-koordinat i henhold til fargen bar. Skala:. 1 um (B) tverrgående tverrsnitt histogram av x, y-koordinater-lokalisering langs den lange aksen av eske i området (A). For å få histogrammet, er koordinatene projisert på den lange aksen av boksen og binned med en 5-nm bin-størrelse. Den grå kurve indikerer en gaussisk beste tilpasning til histogrammet, med en full bredde ved halve maksimum (FWHM) på 43,88 nm. (C) Histogram av z-stillingen av lokaliseringskoordinater i den eske i området (A). Z-stillingene er binned med en hylle størrelse på 1 nm. Den grå kurven viser en Gaussian passer best til histogrammet, med en FWHM av 17,50 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
/files/ftp_upload/54774/54774fig6.jpg "/>
Figur 6:. Sammenligning av iPALM Imaging av f-aktin Bruke forskjellige merking Reagenser Rekonstruert iPALM bilder av f-aktin merket ved hjelp av Alexa Fluor 647-konjugert phalloidin (A), Alexa Fluor 568-konjugert phalloidin (B), eller ved transfeksjon med aktin -mEos2 fusjonsprotein ekspresjonsvektor (C). Skala barer (AC):. 1 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det optiske system av iPALM er basert på en 4-π to motstående objektiv utforming, som vist i figur 1A. Oppsettet er bygget ved hjelp både custom-maskinerte og kommersielle opto-mekanisk deler, som beskrevet tidligere 23 og oppført i tabell 1. I tillegg til vårt oppsett, Howard Hughes Medical Institute (HHMI) er vert for et system som er tilgjengelig for det vitenskapelige miljøet ved Advanced Imaging Center ved Janelia Forskning Campus. For den fulle mekaniske tegninger, kontroll skjemaer og programvare, er leserne oppfordres til å spørre med Harald Hess på HHMI for ytterligere informasjon. En primær fordel ved bruk iPALM så vel som andre enkelt-molekyl lokalisering mikroskopi metoder for visualisering av f-aktin er det relativt enkelt prøvepreparering i forhold til EM teknikker, som vanligvis krever harde type behandling, arbeidskrevende bearbeiding, og dyktige utøvere 3,23 . Additionally, er fluorescens naturlig mottagelig for flerkanals bildebehandling, som fortsatt er vanskelig for EM. Likevel, som beskrevet nærmere nedenfor, er det flere aktuelle begrensninger for tilnærming, både i forhold til prøven forberedelse og bildeprosessen. Først, slik tilfellet er for EM prøvepreparering, hensyn må tas for å sikre god ultrastructural konservering av prøvene 35, ettersom en protokoll tilstrekkelig for en diffraksjons-begrenset nivå av oppløsning kan forårsake alvorlige forstyrrelser på nanoskala nivå. For aktin avbildning, er riktig fiksering av cellene en viktig faktor som påvirker prøven kvalitet. Glutaraldehyd er en foretrukket fiksativ siden det bevarer cytoskjelettet og membran veldig godt, selv i tilfeller av co-farging med antistoff, kan epitop områder bli berørt. I slike tilfeller kan paraformaldehyd tilby et akseptabelt kompromiss, da det har en tendens til å bedre bevare antistoff epitop områder. Viktigere for enkelt-molekyl lokalisering mikroskopi, disse fiksativ tendenså generere bakgrunn autofluorescence; således, er post-fikser quenching av borhydrid nødvendig, spesielt i tilfellet med glutaraldehyd.
I tillegg er det riktig valg av fluoroforer og etikette strategier er blant de viktigste faktorene for vellykkede forsøk. På grunn av nanoskala dimensjon av f-aktin, er høye tettheter av etiketter nødvendig for å fange opp de underliggende trådformede nettverk, som fastsatt av Nyquist sampling teorem 36. For aktin, lar phalloidin meget høy tetthet merking, med et bredt spekter av organiske fluoroforer som er tilgjengelige fra mange produsenter. Imidlertid, siden phalloidin er giftig, er cellefiksering og permeabiliseringen nødvendig. Alternative strategier for live-cell kompatibel aktin merking inkluderer bruk fusjon av fluorescerende proteiner (FP), enten med monomere aktin eller med små aktin-bindende polypeptider. Men vi fant ut at disse har en tendens til å gi en lavere merking tetthet i forhold til phalloidin (
39. Dette gjelder også for fordeler og begrensninger iPALM. Sammenlignet med andre tre-dimensjonale super oppløsning mikroskopi teknikker, har iPALM forble den høyeste oppløsnings optisk tilnærming til dags dato, særlig langs z-aksen, med z-oppløsning nesten 2 ganger bedre enn den x, y-oppløsning 11. Imidlertid avhengigheten av iPALM på interferometri for en høy z-oppløsning medfører også en begrensning på bildedybden, ettersom kalibreringskurven er periodisk. Med andre ord, z-koordinater gjenta hver 250 nm eller så (for ~ 700 nm emisjonsbølgelengder av Alexa Fluor 647). I praksis kan dette løses ved hjelp av TIRF belysning, noe som begrenser eksitasjon sonen til innenfor det flyktige feltet dybden av <200 nm fra dekkglass. Dermed fluoroforer dypere inn prøven ikke er begeistret og forbli usynlig. Imidlertid begrenser dette også de biologiske strukturer som kan avbildes med de i umiddelbar nærhet til dekkglass, slik som fokal adhesjon, kortikal cytoskjelettet og ventral plasmamembranen, mens flere innvendige strukturer er utenfor rekkevidde. For faste prøven, er ett middel til å utføre cryosectioning 40. Imidlertid er en slik tilnærming svært arbeidskrevende og krever spesialisert kompetanse som ikke er allment tilgjengelig.
Alternativt kan iPALM være tilrettelagt for en utvidet z-serien ved å kombinere interferometri med astigmatic-defokusering ordningen 12 brukes i 3D-STORM. Denne tilnærmingen gir doble z-koordinat avlesninger, den første av interferometri, som er høy presisjon, men periodisk, og den andre av astigmatic defokusering, som er mindre presis, men ikke-periodisk. Den sistnevnte kan deretter brukes til å "pakke" eller bryte degenerasjonen avinterferens z-koordinater, og dermed gjør det tredobling av iPALM avbildningsdybden til ~ 750 nm, effektivt nærmer iboende brennvidde dybde av høye NA objektiv. Med fase opppakkingen har iPALM blitt brukt til bildestrukturer dypt i prøvene, slik som mitokondrier, om enn med noe redusert presisjon i alle 3 dimensjoner på grunn av den ekstra defokusering 40.
En annen iboende begrensning av iPALM er bildehastigheten. Siden et stort antall rammer er nødvendig for å oppnå en høy tetthet av lokaliserings koordinater, er kameraet hastigheten vanligvis grensen på oppkjøp rate. Med dagens EMCCD kameraer kjører på 10 - 20 MHz avlesning priser, er titalls minutter som kreves for et tilstrekkelig antall rammer. Slike lange tidsskalaer krever at prøven være løst. Her nylige fremskritt i kamerateknologi, som for eksempel mye raskere vitenskapelig Complementary Metal Oxide Semiconductor (sCMOS) kamera, kan muliggjøre en rask økning i imaldring hastighet 41, selv om dette ikke er iverksatt for iPALM ennå. For noen single-molekyl lokalisering mikros nærmer seg, kan en tett enkelt-molekyl feltet bli analysert ved hjelp av en modifisert algoritme 42 eller komprimert sensing 43. Tilpasningen av slike strategier kan også fremskynde iPALM ved å tillate tettere enkelt-molekyl bilder, og dermed færre rammer.
Med begrensninger i hastighet og bildeområdet og styrker i romlig oppløsning, en større applikasjon for iPALM er som en ultra metode som utnytter fordelene av fluorescerende merking for å avsløre nanoskala organisering av spesifikke proteiner 14,15,44. Ytterligere forbedring, både når det gjelder optikk og fluoroforen teknologier, bør sette ytterligere forbedring i iPALM romlig oppløsning. For eksempel iPALM bildebehandling sysselsetter i dag en relativt enkel første ordens tilnærming tilnærming, med hvert enkelt molekyl modellert av en 2D-Gaussian funksjon og somsumed å være en isotopically gjennomsnitt dipol. Dette kan bli utvidet med nyere metoder, som benytter en mer nøyaktig modell av punkt-spredning funksjon og dipol orientering, eller eksplisitt behandling av optiske aberrasjoner over hele synsfeltet for å forbedre romlig oppløsning. Likeledes har photocaging blitt rapportert, noe som forbedrer fluorophore lysstyrken ved størrelsesordener 45. Faktisk, siden sentrale elementer i deres ultra organisasjonen er godt karakterisert, kunne f-aktin cytoskjelettet være en svært verdifull modellsystem for å teste videre metodeutvikling i iPALM. Evnen til å analysere protein organisasjon ved lysmikroskopi med ekte EM-nivå oppløsningsevne er ventet å kraftig forbedre vår forståelse av utallige aspekter av cellestruktur og funksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
YW og PK ønsker å takke for finansiell støtte fra Singapore National Research Foundation, tildelt PK (NRF-NRFF-2011-04 og NRF2012NRF-CRP001-084). Vi takker også MBI åpne lab og mikroskjernefasiliteter for infrastruktur støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| optical table | Newport, CA | RS4000 | iPALM, installed on 4 Newport Stabilizer vibration isolators |
| vibration isolator for optical table | Newport, CA | S-2000 | |
| laser-642 | Newport, CA | 1185055 | output power=100 mw |
| laser-561 | Newport, CA | 1168931 | output power=200 mw |
| laser-488 | Newport, CA | 1137970 | output power=200 mw |
| laser-405 | Newport, CA | 1142279 | output power=100 mw |
| broadband dielectric mirrors | Thorlabs, NJ | BB1-E02 | laser combiner |
| dichroic beamsplitter | Semrock, NY | LM01-427-25 | |
| acousto-optic tunable filter | AA Opto-Electronic, France | AOTFnC-VIS-TN | |
| Linear polarizer | Newport, CA | 05LP-VIS-B | |
| baseplate | local workshop | customized | |
| turning mirror (22.5°) | Reynard Corpporation, CA | customized | 22.5° mirror |
| motorized optic mounts | New Focus, CA | 8816 | |
| motorized XYZ translation stage | Thorlabs, NJ | MT3/M-Z6 | sample holder |
| T-Cube DC servo motor controller | Thorlabs, NJ | TDC001 | |
| Piezo Phase Shifter | Physik Instrumente, Germany | S-303.CD | |
| objective lens | Nikon, Japan | MRD01691 | objective. Apo TIRF 60X/1.49 oil |
| translation stage | New Focus, CA | 9062-COM-M | |
| Pico Motor Actuator | New Focus, CA | 8301 | |
| rotary Solenoid/Shutter | DACO Instruments, CT | 5423-458 | |
| 3-way beam splitter | Rocky Mountain Instruments, CO | customized | beamsplitter |
| Piezo Z/Tip/Tilt scanner | Physik Instrumente, Germany | S-316.10 | |
| motorized five-axis tilt aligner | New Focus, CA | 8081 | |
| Picmotor ethernet controller | New Focus, CA | 8752 | |
| Piezo controllers/amplifier/digital operation module | Physik Instrumente, Germany | E-509/E-503/E-517 | |
| band-pass filter | Semrock, NY | FF01-523/20 | filters |
| band-pass filter | Semrock, NY | FF01-588/21 | |
| band-pass filter | Semrock, NY | FF01-607/30 | |
| band-pass filter | Semrock, NY | FF01-676/37 | |
| notch filter | Semrock, NY | NF01-405/488/561/635 | |
| motorized filter wheel with controllter | Thorlabs, NJ | FW103H | |
| EMCCD | Andor, UK | DU-897U-CSO-#BV | 3 sets |
| Desktop computers for controlling cameras and synchronization | Dell | Precision T3500 | PC, 4 sets |
| coverslips with fiducial | Hestzig, VA | 600-100AuF | sample preparation. fiducial marks with various density and spectra available |
| fibronectin | Millipore, MT | FC010 | |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences, PA | 15710 | fixation. 16% |
| glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences, PA | 16220 | 25% |
| triton X-100 | Sigma aldrich, MO | T8787 | |
| HUVEC cells | Life Technologies, CA | C-015-10C | |
| Medium 200 | Life Technologies, CA | M-200-500 | |
| Large Vessel Endothelial Factors | Life Technologies, CA | A14608-01 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | 14190367 | ||
| Pennicillin/Streptomycin | 15140122 | ||
| Trypsin/EDTA | Life Technologies, CA | 25200056 | |
| PIPES | Sigma aldrich, MO | P1851 | PHEM |
| HEPES | 1st base, Malaysia | BIO-1825 | |
| EGTA | Sigma aldrich, MO | E3889 | |
| MgCl2 | Millipore, MT | 5985 | |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Invitrogen, CA | A22287 | staining |
| sodium borohydride (NaBH4) | Sigma aldrich, MO | 480886 | quenching |
| glucose | 1st base, Malaysia | BIO-1101 | imaging buffer |
| glucose oxidase | Sigma aldrich, MO | G2133 | |
| catalase | Sigma aldrich, MO | C9322 | |
| cysteamine | Sigma aldrich, MO | 30070 | |
| Epoxy | Thorlabs, NJ | G14250 | |
| vaseline | Sigma aldrich, MO | 16415 | sample sealing |
| lanolin | Sigma aldrich, MO | L7387 | |
| parafin wax | Sigma aldrich, MO | 327204 | |
| Immersion oil | Electron Microscopy Sciences, PA | 16915-04 | imaging. Cargille Type HF |
References
- Kanchanawong, P., Waterman, C. M. Localization-based super-resolution imaging of cellular structures. Methods Mol Biol. 1046, 59-84 (2013).
- Bertocchi, C., Goh, W. I., Zhang, Z., Kanchanawong, P. Nanoscale imaging by super resolution fluorescence microscopy and its emerging applications in biomedical research. Crit Rev Biomed Eng. 41, 281-308 (2013).
- Kanchanawong, P., Waterman, C. M. Advances in light-based imaging of three-dimensional cellular ultrastructure. Curr Opin Cell Biol. 24, 125-133 (2012).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys J. 91, 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3, 793-795 (2006).
- Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angew Chem Int Edit. 47, 6172-6176 (2008).
- Sharonov, A., Hochstrasser, R. M. Wide-field subdiffraction imaging by accumulated binding of diffusing probes. P Natl Acad Sci USA. 103, 18911-18916 (2006).
- Fölling, J., Bossi, M., Bock, H., Medda, R., Wurm, C. A., Hein, B., Jakobs, S., Eggeling, C., Hell, S. W. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat Methods. 5, 943-945 (2008).
- Biteen, J., et al. Single-moldecule active-control microscopy (SMACM) with photo-reactivable EYFP for imaging biophysical processes in live cells. Nat Methods. 5, 947-949 (2008).
- Shtengel, G., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. P Natl Acad Sci USA. 106, 3125-3130 (2009).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
- Dani, A., Huang, B., Bergan, J., Dulac, C., Zhuang, X. Super resolution imaging of chemical synapses in the brain. Neuron. 68, 843-856 (2010).
- Liu, J., et al. Talin determines the nanoscale architecture of focal adhesions. P Natl Acad Sci USA. 112 (35), E4864-E4873 (2015).
- Kanchanawong, P., et al. Nanoscale architecture of integrin-based cell adhesions. Nature. 468, 580-584 (2010).
- Wu, Y., Kanchanawong, P., Zaidel-Bar, R. Actin-delimited adhesion-independent clustering of e-cadherin forms the nanoscale building blocks of adherens junctions. Dev Cell. 32 (2), 139-154 (2015).
- Szymborska, A., et al. Nuclear Pore Scaffold Structure Analyzed by Super-Resolution Microscopy and Particle Averaging. Science. 341, 655-658 (2013).
- Lawo, S., Hasegan, M., Gupta, G. D., Pelletier, L. Subdiffraction imaging of centrosomes reveals higher-order organizational features of pericentriolar material. Nat Cell Biol. 14, 1148-1158 (2012).
- Mennella, V., Agard, D. A., Huang, B., Pelletier, L. Amorphous no more: subdiffraction view of the pericentriolar material architecture. Trends Cell Biol. 24, 188-197 (2014).
- Mennella, V., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence microscopy reveals a domain of the centrosome critical for pericentriolar material organization. Nat Cell Biology. 14, 1159-1168 (2012).
- Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463, 485-492 (2010).
- Salbreux, G., Charras, G., Paluch, E. Actin cortex mechanics and cellular morphogenesis. Trends Cell Biol. 22, 536-545 (2012).
- Shtengel, G., et al. Imaging cellular ultrastructure by PALM, iPALM, and correlative iPALM-EM. Method Cell Biol. 123, 273-294 (2014).
- Juette, M. F., et al. Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples. Nat Methods. 5, 527-529 (2008).
- Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging. Trends Cell Biol. 19, 555-565 (2009).
- Shannon, C. Communication in the presence of noise. Proc. IRE. 37, 10-21 (1949).
- Good, N. E., et al. Hydrogen ion buffers for biological research. Biochemistry. 5, 467-477 (1966).
- Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophys J. 94, 1826-1835 (2008).
- Shin, W. D., et al. Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. Goldman, R. D., Swedlow, J. R., Spector, D. L. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2010).
- Aquino, D., et al. Two-color nanoscopy of three-dimensional volumes by 4Pi detection of stochastically switched fluorophores. Nat Methods. 8, 353-359 (2011).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8, 1027-1036 (2011).
- Pertsinidis, A., Zhang, Y., Chu, S. Subnanometre single-molecule localization, registration and distance measurements. Nature. 466, 647-651 (2010).
- Baddeley, D., Cannell, M. B., Soeller, C. Visualization of Localization Microscopy Data. Microsc Microanal. 16, 64-72 (2010).
- El Beheiry, M., Dahan, M. ViSP: representing single-particle localizations in three dimensions. Nat Methods. 10, 689-690 (2013).
- Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nat Methods. 9, 152-158 (2012).
- Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics. Nat Methods. 5, 417-423 (2008).
- Yamashiro, S., et al. New single-molecule speckle microscopy reveals modification of the retrograde actin flow by focal adhesions at nanometer scales. Mol Biol Cell. 25, 1010-1024 (2014).
- Shroff, H., et al. Dual-color super resolution imaging of genetically expressed probes within individual adhesion complexes. P Natl Acad Sci USA. 104, 20308-20313 (2007).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346, (2014).
- Brown, T. A., et al. Super resolution fluorescence imaging of mitochondrial nucleoids reveals their spatial range, limits, and membrane interaction. Mol Cell Biol. 31, 4994-5010 (2011).
- Huang, F., et al. Video-rate nanoscopy using sCMOS camera-specific single-molecule localization algorithms. Nat Methods. 10, 653-658 (2013).
- Daostorm, S. DAOSTORM: an algorithm for high-density super-resolution microscopy. Nat methods. 8, 279 (2011).
- Zhu, L., Zhang, W., Elnatan, D., Huang, B. Faster STORM using compressed sensing. Nat Methods. 9, 721-723 (2012).
- Van Engelenburg, S. B., et al. Distribution of ESCRT machinery at HIV assembly sites reveals virus scaffolding of ESCRT subunits. Science. 343, 653-656 (2014).
- Vaughan, J. C., Jia, S., Zhuang, X. Ultrabright photoactivatable fluorophores created by reductive caging. Nat Methods. 9, 1181-1184 (2012).
