Summary
Biz yapışık memeli hücrelerinde aktin hücre iskeletinin görüntüleme, interferometrik photoactivated Yerelleştirme Mikroskopi (iPALM), 3-boyutlu tek-molekül yerelleştirme süper çözünürlük mikroskopi yöntemi uygulaması için bir protokol mevcut. Bu yaklaşım, aksi takdirde geleneksel kırınım sınırlı optik mikroskopi ile çözülmemiş kalacağını nano yapısal özellikleri ışık tabanlı görselleştirme sağlar.
Abstract
Floresan mikroskopi hücreleri içinde belirli biyomoleküllerin doğrudan görüntülenmesine olanak tanıyan. Bununla birlikte, geleneksel floresan mikroskobu için, uzamsal çözünürlük optik eksen boyunca görüntü düzleminde ve> 500 nm olan ~ 200 nm ila kırınımı ile sınırlıdır. Bunun bir sonucu olarak, floresan mikroskobu uzun ciddi hücre içinde ultrastrüktürel özellikler gözlem sınırlıdır. süper çözünürlüklü mikroskopi yöntemleri son gelişmeler bu sınırlamanın üstesinden gelmiştir. Özellikle, photoswitchable fluorophores gelişi moleküler uzunlukta ölçeği yaklaşan çözme gücü sağlar yerelleştirme tabanlı süper çözünürlük mikroskopi, sağlar. Burada, interferometrik photoactivated Yerelleştirme Mikroskobu (iPALM) olarak adlandırılan tek-molekül yerelleştirme mikroskopi ve çok fazlı interferometriye dayalı üç boyutlu süper çözünürlük mikroskopi yöntemi uygulanmasını açıklar. Bu yöntem neredeyse izotropik çözünürlük sağlarher üç boyutta da 20 nm sırası. iPALM aletin numune hazırlama ve işlemler dahil, ipliksi aktin hücre iskeleti görselleştirmek için protokoller, burada açıklanmıştır. Bu protokoller de hücrelerde diğer ultrastrüktürel özellikleri çalışma için kolaylıkla adapte ve öğreticidir.
Introduction
kompleks hücresel yapıların görselleştirme uzun biyolojik anlayışlar ve keşif ayrılmaz olmuştur. floresan mikroskopi, onun çözme gücü ~ 200 resim düzleminde nm (x, y, veya lateral boyut) ve> 500 nm optik eksen boyunca (z, ya da eksenel boyut) kırınım yüksek moleküler özgüllük ile görüntü hücreleri sınırlı olsa da 1,2. Bu nedenle, ultrastrüktürel özellikleri gözlem tarihsel elektron mikroskobu (EM) ile sınırlı kalmıştır. 100 nm aralığında 1-6 - Neyse, süper çözünürlük mikroskopisi son gelişme 10 uzaysal çözünürlüğü sağlayan bu sınırı hile vardır. Özellikle, süper çözünürlük gibi PALM (photoactivated Yerelleştirme Mikroskobu) 4, FPALM (Floresan photoactivated Yerelleştirme Mikroskobu) 5 (d) STORM (doğrudan Stokastik Optik İmar Mikroskopi) 6,7, BOYA (as kısaltmaları tarafından bilinen tek bir molekül lokalizasyonu dayalı yaklaşımlar poGörüntüleme Nano Topografya) 8 için int Birikim, GSDIM (Ground Devlet tükenmesi Mikroskopi 9) bireysel moleküler dönüşü takiben, ya da SMACM (Tek Molekül Aktif Kontrol Mikroskopi) 10, yanı sıra bunların 3 boyutlu (3D) uygulamaları, interferometrik PALM (iPALM) 11 veya 3D-STORM 12, nöronal aksonlar, çok sayıda biyolojik yapıların nano örgüte yeni bakış açıları ortaya dahil olmak üzere değerli olmuştur ve fokal yapışıklıklar 14,15, hücre-hücre kavşak 16, nükleer 17 gözeneklerin, 13 sinapsların ve sentrozomlar 18-20, birkaç isim.
süper çözünürlüklü mikroskopi potansiyel olarak yararlı olduğu hücrelerde başka ultrastrüktürel özelliği aktin hücre iskeleti olduğunu. Hücre kortekste filamentli (f) aktin için kompleks ağ örgüsü hücre şekli ve mekanik özellikleri 21 kontrolünde önemli bir rol oynar. organizasyon of f-aktin aktif ve dinamik güçlü polimerizasyonu, çapraz bağlanmayı, ciro, istikrar ve ağ topolojisini 22 etkileyen çok sayıda düzenleyici proteinler olsa düzenlenir. Ancak, f-aktin ağ örgüsü mimarisinin karakterizasyonu hücresel süreçlerin çeşitli bir yelpazede, geleneksel kırınım sınırlı ışık mikroskobu ile kendi gözlemini engelleyen f-aktin filamentler küçük boyutlu (~ 8 nm) içine mekanistik anlayışlar için önemli olmasına rağmen; böylece, aktin ince yapısı görselleştirme, şimdiye kadar sadece EM ile yapılmaktadır. Burada, biz, yapışık memeli hücrelerinde f-aktin hücre iskeleti görselleştirmek 3D 11,23 yılında çok yüksek hassasiyetli yeteneği yararlanmak için iPALM süper çözünürlük mikroskopi tekniği kullanarak protokolleri açıklar. IPALM enstrüman son derece uzmanlaşmış olmasına rağmen, böyle bir araç kurma hakkında talimat, son zamanlarda 23 tarif edilmiştir Ho tarafından barındırılan iPALM mikroskop erişim sırasındakoğuş Hughes Tıp Enstitüsü de minimum maliyetle araştırma topluluğuna kullanılabilir hale getirilmiştir. Buna ek olarak, burada açıklanan numune hazırlama yöntemleri daha geniş mevcut gibi nokta dağılım fonksiyonu (PSF) ve astigmat odaktan uzaklaşma dayalı olanlar gibi alternatif 3D süper çözünürlük yaklaşımları, 12 veya bi-düzlem algılama 24, doğrudan uygulanabilir.
Biz genel olarak tek-molekül yerelleştirme tabanlı süper çözünürlük mikroskopi için gerekli bir maddedir yerine getirilmesi tek-molekül yerelleştirme tabanlı süper çözünürlük mikroskopi için üç kritik gereksinimleri izin veren photoswitchable fluorofor 25 olduğuna dikkat: i) yüksek tek-molekül arka plan sinyallerine parlaklık ve kontrast akraba; ii) Belirli bir resim çerçevesi içinde tek moleküllerin seyrek dağılımı; Ayrıca Nyquist-Sha olarak bilinen altta yatan yapının (profilini yakalamak için yeterli etiketleme ve iii) yüksek uzaysal yoğunluknnon örnekleme kriteri) 26. Bu nedenle, tatmin edici sonuçlar elde etmek için ağırlık florofor photoswitching optimize etmek ve altta yatan ultrastrüktürel korumak hem de deney cihazı ve alıcı yönleri için numunelerin uygun hazırlanması hem de eşit yerleştirilmelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Görüntüleme Numune Hazırlama
- Arka plan floresan sinyalleri florofor etiketlerden floresan ile etkileştikleri ilk (GKD 2 O) deiyonize suda durulama ve daha sonra basınçlı hava kullanarak hava-kurutma ile coverglasses temizleyin. Daha sonra, 15 saniye için bir plazma temizleme plazma aşındırma yerine veya gerekirse daha fazla.
- sürüklenme düzeltme ve iPALM kalibrasyon etkinleştirmek için, # 1.5 yuvarlak (22 mm çap) güvenilir kalibrasyon ve sürüklenme düzeltilmesi için olduğu gibi son derece ışığa, referanslar hizmet referans işaretleri gibi floresan nanopartiküller ile gömülü önceden temizlenmiş coverglasses kullanın. Nedeniyle yeterli fluorofor yoğunluğu birikir gereken uzun satın alma süresi (> 15 - 30 dk), örnek sürüklenme kaçınılmazdır.
- 6-çukurlu doku kültürü plakasının her bir fiducialed coverglass yerleştirin. 15 dakika boyunca, bir laminar akış başlığı içinde ultraviyole (UV) ışıma ile sterilize.
- Steril bir laminer akış kaputu, fibro hazırlamak10 ug / ml - bir nihai konsantrasyonda 2 steril Dulbecco fosfat tamponlu tuz (DPBS) içinde 1 mg / ml stok çözeltisi fibronektin seyreltilerek coverglass kaplama adiponektin çözeltisi. Her DPBS ile üç kez coverglass durulayın ve 4 ° C'de bir gece fibronektin çözeltisinin 2 ml'si ile inkübe edin. Daha sonra, fibronektin çözüm aspirat ve DPBS ile bir kez yıkayın.
- DPBS kısaca hücreleri durulayın. hücreleri ayırmak ve taze serum içeren hücre kültür ortamının ~ 10 ml söndürün kadar 37 ° C 'de, bir kaç dakika boyunca tripsin, 2 ml 1 - kuluçkalayın. Örneğin, insan göbek damarı endotel hücrelerinin (HUVEC) için, daha büyük damar endotel faktörleri ve penisilin veya streptomisin ile desteklenmiş büyük damar endotel kültür ortamı kullanın.
- (Seyrek yoğunluğu, levha <coverglass başına 50,000 hücre için), fibronektin kaplı coverglass üzerine hücreleri Replate ve korumak kültürü% 95 nem,% 5 CO2 ayarlanmış bir kuluçka makinesi içinde, 37 ve #176 ° C.
- F-aktin hücre iskeletinin ince yapılarının uygun korunması için iyi, tampon reaktif 27 dayalı tampon çözümleri kullanın.
- Örneğin, bir 2 x stok çözeltisi olarak PHEM tamponu hazırlamak (120 mM PIPES, 50 mM HEPES, 20 mM EGTA, KOH ile 4 mM MgCl2, pH 7.0) HEPES, 6.5 g, EGTA, 3.8 g, ve 190 mg arasında eritilmesi ile konsantre KOH çözeltisi damla damla ilave edilerek 7.0'a ayarlandı pH GKD 2 O ~ 300 ml 'si içinde MgCl2; Daha sonra, 500 ml hacim getirmek için GKD 2 O ekleyin. , 0.22 mikron filtre kullanılarak tampon sterilize 4 ° C sıcaklıkta saklayın ve bunu 1 sulandırmak: Kullanmadan önce GKD 2 O ile 1.
- f-aktin yüksek yoğunluklu etiketleme ile en iyi sonuçları elde etmek için, kullanım faloidin şöyle hücreleri düzeltmek, bu tür hücre şarjı sonra istenilen zaman noktasında Alexa Fluor 647 gibi organik fluorophores, konjuge:
- iyi ce içeren her kültürden medya aspirell örnek. Yavaşça ama çabuk% 0.25 Triton X-100 ile PHEM tamponu içinde% 0.25 glutaraldehid içeren sıcak (37 ° C) ekstraksiyon fiksatif 2 ml dağıtın. 2 dakika - 1, oda sıcaklığında inkübe edin. takip eden adımlar için sabitleyici 2 ml, ya da başka şekilde belirtilmediği sürece, coverglass başına tampon söndürülmesi.
- PHEM tampon maddesi içinde bir% 2.5 glutaraldehid fiksatif ile ekstre Fiksatif yerine ve numuneler 10 inkübe edin - 12 dakika. Bu ve takip eden adımlar tüm oda sıcaklığında gerçekleştirilir.
- fiksatif dışarı aspire ve yavaşça PHEM tamponu ile değiştirin. Tilt ve girdap yavaşça ve sonra PHEM ile tekrar yıkayın. İki kez tekrarlayın.
- Istenen floroforlar gelen sinyalleri bastırmak PHEM içinde% 0.1 bir kütle konsantrasyonunda NaBH4 ihtiva eden yeni hazırlanmış bir söndürme tamponu ile numune inkübe olabilir glutaraldehit gelen otoflüoresanı, soğutulur. Miktarda kabarcık gözlemlenecektir. Bazen disl hafifçe örnek çanak dokununkabarcıklar odge. 10 dakika - bu 5 için inkübe edelim.
- Söndürme tampon dışarı aspire ve yavaşça PHEM tamponu ile değiştirin. kabarcıklar temizlemek için birkaç kez durulayın. PHEM 2 ml pipetle tampon ve 5 dakika süreyle karanlıkta inkübe edin. İki kez tekrarlayın ve işiniz bittiğinde PHEM tamponunda örnek dinlendirin.
- GKD 2 O. 10 ml - Petri kabı cömertçe 5 ile nemlendirilmiş kağıt havlu parçası ile boşluklarla büyük bir plastik kullanarak inkübasyon faloidin için bir rutubet gözünün hazırlayın ıslak kağıt havlu üstüne temiz Parafilm büyük bir yaprak yerleştirin.
- Nedeniyle işaretlenmiş falloidinle nispeten yüksek maliyetine bağlı olarak, her bir etiketleme için küçük bir hacim kullanımı. Yüksek yoğunluklu etiketleme için 0.3 uM bir konsantrasyonda ile başlar. PHEM tamponu falloidin-Alexa Fluor 647 ile coverglass başına ~ 60 ul hazırlayın.
- Pipet 55 - nem odasında Parafilm tabaka üzerine falloidin çözeltisi 60 ul. Ince forseps kullanarak, hafifçe örnek coverg kaldırmakkız. Doğru hücre içeren yüzünü dikkat dikkatli olun.
- Hızlı ve yavaşça hassas emici bir kağıt katlanmış bir parça ile coverglass kenarına dokunarak aşırı tampon uzak dokunun ve ardından Parafilm Phalloidin solüsyonu damlasına üzerine aşağı bakacak şekilde coverglass hücre tarafı yerleştirin. coverglass tarafından yakalanan hava kabarcığı olmadığından emin olun.
- nem odası kapağı yerleştirin. Ortam ışıktan korumak için alüminyum folyo ile bölme sarın ve örnek 4 ° C'de gece boyunca inkübe edin. Numune birkaç gün bu durumda muhafaza edilebilir. Uzun depolama planlanmış ise nem odası nemli kalır emin olun.
- görüntüleme önce hafifçe PHEM tamponu 2 mi çukur başına ihtiva eden yeni bir 6-yuvalı plaka üzerine coverglass ile yan yerleştirin.
- Aşağıdaki stok çözümleri kullanarak oksijen temizlenmiş tiyol-temelli görüntüleme tamponlar hazırlayın: 1 M glükoz, 1 M sistamin ve 100x glukoz oksidaz / katalaz enzimi MixtURE (katalaz 4 mg ve vorteks yoluyla iyice karıştırılır PHEM tampon 100 ul, glukoz oksidaz, 10 mg), 28. Sağ görüntüleme önce, 1 M glükoz çözeltisinin 75 ul 1 M sisteamin çözeltisi 30 ul ve 100x hazır enzim karışımı 3 ul karıştırın. PHEM tamponu ile 300 ul ses seviyesini ayarlamak ve örnek monte karıştırma hemen sonra kullanın.
- iPALM için, önceden temizlenmiş # 1.5 coverglass (22 mm çap) ile görüntüleme örneği hazırlayın.
- Alternatif olarak, astigmatizma tabanlı 3D-STORM 12 yerine kullanılmak üzere ise mecliste yardımcı olmak için bir çift taraflı yapışkan ayırıcı ile bir cam slayt (3 "x 1") kullanın.
- görüntüleme örneği monte etmek için, yavaşça de tampon örnek coverglass kaldırmak için ince forseps kullanabilir. Sonra, hızlı ve yavaşça katlanmış emici kağıt ile coverglass kenarına dokunarak aşırı tampon uzak dokunun.
- Temiz objektif bir kağıt parçası üzerinde yukarı bakacak şekilde coverglass hücre tarafı yerleştirin. örnek durulayın30 yerleştirerek - ve, numune üzerine görüntüleme tampon 50 ul eğerek ve katlanmış emici kağıt ile dokunarak fazla tampon kaldırmak.
- durulama adım birkaç kez tekrarlayın ve sonra 30 koyun - numune üzerine görüntüleme tampon 50 ul. Leke coverglass kenarını kurutun ve kurutulmuş alanı üzerine hızlı sertleşen epoksi birden çok küçük noktalar koyun.
- Yavaşça hücre içeren 22 mm coverglass merkezi üzerine başka önceden temizlenmiş # 1.5 coverglass (düz, yuvarlak coverglass, 18 mm çapında) indirin. Görüntüleme tampon kılcal etki ile her iki coverglasses ıslak olsun. Hızlı sertleşen epoksi küçük noktalar her iki coverglasses uymalıdır.
- Yavaşça basıncı eşit yaymak için katlanmış emici kağıt kullanılarak monte numune üzerine basın. Hatta örnek hücre ince ve (<15 mikron) yapmak için yeterli basınç kullanın, ancak hücreleri ezmek için çok fazla değil. Newton halkaları desen gözlemleyerek doğru kalınlığı ölçmek. Ayrıca, bu st gerçekleştirmek için emin olunep nazikçe hava kabarcıklarını en aza indirmek için. Gerekirse, önceden boş coverglasses birkaç kez uygulama.
- Eritilmiş vazelin-lanolin-parafin ile örnek Seal 29 (valap, hisse senedi, g vazelin, lanolin ve parafin her 100 hazırlanır birlikte eritilir), GKD 2 O ile mühürlü numune durulayın ve basınçlı hava ile kuru bir darbe. Örnek şimdi görüntüleme için mikroskop üzerine monte etmek için hazırdır.
2. Örnek Yerleştirme ve iPALM Hizalama
- numune tutucu çıkarılması için izin vermek için yukarıya doğru yaylı En objektif lens getirin. numune tutucu üzerine adım 1.10 hazırlanan mühürlü numune yerleştirin ve birkaç küçük nadir toprak mıknatıslar ile sabitleyin. Görüntüleme numunenin her iki tarafında immersiyon uygulanır. optik yoluna geri numune tutucu yerleştirin ve yavaşça üst objektif lens düşük.
- uyarma lazerler açın. (Elektron Çarpma Charge-Coupled Cihazda EMC açınçerçeve aktarım modunda CD) kamera.
- Uygun emisyon filtreleri döndürün. Üst ışın yolu (Şekil 1A) blok ve alt kiriş yolunu açmak için mekanik bir deklanşör etkinleştirin. Piezo çalıştırıcıyı kullanarak küçük artışlarla çeviri tarafından odak haline alt objektif lens getirin.
- yanlılık odak sonra, alt ışın yolunu bloke ederken üst ışın yolunu açmak ve benzer şekilde odak haline üst objektif lens getirmek. Optimum odak için bilgisayar ekranındaki miyar komponenti genişliğini izleyin.
- Uygun santralizasyonunun, üstü açık hem de alt kiriş yolları. alt amaç mikro-ince ayar vidalarının bir çift kullanarak sabit tutulurken referans görüntüler ideal bir piksel içinde, mümkün olduğunca yakından çakışan kadar elle üst objektif lens ayarlayın.
- Daha sonra, ince ayar yapmak bir EMCCD piksel onda biri içinde adımda fiducial görüntüleri 2.3 örtüşme böylece. üst ayarlayınkontrol yazılımı ile 2-eksenli piezo monte aynalar hem nesnel lensler tutarak ve alt yansıma sabit yansıtır. sürecine rehberlik etmek bilgisayar ekranı aracılığıyla üst fiducials ve alt objektif görüş merkezleri karşılaştırın.
iPALM Kur 3. Kalibrasyon
NOT: floresan emisyon tutarsız olduğundan parazit iPALM gözlenen için, yol üst yoluyla uzunlukları ve alt hedefler birkaç mikron içinde, birbirine yakın olmalıdır. aşağıdaki gibi elde edilebilir:
- kameralar sürekli akış ve hem üst hem de alt kiriş yolları açık, üzerinde lazerler ile, 400 nm büyüklükte üzerinde sürekli bir z-ekseni salınım için kontrol yazılımı tarafından üretilen bir sinüzoidal gerilim dalga formu kullanarak numune tutucusu z-piezo salınım .
- Aslında yararlanan, optimum uyum dışında olduğunu, referans yoğunluğu t küçük değişirO salınım manuel nedeniyle istenen tek foton girişim etkisi yukarı veya aşağı referans dolaşacaktır yoğunluğu kadar motorlu ışın ayırıcı takımını çevirmek. Bu optik yol uzunlukları yakın eşleştirme belirtir. > 10 bir tepe-Valley oranı uygun durumlarda (Şekil 1D) 'de elde edilebilir.
- boşluğu ve tilt açıları ince ayar için küçük adımlarla ışın ayırıcı montaj alt ayna ayarlamak, her yüzeyde genlik ve faz hem de alanın karşısındaki mümkün olduğunca tekdüze olmasını sağlamak için. 800 nm üzerinde 8 nm z-adımlarla örnek çevirerek ışın ayırıcı ince ayarı gerçekleştirin.
- Böyle kamera # salınım fazı 1 göreli kameraya 2. maksimize olduğunu, ideal olarak küçük adımlarla ışın ayırıcı montaj içinde alt aynanın yüksekliği, konumunu ve eğimini ayarlayın, 3. - kameralar 1. arasında yanlılık yoğunluğunu izlemek 120 ° (Şekil 1B-D).
- ilk kezhizalama tamamlandığında, yakın görüntü ve çoklu fiducials hem hücreleri içeren bir görüş alanına uygun taramak için örnek çevirmek. kaçak ışık ve ortam tedirginlikler engellemek için sistem etrafında bir muhafaza yerleştirin. Görüntüleme alanı bulunduğunda, yine adım 3.4 yordamı yürütmek ve ana arayüzünde "Örnek Piezo Pozisyonu vs Kalibrasyon tarar Edinme" komutunu kullanarak sonraki z koordinat çekimlerinde kullanılmak üzere kalibrasyon eğrisi kaydedin.
4. Veri Toplama
- istenen bölge bulunur ve kalibrasyon eğrisi elde edildikten sonra, yazılımın içine uygun dosya adlarını girin. üst ve alt kiriş yolları ikisini de açın. maksimum 642 nm lazer uyarma gücünü artırmak. Alexa Fluor 647 için kapatarak fluorofor bir başlangıç dönemi (Şekil 2A) ihtiyaç duyulabilir.
- si kadar 5 dakika veya gerektiğinde daha uzun bir süre sabit bir 642-nm eksitasyon ile açığaYanıp sönen ngle molekülü (Şekil 2B) görülmektedir. Yazılım satın alma sırasında 405 nm fotoğraf aktivasyon otomatik artmasını sağlar. ipliksi özellikler açıkça görünür olabilmesi için satın alma kare Büyük numaralar genellikle gereklidir (> 50.000 kare). Hazır olduğunuzda, ana arayüzünde komutu "Başlat iPALM Toplama" seçeneğini kullanarak ham görüntü setleri satın başlar.
- (Şekil 2B örneklere bakınız) gerektiği gibi satın alma sırasında, ayar 405-nm lazer yoğunluğu ayarlayarak fotoaktivasyon seviyesi uygun yanıp sönen yoğunluğunu korumak için.
NOT: edinimi tamamlandığında, yazılım otomatik olarak uygun ikili biçime görüntü dosyalarını dönüştürmek olacaktır. hesaplama sunucusunda veri deposu veri doğrudan daha fazla işlenmek üzere orada kopyalanacak sağlayan bir ağ sürücüsü olarak monte edilir.
5. Veri İşlemeve Analiz
- Tüm tek moleküllerin yanı sıra fiducials 11,15,23 için en uygun parametreleri ayıklamak için geliştirilmiş özel bir yazılım kullanılarak yerelleştirme analizi yapın. Bu x, y-koordinatı, aynı zamanda kalibrasyon eğrisi analizi için kullanılan yoğunluğu sadece verir.
- komutunu kullanarak adım 3.5 edinilen ham kalibrasyon verilerini almak tek-molekül yerelleştirme yapmak için "Dosya" menüsünden "Peaks Çoklu Etiketlerin Özü". İlk yerelleştirme analizi takiben, 1 kamera # elde edilen koordinatları - 3 sırasıyla kırmızı, yeşil ve mavi kanalları mevcut ve altında komutu kullanarak daha fazla analiz için "(.sav) IDL olarak İşlenmiş kaydet" kaydedilebilir " dosya "menüsünden.
- Kameralar # 1 veri getirmek için - (lamelleri üzerinde gömülü floresan miyar komponentlerinin kullanarak kayıt içine 3 merkez görüntünün kapsama sağlamak için birkaç parlak, referanslar seçin, örneğin,"Görüntü Dönüşümler" menüsü altında "Çapa Fiducial Noktaları" komutunu kullanarak Şekil 1B). Kamera # 2 ile kayıt içine kameralar 1. ve 3. getirecek dönme ve ölçekleme matris hesaplamak için adım 5.1 parlak fiducials elde edilen 3 - yerelleştirme kameralar 1. koordinatları üçlü setleri kullanın. miyar yeterince büyük bir sayı ile daha yüksek dereceden polinom çözgü iyi uyuyor için yapılabilir.
- özetlenebilir ham verileri elde etmek için bir araya 3 - dönüşüm matrisi hesaplandıktan sonra, kameralar 1. ham verilerini dönüştürmek. y koordinatı ve toplanır ham verilere her kamera kanalının göreli katkısını belirlemek için, daha kesin x elde etmek için yerelleştirme analizi başka yuvarlak gerçekleştirin; Komut "Görüntü Dönüşümler" menüsü altında "Raw, Kaydet ve Kaydet Sum (.dat) Transform" kullanın. Bu yoğunluk oranı z koordinat bilgileri içerir.
- parlak Fiducial seçin ve z gerçekleştirmekKalibrasyon "Özel Fonksiyonlar" menüsü altında "Operasyon Z koordinatı" tıklayarak açılan iletişim işlevi "Test Wind Point 3D" seçeneğini kullanarak uydurma. Bu kalibrasyon eğrisi belirlemek için 3 kamera kanallarının şiddetleri 3-sinüs fonksiyonları uyacaktır. Kalibrasyon dosyası, daha sonra ana veri kümeleri üzerinde ileride kullanılmak üzere kaydedilir.
- Kalibrasyon eğrisinin kalitesini test etmek için, daha önce tarif edildiği gibi 23, çıkarma Z koordinatı gerçekleştirin. Kalibrasyon veri setleri z konumunda doğrusal süpürme ile alınır çünkü iyi kalibre sistemde uslu fiducials için, z koordinatlı, doğrusal ölçek gerekir. Ayrıca, tüm fiducials z-pozisyonları benzer bir eğimle ölçekli olmalıdır.
- tatmin edici bir kalibrasyon elde edildikten sonra, adım 5,1-5,3 özetlenen aynı prosedür takip 4. adımda elde edilen ham görüntü veri setleri için yerelleştirme ve dönüşüm analizi gerçekleştirmek. Bittiğinde, adım 5 kalibrasyon dosyasını yüklemek.4 ve gerçekleştirmek "WND Dosya seç" ve "Özel Fonksiyonlar" menüsü altında "Operasyon Z koordinatı" tıklayarak açılan iletişim kutusunda "Z Koordinat Extract" fonksiyonlarını kullanarak çıkarma z koordinatı.
NOT: kazanım süresi> 15 dakika olduğundan, mekanik sürüklenme beklenebilir. - x sürüklenme düzeltme gerçekleştirmek için, y, yerelleştirme koordinatlardan parlak bir referans seçin. Bu referans tüm çerçeveler mevcut olmalıdır. Ardından, "Görüntü Dönüşümler" menüsü altında "Kılavuzu Yıldız yazın / Testi" işlevini kullanarak (Şekil 3A-B) kayıt içine tekrar aynı çerçevede diğer tüm koordinatları hizalamak için miyar komponenti sürüklenme y koordinatı, x kullanabilirsiniz. Z-koordinat kaydı "Özel Fonksiyonlar" menüsü altında "Operasyon Z koordinatı" tıklayarak "Test Kılavuzu Yıldızı" ve pop-up iletişim "Guide Yıldız yazın" fonksiyonları erişerek benzer yapılabilir.
- Numune hafif eğim gösterebilir gibi, "tıklayarak açılan iletişim kutusunda" XYZ Tilt Kaldır "fonksiyonunu kullanarak düzeyini ayarlamak gerekir uçağı tanımlayan 3 referans noktalarının x, y, z koordinatlarını vererek eğim düzeltme yapmak Özel Fonksiyonlar "menüsünden" altında "Operasyon Z koordinatı.
- Sürüklenme ve eğim düzeltmeleri ardından, yerelleştirme koordinatlarını kaydedin. Ana arayüzü "Render" komutunu kullanarak daha fazla analiz (Şekil 4A-D) için süper çözünürlük görüntüyü yeniden. Renk Z koordinatı belirtmek için kullanılabilir. Seçenek olarak ise, seçilen alan bir yandan görünüşüdür da kılınabilir. yerelleştirme koordinatları daha ölçümü için metin dosyaları olarak ihraç edilebilir veya yeniden görüntü tif dosyası olarak kaydedilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
iPALM için kritik şartlar optik sistemlerin hizalama, kayıt ve kalibrasyon vardır. çıkarma z koordinatı için bu 3 yollu ışın ayırıcı koşul içinde uygun girişim sağlamak için gereklidir. sürekli izleme etkinleştirmek için, floresan sabit nokta kaynağı gereklidir. Bu flüoresan Au veya olan Fotolüminesans lokalize yüzey plazmon rezonansı (lspr) ortaya bimetalik nano-tanecikleri 23 kullanılarak elde edilebilir. Onlar aydınlatma üzerine kararlı bir tek dipol olarak işlev ve tipik olarak 5 ile lokalize olabilir - 10 nm doğruluğu. Bunlar piyasada mevcut nanopartiküller doygunluk olmadan (Şekil 1B), fluorophores ve referans işaretleri hem EMCCD fotoğraf makinelerinde uyarma yoğunlukları ve kazanç ayarları benzer ile görüntülü olabilir öyle ki çoğu tek-molekül fluorophores, aralığında parlaklık seviyesini yayarlar. Bundan başka, bu referans işaretleri büyük FAC dafiducials görünen genişliği odak ayarı sırasında izlenebilir sayede ilitate, duruluyor. temizlenmemiş ya da zayıf biçimde temizlenmiş coverglasses arasında sahte eşiğe kolayca tek moleküllü sinyalleri bastırmak çünkü daha önce açıklandığı gibi, aynı zamanda, Piranha aşındırma veya plazma temizleme ile olduğu gibi coverglass yüzeyinin sert temizleme, aynı zamanda, gereklidir.
iPALM yüksek hassasiyetli (x, y) PALM ile eş zamanlı ölçümü z koordinatı etkinleştirmek için çok fazlı interferometriye dayanır. iPALM alet, her bir yayılan floresan foton daha sonra özel olarak imal edilmiş 3-yollu ışın ayırıcı kendini müdahale her iki optik yolları yayılması olarak kabul edilebilir. Z koordinatı ve böylece Müdahale foton aşamasında kodlanır. ~ 120 3 camer arasındaki tek-molekül görüntülerin yoğunluk değişimi 3-yollu ışın ayırıcı sonucu çıktı kirişlerin ° karşılıklı faz farkıBir kalibrasyon eğrisinden çıkarma koordinat - z izin olarak. Bu ayan ve kalibrasyon için kullanılabilir z mil hassas olanak sağlamak piezoelektrik başlatıcılann bir çift ile donatılmıştır, çünkü Buna göre, iPALM numune taşıyıcı düzeneği olup, temel bir bileşenidir.
Uygun odak ve hizalama anda, z ekseni boyunca numunenin çeviri bir girişim etkisi yaratacaktır. Bu üç kamera kanalı (Şekil 1C-D) arasındaki referans yoğunluğu salınım olarak tezahür eder. Bu salınımlar da tek foton girişimi sağlayan üst ve alt optik ışın yolları hem neredeyse uyumlu olduğunu göstermektedir. Genellikle, enstrüman dönüm üzerine her kameranın ilk aşamaları optimum olmaz ve z-pozisyon tarama kalibrasyon ve hizalama için bir tanı aracı olarak gereklidir. Optimal aşamalarında ışın ayırıcı alt ayna gelmesi(Şekil 1A) piezoelektrik uç-tilt sahne kullanılarak ayarlanabilir. 20 nm ayarı - z-pozisyon kalibrasyon taraması her küçük 10 sonra alınır. Her kanaldaki miyar komponenti yoğunluğu daha sonra (örneğin, bir 2D-Gauss fonksiyonuyla uydurma) localisation analizi ile tespit edilir. toplam yoğunluğu ile normalize yoğunluk faz terimi hesaplanacak izin sinüzoidal dalga yaklaşık olarak hesaplanabilir; Şekil 1C'de görüldüğü gibi, böylece her bir kamera karşılık gelen faz belirlenebilir. Biz iPALM kullanılan tek foton parazit madde, aynı zamanda çok daha basit 2 yönlü ışın dağıtıcı kullanıldığı gösterilebilir dikkat edin. Ancak, 2 yönlü ışın ayırıcı başlangıcı ya da yıkıcı girişim sınırına yakın 3D süper çözünürlük mikroskopi için pratik değildir, bir kanalda sinyal etkin bir z-koordinat kısıtlamak, hangi yoğunluk ve yerelleştirme koordinatları gürültülü tahminleri sonuçlanan minimal çaldı için tayiniHer iki kamera önemli yoğunluk (<100 nm) sahip e. Bu etkinin üstesinden gelmek için gerekli kanalların asgari sayısı üçtür ve 3- ve 4-yollu projeksiyon sistemleri, literatürde 11,30 tarif edilmiştir.
Optimum koşullar altında, bir 3-yollu ışın ayırıcı için, 3 kamera arasındaki faz farkı 120 ° olmalıdır. IPALM için 3 yollu ışın ayırıcı Şekil 1A diyagramı çizilen gibi, 3 yansıma ara-yüzü içermektedir. ışın ayırıcı yolunun ince ayar ışın ayırıcı içinde uzunlukları sağlamak için ve en iyi bir faz farkı elde etmek için, kırılma indisi eşleştirme yağ ile dolu ince boşluk, düz dielektrik ayna üzerine konumlandırılır. Şekil 1C-D gösterildiği gibi, iPALM için uygun şeklinde yayılıyor, kameralar 120 ° karşılıklı faz farkı yakındır. Uygulamada, bir faz farkı daha büyük 105 ° genel olarak kabul edilebilir. Bu kalibrasyon, hem indSistem iyi uyumlu olduğunu icates ve daha sonra Z-koordinat çıkarılması için kullanılacağını. Ayrıca, farklı miyar komponentlerinin kullanılarak oluşturulan kalibrasyon eğrisi değerlendirmek faydalı olacaktır. orta parlaklık ile en referans işaretleri genellikle uslu kalibrasyon eğrilerini veren, tek bir dipol olarak yayarlar. Ancak, fiducials ara sıra agrega (aşırı parlaklık ile sık sık olanlar) güvenilmez kalibrasyon eğrileri veren, anormal bir şekilde davranabilir. Görüntüleme alanının merkezine yakın ve iPALM kurulumunda kullanılan yüksek NA hedefleri objektif düzeltilmiş düz alan değildir, özellikle beri biyolojik ilgi alanı (Şekil 1B), yakın, referanslar seçmek için de tavsiye edilir. etkili bir alan-of-view alanının kenarına doğru büyük referans genişlikleri belirginlik orta alanda, sınırlıdır.
İlk hizalama müteakiben, arzu mo ile hücreleri içeren alanlar-of-viewİyi kalibrasyonu sağlamak için rphology ve birden fazla referans işaretleri görüntüleme için tercih edilmektedir. Bu yavaş yavaş 2 eksenli servo motor sürücüleri kullanarak örnek tutucu çevirerek elde edilebilir. Numune her zaman mükemmel düz olmadığı için örnek Tercüme, bazı odaktan uzaklaşma neden olur. Bu nedenle, odak sürekli çeviri sırasında ayarlanmalıdır. Görüntü alanı seçildikten sonra, kalibrasyon bir tur kalibrasyon eğrisi ince ayar yapmak için sistem hizalama yapılır optimize etmek ve gerçek kalibrasyon eğrisi elde etmek için. Uzunlukları, bu Z-koordinat bozan göreli yolunun önemli bir değişikliğe neden olur çünkü Önemli olarak, heterojen bir kırılma indisinin (örn hava kabarcığı) sahip çekirdek veya yakınındaki bölgelerde altındaki bölgeleri, genel olarak kaçınılmalıdır.
yüksek yoğunluklu etiketleme ile, bu tür Alexa Fluor 647 gibi organik fluorophores gelen floresan sinyalleri son derece parlak olabilir. i gösterildiği gibin Şekil 2A, tiyol (-SH) gruplarının 31 yüksek konsantrasyonda içeren uygun tampon hazırlanması, flüorofor hızla yüksek uyarma aydınlatma altında kapatılmalıdır. Bu moleküllerin çoğunda flüoresan sinyallerin bastırılmasıyla sonuçlanır. Belirli bir aşamada, fluorophores çok küçük bir azınlık stokastik "konulu" durumuna dönmek. Bunlar seyrek dağıtılacak ve böylece tek tek moleküller veya çalıştırmadan önce birkaç kare olarak görüntülenebilir bekleniyor "kapalı." burada - (647 nm 640) photoswitching dinamikleri uyarım yoğunluğu ve -SH konsantrasyonuna bağlı güçlü bir şekilde bağlıdır, ve bu nedenle, belirli bir sistem için, bakım, özellikle nispeten yüksek uyarım yoğunluğu için, uygun bir markalama yoğunluğu etkin kılmak için alınması gereken Alexa Fluor 647 moleküllerinin çoğunluğu kapatmak gerekiyordu. uyarma yeterince güçlü, Alex Fluor 647 irade önemli bir kısmının değilseyüksek arka planda ortaya çıkan, "üzerinde" durumunda kalır, sonuçta, kalitesiz tek-molekül yerelleştirme sonuçlarını tek bir molekül floresan gözlemleyerek ve zorluklar. Her molekül net algılama ve yerelleştirme analizi izin verecek kadar seyrek iken düzgün dengeli koşul altında, tek-molekül ham veri, çerçeve (Şekil 2B) başına moleküllerin (yüzlerce) yeterince büyük bir sayı içermelidir. Bu iPALM için, photoswitching ilkeleri PALM veya STORM özdeştir fazlalaştı ve böylece düzgün iPALM için hazırlanan numuneler doğrudan basit 3D-PALM veya 3D-STORM sistemlerinde kullanılabilir. Nyquist örnekleme karşılamak için moleküllerin yeterince yüksek yoğunluğa kazanmak için, genellikle ham veri 50.000 veya daha fazla kare gerekiyor (yani, 3 kameralar için 150.000 toplam kareler). edinimi ilerledikçe, fluorophores giderek artan oranda spar sonuçlanan yıkıcı photobleaching tarafından tüketilmiş olabilirser tek bir molekül yoğunluğu. Bunu dengelemek için, 405 nm mavi ışık (405 nm) kısa bakliyat fluorofor aktivasyonunu teşvik etmek aralıklarla numune üzerine aydınlatılabilir.
Nedeniyle gereken uzun alma zamanına, optimum iPALM sonuçları (ya da genel olarak tek-molekül yerelleştirme mikroskopisi) düşük örnek sürüklenme ve / veya iyi sürüklenme düzeltme gerektirir. Örneğin, çerçeve aktarım modu (20 Hz kare oranı) 50 milisaniye pozlama süresini kullanarak, 50.000 kare toplam satın alma süresi 42 dakikadır. Bu dönemde, nm onlarca üzerinde mekanik sürüklenme bekleniyor. Gerçekte, yüksek lokalizasyon hassas ve yüksek etiketleme yoğunluğa ilave olarak, çözünürlük, aynı zamanda kayma düzeltme kalitesine bağlıdır. termal dalgalanma önemli bir nedeni olan bu sürükleniyor için birden fazla kökeni vardır. Nedeniyle, iPALM parçalar Invar, düşük ısıl genleşme alaşımlı veya paslanmaz çelik kullanılarak özel işlenmiş olası bu dikkate, için,bunların her ikisi de pirinç veya alüminyumdan çok daha düşük termal genleşme özelliklerine sahiptir. Ne yazık ki, bu da makinenin daha ucuz ve daha kolay olan, optik-parçaları için daha yaygın olarak kullanılan metal alüminyum ek maliyet göreli, uygular. sürüklenme Diğer kaynaklar çevresel ekipman, ortam ortamlar veya hava akımları mekanik titreşimler olabilir. Bu, uygun bir muhafaza sistemi koyarak ve mikroskop alanında hava akış yönü yönlendirerek en aza indirilmelidir. Mümkün, fan içeren bileşenler optik masadan konulmalıdır eğer kurulum, bir araştırma dereceli optik masaya inşa ve edilmelidir. Bununla birlikte, tüm önlemlere rağmen, sürüklenme miktar kalacaktır. Kritik, bu sürükleniyor görüntü elde etme süresi boyunca odak kalacak şekilde minimize edilmelidir. Bizim sistemlerde, bu pasif yöntemler kabul edilebilir seviyelere sürüklenme en aza indirmek için yeterli. Bununla birlikte aktif sürüklenme com uygulanması mümkün olmalıdırTelafisi yöntemleri uzun vadeli ve yüksek hassasiyetli görüntüleme 32 sağlamaktır.
Veri kümesi başına 10 milyon tek-molekül zirveleri - ham verilerin işlenmesi ardından, 3D yerelleştirme koordinatları genellikle 5 ile elde edilebilir. Şekil 3'te gösterildiği gibi, bir zaman fonksiyonu olarak sürüklenme miyar komponentlerinin lokalizasyonu koordinatlardan görselleştirilebilir. Birden fazla referans işaretleri, ortalama kayma düzeltme yörünge (Şekil 3A-B) hesaplamak için kullanılabilir. Ayrıca, yerelleştirme analizi sırasında 2D-Gauss fonksiyonu zayıf uygun zirveleri filtrelemek için gelenektir. Bu sahte sesler veya kısmen örtüşen tek-molekül zirveleri nedeniyle olabilir ve montaj sürecinde hesaplanan geniş kalıntı kare hata ile ayırt edilebilir. Bu şekilde, düşük parlaklık (foton sayımı ile gösterildiği gibi), daha yüksek bir belirsizlik ile zirveler (örn, ~ 25 nm'den daha büyük), aynı zamanda, filtre edilir, birBu olası spesifik olmayan arka plan floresanı ortaya s. Elde edilen z koordinatları güvenilmez Benzer şekilde, 3 kamera kanallarından şiddetleri kalibrasyon eğrisi için kötü uyum hangi zirveleri de, reddedilir. IPALM (ve genel olarak yeri mikroskopisi) tam bilgi içeriği florofor koordinatlarında, aynı zamanda bu tür Ancak vb yoğunluğu, genişlik, parlaklık gibi birkaç ek parametreleri, sadece analiz sonuçları, çünkü büyük olduğuna dikkat edilmelidir uygulamada, çünkü görece az sayıda hesaplama araçları koordinat alanında analiz için şu anda mevcuttur, yerelleştirme koordinatları tipik hale ya da daha fazla analiz için piksel tabanlı görüntü içine yeniden inşa edilir.
iPALM görüntü rekonstrüksiyonu için yaygın olarak kullanılan bir yaklaşım Gau olarak ayarlanmış yerelleştirme belirsizlik, her yerelleştirme bir normalleştirilmiş 2B Gauss fonksiyonu ile koordine temsil etmektirssian genişliği 33. Düşük hassasiyet koordinatları (tipik olarak düşük parlaklık ya da yüksek arka plan tek-molekül zirveleri) sönük ve daha geniş olarak görünür Böylece, yüksek hassasiyetli koordinatları (düşük arka plana karşı yüksek parlaklık tipik tek-molekül zirveleri), keskin ve dar doruklarına görünür zirveleri. Bu şekilde, her bir molekülün görüntü yoğunluğu aynı miktarda katkı sağlamaktadır. 3B veri kümesi için, Z-koordinat tipik olarak bir renk skalası (Şekil 4C-D) göre renk kullanılarak temsil edilebilir. Alternatif olarak, görüntüler bir yan görünüm (x, z veya y, z) projeksiyon ya da birimler olarak gösterilebilir. Halka açık yazılım gibi bir dizi verileri 34 görselleştirmek için kullanılabilmektedir.
Şekiller 4-6'da gösterildiği gibi, iPALM resim kırınım sınırlı floresan mikroskobu üzerinde önemli bir gelişme elde. HUVEC hücreleri f-aktin mimari çok gelişmiş mekansal Reso ile görüntülenmiştir olabilirdökülmesinden. stres lifleri, demetleri ve lamellipodia olarak, yoğun şekilde paketlenmiş F-aktin ağlar lifli bir yapıya sahip görülmektedir ise münferit filamanlar ayırt olmamakla birlikte korteks bölgelerinde farklı, filamanların ağ, görülebilir. Bunun nedeni fluorophores parlaklık ve yerelleştirme hassas hem de sınırlamaları muhtemeldir. farklı kortikal filamentler varlığı f-aktin ağ ultrastrüktür yeterince iyi korunmuş olduğunu göstermektedir; böylece, iPALM kortikal mimarisini karakterize etmek için kullanışlı bir araç olabilir. Şekil 5'de, bir HUVEC hücre bir alt bölge sayısal bir aktin filamentin profilleri gösterilir. Filaman z histogram iPALM z çözünürlüklü nisbetle önemli bir gelişme üreten, çözünürlük gösteren, enine (x, y) görünümü için ~ 45 nm ile karşılaştırıldığında, nispeten küçük bir genişliği yaklaşık 15 nm olduğu görülebilir x, y düzlem, beklendiği gibi. Bununla birlikte, Actu yanaF-aktin ark çapı gözlemlenen iplik tek bir lif ya da bir kaç filamentler bir demet olup olmadığı açık değildir, ~ 8 nm'dir. Bu yaklaşım F-aktin yapılmamış 23 çalışma uygulanmamıştır da Korelatif görüntüleme, iPALM kullanarak EM F-aktin mimarisi daha iyi tanımlanması için yararlı bir strateji olabilir.
Şekil 1: iPALM 3-D Süper Çözünürlük Mikroskopi Şematik. IPALM optik A) Şemalar. Çift objektif lensler (Nikon, NA 1.49 60X) her yayılan floresan foton üst ve alt optik ışın yolları hem yayılması, izin ve onlar 22.5 ° odaklı aynalar, bir çift ışın ayırıcı müdahale yönlendirilir. Kendi kendine müdahale fotonun aşaması, böylece fluorofor Z koordinatı kodlayan, δZ ile doğrudan orantılı olduğunu ve bize ölçülebilirüç çıkış kirişler arasındaki ~ 120 ° karşılıklı faz farkını bir 3-yollu profil ayırıcı ing. Onlar tüp lensler (L1-L3, f = 400 nm) tarafından odaklanmış ve emisyon filtresi tarafından filtre edilir (F1 - F3). Her tek bir molekülün, bu nedenle y koordinatlarından, kameralar (EMCCD1-3) arasında ancak benzer x farklı yoğunluklarda görüntülenir. (A) çoğaltılamaz ve Ref güncellenmiştir. Alexa Fluor 647. Parlak noktalar ile f-aktin etiketli HUVEC hücreleri 11. (B) Kırınım sınırlı görüntü Au nanoparçacık, referanslar ifade etmektedir. Kameralar # 1 için faz açıları - belirtilen 3 - 3 kamera # 1 arasındaki faz farkı, her miyar komponenti merkezli, sırasıyla, kırmızı, yeşil ve mavi çizgiler ile temsil edilmektedir. Ölçek çubuğu:. 5 mikron (C) interferometrik etkilerini gösteren Fiducial görüntüler. (Alt satırda nm) z-pozisyon olarak alınan her kamera (CCD1-3) veya toplam (sum), bir Au nanoparçacık miyar komponenti görüntüleri kalibrasyonu için taranır. ea içinde şiddeti(B). (D) iPALM kalibrasyon eğrisinde gösterildiği gibi CH kamerası, bir faz ilişkisi salınacak şekilde görülebilir. Örnek Z ekseni boyunca çevrilmiştir. EMCCD1-3 için bir Au nanoparçacık miyar komponenti yoğunlukları, kırmızı, yeşil ve mavi çizgiler, sırasıyla (üst) olarak göstermek vardır. Bunlar daha sonra normalleştirilir ve faz farkları (alt) belirlemek için uygun. hizalama sırasında, sistem üç kamera arasında maksimum faz farklılıklarını elde etmek için ayarlanır. Kalibrasyon eğrisi çıkarma kullanmak için her bir görüntüleme yerinde alınır z koordinatı her bir molekülün. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: Photoswitching Al Tek Molekül GörüntülemeAktin Etiketler olarak exa Fluor 647-Phalloidin. (A) İlk photoswitching bir adım. Sabit hücrelerde F-aktin en florofor hızlı kapanma bir tiol içeren görüntü tamponu sonuçlarında Alexa Fluor 647 Yüksek yoğunluklu aydınlatmasına birleşmiş falloidin ile yüksek bir yoğunlukta etiketlenmiştir. (B) ham tek molekülün Örnek kare çerçeveler. Kararlı hal yanıp sönen anda aktif Alexa Fluor 647 ayrı tek molekülleri PSF boyutlu nokta olarak görünür yeterince seyrek olmalıdır. ters kontrastlı gösterilir (A) 'da gösterilen aynı hücrelerin görüntüler. Ölçek A bar ve B:. 5 mikron bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: MULTIP kullanarak Drift Düzeltme. le miyar komponentleri Yerelleştirme dört fiducials koordinatları (A, x koordinatı, B, y-koordinatı) polinom parçaları kullanarak sürüklenme hesaplamak için kullanılmıştır (5 sipariş inci, sağ üst köşesinde bulunan uygun parametreler). Ortalama sürüklenme yörüngesi alt-5 nm hassas olan kayma düzeltme sağlar (x: 3,085 nm, y: 3,606 nm). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: iPALM 3-D f-aktin Mimarlık Görselleştirme. (A) ve Alexa Fluor 647-Phalloidin etiketli F-aktin HUVEC hücrelerinin kırınım sınırlı görüntü (Şekil 2'de hücre alt alanlara karşılık gelir). parlak nokta Au nanoparçacık fiducials kaynaklanmaktadır.
Şekil 5: iPALM tarafından görüntülendi f-aktin Nano Boyut. (A), F-aktin B etiketli yeniden inşa iPALM görüntü HUVEC hücreleri y Alexa Fluor 647-Phalloidin. renk renk çubuğunun göre z-koordinat gösterir. Ölçü bar:. 1 um (b) X enine kesit histogram, y-localisation kutulu alanının uzun ekseni (A) boyunca koordine eder. histogram elde etmek için, koordinatlar kutunun uzun ekseni yansıtılan ve 5 nm bin-boyutu ile binned edilir. Gri eğrisi yarı maksimum 43.88 nm (FWHM) tam bir genişliğe sahip histogramın bir Gauss en uygun olduğunu gösterir. Lokalizasyonu z-konumunda (C) Histogram (A) kutulu alanda koordine eder. Z-konumlarında 1 nm bölmesi boyutu ile binned edilir. Gri eğri 17,50 nm FWHM ile histograma bir Gauss en uygun gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
/files/ftp_upload/54774/54774fig6.jpg "/>
Şekil 6:. F-aktin iPALM Görüntüleme karşılaştırması farklı etiketleme ayıraçları kullanarak Alexa Fluor 647 birleşmiş falloidin (A), Alexa Fluor 568-birleşmiş falloidin (B) kullanılarak işaretlenmiş F-aktin, yeniden oluşturulan iPALM görüntü ya da aktin ile transfeksiyonla -mEos2 füzyon proteini ekspresyon vektörü (C). Ölçek çubukları (AC):. 1 mikron bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Şekil 1A 'de gösterildiği gibi iPALM optik sistemi, 4-π çift karşıt amaçlı tasarım dayanmaktadır. Tablo 1'de önceki 23 anlatıldığı ve listelenen kurulum, özel işlenmiş ve ticari opto-mekanik parçalar kullanılarak inşa edilmiştir. Bizim kurulumuna ek olarak, Howard Hughes Tıp Enstitüsü (HHMI) Janelia Araştırma Kampüsü'nde İleri Görüntüleme Merkezi bilim dünyası için erişilebilir bir sistem barındırır. Tam mekanik çizimler, kontrol şemaları ve yazılım için, okuyucular daha fazla bilgi için HHMI Harald Hess ile sorgulamak için teşvik edilir. F-aktin görselleştirmek için iPALM gibi diğer tek moleküllü lokalizasyon Mikroskopisi yöntemleri kullanarak öncelikli avantajı, EM, genel olarak sert bir örnek işlem gerektiren tekniklere, zahmetli hazırlama ve yüksek nitelikli pratisyenler 3,23 ile karşılaştırıldığında numune hazırlama nispi kolaylığı . Additionally floresan EM için zor kalır çok kanallı görüntüleme, doğal müsait. aşağıda daha ayrıntılı olarak tarif edildiği gibi Bununla birlikte, numune hazırlama ve görüntüleme işlemi açısından hem de bir yaklaşım için çeşitli mevcut kısıtlamalar vardır. EM numune hazırlama olduğu gibi ilk olarak, bakım nano ölçekli düzeyinde ciddi tedirginlikler yol açabilir çözünürlük kırınım sınırlı düzeyde yeterli bir protokol beri, örneklerin 35 iyi ultrastrüktürel korumayı sağlamak amacıyla alınmalıdır. aktin görüntüleme için, hücreler uygun sabitleme örneği kalitesini etkileyen önemli bir faktördür. antikor ile birlikte boyama durumlarda epitop siteleri etkilenebilir olsa, çok iyi hücre iskeleti ve membran korur çünkü Glutaraldehit tercih edilen bir fiksatif olduğunu. daha iyi bir antikor epitopunu siteleri muhafaza eğilimi gibi durumlarda, paraformaldehit, kabul edilebilir bir uzlaşma sağlanabilir. Önemlisi tek-molekül yerelleştirme mikroskopi için, bu fiksatif eğilimiArka plan otofloresans oluşturmak için; Bu şekilde, borohidrid ile sonradan tespit söndürme özellikle glutaraldehit durumunda gereklidir.
Ayrıca, fluorophores ve etiketleme stratejilerinin doğru seçimi başarılı deneyler için en önemli faktörler arasındadır. Nyquist örnekleme teoremi 36 öngördüğü nedeniyle f-aktin nano boyuta, etiket yüksek yoğunlukları, altta yatan ipliksi ağları yakalamak için gereklidir. aktin, faloidin birçok üretici edinilebilir organik fluorophores geniş bir yelpazede, çok yüksek yoğunluklu etiketleme sağlar. faloidin zehirli olduğundan Ancak, hücre fiksasyon ve permeabilization gereklidir. canlı hücre uyumlu aktin etiketleme için alternatif stratejiler monomerik aktin ile veya küçük aktin bağlayıcı polipeptitler ile ya floresan proteinleri (FP) kaynaşmasını kullanılması yer alıyor. Bununla birlikte, bu (Phalloidin kıyasla daha düşük bir etiketleme yoğunluğu elde etmek için eğiliminde olduğu tespit
39. Bu eşit iPALM avantajları ve sınırlamaları için de geçerlidir. Diğer 3 boyutlu süper çözünürlük mikroskopi teknikleri ile karşılaştırıldığında, iPALM x, y çözünürlüklü 11 oranla yaklaşık 2 kat daha iyi z çözünürlükte, özellikle z ekseni boyunca, bugüne kadar en yüksek çözme optik bir yaklaşım kalmıştır. Kalibrasyon eğrisi periyodik olduğundan Ancak, yüksek z çözünürlüğe interferometriye üzerinde iPALM ve güven de, görüntüleme derinliğine bir kısıtlama getirmektedir. Diğer bir deyişle, Z-koordinatları her 250 nm ya da (Alexa Fluor 647 700 ~ için nm emisyon dalga boyları) tekrarlayın. Uygulamada, bu fani alan derinliği içinde uyarım bölgesini sınırlayan TIRF aydınlatma kullanılarak ele alınabilir <coverglass 200 nm. Numune heyecanlı değildir ve görünmez kalır içine Böylece, derin floroforlar. Ancak, bu da daha fazla iç yapıları ulaşamayacağı ise, bu tür odak yapışıklıklar, kortikal hücre iskeletinin ve ventral plazma membran olarak coverglass yakın kişilerce görüntülü olabilir biyolojik yapıları sınırlar. Sabit numune için bir çözüm, 40 cryosectioning yapmaktır. Ancak, böyle bir yaklaşım son derece zahmetli ve yaygın olarak erişilebilir değil özel uzmanlık gerektirir.
Seçenek olarak ise, iPALM 3D-STORM kullanılan astigmat-odaktan uzaklaşma Şema 12 interferometrik birleştirilmesi ile genişletilmiş z aralığı için uyarlanabilir. Bu yaklaşım, çift z koordinat readouts, yüksek hassasiyetli ama periyodik interferometri, ilk ve az hassas ama olmayan periyodik astigmat odaktan uzaklaşma, ikinci sağlar. İkincisi daha sonra "paketini" ya da dejenere kırmak için kullanılırİnterferometrik z koordinatları, bu nedenle etkili yüksek NA objektif lens içsel odak derinliği yaklaşan, ~ 750 nm iPALM görüntüleme derinliği üç katına sağlayan. Faz açması ile iPALM bağlı olarak ek 40 odaktan uzaklaşma amacıyla, 3 boyutta biraz azaltılmış hassasiyet ile de olsa, mitokondri gibi derin numune içindeki resim yapıları kullanılmıştır.
iPALM başka içsel bir sınırlama görüntüleme hızıdır. çerçeve çok sayıda lokalizasyon koordinatlarının yüksek yoğunluklu elde etmek için gerekli olduğundan, kamera hızı elde etme oranı sınır genellikle. Geçerli EMCCD kameraları 10 çalışan ile - 20 MHz okuma oranları, dakika onlarca kare yeterli sayıda için gereklidir. Bu tür uzun zaman ölçekleri numune sabit olmasını gerektirir. Burada, bu tür çok daha hızlı bilimsel Tamamlayıcı Metal Oksit Yarıiletken (sCMOS) kamera gibi kamera teknolojisindeki son gelişmeler, im hızlı bir artış sağlayabilirBu henüz iPALM için uygulamaya konmamıştır rağmen, hız 41 yaşlanma. Bazı tek-molekül yerelleştirme mikroskopi yaklaşımlar, yoğun bir tek-molekül alan bir modifiye algoritma 42 kullanılarak analiz veya 43 algılama sıkıştırılabilir. Bu tür stratejilerin adaptasyon da, dolayısıyla, daha az kare yoğun tek-molekül görüntüleri izin vererek iPALM hızlandırmak ve olabilir.
Mekansal çözünürlükte hız ve görüntüleme aralığında sınırlamalar ve güçlü olan, iPALM için önemli bir uygulama spesifik proteinlerin 14,15,44 ve nano ölçekli organizasyonu açıklayacak floresan etiketleme faydalarını güçlendirir bir ultrastrüktürel bir yöntem olarak ise. Başka gelişme, hem optik ve fluorofor teknolojileri açısından, iPALM uzamsal çözünürlük daha artışı etkinleştirmeniz gerekir. Örneğin, iPALM görüntü işleme şu anda 2D-Gauss fonksiyonu tarafından ve olarak modellenmiştir her bir molekül ile, nispeten basit bir birinci dereceden yaklaşım yaklaşım kullanırBir olmak için varsayılır izotopik dipol ortalama. Bu önemli ölçüde uzaysal çözünürlüğü artırmak için nokta-dağılım fonksiyonu ve dipol yönelimi ya da görüş alanı boyunca optik sapmaları açık tedavinin daha doğru bir modeli kullanan son yöntemleri ile artar olabilir. Aynı şekilde, photocaging büyüklüğü 45 emriyle fluorofor parlaklığını arttırır ki, bildirilmiştir. onların ultrastrüktürel örgütün temel unsurları iyi karakterize beri Nitekim, f-aktin hücre iskeleti iPALM daha metodolojik gelişmeleri test etmek için son derece değerli bir model sistem olabilir. Gerçek EM-düzey çözme gücüne sahip ışık mikroskobu ile protein organizasyonu analiz etme yeteneği büyük ölçüde hücresel yapısı ve fonksiyonu sayısız yönlerini anlayışımızı geliştirmek için bekleniyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
YW ve PK minnetle PK (NRF-NRFF-2011-04 ve NRF2012NRF-CRP001-084) verilir Singapur Ulusal Araştırma Vakfı, finansman desteği kabul. Biz de altyapı desteği için MTE açık laboratuvar ve mikroskopi çekirdek imkanları teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| optical table | Newport, CA | RS4000 | iPALM, installed on 4 Newport Stabilizer vibration isolators |
| vibration isolator for optical table | Newport, CA | S-2000 | |
| laser-642 | Newport, CA | 1185055 | output power=100 mw |
| laser-561 | Newport, CA | 1168931 | output power=200 mw |
| laser-488 | Newport, CA | 1137970 | output power=200 mw |
| laser-405 | Newport, CA | 1142279 | output power=100 mw |
| broadband dielectric mirrors | Thorlabs, NJ | BB1-E02 | laser combiner |
| dichroic beamsplitter | Semrock, NY | LM01-427-25 | |
| acousto-optic tunable filter | AA Opto-Electronic, France | AOTFnC-VIS-TN | |
| Linear polarizer | Newport, CA | 05LP-VIS-B | |
| baseplate | local workshop | customized | |
| turning mirror (22.5°) | Reynard Corpporation, CA | customized | 22.5° mirror |
| motorized optic mounts | New Focus, CA | 8816 | |
| motorized XYZ translation stage | Thorlabs, NJ | MT3/M-Z6 | sample holder |
| T-Cube DC servo motor controller | Thorlabs, NJ | TDC001 | |
| Piezo Phase Shifter | Physik Instrumente, Germany | S-303.CD | |
| objective lens | Nikon, Japan | MRD01691 | objective. Apo TIRF 60X/1.49 oil |
| translation stage | New Focus, CA | 9062-COM-M | |
| Pico Motor Actuator | New Focus, CA | 8301 | |
| rotary Solenoid/Shutter | DACO Instruments, CT | 5423-458 | |
| 3-way beam splitter | Rocky Mountain Instruments, CO | customized | beamsplitter |
| Piezo Z/Tip/Tilt scanner | Physik Instrumente, Germany | S-316.10 | |
| motorized five-axis tilt aligner | New Focus, CA | 8081 | |
| Picmotor ethernet controller | New Focus, CA | 8752 | |
| Piezo controllers/amplifier/digital operation module | Physik Instrumente, Germany | E-509/E-503/E-517 | |
| band-pass filter | Semrock, NY | FF01-523/20 | filters |
| band-pass filter | Semrock, NY | FF01-588/21 | |
| band-pass filter | Semrock, NY | FF01-607/30 | |
| band-pass filter | Semrock, NY | FF01-676/37 | |
| notch filter | Semrock, NY | NF01-405/488/561/635 | |
| motorized filter wheel with controllter | Thorlabs, NJ | FW103H | |
| EMCCD | Andor, UK | DU-897U-CSO-#BV | 3 sets |
| Desktop computers for controlling cameras and synchronization | Dell | Precision T3500 | PC, 4 sets |
| coverslips with fiducial | Hestzig, VA | 600-100AuF | sample preparation. fiducial marks with various density and spectra available |
| fibronectin | Millipore, MT | FC010 | |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences, PA | 15710 | fixation. 16% |
| glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences, PA | 16220 | 25% |
| triton X-100 | Sigma aldrich, MO | T8787 | |
| HUVEC cells | Life Technologies, CA | C-015-10C | |
| Medium 200 | Life Technologies, CA | M-200-500 | |
| Large Vessel Endothelial Factors | Life Technologies, CA | A14608-01 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | 14190367 | ||
| Pennicillin/Streptomycin | 15140122 | ||
| Trypsin/EDTA | Life Technologies, CA | 25200056 | |
| PIPES | Sigma aldrich, MO | P1851 | PHEM |
| HEPES | 1st base, Malaysia | BIO-1825 | |
| EGTA | Sigma aldrich, MO | E3889 | |
| MgCl2 | Millipore, MT | 5985 | |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Invitrogen, CA | A22287 | staining |
| sodium borohydride (NaBH4) | Sigma aldrich, MO | 480886 | quenching |
| glucose | 1st base, Malaysia | BIO-1101 | imaging buffer |
| glucose oxidase | Sigma aldrich, MO | G2133 | |
| catalase | Sigma aldrich, MO | C9322 | |
| cysteamine | Sigma aldrich, MO | 30070 | |
| Epoxy | Thorlabs, NJ | G14250 | |
| vaseline | Sigma aldrich, MO | 16415 | sample sealing |
| lanolin | Sigma aldrich, MO | L7387 | |
| parafin wax | Sigma aldrich, MO | 327204 | |
| Immersion oil | Electron Microscopy Sciences, PA | 16915-04 | imaging. Cargille Type HF |
References
- Kanchanawong, P., Waterman, C. M. Localization-based super-resolution imaging of cellular structures. Methods Mol Biol. 1046, 59-84 (2013).
- Bertocchi, C., Goh, W. I., Zhang, Z., Kanchanawong, P. Nanoscale imaging by super resolution fluorescence microscopy and its emerging applications in biomedical research. Crit Rev Biomed Eng. 41, 281-308 (2013).
- Kanchanawong, P., Waterman, C. M. Advances in light-based imaging of three-dimensional cellular ultrastructure. Curr Opin Cell Biol. 24, 125-133 (2012).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys J. 91, 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3, 793-795 (2006).
- Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angew Chem Int Edit. 47, 6172-6176 (2008).
- Sharonov, A., Hochstrasser, R. M. Wide-field subdiffraction imaging by accumulated binding of diffusing probes. P Natl Acad Sci USA. 103, 18911-18916 (2006).
- Fölling, J., Bossi, M., Bock, H., Medda, R., Wurm, C. A., Hein, B., Jakobs, S., Eggeling, C., Hell, S. W. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat Methods. 5, 943-945 (2008).
- Biteen, J., et al. Single-moldecule active-control microscopy (SMACM) with photo-reactivable EYFP for imaging biophysical processes in live cells. Nat Methods. 5, 947-949 (2008).
- Shtengel, G., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. P Natl Acad Sci USA. 106, 3125-3130 (2009).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
- Dani, A., Huang, B., Bergan, J., Dulac, C., Zhuang, X. Super resolution imaging of chemical synapses in the brain. Neuron. 68, 843-856 (2010).
- Liu, J., et al. Talin determines the nanoscale architecture of focal adhesions. P Natl Acad Sci USA. 112 (35), E4864-E4873 (2015).
- Kanchanawong, P., et al. Nanoscale architecture of integrin-based cell adhesions. Nature. 468, 580-584 (2010).
- Wu, Y., Kanchanawong, P., Zaidel-Bar, R. Actin-delimited adhesion-independent clustering of e-cadherin forms the nanoscale building blocks of adherens junctions. Dev Cell. 32 (2), 139-154 (2015).
- Szymborska, A., et al. Nuclear Pore Scaffold Structure Analyzed by Super-Resolution Microscopy and Particle Averaging. Science. 341, 655-658 (2013).
- Lawo, S., Hasegan, M., Gupta, G. D., Pelletier, L. Subdiffraction imaging of centrosomes reveals higher-order organizational features of pericentriolar material. Nat Cell Biol. 14, 1148-1158 (2012).
- Mennella, V., Agard, D. A., Huang, B., Pelletier, L. Amorphous no more: subdiffraction view of the pericentriolar material architecture. Trends Cell Biol. 24, 188-197 (2014).
- Mennella, V., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence microscopy reveals a domain of the centrosome critical for pericentriolar material organization. Nat Cell Biology. 14, 1159-1168 (2012).
- Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463, 485-492 (2010).
- Salbreux, G., Charras, G., Paluch, E. Actin cortex mechanics and cellular morphogenesis. Trends Cell Biol. 22, 536-545 (2012).
- Shtengel, G., et al. Imaging cellular ultrastructure by PALM, iPALM, and correlative iPALM-EM. Method Cell Biol. 123, 273-294 (2014).
- Juette, M. F., et al. Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples. Nat Methods. 5, 527-529 (2008).
- Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging. Trends Cell Biol. 19, 555-565 (2009).
- Shannon, C. Communication in the presence of noise. Proc. IRE. 37, 10-21 (1949).
- Good, N. E., et al. Hydrogen ion buffers for biological research. Biochemistry. 5, 467-477 (1966).
- Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophys J. 94, 1826-1835 (2008).
- Shin, W. D., et al. Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. Goldman, R. D., Swedlow, J. R., Spector, D. L. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2010).
- Aquino, D., et al. Two-color nanoscopy of three-dimensional volumes by 4Pi detection of stochastically switched fluorophores. Nat Methods. 8, 353-359 (2011).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8, 1027-1036 (2011).
- Pertsinidis, A., Zhang, Y., Chu, S. Subnanometre single-molecule localization, registration and distance measurements. Nature. 466, 647-651 (2010).
- Baddeley, D., Cannell, M. B., Soeller, C. Visualization of Localization Microscopy Data. Microsc Microanal. 16, 64-72 (2010).
- El Beheiry, M., Dahan, M. ViSP: representing single-particle localizations in three dimensions. Nat Methods. 10, 689-690 (2013).
- Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nat Methods. 9, 152-158 (2012).
- Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics. Nat Methods. 5, 417-423 (2008).
- Yamashiro, S., et al. New single-molecule speckle microscopy reveals modification of the retrograde actin flow by focal adhesions at nanometer scales. Mol Biol Cell. 25, 1010-1024 (2014).
- Shroff, H., et al. Dual-color super resolution imaging of genetically expressed probes within individual adhesion complexes. P Natl Acad Sci USA. 104, 20308-20313 (2007).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346, (2014).
- Brown, T. A., et al. Super resolution fluorescence imaging of mitochondrial nucleoids reveals their spatial range, limits, and membrane interaction. Mol Cell Biol. 31, 4994-5010 (2011).
- Huang, F., et al. Video-rate nanoscopy using sCMOS camera-specific single-molecule localization algorithms. Nat Methods. 10, 653-658 (2013).
- Daostorm, S. DAOSTORM: an algorithm for high-density super-resolution microscopy. Nat methods. 8, 279 (2011).
- Zhu, L., Zhang, W., Elnatan, D., Huang, B. Faster STORM using compressed sensing. Nat Methods. 9, 721-723 (2012).
- Van Engelenburg, S. B., et al. Distribution of ESCRT machinery at HIV assembly sites reveals virus scaffolding of ESCRT subunits. Science. 343, 653-656 (2014).
- Vaughan, J. C., Jia, S., Zhuang, X. Ultrabright photoactivatable fluorophores created by reductive caging. Nat Methods. 9, 1181-1184 (2012).
