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Chemistry

Preparación y Published: December 4, 2016 doi: 10.3791/54776
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1MR Neuroimaging Agents, Max Planck Institute for Biological Cybernetics

Summary

Este protocolo describe la preparación y caracterización de un agente de contraste dendrimérica imágenes de resonancia magnética (MRI) que lleva a base cyclen-quelatos macrocíclicos de coordinación iones paramagnéticos de gadolinio. En una serie de experimentos de resonancia magnética en vitro, este agente produce una señal de MRI amplificado en comparación con el análogo monomérico disponible comercialmente.

Abstract

complejos paramagnéticos de gadolinio (III) con acíclico o quelatos macrocíclicos son los agentes de contraste más utilizados (CAS) para la formación de imágenes por resonancia magnética (MRI). Su propósito es mejorar la velocidad de relajación de protones del agua en el tejido, aumentando así el contraste de la imagen MR y la especificidad de las mediciones de resonancia magnética. Los agentes de contraste clínicamente aprobados actuales son moléculas de bajo peso molecular que se eliminan rápidamente del cuerpo. El uso de dendrímeros como portadores de quelantes paramagnéticas puede desempeñar un papel importante en el futuro desarrollo de agentes de contraste para MRI más eficientes. En concreto, el aumento de la concentración local de los resultados especie paramagnética en un mayor contraste de la señal. Además, esta CA proporciona un tiempo de retención de tejido más largo debido a su alto peso molecular y el tamaño. Aquí, se demuestra un procedimiento conveniente para la preparación de agentes de contraste macromoleculares de resonancia magnética a base de poli (amidoamina) (PAMAM) con monomacrocíclicos quelantes de tipo DOTA (DOTA - 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacetato). La unidad quelante se adjuntó explotando la reactividad del grupo isotiocianato (NCS) hacia los grupos de superficie amina del dendrímero PAMAM para formar puentes de tiourea. productos dendrímeros se purificaron y se analizaron por medio de espectroscopía de resonancia magnética nuclear, espectrometría de masas y análisis elemental. Por último, de alta resolución las imágenes de RM se registraron y se compararon los contrastes de señal obtenidos a partir de la dendrimérica preparados y los agentes monoméricos disponibles comercialmente.

Introduction

La resonancia magnética (RM) es una técnica de imagen de gran alcance y no ionizantes ampliamente utilizado en la investigación biomédica y el diagnóstico clínico debido a su naturaleza no invasiva y excelente contraste de los tejidos blandos intrínseca. Los métodos de resonancia magnética utilizados más comúnmente utilizan la señal obtenida a partir de los protones del agua, proporcionando imágenes de alta resolución e información detallada dentro de los tejidos en base a las diferencias en la densidad de las señales de agua. La intensidad de la señal y la especificidad de los experimentos de resonancia magnética se pueden mejorar aún más el uso de agentes de contraste (CAS). Estos son especies paramagnéticas o superparamagnéticas que afectan a la longitudinal (T 1) y transversal (T 2) tiempos de relajación, respectivamente 1,2.

Los complejos de gadolinio de iones lantánidos con ligandos de ácido poliamino policarboxílicos son los más comúnmente utilizados T 1 AC. Gadolinio (III) acorta la relajación T 1tiempo de protones del agua, lo que aumenta el contraste de la señal en la RM experimentos 3. Sin embargo, el gadolinio iónico es tóxico; su tamaño se aproxima al de calcio (II), y afecta seriamente calcio asistida señalización en las células. Por lo tanto, se emplean acíclicos y macrocíclicos quelatos para neutralizar esta toxicidad. Varios ligandos polidentados se han desarrollado hasta el momento, dando como resultado complejos de gadolinio (III) con alta estabilidad termodinámica e inercia cinética 1. Los basados ​​en los cyclen azamacrocycle de 12 miembros, en particular, su tetracarboxílico DOTA derivado (1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacetato) son los complejos más investigados y aplicados de esta clase CA.

Sin embargo, de tipo GdDOTA CAs son sistemas de bajo peso molecular, que presentan ciertas desventajas tales como la baja eficiencia de contraste y la excreción renal rápido. Macromolecular y multivalente entidades emisoras pueden ser una buena solución a estos problemas 4. Desde CA biodistribución está determinada principalmente por su tamaño, AC macromoleculares muestran tiempos de retención más largos dentro de los tejidos. Igualmente importante, la polivalencia de estos agentes da como resultado un aumento de la concentración local de la sonda monomérica MR (por ejemplo, complejo GdDOTA), mejorando sustancialmente la señal de MR adquirida y la calidad de la medición.

Los dendrímeros son algunos de los andamios más preferidos para la preparación de multivalente CAs para MRI 4,5. Estas macromoléculas altamente ramificadas con tamaños bien definidos son propensos a diversas reacciones de acoplamiento en su superficie. En este trabajo se reporta la preparación, purificación y caracterización de un dendrímero CA para la resonancia magnética que consiste en un poli 4 (G4) generación (amidoamina) (PAMAM) dendrímero acoplado a quelatos GdDOTA-como (DCA). Se describe la síntesis del derivado de DOTA reactivo y su acoplamiento al dendrímero PAMAM. Tras la formación de complejos con Gd (III), la caracterización físico-química estándar procedire de DCA se realizó. Por último, se realizaron experimentos de resonancia magnética para demostrar la capacidad de DCA para producir imágenes de RM con un contraste más fuerte que los obtenidos de bajo peso molecular CAs.

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Protocol

1. Preparación de DCA

  1. Síntesis de la unidad monomérica 4 6.
    1. Síntesis de 4- (4-nitrofenil) -2- (terc 4,7,10-tris- -butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10-tetraazaciclododec-1-il) éster de ácido butírico tert -butil (2).
      1. Disolver (terc 4,7-bis- -butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10-tetraaza-cyclododec-1-il) éster terc -butílico del ácido acético 1 (1,00 g, 1,94 mmol) en N, N-dimetilformamida ( DMF, 5 ml), añadir carbonato de potasio (0,67 g, 4,86 ​​mmol, 2,5 equiv.) y se agita la mezcla a temperatura ambiente durante 45 min.
        NOTA: Macrociclo 1 se preparó a partir cyclen y terc-butil bromoacetato de acuerdo con el procedimiento previamente publicado 7.
      2. Añadir terc-butil-2-bromo-4- (4-nitrofenil) butanoato de etilo (0,87 g, 2,53 mmol, 1,3 equiv.) En porciones durante 1 hr. Se continúa agitando la mezcla bajo tél mismas condiciones de reacción para los siguientes 18 horas.
        Nota: butil-2-bromo-4-terc-(4-nitrofenil) butanoato de etilo Se preparó a partir de 4- (4-nitrofenil) ácido butírico, cloruro de tionilo, y bromo de acuerdo con el procedimiento publicado previamente 8.
      3. Eliminar DMF por medio de destilación al vacío de bulbo a bulbo a 40-60 ° C 9.
      4. Se purifica el residuo por cromatografía en columna (gel de sílice, metanol al 7% / diclorometano) para obtener el producto 2 como un sólido amorfo de color marrón (1,09 g, 72%) 10.
    2. Síntesis de 4- (4-aminofenil) -2- (terc 4,7,10-tris- -butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10-tetraazaciclododec-1-il) éster de ácido butírico tert -butil (3).
      1. Se disuelve el derivado de nitrobenceno 2 (1,00 g, 1,28 mmol) en etanol (10 ml) y 7 N solución de amoniaco en metanol (150 l). Añadir paladio sobre carbón activado como catalizador (Pd / C, 150 mg, 15% en peso) a la solutien.
      2. Agitar la mezcla heterogénea durante 16 h bajo una atmósfera de hidrógeno (2,5 bar) en el aparato hidrogenador Parr.
      3. Preparar una torta de tierra de diatomeas suspendiéndolo en etanol y la filtración de la suspensión a través de un embudo de vidrio sinterizado. Se vierte la suspensión de la 1.1.2.2 sobre el pastel preparado para eliminar el catalizador Pd / C por filtración.
      4. Eliminar el disolvente por destilación suave en un evaporador rotativo (temperatura del baño de agua ~ 40 ° C) para obtener el compuesto 3 como un sólido amorfo de color marrón (0,91 g, 95%).
    3. Síntesis de 4- (4-isotiocianatofenil) -2- éster (4,7,10-tris- terc--butoxycarbonylmethyl 1,4,7,10- tetraazaciclododec-1-il) butírico tert -butil ácido (4).
      1. Añadir tiofosgeno (0,124 ml, 1,58 mmol, 1,3 equiv.) A una mezcla de 3 (0,91 g, 1,22 mmol) y trietilamina (0,685 ml, 4,87 mmol, 4 equiv.) En diclorometano (15 ml).
      2. Agite enérgicamente las millas de reacciónxture con un agitador magnético a temperatura ambiente durante 16 hr.
      3. Eliminar el disolvente por destilación suave en un evaporador rotativo (temperatura del baño de agua ~ 40 ° C) y, a continuación purificar el producto bruto por cromatografía en columna (gel de sílice, 5% de metanol / diclorometano) para obtener el producto 4 como un sólido marrón claro amorfo (0,51 g, 53%).
  2. Síntesis del dendrímero DCA.
    1. Síntesis del dendrímero 5.
      1. Tome dendrímero G4-PAMAM (667 mg, 10% de solución de dendrímero en metanol, 4,67 mmol), se evapora el metanol por destilación suave en un evaporador rotativo (temperatura del agua de baño ~ 40 ° C), y disolver el residuo en DMF (4 ml) .
      2. Se añade trietilamina (0,105 ml, 0,75 mmol, 160 equiv.), Se agita durante 45 min a 60 ° C, y añadir isotiocianato de 4 (354 mg, 0,45 mmol, 1,5 equiv. En relación con los grupos superficiales amino del dendrímero) ove porcionesr 1 hr.
      3. Se agita la mezcla de reacción con un agitador magnético a 45 ° C durante 48 hr.
      4. Se elimina el disolvente mediante destilación a vacío de bulbo a bulbo a 40-60 ° C.
      5. Se purifica el residuo por cromatografía de exclusión por tamaño usando un medio de filtración en gel lipofílico y metanol como eluyente. Para empaquetar la columna, se hinchan los medios de filtración en metanol durante al menos 3 horas a temperatura ambiente (> 4 ml de metanol por 1 g de polvo) sin aplicar presión. Realizar la separación por gravedad recogiendo fracciones de 1 ml.
      6. Analizar las fracciones recogidas con cromatografía en capa fina (TLC). Desarrollar la placa de TLC en metanol al 15% / diclorometano (sólo el lugar más polar se encuentra en la línea de base se deriva del producto dendrímero). Se evaporan las fracciones recogidas por destilación suave en un evaporador rotativo (temperatura del baño de agua ~ 40 ° C) para obtener el producto 5 (270 mg, 91%).
    2. Síntesis del dendrímero
    3. Disolver el quelante protegido dendrimérica 5 (270 mg, 4,23 mmol) en ácido fórmico (5 ml) y se agita la mezcla a 60 ° C durante 24 hr.
    4. Se evapora el ácido fórmico por destilación en un evaporador rotatorio (~ 15 mbar de presión, temperatura del baño de agua ~ 40 ° C) y liofilizar el producto para dar 6 (presión ~ 0,2 mbar) 9.
  3. Síntesis del agente de contraste dendrimérica (DCA)
    1. Disolver el quelante dendrimérica 6 (4,35 mol) en agua y ajustar el pH a 7,0 con hidróxido de sodio 0,1 M.
    2. Disolver GdCl 3 · 6H 2 O (113 mg, 304 mmol) en agua (1 ml) y agregarlo gota a gota a la solución de agente quelante 6 durante un período de 4 horas; mantener el pH a 7,0 con solución de hidróxido de sodio acuoso (0,05 M) mediante la medición de pH con un medidor de pH.
    3. Se agita la mezcla con un agitador magnético en la sala de tEMPERATURA durante 24 horas.
    4. Añadir ácido etilendiaminotetraacético (EDTA, 158 mg, 426 mmol) en porciones a la solución durante 4 horas para eliminar el exceso de Gd (III) mientras se mantiene el pH a 7,0 con solución de hidróxido de sodio acuoso (0,05 M). Se agita la mezcla a temperatura ambiente durante 24 hr.
    5. Se realiza una cromatografía de exclusión por tamaño para eliminar la mayoría de GdEDTA y el exceso de EDTA. Utilizar un medio de filtración en gel hidrófilo hinchado en agua para empacar la columna. Reducir la mezcla a un volumen adecuado y la carga de la columna. Eluir la columna con agua desionizada sin aplicar presión.
    6. Centrifugar la muestra usando una unidad de filtro centrífugo 3 kDa durante 30 min a 1.800 xg fuerza centrífuga para eliminar los residuos de GdEDTA y EDTA. Repita este paso (alrededor de cinco veces) hasta que el filtrado muestra la ausencia de EDTA y GdEDTA. Transferir la muestra a un matraz, se evapora, y luego liofilizar el disolvente para obtener un producto de color blanco como la final DCA (186 mg, 71%).
      Nota: Control de ausencia de EDTA y GdEDTA mediante ESI-MS.
    7. Confirmar la ausencia de Gd (III) como ion libre mediante la prueba de anaranjado de xilenol. Se disuelve el filtrado (0,5 ml) en una solución tampón de acetato (pH 5,8). Añadir unas gotas de una solución de naranja de xilenol y realizar un seguimiento del cambio de color (color amarillo o violeta indica la ausencia o presencia de libre Gd (III) los iones en solución, respectivamente) 11.

2. En Vitro Caracterización de los productos dendrimérica

  1. Estimación del número de unidades de DOTA-macrocíclicos acoplados al dendrímero PAMAM (carga del dendrímero con macrociclos DOTA-like)
    1. Estimación con 1 H NMR (NMR - espectroscopía de resonancia magnética nuclear).
      NOTA: Este procedimiento es posible en dendrímeros 5 y 6, pero no en DCA.
      1. Registre el espectro de RMN de 1H 12.
      2. Integrar la región aromática y las dos regiones separadas alifáticos (1. Las señales del dendrímero alifáticos y protones macrocíclicas, 2. las señales de los grupos t-Bu) o sólo una región alifático para dendrímeros 5 y 6, respectivamente.
        Nota: No hay señal separada en la región alifática se originó a partir de los grupos t-Bu en dendrímero 6 ya que se han hidrolizado.
      3. Utilice la ecuación. 1 o la Ec. 2 para estimar el número de unidades macrocíclicas (n), donde R = la relación de las integrales (alifáticos / aromáticos en la Ec. 1 o alifático-dendrímero / alifáticos t- Bu en la Ec. 2), H = DEND el número de protones en dendrímero, H Ar = número de protones aromáticos, H t Bu = número de protones en grupos t-Bu, y H mac = número de protones en un macrociclo.
        Nota: O Eq. 1 o la Ec. 2 se puede utilizar for dendrímero 5, mientras que sólo la ecuación. 1 puede ser utilizado para dendrímero 6. Desde protones intercambiables (en aminas, amidas, tioureas, o carboxilatos) son típicamente siendo sustituidos con deuterio, que no se asumieron en los cálculos. Aquí, H DEND se utilizaron = 1,128 (para 5) o 1000 (para 6), H Ar = 4, y H = 27 mac.
        Ecuación 1 (1)
        Ecuación 2 (2)
    2. Estimación del análisis elemental mediante el uso de la relación de nitrógeno a azufre.
      1. Realizar el análisis elemental de la muestra sólida dendrímero (DCA en este trabajo).
      2. Utilice la ecuación. 3 Para estimar el número de unidades macrocíclicas (n), donde R = la relación de determinados% N% y S, N o S DEND DEND = el número denitrógeno o átomos de azufre en el dendrímero, y N mac o S mac = el número de átomos de nitrógeno o de azufre en una unidad macrocíclico.
        Nota: El factor 2,29 se obtiene de la relación en masas atómicas de azufre y nitrógeno. En este trabajo, se utilizaron N DEND = 250, S DEND = 2, N = 5 mac, mac y S = 1.
        Ecuación 3 (3)
    3. Estimación con láser de tiempo de desorción / ionización asistida por matriz de vuelo (MALDI-TOF).
      1. Realizar el análisis MALDI-TOF MS 13.
      2. Calcular el número de unidades macrocíclicos (n) de acuerdo con la Ec. 4, en la que M z = la masa observada (m / z), z = la carga de la especie, M = DEND la masa de la parte dendrímero, y M mac = la masa de una unidad macrocíclico.
        NOTE: M DEND = 14.306 y M mac = 719 se utilizaron en este trabajo.
        Ecuación 4 (4)
  2. Determinación de la concentración de DCA ([DCA]): Bulk medición de susceptibilidad magnética (BMS)
    1. Disolver DCA (5-10 mg) en agua (360 l) en un tubo de vial de plástico ([DCA] ~ 5-10 mM).
      NOTA: [DCA] debe estar en el intervalo de 5-10 mM para evitar un posible solapamiento de resonancias BuOH t- en concentraciones de muestra> 15 mm, con la resonancia de agua a δ = 4,7 ppm.
    2. Añadir 60 l de D 2 O: t- mezcla BuOH (2: 1 v / v) a la solución acuosa de DCA y mezclar la solución resultante (420 l) usando un mezclador Vortex.
    3. Transferencia de 400 l de la muestra en un tubo de RMN exterior y colocar un tubo de RMN de inserción coaxial con un BuOH t-: H 2 O mezcla (10:90 v / v) en el tubo de muestra.
    4. Grabarel espectro de RMN 1 H y medir el desplazamiento de frecuencia entre las señales de resonancia que se derivan de t- BuOH en los tubos de RMN interior y exterior (referencia) 12.
    5. Utilice la ecuación. 5 para determinar el [DCA], donde T es la temperatura absoluta, Δχ = el cambio registrado, mu eff = el momento efectivo magnética para un ion lantánido (μ eff = 7,94 para el Gd (III) 14, y s = una constante dependiente de la forma de la muestra y su posición en el campo magnético (0, 1/3, y 1/6 en el caso de una esfera, cilindro paralelo a, y el cilindro perpendicular al campo magnético, respectivamente).
      NOTA: El valor calculado obtenido por la [DCA] debe corregirse para la concentración original debido a la adición de la D2O: t- solución BuOH (60 l).
      Ecuación 5 (5)
  3. La luz dinámicadispersión de las mediciones (DLS).
    1. Preparar una solución de DCA se filtró (filtro / PTFE 0,2 micras politetrafluoretileno, 0,75 mM por Gd (III)) en (2-hidroxietil) -1-piperazinetanosulfónico (HEPES) tampón de 4- (25 mM, pH 7,4) y la transfiere en una cubeta para la medición DLS.
    2. Colocar la cubeta en el aparato de DLS y establecer los siguientes parámetros: 5 repeticiones de 15 exploraciones (1 ciclo = 12 seg, índice de refracción = 1,345, absorción = 1%) sin retrasos en entre las exploraciones y con equilibrio de la temperatura 30 segundos antes de la grabación .
    3. Exportación de los datos adquiridos y obtener el histograma de distribución de tamaño por el trazado de la población (%) como una función del tamaño (diámetro hidrodinámico).
  4. Medición de las capacidades de relajación longitudinal y transversal.
    NOTA: Un procedimiento similar ya fue descrito utilizando el analizador de tiempo de relajación 15; este procedimiento se realizó usando un espectrómetro de RMN de 300 MHz con Topspinsoftware.
    1. Preparar un conjunto de soluciones de DCA en H2O: D2O (500 l, 10% de D 2 O en H 2 O, [DCA] = 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5 y 5,0 mM, [HEPES ] = 25 mM) de la muestra Stock DCA (ver sección 2.2).
    2. Transferir 450 l de solución en un tubo de RMN y colocarlo en el instrumento.
    3. Optimizar los parámetros de adquisición (duración 90 ° impulso de excitación (P1), y la irradiación desplazamiento de frecuencia (O 1)) y luego realizar la T 1 y T 2 experimentos usando la recuperación de la inversión (RI) y Car-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG ) secuencias de pulsos, respectivamente.
    4. Determinación de los tiempos T 1 y T 2 de relajación.
      1. Seleccione la medición registrada, el proceso del espectro 2D en la dimensión F2, y llevar a cabo la corrección de fase interactiva.
      2. Seleccione la división apropiada (pico con la máxima intensidad) en el Análisis / T 2 ventana de relajación, integrarlo, y exportar la región al módulo de relajación.
      3. Seleccione la función apropiada de ajuste (invrec o uxnmrt2 para experimentos de IR y CPMG, respectivamente) para obtener los tiempos de relajación T1 o T2.
    5. Repita los pasos 2.4.4.2-2.4.4.4 para todos los restantes [DCA] soluciones.
    6. Calcula las velocidades de relajación (R1 y R2) a partir de los valores obtenidos T 1 (R 1,2 = 1 / T 1,2).
    7. Parcela R 1 y R 2 (seg -1) como una función de la concentración de Gd (III) en mM.
    8. Determinar las capacidades de relajación longitudinal y transversal, R1 y R2 (s-1 mM -1), a partir de la pendiente de la recta de ajuste, tal como se define por la ecuación. 6, donde R i, obs = la longitudinal (i = 1) o transversal (i = 2) velocidad de relajación de diamagnéticoagua en ausencia de especies paramagnéticas y [Gd] = la concentración de Gd (III) usado en el experimento.
      Ecuación 6 (6)

3. En Vitro MRI; Comparación entre el DCA y GdDOTA

  1. Preparación de fantasmas de tubo
    1. Preparar soluciones acuosas de DCA (4 x 350 l) y GdDOTA (4 x 350 l), así como muestras de agua (4 x 350 l) para dos conjuntos de experimentos en los que se calcula la concentración de los agentes de contraste: (3.1.1.1) por Gd (III) o (3.1.1.2) por molécula.
      1. Se preparan dos muestras de DCA y dos GdDOTA muestras con concentraciones de 0,5 y 1,0 mm por Gd (III), respectivamente. Además, preparar dos muestras de agua (como tubos de control).
      2. Preparar dos muestras DCA (2,5 y 5,0 mM por Gd (III) o 0,05 y 0,1 mM por molécula dendrimérica), dos muestras GdDOTA (0,25, 0,5 mM) y dos muestras de agua (controtubos L).
        NOTA: Las concentraciones apropiadas DCA y GdDOTA deben ser preparados mediante la dilución de las muestras respectivas acciones con concentraciones determinadas por el método de BMS (ver sección 2.2) con tampón HEPES (pH 7,4). Con el fin de simplificar los cálculos, n = 50 se supuso para el número medio de unidades de macrocíclicos por molécula de dendrímero. Por lo tanto, la relación de DCA: GdDOTA era 1: 5, calculado sobre una base por molécula.
    2. Colocar las muestras en 300 tubos vial de plástico mu l, evitando la presencia de burbujas de aire en la solución.
      NOTA: El tamaño de los tubos vial de plástico depende del tipo y el tamaño de la bobina de radiofrecuencia utilizado (aquí, se da un ejemplo con la bobina de volumen).
    3. Inserte las muestras dentro de una jeringa (60 ml de volumen), llenarlo con GdDOTA 1 mM solución, y lo coloca en el escáner.
      Nota: Las muestras se colocaron en la solución acuosa de GdDOTA para evitar los efectos de susceptibilidad (variaciones en el campo magnético strength que se producen cerca de interfaces entre las sustancias de diferente susceptibilidad magnética).
  2. Optimización de parámetros y de imagen.
    1. Utilice la exploración anatómica (Localizador / TriPilot) a la posición de la jeringa con las muestras en el isocentro del imán.
    2. Pulse el semáforo (exploración de ajuste) para realizar ajustes de cuñas (ajuste de la homogeneidad del campo magnético) de todo el volumen, la frecuencia central (O 1), la ganancia del receptor (RG), y la ganancia de transmisión (TX0 y TX1).
    3. Para T1-ponderada (T 1w) de imágenes, seleccione el método rápido de bajo ángulo de disparo (FLASH).
    4. Elija corte coronal de las muestras colocadas en vertical (horizontal) de la jeringa en el escáner utilizando el escaneo del localizador.
    5. Utilice la ecuación. 7 para la optimización de la adquisición de contraste a ruido (CNR) Parámetro 16, donde α = el ángulo de inclinación, TE = el tiempo de eco, TR =el tiempo de repetición, y T 1, A, T 1, B = T 1 veces de la muestra A (T 1, A) y la muestra B (T 1, B) para los que el CNR debe maximizarse (lo mismo es válido para T 2 veces: T 2, A y T 2, B).
      NOTA: T 1 y T 2 tiempos de relajación se debe establecer en valores obtenidos de las mediciones de capacidades de relajación longitudinal y transversal (sección 2.4), mientras que TE, TR, y α debe ser obtenida del cálculo de optimización CNR.
      Ecuación 7 (7)
    6. Adquirir la imagen utilizando los parámetros obtenidos en el paso anterior (3.2.5).
    7. Se calcula la relación de señal a ruido (SNR).
      1. Cargar la imagen T 1w adquirida (escanear) en la pantalla y procesamiento de imágenesventana, y haga clic en Definir región de interés (ROI).
      2. Elija un ROI circular y dibujarlo en la posición de la muestra y el fondo. Posteriormente, haga clic en la pantalla para obtener la amplitud media de la señal (S señal) y la desviación estándar de la de fondo (ruido S).
      3. Repita el paso 3.2.7.2 para la DCA, GdDOTA, y las muestras de agua.
      4. Calcular la SNR mediante la fórmula: SNR = señal S / S ruido.
    8. Siguiendo un procedimiento ligeramente modificado, realice 2-ponderada de imágenes T (T 2w) utilizando el método de mejora rápida adquisición de relajación (RARE) con. Para la optimización de los parámetros de adquisición de CNR, utilizar la ecuación. 8.
      Ecuación 8 (8)

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Representative Results

La preparación de DCA consistía en dos etapas: 1) la síntesis del quelante monomérica de tipo DOTA (Figura 1) y 2) de acoplamiento del quelante con el dendrímero G4 PAMAM y la posterior preparación del Gd dendrimérica (III) (Figura 2) . En la primera etapa, se preparó una de tipo DOTA quelante basado en cyclen que contiene cuatro ácidos carboxílicos y un grupo ortogonal adecuado para otras modificaciones sintéticas. La preparación comenzado desde 1 (DO3A- éster terc -butil) 7, que se alquiló con terc butil 2-bromo-4- (4-nitrofenil) butanoato de 8 para proporcionar DOTA-derivado 2. La hidrogenación catalizada por paladio reduce el grupo nitro aromático en 2 para producir la anilina 3. La conversión de 3 con tiofosgeno resultó en la isotiocianato de 4, which se utilizó anteriormente como un agente reactivo con amina para la preparación de dendrimérica CAs 17.

En la etapa siguiente, el macrociclo 4 se utilizó como unidad monomérica básica en una reacción de acoplamiento con el dendrímero PAMAM G4 disponible comercialmente. Los grupos superficiales amina del dendrímero reaccionan con los grupos isotiocianato del monómero 4 en presencia de una base. El exceso de 4 se eliminó mediante cromatografía de exclusión por tamaño usando un medio de filtración en gel lipofílico con metanol como eluyente. Los ésteres de terc -butilo en el conjugado obtenido dendrímero macrocíclico 5 se hidrolizaron con ácido fórmico para producir 6, que después se liofilizó y se usó en la siguiente etapa sin purificación. La formación de Gd (III) de los macrociclos de tipo DOTA se realizó mediante la adición de GdCl 3 · 6H 2 O a una solución acuosa of 6 mientras se mantiene el pH a aproximadamente 7. El exceso de Gd (III) se compleja con un ácido etilendiaminotetraacético quelante común (EDTA). El EDTA complejo y el exceso de GdEDTA se elimina del sistema por cromatografía de exclusión por tamaño usando un medio de filtración de gel hidrófilo con agua como eluyente. Las impurezas de pequeño tamaño restantes se retiraron de la solución por centrifugación utilizando 3 unidades de filtración centrífuga kDa.

Después de la síntesis de los conjugados de dendrímero-macrociclo, un enfoque analítico combinado se ha empleado para caracterizar los productos. Para determinar la ocupación de superficie-amina de 5 y 6, se han analizado los espectros de 1H RMN. Los resultados se compararon y se confirmó con el producto final (DCA), donde la carga del dendrímero con macrociclos se ha estimado usando el análisis elemental y espectrometría de masas MALDI-TOF (Figura3). Una combinación de estos tres métodos resultó en un promedio de 49 unidades macrocíclicos que se conjuga con el dendrímero G4, que corresponde a ~ 75% de ocupación grupo de superficies de amina.

Además de la caracterización del complejo dendrimérica incluye la determinación de los valores de capacidad de relajación, lo que resulta en 6,2 ± 0,1 mM -1 s -1 por Gd (III) (o más o menos alrededor de 300 mM -1 s -1 por dendrímero) para la capacidad de relajación longitudinal y 30,5 ± seg 0,6 mM -1 -1 por Gd (III) (casi 1.500 seg mM -1 -1 por dendrímero) para la capacidad de relajación transversal. Mediciones DLS indicaron un diámetro hidrodinámico de 7,2 ± 0,2 nm para DCA (Figura 4).

Por último, para demostrar el efecto del agente de contraste MRI dendrimérica, la RM se realizó en dos conjuntos de fantasmas con DCA y la clínicaaliado disponibles GdDOTA para la comparación (Figura 5). El primer conjunto de fantasmas se prepararon para el propósito de la comparación de estos dos agentes de contraste a concentraciones idénticas Gd (III), mientras que el segundo conjunto fue diseñado para demostrar el efecto a concentraciones de moléculas comparables de los agentes de contraste dendrímeros y monoméricas, respectivamente.

Figura 1
Figura 1: Síntesis de la macrocíclico DOTA de tipo quelante 4. Reactivos, condiciones y aisladas se obtiene: (i) terc butil 2-bromo-4- (4-nitrofenil) butanoato, K 2 CO 3, DMF, 45 ° C , 16 h, 72%; (ii) H 2, Pd / C, EtOH, RT, 16 h, 95%; (iii) CsCl 2, Et3N, RT, 2 h, 53%. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta fi gura.

Figura 2
Figura 2: Síntesis del agente de contraste de MRI dendrimérica DCA Reactivos y condiciones: (i) 4, Et 3 N, DMF, 45 ° C, 48 h, 91%;. (Ii) ácido fórmico, 60 ° C, 24 hr, cuant; (iii) GdCl3 ∙ 6H 2 O, pH 7,0, RT, 24 h, 71%. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3:. La caracterización del producto dendrimérica por medio de MALDI-TOF espectrometría de masas un espectro de masas MALDI-TOF típico obtenido para DCA.rget = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4:.. La caracterización del producto dendrímero mediante dispersión dinámica de luz (DLS) DLS medición de DCA (HEPES, pH 7,4) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5: En experimentos in vitro de resonancia magnética el tubo fantasmas en 7 campo magnético T (a, b) T1-ponderada y (c, d) T2 y resonancia magnética de DCA y GdDOTA.. Cada experimento se realizó con MRI dos concentraciones diferentes de agente de contraste: (a, c) con Gd comparable (III) concentraciones (HEPES, pH 7,4); (B, d) con un DCA: coeficiente de concentración GdDOTA de 1: 5 (HEPES, pH 7,4). Las concentraciones se expresan por molécula y los valores de SNR se muestran entre paréntesis. Los parámetros utilizados en estos experimentos fueron: campo de visión (FOV) = 40 x 40 mm 2, grosor de corte = 0,5 mm, número de excitaciones (NEX) = 30; (A) el tamaño de la matriz (MTX) = 256 x 256, tiempo de repetición (TR) = 100 ms, tiempo de eco (TE) = 2,95 ms, ángulo de inclinación (FA) = 90 °, el tiempo de adquisición (TA) = 12 min 48 seg ; (B) MTX = 256 x 256, TR / TE = 20 / 2.95 ms, FA = 90 °, TA = 2 min 34 seg; (C) MTX = 512 x 512, TR / TE = 10.000 / 130 ms, factor poco comunes (RF) = 16, TA = 26 min 40 seg; (D) MTX = 512 x 512, TR / TE = 10000/100 mseg, RF = 16, TA = 26 min 40 sec.776fig5large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Preparación del agente de contraste de MRI dendrimérica requiere la selección apropiada de la unidad monomérica (es decir, el quelante de Gd (III)). Reducen la toxicidad de este ion paramagnético y, hasta la fecha, una gran variedad de acíclicos y quelantes macrocíclicos sirven para este propósito 1-3. Entre estos, macrocíclicos quelantes de tipo DOTA poseen la más alta estabilidad termodinámica e inercia cinética y, por lo tanto, son la opción más preferido para la preparación de agentes de contraste de MRI inerte 1,18. Además, son propensos a diversas transformaciones sintéticas, que resultan en quelantes bifuncionales, capaces de ligarse a diversas moléculas funcionales (por ejemplo, vectores de abordaje o nano-portadores) mientras que todavía formando estable Gd (III) 19. Para este fin, la unidad monomérica de tipo DOTA se describe en este procedimiento se preparó a partir de éster terc -butil DO3A-, el precursor común y fácilmente disponibles, y el derivado de bromuro deel (4-nitrofenil) butanoico ácido 4-. Esta molécula se deriva de DOTA y posee una estructura similar a coordinar Gd (III). La modificación sintética tiene como objetivo hacer de este quelante propenso a reacciones de acoplamiento a diversas moléculas funcionales y transportistas. A saber, la preparación de los resultados de moléculas de DOTA-modificado en un quelante todavía con cuatro grupos carboxílicos disponibles para la coordinación a Gd (III) para formar un complejo inerte y un grupo nitrofenilo ortogonal, que después de la conversión se une este quelante a la superficie del dendrímero. Este procedimiento también permite la flexibilidad en la elección del grupo reactivo ortogonal (por ejemplo, NH2 o COOH), que puede servir para acoplar el quelante de Gd (III) a un soporte deseado de una manera preferida.

El quelante bifuncional obtenido se puede acoplar a otras moléculas de dos formas diferentes (es decir, procedimientos sintéticos). Cuando el grupo nitro se reduce a un grupo amino, la anilina resultante bajo puedeir a una reacción de condensación con el grupo ácido carboxílico de la otra molécula 8. Por otra parte, un grupo funcional amina primaria aromática en presencia de tiofosgeno se puede convertir fácilmente en un isotiocianato, un grupo que reacciona fácilmente con aminas en disolventes orgánicos polares, así como el agua, que ofrece más posibilidades de reacción para el acoplamiento de unidades monoméricas a dendrímeros 17 , 20,21.

Para acoplar el quelante bifuncional a la portadora dendrimérica, un andamio dendrimérica apropiado debe ser seleccionado. Varios factores relacionados con la estructura del dendrímero conjugado final y la aplicación deseada, debe ser contabilizado en este paso. Debido a la amplia disponibilidad comercial de las compañías dendrímeros, productos con diferentes estructuras de núcleo, los grupos reactivos de la superficie, o generaciones pueden ser elegidos. En consecuencia, la reacción de conjugación dependerá del grupo de la superficie del dendrímero y el grupo ortogonal del quelante, mientras que elconjugado final puede ser neutra, cargada, o tienen diferentes tamaños (hasta el 15-20 nm, dependiendo de la generación del dendrímero) 22. Todos estos aspectos deben tenerse en cuenta antes de preparar el CA dendrimérica, ya que pueden afectar a la solubilidad, capacidad de relajación (mejora de la señal MRI), la difusión, y otras propiedades farmacocinéticas del agente de contraste, lo que potencialmente pueden poner en peligro su aplicación en MRI. Por ejemplo, dendrímeros catiónicos pueden exhibir toxicidad en los sistemas biológicos. Sin embargo, este efecto se puede reducir mediante la conjugación de grupos cargados negativamente en la superficie del dendrímero, reduciendo así su carga global positiva 23.

En este protocolo, hemos preparado el agente de contraste dendrimérica DCA usando el procedimiento en el que el grupo isotiocianato del macrociclo monomérica 4 se acopló a un cistamina-core-G4 PAMAM comercial equipado con 64 grupos de superficie de amina primaria. La purificación inicial de la hydrophOBIC producto dendrimérica 5 se realizó por cromatografía en gel utilizando una columna con un medio de filtración en gel lipofílico y metanol como el eluyente, a fin de eliminar la mayor parte de las unidades monoméricas que no han reaccionado. La hidrólisis de ésteres de t-butilo con ácido fórmico es sencillo, lo que resulta en un producto dendrimérica soluble en agua que puede ser purificado con cromatografía de exclusión por tamaño usando un medio de filtración de gel hidrófilo. La complejación de los quelantes multiméricas y dendrímeros con Gd (III) se llevó a cabo mientras se mantiene la solución a un pH neutro con el fin de facilitar la formación de complejos. De lo contrario, la complejación de Gd (III) (añadido en forma de sal de cloruro) reduce el pH, lo que frena la reacción. Por último, es de destacar que los grupos amina en el núcleo dendrímero también tienden a coordinar con Gd (III), pero sólo con el exceso que no podía ser quelado con las unidades de DOTA. Evitar la presencia de Gd (III) fuera del quelante DOTA es esencial, ya que leAkage de Gd (III) de la entidad emisora ​​puede tener efectos no deseados; es decir, puede inducir la toxicidad in vivo 18. El exceso de Gd (III) se puede quitar con eficacia por formación de complejos con EDTA seguido de ultrafiltración de GdEDTA y EDTA gratis con 3 kDa de peso molecular de corte (MWCO) filtros. filtros MWCO más bajas podrían ser utilizados cuando los conjugados dendrímeros tienen pesos moleculares más bajos.

Hay dos grandes temas de solución de problemas relacionados con la preparación de DCA. Debido al gran efecto de ampliación de Gd (III) en las señales de RMN, el análisis de DCA mediante espectroscopia de RMN no es informativo. En lugar de ello, este análisis debe realizarse en los pasos anteriores (compuestos 5 y 6). A continuación, la conjugación de unidades monomacrocyclic a la superficie del dendrímero no se logra con la conversión de 100%, pero es probable que sea entre 50 a 90% (ver más abajo). Típicamente, los rendimientos de la reacción se puede aumentar mediante la adición de una segunda porción de la monomeric unidad reactiva después de la primera conjugación del dendrímero y la unidad monomérica se completa 24. Sin embargo, cada preparación de lotes resultados en algo diferentes números medios de los quelantes conjugados en la superficie del dendrímero, incluso cuando se utilizan idénticas unidades de dendrímero y DOTA como materiales para acoplamiento. A pesar de que la cantidad final de Gd (III) presente en DCA se puede determinar de forma independiente a través del método BMS (ver sección 2.2), para una mejor caracterización de conjugados de dendrímeros, es necesario llevar a cabo la estimación de unidades monoméricas unidas cada vez que un nuevo lote de DCA se prepara (ver 2.1 y la discusión más adelante).

La caracterización analítica de los productos dendrímeros aislados se puede realizar por medio de espectroscopia 1 H NMR (sólo en los productos 5 y 6), análisis elemental y MALDI-TOF MS. Los rendimientos típicos para la conversión de grupos superficiales amino se encuentran entre 50 a 90%, dependiendo de las Generati dendrímeroen, el tipo de agente quelante, y las condiciones de reacción utilizadas (disolvente y temperatura) 6,20,24,25. En este caso particular, las masas calculados obtenidos de los análisis combinados corresponden a un promedio de 49 quelatos monoméricos ser acoplado al dendrímero (es decir, ~ 75% de ocupación de las aminas de la superficie dendrímero). Aunque una ligera falta de coincidencia en el número final de los grupos amino han reaccionado se podía esperar entre estas metodologías 25, su comparación directa proporciona evidencia razonable para la formación de la DCA deseada con un número medio particular de unidades quelantes adjuntos.

La caracterización in vitro con el objetivo de evaluar el potencial de DCA para mejorar el contraste en MRI experimentos consistió en DLS, relaxometric, y los experimentos de resonancia magnética. El diámetro hidrodinámico de DCA se determinó que era 7,2 ± 0,2 nm por mediciones DLS, que está de acuerdo con conjugados se informó anteriormente de este tipocon la generación G4 PAMAM 4 dendrímeros 26. Determinación de la capacidad de relajación longitudinal de DCA siguió el procedimiento descrito anteriormente 15 y reveló el valor de 6,2 ± 0,1 mM -1 s -1 por Gd (III). Alrededor del 50% de la mejora en el r 1 de paramagnético Gd (III) en DCA con relación a moléculas de pequeño tamaño de un tipo similar (por ejemplo, GdDOTA) puede explicarse con el tamaño intermedio del agente de contraste dendrimérica. A saber, la reducción del movimiento de los quelatos de Gd unido a la superficie del dendrímero aumenta el tiempo de correlación rotacional y, por tanto, r 1; este efecto todavía se puede observar en los altos campos magnéticos para los agentes más pequeños de tamaño nanométrico. De lo contrario, el aumento del tiempo de correlación rotacional contribuye predominantemente a r 1 mejora en los campos magnéticos de baja 27. Por otro lado, el tamaño del agente de contraste dendrimérica tenía un efecto pronunciado sobre la rela transversalxivity 28, lo que resulta en el valor de 30,5 ± 0,6 mM -1 s -1 por Gd (III). En resumen, los métodos para la evaluación in vitro de DCA son sencillos y requieren una preparación cuidadosa de la muestra solamente, por lo que no se prevén dificultades en la adquisición de datos y el análisis de los resultados.

Para demostrar la eficacia del agente de contraste dendrimérica y su poder de afectar el contraste de la imagen, hemos realizado experimentos de resonancia magnética en fantasmas tubo con el agente de contraste recién preparado DCA. También usamos una solución de un agente de contraste MRI comercialmente disponible y aprobado clínicamente, GdDOTA, como comparación y los tubos con agua como control. En la primera T 1 ponderadas experimento MRI, cuando se utilizaron concentraciones iguales de Gd (III) (0,5 o 1 mM de Gd (III) en DCA o GdDOTA), la SNR en los tubos con DCA era ya hasta un 12% más alto debido a un aumento de alrededor de 50% en capacidad de relajación longitudinal de DCA en comparación con GdDOTA (Figura 5a). El segundo experimento T 1 MRI ponderadas fue diseñado para demostrar el efecto de DCA, cuando se calcularon las concentraciones por molécula. Aunque se aplicó 5 veces menos en comparación con DCA GdDOTA (50 vs. 250 M o 100 vs. 500 M DCA vs. GdDOTA, respectivamente), una alta carga de DCA con Gd (III) resultó en un incremento significativo en el contraste de la imagen, que a su vez dio como resultado los valores de SNR observadas ser al menos tres veces mayor en los tubos de fantasmas llenos de DCA. Como era de esperar, tanto T2 y experimentos de resonancia magnética mostraron grandes diferencias (3-20 veces) en la SNR entre los tubos llenos de fantasmas DCA y GdDOTA.

En conclusión, este protocolo describe una preparación conveniente de un dendrímero CA para la resonancia magnética usando procedimientos sintéticos comunes para proporcionar DCA con propiedades mejoradas en comparación con las entidades emisoras de pequeño tamaño. exposiciones DCA prefieren estabilidad termodinámica e inercia cinética cuando se comparaa sus análogos monoméricos CA. Sin embargo, la multivalencia de DCA y, por lo tanto, la alta concentración local de la especie paramagnética en la región diana induce alto contraste en las imágenes de RM. Teniendo en cuenta las propiedades farmacocinéticas a menudo preferible (por ejemplo, tiempo más largo tejido de retención) en comparación con sus análogos CA monoméricos, o la capacidad para llevar a funcionalidades adicionales (por ejemplo, vectores dirigidos), estos conjugados dendrímeros-macrociclo representan una clase prometedora y valiosa de agentes de contraste para diversos MRI futuro y aplicaciones de formación de imágenes moleculares.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cyclen CheMatech C002
tert-Butyl bromoacetate  Alfa Aesar A14917
N,N-Dimethylformamide Fluka 40248
Potassium carbonate Sigma-Aldrich 209619
4-(4-Nitrophenyl)butryic acid Aldrich 335339
Thionyl chloride  Acros Organics 382662500 Note: Corrosive substance; toxic if inhaled
Bromine Acros Organics 402841000 Note: causes severe skin burns, fatal if inhaled 
Diethyl ether any source
Sodium sulphate Acros Organics 196640010
Chloroform  VWR Chemicals 22711.29
tert-Butyl 2,2,2-trichloroacetimidate Aldrich 364789 Note: flammable substance; irritrant to skin and eyes
Boron trifluoride etherate Acros Organics 174560250 48% BF3. Note: Flammable substance; causes skin burns, fatal if inhaled
Sodium bicarbonate Acros Organics 424270010
Ethyl-acetate any source For column chromatography
n-Hexane any source For column chromatography
Bulb-to-bulb (Kugelrohr) distillation apparatus Büchi Model type: Glass oven B-585
Silicagel Carl Roth GmbH P090.2
Methanol any source For column chromatography
Dichloromethane  any source For column chromatography
Ethanol VWR Chemicals 20821.296
Ammonia Acros Organics 428381000 7 N Solution in Methanol
Palladium Aldrich 643181 15% wet
Hydrogenation apparatus PARR PARR Instrument Company
Celite 503 Aldrich 22151
Sintered glass funnel any source
Thiophosgen Aldrich 115150 Note: irritrant to skin; toxic if inhaled
Triethylamine Alfa Aesar A12646
Dichloromethane  Acros Organics 348460010 Extra dry 
Magnetic stirrer any source
PAMAM G4 Dendrimer Andrews ChemService AuCS - 297 10% wt. solution in MeOH
Lipophylic Sephadex LH-20 Sigma LH20100
Thin-layer chromatography plates Merck Millipore 1.05554.0001
Formic acid VWR Chemicals 20318.297
Lophylizer  any source
Gadollinium(III) chloride hexahydrate Aldrich G7532
Sodium hydroxide Acros Organics 134070010
pH meter any source
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate Aldrich E5134
Mass spectrometer (ESI) Agilent Ion trap SL 1100 
Acetate buffer any source pH 5.8
Xylenol orange Aldrich 52097 20 μM in acetate buffer
Hydrophylic Sephadex G-15 GE Healthcare 17-0020-01
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit Merck Millipore UFC900324 Ultracel-3 membrane (MWCO 3000)
Centrifuge any source
NMR spectrometer  Bruker Avance III 300 MHz
Topspin Bruker Version 2.1
Combustion analysis instrument EuroVector SpA EuroEA 3000 Elemental Analyser 
MALDI-ToF MS instrument Applied Biosystems Voyager-STR
Deuteriumoxid Carl Roth GmbH 6672.3
tert-Butyl alcohol Carl Roth GmbH AE16.1
Vortex mixer any source
Norell NMR tubes Deutero GmbH 507-HP-7
NMR coaxial tube Deutero GmbH coaxialb-5-7
DLS instrument Malvern Zetasizer Nano ZS
0.20 μm PTFE filter  Carl Roth GmbH KC94.1
HEPES Fisher BioReagents BP310
Plastic tube vials any source
Dotarem Guerbet NDC 67684-2000-1
MRI scanner Bruker BioSpec 70/30 USR magnet (7 T). Note: potential hazards related to high magnetic fields
RF coil Bruker Dual frequency volume coil (RF RES 300 1H/19F 075/040 LIN/LIN TR)
Paravision (software) Bruker Version 5.1

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References

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