Summary
Este protocolo descreve a preparação e caracterização de um agente de contraste dendrimérico ressonância magnética (MRI), que transporta os quelatos macrocíclicos baseados-ciclen coordenação iões paramagnéticos gadolínio. Numa série de experiências de ressonância magnética in vitro, este agente produzido um sinal de ressonância magnética amplificado quando em comparação com o análogo monomérico comercialmente disponível.
Abstract
complexos paramagnéticos de gadolínio (III) com acíclico ou quelatos macrocíclicos são os agentes de contraste mais comumente utilizados (CAS) para imagens de ressonância magnética (MRI). O seu objectivo é melhorar a taxa de relaxação dos protões da água no tecido, aumentando assim o contraste da imagem MR e a especificidade das medições de ressonância magnética. agentes de contraste actuais clinicamente aprovados são moléculas de baixo peso molecular que são rapidamente eliminados do corpo. O uso de dendrímeros como transportadores de agentes quelantes paramagnéticas podem desempenhar um papel importante no desenvolvimento futuro de agentes mais eficazes de contraste para IRM. Especificamente, o aumento na concentração local das espécies paramagnéticas resultados em um sinal de contraste mais elevado. Além disso, esta CA fornece um tempo de retenção mais longo do tecido devido ao seu elevado peso molecular e tamanho. Aqui, demonstramos um processo conveniente para a preparação de agentes de contraste macromoleculares de MRI à base de poli (amidoamina) (PAMAM) dendrímeros com monomacrocíclicos do tipo quelantes DOTA (DOTA - 1,4,7,10-tetra-azaciclododecano-1,4,7,10-tetra-acetato). A unidade quelante foi anexado ao explorar a reactividade do grupo isotiocianato (NCS) para os grupos amina na superfície do dendrímero PAMAM para formar pontes de tioureia. dendriméricos produtos foram purificados e analisados por meio de espectroscopia de ressonância magnética nuclear, espectrometria de massa e análise elementar. Finalmente, as imagens de RM de alta resolução foram registados e os contrastes sinal obtido a partir do dendrimérico preparada e os agentes monoméricos disponíveis comercialmente foram comparados.
Introduction
A ressonância magnética (MRI) é uma técnica de imagem poderosa e não-ionizante amplamente utilizado na investigação biomédica e diagnóstico clínico devido à sua natureza não invasiva e excelente contraste de tecidos moles intrínseco. Os métodos de ressonância magnética mais comumente utilizados utilizar o sinal obtido a partir de protões da água, fornecendo imagens de alta resolução e a informação detalhada dentro dos tecidos com base em diferenças na densidade dos sinais de água. A intensidade do sinal e a especificidade das experiências de ressonância magnética pode ser ainda melhorada utilizando agentes de contraste (CAs). Estas espécies são paramagnéticos ou superparamagnéticos que afectam o longitudinal (T1) e transversal (T2) dos tempos de relaxação, respectivamente 1,2.
Complexos do gadolínio lantanídeos íon com poliaminoácidos ligandos de ácidos policarboxílicos são as mais comumente usadas T 1 CAs. Gadolínio (III) encurta o t um relaxamentotempo dos protões da água, aumentando assim o contraste do sinal em MRI experiências 3. No entanto, o gadolínio iónico é tóxico; o seu tamanho, que se aproxima de cálcio (II), e isto afecta gravemente a sinalização em células assistida-cálcio. Portanto, acíclicos e macrocíclicos quelatos são empregadas para neutralizar esta toxicidade. Vários ligandos multidentados têm sido desenvolvidos até ao momento, resultando em complexos de gadolínio (III) com elevada estabilidade termodinâmica e inércia cinética 1. Aqueles com base nos ciclen azamacrocycle de 12 membros, em particular, o seu derivado de DOTA tetracarboxílico (1,4,7,10-tetrazaciclododecano-1,4,7,10-tetra-acetato) são os complexos mais investigados e aplicadas desta classe CA.
No entanto, GdDOTA tipo CAs são sistemas de baixo peso molecular, exibindo certas desvantagens, como a baixa eficiência de contraste e excreção renal rápido. Macromolecular e multivalente CAs pode ser uma boa solução para estes problemas 4. Desde CA biodistribução é determinada principalmente pelo seu tamanho, CAs macromoleculares exibir tempos de retenção muito mais longos dentro dos tecidos. Igualmente importante, o multivalência destes agentes resulta em uma concentração local aumentada da sonda monomérica MR (por exemplo, complexo GdDOTA), melhorando substancialmente o sinal MR adquirida ea qualidade da medição.
Dendrímeros estão entre os andaimes mais preferidos para a preparação de CAs multivalente de MRI 4,5. Estas macromoléculas altamente ramificada, com dimensões bem definidas são propensos a várias reacções de acoplamento na sua superfície. Neste trabalho, relatamos a preparação, purificação e caracterização de uma CA dendrimérico para MRI consistindo de um 4 (G4) poli geração (amidoamina) (PAMAM) dendrimer acoplado a quelatos GdDOTA-like (DCA). Descreve-se a síntese do derivado de DOTA reactivo e o seu acoplamento ao dendrímero PAMAM. Após complexação com Gd (III), a caracterização físico-química padrão procedure da DCA foi realizada. Finalmente, as experiências de MRI foram realizadas para demonstrar a capacidade de DCA para produzir imagens de RM com um contraste mais forte do que os obtidos a partir de baixo peso molecular CAs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparação de DCA
- Síntese da unidade monomérica 4 6.
- Síntese de 4- (4-nitrofenil) -2- (terc-4,7,10-tris- butoxicarbonilmetil-1,4,7,10-tetraazacyclododec-1-il) butírico éster de ácido terc-butilo (2).
- Dissolver (4,7-bis- terc-butoxicarbonilmetil-1,4,7,10-tetra-aza-cyclododec-1-il) terc-butil éster do ácido acético 1 (1,00 g, 1,94 mmol) em N, N-dimetilformamida ( DMF, 5 ml), adiciona-se carbonato de potássio (0,67 g, 4,86 mmol, 2,5 equiv.) e agita-se a mistura à temperatura ambiente durante 45 min.
NOTA: Macrociclo 1 foi preparado a partir ciclen e bromoacetato de terc-butilo de acordo com o procedimento previamente publicado em 7. - Adicionar terc-butil-2-bromo-4- (4-nitrofenil) butanoato de etilo (0,87 g, 2,53 mmol, 1,3 equiv.) Em porções durante 1 h. Continuar a agitar a mistura sob tele mesmas condições de reacção para a 18 h seguintes.
Nota:-butil-2-bromo-4-terc-(4-nitrofenil) butanoato de etilo foi preparado a partir de 4- (4-nitrofenil) butírico, cloreto de tionilo, e o bromo de acordo com o procedimento previamente publicada 8. - Remover DMF por meio de destilação sob vácuo bolbo-a-bolbo a 40-60 ° C 9.
- Purifica-se o resíduo por cromatografia em coluna (gel de sílica, metanol a 7% / diclorometano) para se obter o produto 2 como um sólido amorfo castanho (1,09 g, 72%) 10.
- Dissolver (4,7-bis- terc-butoxicarbonilmetil-1,4,7,10-tetra-aza-cyclododec-1-il) terc-butil éster do ácido acético 1 (1,00 g, 1,94 mmol) em N, N-dimetilformamida ( DMF, 5 ml), adiciona-se carbonato de potássio (0,67 g, 4,86 mmol, 2,5 equiv.) e agita-se a mistura à temperatura ambiente durante 45 min.
- Síntese de 4- (4-aminofenil) -2- (terc-4,7,10-tris- butoxicarbonilmetil-1,4,7,10-tetraazacyclododec-1-il) butírico éster de ácido terc-butilo (3).
- Dissolve-se o derivado nitrobenzeno 2 (1,00 g, 1,28 mmol) em etanol (10 ml) e solução de amónia a 7 N em metanol (150 ul). Adicionar paládio em carvão activado como catalisador (Pd / C, 150 mg, 15% em peso) para a solução queem.
- Agitar a mistura heterogénea durante 16 horas sob uma atmosfera de hidrogénio (2,5 bar) no aparelho hidrogenador de Parr.
- Preparar uma pasta de terra de diatomáceas através da sua suspensão em etanol e filtração da suspensão através de um funil de vidro sinterizado. Verter a suspensão a partir 1.1.2.2 sobre o bolo preparado para remover o catalisador de Pd / C por filtração.
- Remover o solvente por destilação suave num evaporador rotativo (temperatura do banho de água a ~ 40 ° C) para se obter o composto 3 como um sólido amorfo castanho (0,91 g, 95%).
- Síntese de 4- (4-isotiocianatofenil) -2- (terc tetraazacyclododec-1-il 4,7,10-tris- butoxicarbonilmetil-1,4,7,10-) de terc-butil éster do ácido butírico (4).
- Adicionar tiofosgénio (0,124 ml, 1,58 mmol, 1,3 equiv.) A uma mistura de 3 (0,91 g, 1,22 mmol) e trietilamina (0,685 ml, 4,87 mmol, 4 equiv.) Em diclorometano (15 mL).
- Vigorosamente agitar as mi de reaçãoxture com um agitador magnético à temperatura ambiente durante 16 h.
- Remover o solvente por destilação suave num evaporador rotativo (temperatura do banho de água a ~ 40 ° C), e, em seguida, purificar o produto bruto por cromatografia em coluna (gel de sílica, 5% de metanol / diclorometano) para se obter o produto 4 como um castanho claro sólido amorfo (0,51 g, 53%).
- Síntese de 4- (4-nitrofenil) -2- (terc-4,7,10-tris- butoxicarbonilmetil-1,4,7,10-tetraazacyclododec-1-il) butírico éster de ácido terc-butilo (2).
- Síntese do DCA dendrímero.
- Síntese do dendrímero 5.
- Aqui dendrímero G4-PAMAM (667 mg, solução de dendrímero 10% em metanol, 4,67 mol), evapora-se o metanol por destilação suave num evaporador rotativo (temperatura do banho de água a ~ 40 ° C), e dissolve-se o resíduo em DMF (4 ml) .
- Adicionar trietilamina (0,105 ml, 0,75 mmol, 160 equiv.), Agitar durante 45 min a 60 ° C, e adicionar o isotiocianato de 4 (354 mg, 0,45 mmol, 1,5 equiv. Em relação aos grupos amino de superfície do dendrímero) ove porçõesR 1 h.
- Agita-se a mistura de reacção com um agitador magnico a 45 ° C durante 48 h.
- Remover o solvente por meio de destilação sob vácuo bolbo-a-bolbo a 40-60 ° C.
- Purifica-se o resíduo por cromatograf ia de exclusão de tamanho utilizando um meio de filtração em gel lipofílico e metanol como o eluente. Para empacotar a coluna, inchar o meio de filtração em metanol durante pelo menos 3 horas à temperatura ambiente (> 4 ml de metanol por 1 g de pó), sem aplicação de pressão. Executar separação de gravidade através da recolha de fracções de 1 ml.
- Analisar as fracções recolhidas por cromatografia de camada fina (TLC). Desenvolver a placa de TLC, em 15% de metanol / diclorometano (apenas a mancha mais polar localizado na linha de base é derivada de produto dendrimérico). Evapora-se as fracções recolhidas por destilação suave num evaporador rotativo (temperatura do banho de água a ~ 40 ° C) para se obter o produto 5 (270 mg, 91%).
- Síntese do dendrímero
- Dissolve-se o agente quelante protegido dendrimérico 5 (270 mg, 4,23 mol) em ácido fórmico (5 ml) e agita-se a mistura a 60 ° C durante 24 h.
- Evapora-se o ácido fórmico por destilação num evaporador rotativo (~ pressão 15 mbar, temperatura de banho de água a ~ 40 ° C) e liofilizar o produto para dar origem a 6 (~ pressão de 0,2 mbar) 9.
- Síntese do dendrímero 5.
- Síntese do agente de contraste dendrimérico (DCA)
- Dissolve-se o agente quelante dendrimérico 6 (4,35 mol) em água e ajustar o pH para 7,0 com hidróxido de sódio 0,1 M.
- Dissolver GdCl 3 .6H 2 O (113 mg, 304 umol) em água (1 mL) e adicionar-gota a gota à solução de quelante de 6 durante um período de 4 horas; manter o pH a 7,0 com solução de hidróxido de sódio aquoso (0,05 M) de medição de pH com um medidor de pH.
- Agita-se a mistura com um agitador magnético no quarto temperatura durante 24 h.
- Adicionar ácido etilenodiaminotetracético (EDTA, 158 mg, 426 umol) em porções à solução ao longo de 4 horas para remover o excesso de Gd (III), enquanto se mantém o pH a 7,0 com solução de hidróxido de sódio aquoso (0,05 M). Agita-se a mistura à temperatura ambiente durante 24 h.
- Realizar cromatografia de exclusão de tamanho para remover a maioria dos GdEDTA e o excesso de EDTA. Utilizar um meio de filtração em gel hidrofílico inchado em água para embalar a coluna. Reduzir a mistura para um volume adequado e carregar a coluna. Elui-se a coluna com água desionizada sem aplicar pressão.
- Centrifugar a amostra utilizando uma unidade de filtração centrífuga 3 kDa durante 30 min a 1800 xg força centrífuga para remover os resíduos de GdEDTA e EDTA. Repetir esta etapa (cerca de cinco vezes) até que o filtrado revela a ausência de EDTA e GdEDTA. Transferir a amostra para um balão, evapora-se que, em seguida, liofilizar o solvente para se obter um produto esbranquiçado como o DCA final (186 mg, 71%).
NOTA: Verifique ausência de EDTA e GdEDTA por meio de ESI-MS. - Confirmar a ausência de Gd (III) como um íon livre usando o teste de laranja de xilenol. Dissolve-se o filtrado (0,5 ml) numa solução tampão de acetato (pH 5,8). Adicionam-se algumas gotas de uma solução cor de laranja de xilenol e controlar a mudança de cor (de cor amarela ou violeta indica a ausência ou a presença de livre de Gd (III), iões em solução, respectivamente) 11.
2. Caracterização in vitro de produtos dendriméricos
- A estimativa do número de unidades de DOTA-macrocíclicas acoplados ao dendrímero PAMAM (carregamento do dendrímero com DOTA-macrociclos semelhantes)
- Estimativa com 1 H RMN (RMN - espectroscopia de ressonância magnética nuclear).
NOTA: Este procedimento é possível em dendrímeros 5 e 6, mas não na DCA.- Grave o espectro 1H NMR 12.
- Integrar a região aromática e as duas regiões separadas alifáticos (1. Sinais de dendrímero alifático e protões; macrocíclicas 2. Sinais dos grupos t-Bu) ou apenas uma região alifático para dendrímeros 5 e 6, respectivamente.
Nota: Não há sinal separado na região alifático oriundos dos grupos t-Bu em dendrímeros 6 desde que tenham sido hidrolisado. - Use Eq. 1 ou a Eq. 2 para estimar o número de unidades macrocíclicos (n), onde R = a proporção de integrais (alifático / aromático na Eq. 1 ou alifático-dendrímero / aliphatic- t-Bu na Eq. 2), H = Dend o número de protões em dendrímeros, H Ar = número de prótons aromáticos, H t Bu = número de prótons em grupos t-Bu, e H mac = número de prótons em um macrociclo.
Nota: ou a Eq. 1 ou a Eq. 2 pode ser utilizada foR dendrímero 5, enquanto que apenas a Eq. 1 pode ser utilizado para dendrímero 6. Desde protões permutáveis (em aminas, amidas, tioureias, ou carboxilatos) são tipicamente ser substituído por deutério, eles não foram considerada nos cálculos. Aqui, H Dend foram usadas = 1128 (para 5) ou 1000 (para o 6), H Ar = 4, e H Mac = 27.
(1) 
(2)
- Estimativa de análise elementar usando a proporção de azoto ao enxofre.
- Realizar a análise elementar na amostra dendrimérico sólido (DCA neste trabalho).
- Use Eq. 3 para estimar o número de unidades macrocíclicos (n), onde R = a proporção de N determinada% e% S, N ou S Dend Dend = o número deazoto ou átomos de enxofre no dendrímero, e N ou S Mac Mac = o número de átomos de azoto ou de enxofre em uma unidade macrocíclico.
Nota: O factor de 2,29 é obtido a partir da razão de massas atómicas de enxofre e de azoto. Neste trabalho, foi utilizado N Dend = 250, S Dend = 2, n = 5 Mac, e S = 1 mac.
(3)
- Estimativa com laser de tempo de dessorção / ionização assistida por matriz de voo (MALDI-TOF).
- Realizar a análise MALDI-TOF MS 13.
- Calcular o número de unidades macrocíclicos (n) de acordo com a Eq. 4, em que M = z a massa observada (m / z), Z = a carga das espécies, M = Dend a massa da parte dendrimérico, e M Mac = massa de uma unidade macrocíclico.
NÃOTE: M Dend = 14306 e M mac = 719 foram utilizados neste trabalho.
(4)
- Estimativa com 1 H RMN (RMN - espectroscopia de ressonância magnética nuclear).
- Determinação da concentração DCA ([DCA]): medição de suscetibilidade magnética massa (BMS)
- Dissolver DCA (5-10 mg) em água (360 ul) num tubo de frasco de plástico ([DCA] ~ 5-10 mM).
NOTA: [DCA] deve estar na gama de 5-10 mm para evitar uma possível sobreposição de ressonâncias BuOH T- em concentrações da amostra> 15 mm, com a ressonância da água a δ = 4,7 ppm. - Adicionar 60 ul de D 2 O: t- BuOH mistura (2: 1 v / v) à solução aquosa de DCA e misturar a solução resultante (420 mL) utilizando um misturador de vórtice.
- Transferir 400 ul da amostra num tubo de RMN exterior e colocar num tubo de RMN de inserção coaxial com um BuOH t-: H2O mistura (10:90 v / v) para o tubo de amostra.
- Registroe o espectro RMN de 1H medir o desvio de frequência entre os sinais de ressonância que derivam de t- BuOH nos tubos de RMN interior e exterior (12) de referência.
- Use Eq. 5 para determinar o [DCA], em que T é a temperatura absoluta, Δχ = o deslocamento registada, u eff = o momento efectivo magnético para um ião lantanídeo (μ eff = 7,94 para o Gd (III), 14, e s = uma constante dependente sobre a forma da amostra e a sua posição no campo magnético (0, 1/3, e 1/6 no caso de uma esfera, o cilindro paralelo ao, e cilindro perpendicular ao campo magnético, respectivamente).
NOTA: O valor calculado obtido para o [DCA] deve ser corrigido para a concentração original, devido à adição de D 2 O: t- BuOH solução (60 ul).
(5)
- Dissolver DCA (5-10 mg) em água (360 ul) num tubo de frasco de plástico ([DCA] ~ 5-10 mM).
- luz dinâmicaespalhamento (DLS) medições.
- Prepara-se uma solução DCA filtrada (filtro / PTFE de 0,2 um politetrafluoretileno, de 0,75 mm por Gd (III)) em 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanossulfónico (HEPES) tampão (25 mM, pH 7,4) e transferi-lo para uma cuvete para a medida de DLS.
- Coloque a cuvete no aparelho de DLS e definir os seguintes parâmetros: 5 repetições de 15 scans (1 varredura = 12 sec, índice de refração = 1.345, a absorção = 1%), sem atrasos, entre as varreduras e com equilíbrio de temperatura de 30 segundos antes da gravação .
- Exportar os dados adquiridos e obter o histograma de distribuição de tamanho através da representação gráfica da população (%) como uma função do tamanho (diâmetro hidrodinâmico).
- Medição das relaxividades longitudinais e transversais.
NOTA: Um procedimento semelhante já foi descrito usando o relaxamento analisador de tempo de 15; Este procedimento foi realizado utilizando um espectrómetro de RMN de 300 MHz com TopspinProgramas.- Preparar um conjunto de soluções DCA em H2O: D 2 O (500 mL, 10% de D 2 O em H2O, [DCA] = 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, e 5,0 mM, [HEPES ] = 25 mm) a partir da amostra da DCA (ver secção 2.2).
- Transferir 450 ul da solução para um tubo de RMN e colocá-lo dentro do instrumento.
- Otimizar os parâmetros de aquisição (90 ° duração do pulso de excitação (p1), e irradiação freqüência de offset (O 1)) e, em seguida, executar a T 1 e T 2 experimentos utilizando a recuperação de inversão (IR) e Car-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG ) sequências de pulso, respectivamente.
- Determinação dos tempos t 1 e t 2 de relaxamento.
- Selecione o valor indicado, o processo do espectro 2D na dimensão F2, e realizar a correção fase interativa.
- Selecione a fatia apropriada (pico com intensidade máxima) na Análise / T
- Seleccione a função adequada, ajustando (invrec ou uxnmrt2 para IR e CPMG experimentos, respectivamente) para obter os tempos de relaxação T 1 ou T 2.
- Repita os passos 2.4.4.2-2.4.4.4 para todas as soluções restantes [DCA].
- Calcular as taxas de relaxamento (R1 e R2) em relação aos valores obtidos T 1 (R 1 = 1,2 / 1,2 t).
- Lote R 1 e R 2 (seg-1) como uma função de Gd (III), a concentração em mM.
- Determinar as relaxividades longitudinais e transversais, R 1 e R 2 (seg -1 mM -1), a partir do declive da linha ajustada, tal como definido pela Eq. 6, em que R i, obs = longitudinal (I = 1) ou transversal (i = 2) taxa de relaxação de diamagnéticoágua, na ausência de espécies paramagnéticas e [Gd] = concentração de Gd (III) utilizado na experiência.
(6)
(1) 
(2) 
(3) 
(4) 
(5) 
(6) 3. In Vitro de ressonância magnética; Comparação entre a DCA e GdDOTA
- Preparação de fantasmas tubo
- Prepare soluções aquosas de DCA (4 x 350 ul) e GdDOTA (4 x 350 ul), bem como amostras de água (4 x 350 ul) para dois conjuntos de experiências em que a concentração dos agentes de contraste é calculado: (3.1.1.1) por Gd (III) ou (3.1.1.2) por molécula.
- Prepare duas amostras DCA e dois GdDOTA As amostras com concentrações de 0,5 e 1,0 mm por Gd (III), respectivamente. Além disso, preparar duas amostras de água (como tubos de controle).
- Prepare duas amostras DCA (2,5 e 5,0 mm por Gd (III) ou 0,05 e 0,1 mm por molécula dendrimérico), duas amostras GdDOTA (0,25, 0,5 mM) e duas amostras de água (control tubos).
NOTA: As concentrações DCA e GdDOTA apropriadas devem ser preparadas diluindo as respectivas amostras de ações com concentrações determinadas através do método BMS (ver secção 2.2) com tampão HEPES (pH 7,4). A fim de simplificar os cálculos, n = 50 foi assumida para o número médio de unidades macrocíclicas por molécula dendrímero. Portanto, o rácio de DCA: GdDOTA foi de 1: 5, calculado sobre uma base por molécula.
- Coloque as amostras em tubos de 300 ml dos frascos de plástico, evitando a presença de bolhas de ar na solução.
NOTA: O tamanho dos tubos frasco de plástico depende do tipo e tamanho da bobina de radiofrequência utilizada (aqui, um exemplo com a bobina de volume é dada). - Coloque as amostras dentro de uma seringa (60 ml de volume), preenchê-lo com GdDOTA 1 mM solução e colocá-lo no scanner.
NOTA: As amostras foram colocadas na solução aquosa de GdDOTA para evitar efeitos de susceptibilidade (variações no campo magnético strength que ocorrem perto de interfaces entre substâncias de diferentes susceptibilidade magnética).
- Prepare soluções aquosas de DCA (4 x 350 ul) e GdDOTA (4 x 350 ul), bem como amostras de água (4 x 350 ul) para dois conjuntos de experiências em que a concentração dos agentes de contraste é calculado: (3.1.1.1) por Gd (III) ou (3.1.1.2) por molécula.
- Otimização de parâmetros e de imagem.
- Use a varredura anatômica (Localizer / TriPilot) para posicionar a seringa com as amostras no isocentro do ímã.
- Pressione o semáforo (varredura de ajuste) para realizar ajustes para calçar (ajuste de homogeneidade do campo magnético) de todo o volume, a frequência central (O 1), o ganho do receptor (RG) e o ganho de transmissão (TX0 e TX1).
- Para T 1 ponderadas (T 1w) de imagem, selecione o método rápido de baixo ângulo de tiro (FLASH).
- Escolha fatia coronal para as amostras colocadas verticalmente (seringa horizontalmente) no scanner usando a digitalização Localizer.
- Use Eq. 7 para optimização da aquisição contraste-ruído (CNR) Parâmetros 16, onde α = o ângulo da aleta, TE = o tempo de eco, TR =o tempo de repetição, e T 1, A, T 1, B = T 1 tempos de amostra A (t 1, A) e a amostra B (T 1, B) para o qual o CNR deve ser maximizado (o mesmo é válido para T 2 vezes: T 2, A e T 2, B).
NOTA: T 1 e T 2 vezes relaxamento deve ser ajustado para valores obtidos a partir das medições de relaxividades longitudinais e transversais (secção 2.4), enquanto que TE, TR, e α deve ser obtido a partir do cálculo optimização CNR.
(7) - Adquirem a imagem usando os parâmetros obtidos no passo anterior (3.2.5).
- Calcula-se a relação sinal-para-ruído (SNR).
- Carregar a imagem T 1w adquirida (varredura) para a exibição e processamento de imagemjanela, e clique em Definir região de interesse (ROI).
- Escolha um ROI circular e desenhá-la na posição de amostra e de fundo. Subsequentemente, clicar no indicador para obter a amplitude média do sinal (sinal S) e o desvio padrão do fundo (ruído S).
- Repita o passo 3.2.7.2 para a DCA, GdDOTA, e amostras de água.
- Calcular o SNR utilizando a fórmula: SNR = sinal S / S ruído.
- Seguindo um procedimento ligeiramente modificado, execute T 2 ponderadas (T 2W) imaging usando a rápida aquisição com o método de valorização de relaxamento (raro). Para otimização dos parâmetros de aquisição CNR, use Eq. 8.
(8)
(7) 
(8) Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A preparação de DCA consistia em duas fases: 1) a síntese da monomérica tipo DOTA quelante (Figura 1) e 2) de acoplamento do quelante com o dendrímero G4 PAMAM e preparação subsequente do Gd dendrimérico (III) complexo (Figura 2) . Na primeira fase, foi preparado um tipo de DOTA quelante à base de ciclen contendo quatro ácidos carboxílicos e um grupo ortogonal apropriado para outras modificações sintéticas. A preparação iniciada a partir de 1 (DO3A- éster de terc-butil) 7, que foi alquilado com 2-terc-butil-bromo-4- (4-nitrofenil) butanoato de etilo para proporcionar 8-DOTA derivado 2. A hidrogenação catalisada por paládio reduziu o grupo nitro aromático em 2 para se obter a anilina 3. A conversão de 3 com tiofosgénio resultou na isotiocianato de 4, which foi previamente utilizado como um agente reactivo com amina para a preparação de dendrimérico CAs 17.
Na etapa seguinte, o macrociclo 4 foi utilizado como a unidade monomérica de base numa reacção de acoplamento para o dendrímero PAMAM G4 disponíveis comercialmente. Os grupos amina na superfície do dendrímero reagir com os grupos de isotiocianato do monómero de 4 na presença de uma base. O excesso de 4 foi removido por cromatografia de exclusão de tamanho utilizando um meio de filtração em gel lipofílico com metanol como eluente. Os ésteres de terc-butilo sobre o conjugado de dendrímero-macrocíclico obtido 5 foram hidrolisados com ácido fórmico para se obter 6, que foi depois liofilizado e utilizado no passo seguinte sem purificação. A formação de Gd (III) de macrociclos DOTA-tipo foi realizada por adição de GdCl 3 .6H 2 O para uma solução aquosa óf 6, mantendo o pH a cerca de 7. O excesso de Gd (III) foi complexado com um ácido etilenodiaminotetracético comum quelante (EDTA). O complexo de EDTA e excesso GdEDTA foram removidos do sistema por meio de cromatografia de exclusão de tamanho utilizando um meio de filtração em gel hidrofílico com água como eluente. As restantes impurezas de pequenas dimensões foram removidos da solução por centrifugação usando 3 kDa unidades de filtração centrífuga.
Após a síntese dos conjugados dendrímero-macrociclo, uma abordagem analítica combinada foi utilizada para caracterizar os produtos. Para determinar a ocupação superfície-amina de 5 e 6, os espectros de 1 H RMN foram analisados. Os resultados foram comparados e confirmado com o produto final (DCA), onde o carregamento do dendrímero com macrociclos foi estimada usando a análise elementar e por espectrometria de massa MALDI-TOF (Figura3). A combinação destes três métodos resultaram numa média de 49 unidades macrocíclicas ser conjugado com o dendrímero G4, o que corresponde a ~ 75% de ocupação da superfície grupo amina.
A caracterização adicional do complexo dendrimérico incluiu a determinação da relaxividade os valores, resultando em 6,2 ± 0,1 mM -1 seg -1 por Gd (III) (ou mais ou menos cerca de 300 mM -1 seg -1 por dendrímero) para a relaxividade longitudinal e 30,5 ± sec 0,6 mM -1 -1 por Gd (III) (seg quase 1.500 mM -1 -1 por dendrímeros) para a relaxação transversal. Medidas de DLS indicado um diâmetro hidrodinâmico de 7,2 ± 0,2 nM para DCA (Figura 4).
Finalmente, para demonstrar o efeito do agente de contraste para IRM dendrimérico, RM foi realizado em dois conjuntos de fantasmas e com DCA a clínicaGdDOTA aliado disponíveis para comparação (Figura 5). O primeiro conjunto de fantasmas foram preparadas com a finalidade de comparar estes dois agentes de contraste em concentrações idênticas de Gd (III), enquanto o segundo foi desenhado para demonstrar o efeito da molécula em concentrações comparáveis de os agentes de contraste e dendriméricos monoméricas, respectivamente.
Figura 1: Síntese do macrocíclico de tipo quelante DOTA 4. Os reagentes, condições e rendimentos isolados: (i) terc-butil 2-bromo-4- (4-nitrofenil) butanoato de etilo, K 2 CO 3, DMF, 45 ° C , 16 h, 72%; (ii) H 2, Pd / C, EtOH, TA, 16 h, 95%; (iii) CSCL 2, Et 3 N, RT, 2 horas, 53%. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta fi gura.
Figura 2: Síntese do agente de contraste para IRM dendrimérico DCA Reagentes e condições: (i) 4, Et3N, DMF, 45 ° C, 48 h, 91%;. (Ii) ácido fórmico, a 60 ° C, 24 h, quant; (iii) GdCl 3 ∙ 6H 2 O, pH 7,0, RT, 24 h, 71%. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3:. A caracterização do produto dendrimérico por meio de espectrometria de massa MALDI-TOF Um espectro típico de massa MALDI-TOF obtidos para DCA.rget = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4:.. A caracterização do produto dendrimérico por meio de espalhamento dinâmico de luz (DLS) de medição DLS da DCA (HEPES, pH 7,4) Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: In vitro experimento de imagens em fantasmas metro a 7 T campo magnético (a, b) T 1 ponderadas e (c, d) T 2 ponderadas MRI do DCA e GdDOTA.. Cada experiência foi realizada com a RM duas concentrações diferentes do agente de contraste: (A, C) com Gd comparável (iii) as concentrações (HEPES, pH 7,4); (B, d) com um DCA: rácio de concentração GdDOTA de 1: 5 (HEPES, pH 7,4). As concentrações são expressas por molécula e os valores de SNR são exibidas nos parênteses. Os parâmetros utilizados nestas experiências foram: campo de visão (FOV) = 40 x 40 mm2, a espessura do corte = 0,5 mm, número de excitações (NEX) = 30; (A) o tamanho da matriz (MTX) = 256 x 256, tempo de repetição (TR) = 100 ms, tempo de eco (TE) = 2.95 ms, ângulo de flip (FA) = 90 °, tempo de aquisição (TA) = 12 min 48 seg ; (B) MTX = 256 x 256, TR / TE = 20 / 2.95 ms, FA = 90 °, TA = 2 min 34 seg; (C) MTX = 512 x 512, TR / TE = 10.000 / 130 ms, fator Rare (RF) = 16, TA = 26 min 40 seg; (D) MTX = 512 x 512, TR / TE = 10.000 / 100 ms, RF = 16, TA = 26 min 40 seg.776fig5large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Preparação do agente de contraste para IRM dendrimérico requer selecção adequada da unidade monomérica (isto é, o quelante de Gd (III)). Eles reduzem a toxicidade do ião paramagnético e, até à data, uma ampla variedade de acíclicos e quelantes macrocíclicos servir para este fim 1-3. Entre estes, os quelantes macrocíclicos-DOTA tipo possuem a maior estabilidade termodinâmica e inércia cinética e, portanto, são a escolha preferida para a preparação de agentes de contraste para IRM inerte 1,18. Além disso, eles são propensos a várias transformações sintéticas, que resultam em agentes quelantes bifuncionais, capaz de ligar a várias moléculas funcionais (por exemplo, vectores de recombinação ou de nano-transportadores), enquanto ainda formando estável de Gd (III), complexos de 19. Para este fim, a unidade monomérica de tipo DOTA descrito neste procedimento foi preparado a partir de éster terc-butílico DO3A-, o precursor comum e facilmente disponíveis, e o derivado de brometo deo 4- (4-nitrofenil) butanóico. Esta molécula é derivado de DOTA e possui uma estrutura semelhante à de coordenadas de Gd (III). A modificação sintética visa tornar este quelante propenso a acoplamento de reações a várias moléculas funcionais e operadoras. Nomeadamente, a preparação dos resultados molécula modificada por um agente quelante DOTA em uma ainda com quatro grupos carboxílicos disponíveis para a coordenação de Gd (III) para formar um complexo inerte e um grupo nitrofenilo ortogonal, o qual após conversão atribui esta quelante à superfície do dendrímero. Este processo também permite flexibilidade na escolha do grupo reactivo ortogonal (por exemplo, NH2 ou COOH), que pode servir para acoplar o quelante de Gd (III) a um transportador desejado de um modo preferido.
O quelante bifuncional obtido pode ser acoplado a outras moléculas de duas formas diferentes (ou seja, os procedimentos de síntese). Quando o grupo nitro é reduzido a um grupo amino, a anilina resultante pode sobir uma reacção de condensação com o grupo ácido carboxílico da outra molécula 8. Além disso, um grupo funcional amina primária aromática na presença de tiofosgénio pode ser facilmente convertido em um isotiocianato, um grupo que facilmente reage com aminas, em solventes orgânicos polares, bem como água, que oferece mais possibilidades de reacção para o acoplamento de unidades monoméricas de dendrímeros 17 , 20,21.
Para o acoplamento do quelante bifuncional para o transportador dendrimérico, um andaime dendrimérico adequado deve ser seleccionado. Vários fatores relacionados à estrutura dendrimer conjugado final e a aplicação desejada deve ser contabilizado nesta etapa. Devido à ampla disponibilidade comercial das transportadoras dendriméricos, produtos com estruturas diferentes do núcleo, grupos reactivos de superfície, ou pode ser escolhido gerações. Por conseguinte, a reacção de conjugação vai depender do grupo superfície do dendrímero e o grupo ortogonal do quelante, enquanto que oconjugado final pode ser neutro, carregada ou têm tamanhos diferentes (até 15-20 nm, dependendo da geração dendrimer) 22. Todos estes aspectos devem ser tidos em conta antes de preparar o CA dendrimérico, uma vez que pode afectar a solubilidade, a relaxividade (aumento do sinal de ressonância magnética), difusão, e outras propriedades farmacocinéticas do agente de contraste, o que pode, potencialmente, comprometer a sua aplicação em MRI. Por exemplo, os dendrímeros catiónicos podem apresentar toxicidade em sistemas biológicos. No entanto, este efeito pode ser reduzido por conjugação de grupos carregados negativamente sobre a superfície do dendrímero, reduzindo assim a sua carga positiva global 23.
Neste protocolo, nós preparamos o agente de contraste dendrimérico DCA usando o procedimento em que o grupo isotiocianato do macrociclo monomérico 4 foi acoplado a um cistamina-core G4-PAMAM comercial equipado com 64 grupos superficiais de aminas primárias. A purificação inicial do hydrophOBIC produto dendrimérico 5 foi realizada por cromatografia em gel utilizando uma coluna com um meio de filtração em gel lipofílico e metanol como o eluente, a fim de remover a maior parte das unidades monoméricas que não reagiram. A hidrólise de ésteres de t-butilo com ácido fórmico é simples, resultando em um produto dendrimérico solúveis em água que podem ser purificados com cromatografia de exclusão de tamanho utilizando um meio de filtração em gel hidrofílico. A complexação dos quelantes multiméricas e dendriméricos com Gd (III) foi realizada enquanto se mantém a solução a um pH neutro, a fim de facilitar a formação do complexo. Caso contrário, a complexação de Gd (III) (adicionado como o sal de cloreto) reduz o pH, diminuindo a velocidade da reacção. Finalmente, vale a pena notar que os grupos de amina no núcleo dendrímero também tendem a coordenar com Gd (III), mas apenas com o excesso que não poderia ser quelatado com as unidades DOTA. Evitar a presença de Gd (III) fora do quelante DOTA é essencial, uma vez que leAkage de Gd (III) a partir do CA pode ter efeitos indesejados; ou seja, pode induzir toxicidade in vivo 18. O excesso de Gd (III) pode ser efetivamente removido por complexação com EDTA seguido por ultrafiltração de GdEDTA e EDTA livre usando 3 kDa de peso molecular de corte filtros (MWCO). filtros de MWCO menores podem ser utilizados quando os conjugados dendriméricos têm pesos moleculares inferiores.
Há duas grandes questões de resolução de problemas relacionados com a preparação da DCA. Devido ao grande efeito de ampliação de Gd (III) em sinais de RMN, análise de DCA por meio de espectroscopia de RMN não é informativo. Em vez disso, a análise deve ser executada em passos anteriores (compostos 5 e 6). Em seguida, a conjugação de unidades monomacrocyclic à superfície do dendrímero nunca é realizado com uma conversão de 100%, mas é provável que seja entre 50-90% (ver abaixo). Tipicamente, os rendimentos da reacção pode ser aumentada pela adição de uma segunda porção do monomeriC unidade reactiva após a primeira conjugação de dendrímero e unidade monomérica é completado 24. No entanto, todos os lotes de preparação resulta em um pouco diferentes números médios de conjugados quelantes na superfície do dendrímero, mesmo quando as unidades de dendrímero e DOTA idênticos são utilizados como materiais para acoplamento. Embora o montante final da Gd (III) presente no DCA pode ser determinada de forma independente através do método BMS (ver secção 2.2), para melhor caracterização dos conjugados dendriméricos, é necessário realizar a estimativa de unidades monoméricas ligadas cada vez que um novo lote de DCA é preparado (ver 2.1 e discussão abaixo).
A caracterização analítica dos produtos dendriméricos isolados podem ser realizadas por meio de espectroscopia de RMN de 1 H (apenas dos produtos 5 e 6), análise elementar, e por MALDI-TOF MS. Rendimentos típicos para a conversão dos grupos amino de superfície encontram-se entre 50-90%, dependendo das geraçã dendrim�icosem diante, o tipo de agente quelante, e as condições de reacção usadas (solvente e temperatura) 6,20,24,25. Neste caso particular, as massas calculadas obtidos a partir das análises combinadas correspondem a uma média de 49 quelatos monoméricas sendo acoplado ao dendrímero (isto é, ~ 75% de ocupação das aminas superfície dendrímero). Embora uma pequena diferença no número final de grupos amino reagiram poderia ser esperada entre estas metodologias 25, a sua comparação directa fornece evidência razoável para a formação do DCA desejada com um número médio de unidades em particular quelantes ligados.
A caracterização in vitro com o objectivo de avaliar o potencial de DCA para melhorar o contraste de ressonância magnética consistiu em experiências de DLS, relaxometric, e as experiências MRI. O diâmetro hidrodinâmico das DCA foi determinado como sendo 7,2 ± 0,2 nm por meio de medições DLS, que está de acordo com conjugados relatados anteriormente deste tipocom geração G4 4 dendrímeros PAMAM 26. Determinação da relaxividade longitudinal do DCA seguido o procedimento anteriormente descrito e 15 revelou o valor de 6,2 ± 0,1 mM de 1 s-1 por Gd (III). Cerca de 50% do aumento na r 1 paramagnética de Gd (III) em DCA em relação a moléculas de pequenas dimensões de um tipo semelhante (por exemplo, GdDOTA) pode ser explicado com o tamanho do intermediário do agente de contraste dendrimérico. Ou seja, o movimento reduzido dos quelatos de Gd-ligado à superfície do dendrímero, aumenta o tempo de correlação rotacional e, portanto, R 1; este efeito ainda pode ser observado em altos campos magnéticos para agentes de tamanho nano menores. Caso contrário, o aumento do tempo de correlação rotacional contribui predominantemente para R1 realce a baixas campos magnéticos 27. Por outro lado, o tamanho do agente de contraste dendrimérico tinha um efeito pronunciado sobre a RELA transversalxivity 28, resultando no valor de 30,5 ± 0,6 mM de 1 s-1 por Gd (III). Em resumo, os métodos de avaliação in vitro da DCA são simples e exigem uma preparação de amostra só cuidado, por isso não há dificuldades são esperados na aquisição de dados e análise dos resultados.
Para demonstrar o desempenho do agente de contraste dendrimérico e o seu poder de afectar o contraste de imagem, foram realizadas experiências de ressonância magnética de fantasmas tubo com o agente de contraste recém-preparado DCA. Nós também utilizada uma solução de um agente de contraste comercialmente disponível e aprovado clinicamente RM, GdDOTA, como uma comparação e tubos com água como um controlo. No primeiro T 1 ponderadas experiência MRI, quando foram utilizadas concentrações iguais de Gd (III) (0,5 ou 1 mM de Gd (III), em DCA ou GdDOTA), o SNR nos tubos com DCA foi já até 12% mais elevado devido a um aumento de cerca de 50% em relaxividade longitudinal do DCA em comparação com GdDOTA (Figura 5a). O segundo T 1 ponderadas experiência MRI foi concebido para demonstrar o efeito de DCA quando as concentrações foram calculadas por molécula. Embora menos 5 vezes DCA foi aplicada em comparação com GdDOTA (50 vs. 250 | iM ou 100 vs. 500 | iM vs DCA GdDOTA, respectivamente), uma carga elevada de DCA com Gd (III) resultaram num aumento significativo no contraste de imagem, que por sua vez, resultou nos valores de SNR observados sendo, pelo menos, três vezes mais elevada nos tubos cheios com fantasmas DCA. Expectedly, tanto T 2 ponderadas experimentos de ressonância magnética exibiram grandes diferenças (3-20 vezes) na SNR entre os tubos fantasmas cheios de DCA e GdDOTA.
Em conclusão, este protocolo descreve uma preparação conveniente de uma CA dendrimérico para MRI usando procedimentos sintéticos comuns para fornecer DCA com propriedades melhoradas em comparação com small-size CAs. exposições DCA preferido estabilidade termodinâmica e inércia cinética quando comparadoaos seus análogos monoméricos CA. No entanto, a multivalência de DCA e, portanto, a concentração local elevada das espécies paramagnéticas na região alvo induz elevado contraste nas imagens de RM. Considerando as propriedades farmacocinéticas muitas vezes preferíveis (por exemplo, o tecido mais tempo de retenção) em comparação com os seus análogos CA monoméricos, ou a capacidade de transportar mais funcionalidades (por exemplo, vectores segmentados), estes conjugados dendriméricos-macrociclo representam uma classe promissora e valiosa de agentes de contraste para vários futuros ressonância magnética e aplicações de imagem molecular.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cyclen | CheMatech | C002 | |
| tert-Butyl bromoacetate | Alfa Aesar | A14917 | |
| N,N-Dimethylformamide | Fluka | 40248 | |
| Potassium carbonate | Sigma-Aldrich | 209619 | |
| 4-(4-Nitrophenyl)butryic acid | Aldrich | 335339 | |
| Thionyl chloride | Acros Organics | 382662500 | Note: Corrosive substance; toxic if inhaled |
| Bromine | Acros Organics | 402841000 | Note: causes severe skin burns, fatal if inhaled |
| Diethyl ether | any source | ||
| Sodium sulphate | Acros Organics | 196640010 | |
| Chloroform | VWR Chemicals | 22711.29 | |
| tert-Butyl 2,2,2-trichloroacetimidate | Aldrich | 364789 | Note: flammable substance; irritrant to skin and eyes |
| Boron trifluoride etherate | Acros Organics | 174560250 | 48% BF3. Note: Flammable substance; causes skin burns, fatal if inhaled |
| Sodium bicarbonate | Acros Organics | 424270010 | |
| Ethyl-acetate | any source | For column chromatography | |
| n-Hexane | any source | For column chromatography | |
| Bulb-to-bulb (Kugelrohr) distillation apparatus | Büchi | Model type: Glass oven B-585 | |
| Silicagel | Carl Roth GmbH | P090.2 | |
| Methanol | any source | For column chromatography | |
| Dichloromethane | any source | For column chromatography | |
| Ethanol | VWR Chemicals | 20821.296 | |
| Ammonia | Acros Organics | 428381000 | 7 N Solution in Methanol |
| Palladium | Aldrich | 643181 | 15% wet |
| Hydrogenation apparatus PARR | PARR Instrument Company | ||
| Celite 503 | Aldrich | 22151 | |
| Sintered glass funnel | any source | ||
| Thiophosgen | Aldrich | 115150 | Note: irritrant to skin; toxic if inhaled |
| Triethylamine | Alfa Aesar | A12646 | |
| Dichloromethane | Acros Organics | 348460010 | Extra dry |
| Magnetic stirrer | any source | ||
| PAMAM G4 Dendrimer | Andrews ChemService | AuCS - 297 | 10% wt. solution in MeOH |
| Lipophylic Sephadex LH-20 | Sigma | LH20100 | |
| Thin-layer chromatography plates | Merck Millipore | 1.05554.0001 | |
| Formic acid | VWR Chemicals | 20318.297 | |
| Lophylizer | any source | ||
| Gadollinium(III) chloride hexahydrate | Aldrich | G7532 | |
| Sodium hydroxide | Acros Organics | 134070010 | |
| pH meter | any source | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Aldrich | E5134 | |
| Mass spectrometer (ESI) | Agilent | Ion trap SL 1100 | |
| Acetate buffer | any source | pH 5.8 | |
| Xylenol orange | Aldrich | 52097 | 20 μM in acetate buffer |
| Hydrophylic Sephadex G-15 | GE Healthcare | 17-0020-01 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Merck Millipore | UFC900324 | Ultracel-3 membrane (MWCO 3000) |
| Centrifuge | any source | ||
| NMR spectrometer | Bruker | Avance III 300 MHz | |
| Topspin | Bruker | Version 2.1 | |
| Combustion analysis instrument | EuroVector SpA | EuroEA 3000 Elemental Analyser | |
| MALDI-ToF MS instrument | Applied Biosystems | Voyager-STR | |
| Deuteriumoxid | Carl Roth GmbH | 6672.3 | |
| tert-Butyl alcohol | Carl Roth GmbH | AE16.1 | |
| Vortex mixer | any source | ||
| Norell NMR tubes | Deutero GmbH | 507-HP-7 | |
| NMR coaxial tube | Deutero GmbH | coaxialb-5-7 | |
| DLS instrument | Malvern | Zetasizer Nano ZS | |
| 0.20 μm PTFE filter | Carl Roth GmbH | KC94.1 | |
| HEPES | Fisher BioReagents | BP310 | |
| Plastic tube vials | any source | ||
| Dotarem | Guerbet | NDC 67684-2000-1 | |
| MRI scanner | Bruker | BioSpec 70/30 USR magnet (7 T). Note: potential hazards related to high magnetic fields | |
| RF coil | Bruker | Dual frequency volume coil (RF RES 300 1H/19F 075/040 LIN/LIN TR) | |
| Paravision (software) | Bruker | Version 5.1 |
References
- Merbach, A. E., Helm, L., Tóth, É The chemistry of contrast agents in medical magnetic resonance imaging. 2nd ed. , Wiley. (2013).
- Geraldes, C. F. G. C., Laurent, S. Classification and basic properties of contrast agents for magnetic resonance imaging. Contrast Media Mol. Imaging. 4 (1), 1-23 (2009).
- Caravan, P., Ellison, J. J., McMurry, T. J., Lauffer, R. B. Gadolinium(III) chelates as MRI contrast agents: Structure, dynamics, and applications. Chem. Rev. 99 (9), 2293-2352 (1999).
- Villaraza, A. J. L., Bumb, A., Brechbiel, M. W. Macromolecules, Dendrimers, and Nanomaterials in Magnetic Resonance Imaging: The Interplay between Size, Function, and Pharmacokinetics. Chem. Rev. 110 (5), 2921-2959 (2010).
- Langereis, S., Dirksen, A., Hackeng, T. M., van Genderen, M. H. P., Meijer, E. W. Dendrimers and magnetic resonance imaging. New J. Chem. 31 (7), 1152-1160 (2007).
- Gündüz, S., Power, A., Maier, M. E., Logothetis, N. K., Angelovski, G. Synthesis and Characterization of a Biotinylated Multivalent Targeted Contrast Agent. ChemPlusChem. 80 (3), 612-622 (2015).
- Pope, S. J. A., Kenwright, A. M., Heath, S. L., Faulkner, S. Synthesis and luminescence properties of a kinetically stable dinuclear ytterbium complex with differentiated binding sites. Chem. Commun. (13), 1550-1551 (2003).
- Vibhute, S. M., et al. Synthesis and characterization of pH-sensitive, biotinylated MRI contrast agents and their conjugates with avidin. Org. Biomol. Chem. 11 (8), 1294-1305 (2013).
- Vogel, A. I., Furniss, B. S. Vogel's textbook of practical organic chemistry. 5th ed. , Longman. (1989).
- Lundanes, E., Reubsaet, L., Greibrokk, T. Chromatography : basic principles, sample preparations and related methods. , Wiley-VCH. (2013).
- Barge, A., Cravotto, G., Gianolio, E., Fedeli, F. How to determine free Gd and free ligand in solution of Gd chelates. A technical note. Contrast Media Mol. Imaging. 1 (5), 184-188 (2006).
- Keeler, J. Understanding NMR spectroscopy. 2nd ed. , Wiley. (2010).
- Hillenkamp, F., Peter-Katalinić, J. MALDI MS : a practical guide to instrumentation, methods and applications. , Wiley-VCH. (2007).
- Peters, J. A., Huskens, J., Raber, D. J. Lanthanide induced shifts and relaxation rate enhancements. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 28, 283-350 (1996).
- Averill, D. J., Garcia, J., Siriwardena-Mahanama, B. N., Vithanarachchi, S. M., Allen, M. J. Preparation, Purification, and Characterization of Lanthanide Complexes for Use as Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging. J. Vis. Exp. (53), e2844 (2011).
- Hagberg, G. E., Scheffler, K. Effect of r1 and r2 relaxivity of gadolinium-based contrast agents on the T1-weighted MR signal at increasing magnetic field strengths. Contrast Media Mol. Imaging. 8 (6), 456-465 (2013).
- Boswell, C. A., et al. Synthesis, characterization, and biological evaluation of integrin alpha(v)beta(3)-targeted PAMAM dendrimers. Mol. Pharmaceut. 5 (4), 527-539 (2008).
- Sherry, A. D., Caravan, P., Lenkinski, R. E. Primer on Gadolinium Chemistry. J. Magn. Reson. Imaging. 30 (6), 1240-1248 (2009).
- Cakić, N., Gündüz, S., Rengarasu, R., Angelovski, G. Synthetic strategies for preparation of cyclen-based MRI contrast agents. Tetrahedron Lett. 56 (6), 759-765 (2015).
- Polasek, M., Hermann, P., Peters, J. A., Geraldes, C. F. G. C., Lukes, I. PAMAM Dendrimers Conjugated with an Uncharged Gadolinium(III) Chelate with a Fast Water Exchange: The Influence of Chelate Charge on Rotational Dynamics. Bioconjugate Chem. 20 (11), 2142-2153 (2009).
- Ali, M. M., et al. Synthesis and relaxometric studies of a dendrimer-based pH-responsive MRI contrast agent. Chem. Eur. J. 14 (24), 7250-7258 (2008).
- Jackson, C. L., et al. Visualization of dendrimer molecules by transmission electron microscopy (TEM): Staining methods and Cryo-TEM of vitrified solutions. Macromolecules. 31 (18), 6259-6265 (1998).
- Jain, K., Kesharwani, P., Gupta, U., Jain, N. K. Dendrimer toxicity: Let's meet the challenge. Int. J. Pharm. 394 (1-2), 122-142 (2010).
- Rudovsky, J., et al. PAMAM dendrimeric conjugates with a Gd-DOTA phosphinate derivative and their adducts with polyaminoacids: The interplay of global motion, internal rotation, and fast water exchange. Bioconjugate Chem. 17 (4), 975-987 (2006).
- Xu, H., et al. Toward improved syntheses of dendrimer-based magnetic resonance imaging contrast agents: New bifunctional diethylenetriaminepentaacetic acid ligands and nonaqueous conjugation chemistry. J. Med. Chem. 50 (14), 3185-3193 (2007).
- Nwe, K., Bryant, L. H., Brechbiel, M. W. Poly(amidoamine) Dendrimer Based MRI Contrast Agents Exhibiting Enhanced Relaxivities Derived via Metal Preligation Techniques. Bioconjugate Chem. 21 (6), 1014-1017 (2010).
- Livramento, J. B., et al. First in vivo MRI assessment of a self-assembled metallostar compound endowed with a remarkable high field relaxivity. Contrast Media Mol. Imaging. 1 (1), 30-39 (2006).
- Norek, M., Kampert, E., Zeitler, U., Peters, J. A. Tuning of the Size of Dy2O3 Nanoparticles for Optimal Performance as an MRI Contrast Agent. J. Am. Chem. Soc. 130 (15), 5335-5340 (2008).
