كشف الإنتاجية العالية للجهاز التنفسي مسببات الأمراض في العينات الحيوانية التي كتبها النانو PCR

Summary

يوصف الإنتاجية العالية اختبار الحمض النووي والحمض النووي الريبي مسببات الأمراض استنادا كتبها النانو PCR باستخدام الكلاب المتلازمة والفروسية لوحة PCR في الجهاز التنفسي.

Abstract

يستخدم على نطاق ونانولتر الوقت الحقيقي PCR المكانية المتعددة للسماح للفحوصات متعددة ليتم تشغيلها في نفس الوقت على لوحة واحدة من دون عيوب نموذجية من الجمع بين ردود الفعل معا. لقد قمنا بتصميم وتقييم لجنة بناء على هذا المبدأ على تحديد بسرعة وجود عوامل الأمراض شيوعا في الكلاب والخيول مع المرض التنفسي الحاد. توضح هذه المخطوطة النانو سير العمل PCR التشخيص لإعداد العينات، والتضخيم، وتحليل تسلسل العوامل المسببة للأمراض المستهدفة، مع التركيز على الإجراءات التي تختلف عن ردود الفعل على نطاق وميكروليتر. في لوحة الجهاز التنفسي المقدمة، وضعت 18 المقايسات كل ما يصل في ثلاث نسخ، واستيعاب ما يصل الى 48 عينات لكل لوحة. تم تحسين واستخراج وقبل التضخيم عالمي سير العمل لإعداد عينة الإنتاجية العالية لاستيعاب مصفوفات متعددة والدنا والرنا مسببات الأمراض مقرها. وتعرض بيانات تمثيلية للهدف واحد RNA (أنفلونزا مصفوفة) والهدف الحمض النووي واحد (هربس الخيول1). القدرة على اختبار بسرعة وبدقة لمجموعة شاملة مستندة إلى متلازمة من مسببات الأمراض هي أداة قيمة لتحسين الكفاءة وبيئة العمل من الاختبارات التشخيصية ولتشخيص أمراض الجهاز التنفسي الحادة والإدارة.

Introduction

مع الطلب للكشف السريع والشامل من وكلاء متعددة في التشخيص السريري للإنسان والحيوان، الكائنات احد الطرق الجزيئية للكشف عن العوامل المسببة للأمراض التشخيص مرهقة ما لم تستخدم لأعداد كبيرة من العينات التي يجري اختبارها لمرض واحد. في سياق البيطري، الإنتاجية العالية منهجيات التشخيص أهمية خاصة نظرا للحاجة إضافية لتغطية مسببات الأمراض من مجموعة واسعة من الأنواع. OneHealth أساليب إدارة الأمراض المنقولة عن طريق الأغذية ومراقبة العوامل المسببة للأمراض الناشئة هي أمثلة على احتياجات التجارب التي تشمل عددا من البكتيريا والفيروسات (DNA أو RNA القائم)، والطفيليات والفطريات. ويتمثل التحدي في الجمع بين اختبارات التحاليل متعددة معا (مضاعفة) من أجل تحسين كفاءة الاختبار هو احتمال فقدان حساسية وعبء كبير لتحسين والتحقق من المقايسات.

مقياس نانولتر في الوقت الحقيقي تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) هو مذبحمواطن لممارسة المتنوعة التي تتيح العديد من ردود الفعل منفصلة لتشغيل في نفس الوقت على نفس العينة ^1. منصة OpenArray هو تطبيق لهذا المبدأ ^2. فهو يجمع بين تكنولوجيا متطورة مع الوقت الحقيقي PCR. واستنادا إلى مفهوم المكانية المتعددة، يتم اختبار كل عينة لعدد كبير من الأهداف في منفصلة من خلال الثقوب. وقد استخدمت هذه المنصة في البداية مع الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل على أساس cyanine ملزمة كيمياء ^2، وتتوفر الآن للكيمياء القائم على التحقيق باستخدام تحقيقات تبريد المظلمة ^3. وفي المقام الأول تم استخدام هذه المنصة لالتنميط الجيني في البشر والحيوانات ^{4 5.} تم تكييفها مؤخرا للكشف عن الحمض النووي والحمض النووي الريبي مسببات الأمراض التي تنتقل عن طريق الدم عن طريق Grigorenko وآخرون. ⁶ باستخدام خطوتين عكس النسخ / قبل التضخيم (PREAMP) الإجراء.

نحن هنا وصف الإجراء القائم على PREAMP خطوة واحدة للكشف عن كلا النوعين من مسببات الأمراض في الجهاز التنفسي ثانيةretions ومجموعة متنوعة من أنواع العينات الأخرى التي يمكن أن يؤديها تماما في يوم العمل العادي. عند الانتهاء من PREAMP خطوة واحدة، يتم نقل العينات إلى لوحة 384 بشكل جيد، وهو الصيغة المقبولة من قبل نظام مناولة السائل الآلية التي تأتي مع هذا المقياس النانوي منصة PCR. النظام يسحب مزيج الرئيسي وعينة على سطح ما يصل الى 4 لوحات (192 عينات والضوابط) في وقت واحد. وبعد هذا عملية التحميل، نحن تصف كيفية تضخيم عينات وتحليلها باستخدام جدول بيانات الماكرو الذي يلخص بمعدل 3 مكررات التقنية لكل تركيبة نموذج / الهدف في الجدول الذي يناسب على الصفحة المطبوعة واحد.

وأنشئ طريقة موحدة لتحليل الحمض النووي المستخرج و / أو الحمض النووي الريبي من العينات باستخدام هذه المنصة. تم استخلاص مجموعة واسعة من العينات، نسخه عكس، وقبل تضخيمه في شكل 96-جيدا، والتقليل من احتمالات الأخطاء. شملت عينات الجهاز التنفسي اختبار مسحات الأنف، ومسحات البلعوم العميق،يغسل عبر القصبة الهوائية، غسل القصبات، وأنسجة الرئة. منذ بعض العوامل التي يمكن أن تكون موجودة في الدم المحيطي أو البراز أيضا اختبارها، ونحن أدرجت هذه الأنواع من العينات في الإجراء. هذا تبسيط العمل يساعد على توفير الوقت والموارد مقارنة مع تجارب تشغيل في لوحات متعددة من خلال تمكين اختبار كفاءة من خلال العوامل المسببة للأمراض والسموم الكشف عن الجين القائم على لوحة في مكان الاختبار الفردي. كانت لوحة الجهاز التنفسي تظاهر هنا 18 المقايسات طباعة كل في ثلاث نسخ من خلال الثقوب، واستيعاب ما يصل الى 48 عينات لكل لوحة. وشملت مسببات الأمراض الفروسية الكشف اتش الخيول 1 و 2، فيروس التهاب الشرايين الخيول، الخيول فيروس التهاب الأنف ألف وباء، هربس الخيول (EHV) أنواع 1 و 4، والمكورات العقدية الخيلية. وشملت مسببات الأمراض الكلاب الفيروس التاجى الكلاب التنفسي (betacoronavirus)، فيروس حمى الكلاب كلاب، اتش الكلاب، فيروس نظير الانفلونزا الكلاب، pneumovirus الكلاب، البورديتيلة قصبات، وcynos الميكوبلازما. اانفلونزا عالمي أدرجت أيضا على فحص والرقابة الداخلية (MS2 RNA فج).

Protocol

تم استخدام أي مواد بشرية أو حيوانات التجارب لتطوير هذا البروتوكول. تم إنشاؤها الضوابط التي كتبها تنقية amplicons مؤكدة تسلسل وفي النسخ المختبر لأهداف الحمض النووي الريبي. قدمت العينات السريرية لاختبار التشخيص الروتيني لمركز الصحة التشخيص كورنيل الحيوان.

تصميم 1. اللوحة

1. استخدام برامج التصميم التمهيدي للتحقق من أن كل فحص يتوافق مع الوقت الحقيقي الظروف PCR ركوب الدراجات القائم على التحقيق القياسية مع 60 ° C الصلب باستخدام أداة الاختبار التمهيدي التحقيق (تحديد الكمي التحقيق الإعداد مع المعلمات الافتراضية).
   ملاحظة: الهدف RNA التمثيلي المستخدمة وقد تم تكييف من انفلونزا عالمي مصفوفة استهدفت فحص نشرتها شو وآخرون ^7. الاشعال والتحقيق على النحو التالي: التمهيدي إلى الأمام: GACCRATCCTGTCACCTCTGAC، عكس التمهيدي: AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA، تحقيق: فام-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-QSY. وقد تم تكييف فحص الحمض النووي التمثيلي المستخدمة هنا جيئة وذهابام وفرسي نوع هربس 1 (EHV-1) طريقة الكشف التي نشرتها إيليا وآخرون. ^8. الاشعال والتحقيق على النحو التالي: التمهيدي إلى الأمام: GCTCTCAGGTTTTACGACATC، عكس التمهيدي: CTTTACCCAGGCCCTTGAAA، تحقيق: FAM-TCAACGTGGACAATACCGCAGTGATTAT-QSY.
2. طلب النانوية لوحات التضخيم PCR في تكوين المطلوب.
   ملاحظة: للحصول على هذه الدراسة، تم استخدام شكل التعبير 18x3 الجين (الجدول 1). تقديم متواليات لجميع الاشعال وتحقيقات (أو معرفات فحص جردها) لكل هدف إلى الشركة المصنعة.

2. نوكليك حمض استخراج

1. استخراج مجموع الحمض النووي (DNA و RNA) من خلال أي طريقة المطلوب.
   ملاحظة: تم استخدام المغناطيسية عدة استخراج القائم على حبة الآلي هنا وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (انظر الجدول المواد لمزيد من التفاصيل).
2. إعداد العينات على النحو التالي:
   1. تنظيف خارج كل حاوية عينة مع التبييض 10٪ ويجف تماما. مسح و القفازنصائح اينغر مع التبييض 10٪ بين عينات لمنع انتقال التلوث.
   2. مكان الأنف أو مسحات عميقة البلعوم في أي العقيمة، قارورة مختومة (مثل أنبوب جمع كبار الدم الحمراء) مع عدة قطرات من المياه المالحة وأضاف لمنع جفاف قبل المعالجة.
      ملاحظة: القطن والبلاستيك والخشب والتعامل معها، والداكرون ومسحات الاصطناعية الأخرى كلها مقبولة، ولكن تجنب مسحات الجينات الكالسيوم.
   3. لمسحات ويغسل القصبة الهوائية، إضافة Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) حتى لا يكون هناك 1-2 مل من السائل على الأقل. دوامة مسحة وDMEM بقوة في الأنبوب. ثم، واستخدام ماصة لنقل حوالي 1 مل من وسائل الاعلام لأنبوب جديد.
   4. الأنسجة ليز ميكانيكيا (100-200 ملغ في 1 مل من DMEM) باستخدام اختلال والأنسجة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة تليها الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 825 ز س. نقل 500 ميكرولتر من طاف لأنبوب جديد.
   5. لالبراز، والجمع بين 400 ملغ من البراز مع 800 ميكرولتر من 1X سا الفوسفاتخط 7.4 درجة الحموضة (PBS). دوامة تعليق لمدة 1 دقيقة أو أكثر حتى تكون العينة متجانسة أو أوقفت تماما. مرة واحدة متجانسة، الطرد المركزي تعليق لمدة 10 دقيقة في 18000 x ج، ثم نقل 400 ميكرولتر إلى أنبوب جديد.
   6. للدم uncoagulated كله، دوامة العينة وجعل قسامة 250 ميكرولتر. إضافة ست قطرات من كاشف التحللي ودوامة لخلط. احتضان 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
3. إعداد تحلل وغسل مخازن وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. إضافة MS2 فج أو الرقابة الداخلية من حرية الاختيار للتحلل العازلة كعنصر تحكم استخراج الإيجابية الداخلية ^9.
4. إضافة 235 ميكرولتر من تحلل العازلة و 175 ميكرولتر من عينة (أو برنامج تلفزيوني لمدة المراقبة السلبية) إلى كل أنبوب حبة. المضي قدما في بروتوكول الشركة المصنعة.
   ومزال تنقية مجموع الحمض النووي هنا في 90 ميكرولتر: ملاحظة.

3. عكس النسخ / قبل التضخيم (PREAMP)

ملاحظة: حافظ على جميع الكواشف والعينات المستخدمة فيرد فعل PREAMP على الجليد في جميع الأوقات. بعد PREAMP، والحفاظ على جميع الكواشف في درجة حرارة الغرفة.

1. تجميع الحمض النووي مزال و / أو RNA، PCR رد فعل ميكس، nuclease خالية من المياه كعنصر تحكم السلبية، والمعايير المجمعة للسيطرة على التضخيم إيجابية.
   ملاحظة: يمكن تشغيل ما يصل إلى 48 العينات على لوحة التضخيم بما في ذلك الضوابط (بما في ذلك واحد على الأقل السيطرة استخراج سلبية على كل لوحة استخراج منه عينات ليتم سحبها).
2. طباعة خريطة العينة. يملك الاختيار الشخص الثاني أن خريطة وعينة مباراة التخطيط.
3. في أنبوب 1.5 مل، إضافة التالية لتحضير مزيج PREAMP الرئيسي.
   ملاحظة: تم استخدام الحجم النهائي من 14 ميكرولتر هنا.
   1. إضافة مجموعة من الاشعال خلط من كل هدف من هذا القبيل أن تركيز النهائي لكل التمهيدي هو 900 نانومتر.
      ملاحظة: تجمع المستخدمة هنا أعد بتركيز 10X، و 1.4 ميكرولتر وأضاف في رد الفعل.
   2. إضافة البادئات العشوائية إلى التركيز النهائي من 600 نانومتر أو 0.1X. إضافة مزيج RT-QPCR 2X إلى نصف الحجم النهائي (7 ميكرولتر هنا).
   3. خلط المكونات مزيج الرئيسي معا قبل vortexing بلطف والغزل إلى أسفل.
4. أداء PREAMP في لوحة 96-جيدا القياسية باستخدام الجانب الأيسر من لوحة فقط (الأعمدة 1-6).
5. إضافة 8.5 ميكرولتر من مزيج الرئيسي PREAMP و 5.5 ميكرولتر من عينة DNA / RNA إلى كل بئر.
6. بعد دمج جميع الكواشف (عينات، وضوابط إيجابية وضوابط السلبية مع مزيج PREAMP)، وختم بدقة القياسية لوحة 96-جيدا مع ختم لاصقة واضح. إزالة أي ختم الزائد باستخدام شفرة حلاقة لمنع تشكيل الفجوات ختم أثناء ركوب الدراجات. أجهزة الطرد المركزي لوحة مغلقة لمدة 20 ثانية باستخدام لوحة الدوار PCR. تحقق للتأكد من يتم الجمع بين جميع الكواشف في الجزء السفلي من الآبار لوحة.
7. تشغيل فحص PREAMP على thermocycler التقليدية وفقا للشروط التالية: 15 دقيقة عند 50 درجة مئوية. 1 دقيقة في درجة حرارة 95 درجة مئوية؛ 20 دورات من 15 ثانية في 95 درجة مئوية، ثم 2 دقيقة عند 60 درجة مئوية. 99.9 & #176؛ ج لمدة 10 دقيقة. عقد في 4 درجات مئوية. برنامج هذه الشروط قبل البدء.
8. بدوره على thermocycler التقليدية، حدد البرنامج ركوب الدراجات PREAMP والبدء في البرنامج. وضع لوحة 96-جيدا في thermocycler فقط عندما يكون الجزء السفلي من thermocycler (وليس غطاء) تصل إلى درجة الحرارة المطلوبة لإنتاج كدنا] (50 ° C) من خلال مراقبة درجة الحرارة القراءة على الشاشة. قبل هذا، والحفاظ على البرد لوحة للحد من مخاطر نتائج إيجابية كاذبة.
9. مرة واحدة على المدى PREAMP اكتمال، تحقق من أن لوحة وظلت مختومة.
10. الشروع فورا في خطوة 4.1. لتخزين هذه اللوحة بين عشية وضحاها، نفذ التخفيف كما هو موضح في الخطوات 4،2-4،5، ولكن بدلا من تغطية فضفاضة لوحة، وختم لوحة مع ختم واضح لاصقة ومكان داخل حقيبة سستة قفل، وتخزينها في 4 درجة مئوية.

4. التخفيف من PREAMP لوحة

1. إزالة العدد المناسب من لوحات التضخيم جيئة وذهابام الثلاجة (تصل إلى 4 يمكن تشغيلها في وقت واحد). لا فتح العبوة. السماح لوحة في عملية الاحماء لمدة 15 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. تسجيل عدد والكثير المسلسل عدد من لوحة.
   ملاحظة: يمكن أن تبقى لوحات غير مفتوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 24 ساعة، ولكن لأفضل الممارسات، وإزالة هذه من الفريزر لا يزيد عن 30 دقيقة اللازمة قبل.
2. أجهزة الطرد المركزي لوحة PREAMP الانتهاء لمدة 20 ثانية باستخدام لوحة الدوار PCR. بدوره على آلة التضخيم والكمبيوتر وبدء البرنامج المقترن.
3. إزالة جميع العناصر غير الضرورية من منطقة الإعداد PCR. وضعت على قفازات مزدوج وكم الأغطية.
4. إزالة ختم من لوحة PREAMP وبعناية إزالة والتخلص من القفازات الخارجية. تمييع المنتجات PREAMP في 1: 5 وذلك بإضافة 56 ميكرولتر من العازلة TE إلى كل بئر من أعمدة 1-6 من لوحة PREAMP 96 جيدا وخلط pipetting صعودا وهبوطا. تذهب فقط إلى المحطة الأولى من ماصة، الشفط من القاع والاستغناء على مستوى اعلى، ولكن ليس خلقفقاعات. إضافة العازلة TE إلى كل الأعمدة 6 بغض النظر عن الآبار غير المستخدمة.
5. ختم لوحة مع أي مادة لاصقة واضحة أو رقائق الختم، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 20 ثانية باستخدام لوحة الدوار PCR. تعيين هذا الطبق جانبا (المشمولة فضفاضة) حتى خطوة 6.1 كاملة. تجاهل المتبقية القفازات وأغطية كم.

5. إعداد لنقل 384 بشكل جيد لوحة التضخيم

1. إعداد المواد اللازمة لتغطية وختم لوحة التضخيم: غطاء، والمكونات، حقنة من السوائل الغمر، اضغط على لوحة، وزجاجة الإيثانول بخ، ومناديل مختبر خالية من الوبر. إزالة الغطاء حقنة وقفل تلميح صغير من البلاستيك على حقنة (يتطلب قوة). إخراج كمية صغيرة من السائل الغمر على منشفة ورقية لإزالة تراكم الهواء (على ما يرام إذا بقيت بعض فقاعات الهواء الصغيرة في الطرف). استخدام السوائل الغمر في غضون 60 دقيقة من إزالة المحقنة من فراغ كيس مختوم الألومنيوم. مرة واحدة يتم فتح حقنة، لا أعد الغطاء لاستخدامها لاحقا.
2. الاختيارأن سلة المهملات لوحة معالج السائل تحميل فارغ وفتح مربع من النصائح. كتابة تاريخ انتهاء الصلاحية من النصائح على غلاف مربع تلميح عندما يتم فتح مربع جديد، والتأكد من أن النصائح التي لم تنته. تشغيل معالج السائل والكمبيوتر وفتح البرنامج معالج السائل، والتي سوف تؤدي اختبار ذاتي.
3. انقر على "إعداد وتحميل". انقر على زر "استعراض" لتحديد ملف CSV التي تم إنشاؤها من البرنامج عينة المقتفي. إذا لم يظهر الملف، انتقل إلى "تفضيلات / تحرير الصك" ثم انقر فوق "تغيير" من قبل "نموذج لوحة مجلد ملف". حدد المجلد حيث تم حفظ الملف CSV. ثم، انقر فوق "إعداد وتحميل"، ثم "تصفح" وحدد الملف.
4. التالي، انقر فوق "استعراض" بجانب "لوحة حامل موقف 1" وحدد ملف TPF (المقدمة من قبل الشركة المصنعة) الذي يحتوي على نفس الرقم التسلسلي مثل لوحة.

نقل 6. السائل معالج

ملاحظة: لا تبدأ فايlling لوحة 384 بشكل جيد حتى كافة الخطوات المذكورة أعلاه هي كاملة. التبخر هو مصدر قلق مع كميات صغيرة - لا تدع لوحة 384 جيدا الجلوس كشف مع السائل في الداخل.

1. مرة واحدة كل الخطوات المذكورة أعلاه يتم الانتهاء من وضع، قفازات مزدوج جديدة مجهزة بشكل جيد ويغطي كم. ثم، إضافة 2.5 ميكرولتر من مزيج الرئيسي التضخيم إلى 384 لوحة جيدا.
2. نقل 2.5 ميكرولتر من الناتج PREAMP المخفف لوحة 384 جيدا وفقا لخريطة في الجدول 2 وتغطية مباشرة لوحة بإحكام مع ختم احباط. تجاهل قفازات الخارجية وكم الأغطية.
3. أجهزة الطرد المركزي لوحة 384 جيدا لمدة 20 ثانية في لوحة الدوار PCR.
4. لا تقم بإزالة ختم احباط، ولكن وضع لوحة 384 جيدا في معالج السائل.
5. فتح الحزمة التي تحتوي على لوحة التضخيم المغطى ووضعه بعناية في معالج السائل في الفتحة الأولى مع الرقم التسلسلي على حق - عقد حالة من الحواف دون لمس س السطحو لوحة. استخدام لوحات غير ملفوف في غضون ساعة واحدة من فتح.
   ملاحظة: إن الغرض من هذه القضية هو لحماية لوحة من لمست، لأن ذلك يمكن أن تعكر صفو كميات صغيرة من الاشعال وتحقيقات داخل الثقوب من خلال.
6. إزالة ختم احباط من 384 لوحة جيدا داخل معالج السائل مرة واحدة كل شيء في المكان. انقر فوق التالي ثم تحقق من كل صناديق واكتمال كل خطوة. انقر فوق موافق لبدء التشغيل.
7. إغلاق باب إلى معالج السائل والبدء فورا في عملية التعبئة. البقاء بجانب معالج السائل والشروع فورا في الخطوة التالية مرة واحدة شغل في اللوحة.
8. أثناء تشغيل معالج السائل، وإزالة فيلم واقية من أسفل غطاء القضية.
   ملاحظة: لاصقة في الجزء السفلي من حالة غطاء تغطيها الروتين وفيلم واقية. يحتاج الفيلم إلى إزالتها أولا للوصول إلى الروتين.
   1. ترك الفيلم الأعلى في مكان حتى خطوة 6.15. رئيس الروتين عن طريق سحب قليلا لاطلاق سراحهمالبريد هو من لاصق.
9. إزالة تحميل (شغل) التضخيم لوحة من معالج السائل وبلطف وضعه في الصحافة لوحة مع الرقم التسلسلي على اليمين.
10. وضع غطاء على رأس لوحة مع نهاية حقق على اليمين ولاصق على الجزء السفلي (مشيرا نحو لوحة).
11. سحب لأسفل على رافعة الصحافة لوحة إغلاقه بعناية. وعلى ضوء فلاش لمدة 20 ثانية. لا تلمس الصحافة لوحة خلال هذه الفترة. وبمجرد أن يتحول الضوء الأخضر الصلبة، وترفع من رافعة بعناية وإزالة بعناية لوحة مغلقة بوضعها على الحواف.
12. في حين الضغط على لوحة التضخيم مختومة عموديا من الحواف القضية، تضاف فورا طرف الحقنة في ميناء التحميل في نهاية القضية، ثم الاستغناء السائل الغمر ببطء في حركة واحدة متواصلة لطيف لملء الفراغ بين لوحة و جفن العين. ترك واحد فقاعة الهواء الصغيرة في الزاوية مرة واحدة مغمورة لوحة.
13. مع الاستمرار في حالقديمة لوحة عموديا من الحواف، ختم ميناء التحميل عن طريق إدخال القابس في الميناء والتواء في اتجاه عقارب الساعة المكونات، وتطبيق ما يكفي من الضغط حتى يكسر مقبض خارج. قبضة حواف القضية بحزم بحيث قوة كسر مقبض لا يسبب حالة لإسقاط. إذا تم إسقاط لوحة، تخلص منه.
14. تنظيف الحال مع مسح أن خالية من الوبر تم رشها بدقة مع الايثانول. لتجفيف الحالة، مسح حالة الهبوط مع نظيفة يمسح. التعامل بلطف القضية؛ تأكد من عدم الضغط على الزجاج فوق الآبار.
15. تقديم لوحة مختومة إلى آلة التضخيم. تحت علامة التبويب "أدوات"، اختر "وحدة التحكم الصك." حدد الجهاز التضخيم ثم انقر على زر "الباب المفتوح".
16. وضع لوحة التضخيم في الفتحة الأولى من محول لوحة، والتحقق من أن محول واصطف بشكل صحيح مع A1 في الزاوية اليسرى العليا. توجيه لوحة مع الباركود التي تواجه صعودا ونحوالجزء الأمامي من الصك. انقر فوق الزر "إغلاق الباب". لاحظ استخدام علبة محول - هناك حد من 10 الاستخدامات.
17. ضمن علامة التبويب الرئيسية في الجزء السفلي من الشاشة، ضمن القائمة تشغيل حدد OpenArray. انقر على "احصل على معرفات اللوحة." والعلب الفارغة سيتم ملؤها تلقائيا مع معلومات حول اللوحة. لبدء تشغيل، انقر فوق "بدء تشغيل".
18. إغلاق برنامج معالج السائل وإيقاف معالج السائل. وضع غطاء أكثر من طرف رف طرف. تجاهل نصائح من سلة المهملات وتنظيفه. نظيفة وتطهير جميع العناصر بما في ذلك سطح العمل، ماصة، دلو النفايات، وصناديق النصائح.
19. ختم لوحة PREAMP مع ختم لاصقة واضح ومخزن في -20 درجة مئوية.

تحليل 7. النتيجة

1. وبمجرد الانتهاء من تشغيل، وحفظ الملف ثم اضغط على "X" في علامة التبويب مع اسم المدى في الجزء السفلي من الشاشة لإغلاق الملف.
2. انقر على "الباب المفتوح"في الجزء العلوي من الشاشة لفتح الباب. إزالة لوحة التضخيم، والتحقق من عدم وجود السائل الغمر قد تسربت. انقر على" إغلاق الباب "في الجزء العلوي من الشاشة لإغلاق الباب.
3. انقر فوق "فتح" وحدد ملف التشغيل لفتحه. اضغط على زر أخضر تحليل في أعلى يمين الشاشة. انقر فوق "تصدير" على الجانب الأيسر من الشاشة ثم "بدء التصدير" لتصدير النتائج (كملف .txt). تقليل الملف بعد فتحه. ثم، انقر فوق "الصور تصدير مراقبة الجودة."
4. استعراض الصور مراقبة الجودة في برنامج تحليل الصور وفقا للمعايير التالية:
   1. تقييم جودة التحميل باستخدام PRE-READ_CHANNEL_4.tiff وما بعد READ_CHANNEL_4.tiff، من خلال التحقق من أن عدم وجود بقع داكنة أو اللطخات.
      ملاحظة: صبغة الكشف عنها من قبل هذه القناة يضاف من قبل الشركة المصنعة للأجهزة الاشعال وتحقيقات، الذي صدر في حل عندما يتم تحميل رد فعل. القراءة في هذه القناة إلى أن ردود الفعل كانت بشكل صحيحتحميل وأن الاشعال والتحقيق مختلطة مع صبغة كانت موجودة.
   2. تحقق من وجود تسرب أو التحريض على لوحة بعد تحميل باستخدام S02_C001_t03_p001_m1_x2_e1_cp # _spotfind.tiff. إذا كانت الصورة تبدو مظلمة، وزيادة سطوع (اضغط Ctrl + Shift + C لفتح الضوابط) حتى لوحة كاملة مرئيا. تأكد من أن الصورة تبدو موحدة مع عدم وجود الظلال، فقاعات، أو عينات النازحين.
   3. تقييم وضع الغطاء والحطام تحت غطاء (نقاط مضيئة) باستخدام STAGE2_CYCLE1_CHANNEL_1.tiff وSTAGE2_CYCLE40_CHANNEL_1.tiff.
5. اختياري: فتح جدول بيانات تحتوي على ماكرو نتائج (التكميلي ملف التعليمات البرمجية). في ملف البيانات التي تم تصديرها، انقر بزر الماوس الأيمن على علامة التبويب في الجزء السفلي من الشاشة وحدد "نقل أو نسخ". في الميدان "للكتاب"، حدد "النتائج Macro.xlsm". انقر على "الانتقال إلى إنهاء" وتحقق مربع "إنشاء نسخة". ثم، انقر فوق موافق.
   1. إذا لم يظهر الخيار نتائج ماكرو في الميدان "للكتاب"، وسيمرقائق نسخ محتويات ورقة عمل ملف البيانات التي تم تصديرها (انقر على الخلية اليسرى العليا لتسليط الضوء على جميع الخلايا والسيطرة-C) ولصقه في علامة تبويب جديدة.
6. حذف القديم "تصدير" التبويب ثم إعادة تسمية علامة التبويب المضافة حديثا باسم "تصدير".
7. انقر على "البديل-F8" (أو انقر فوق عرض ثم وحدات الماكرو) ثم اختر "ماكرو" وانقر على زر "تشغيل". ثم كرر هذا لMacro2 بالنقر على "البديل-F8" ثم اختيار "Macro2" والنقر على "تشغيل".
8. إعادة تسمية ملف نتائج ماكرو باستخدام معلومات ذات صلة (التاريخ والرقم التسلسلي)، وضعت هذه المعلومات فوق الطاولة، وباستثناء ما نفس اسم الملف في مجلد نتائج المصدرة. وأخيرا، وطباعة الجدول النتائج المتولدة الماكرو.
9. في برنامج آلة التضخيم، والتحقق من منحنيات لكل عينة والسيطرة على الطاولة الكلي عن طريق اختيار تحليل / التضخيم مؤامرة على الجانب الأيسر من الشاشة. ثم، حدد علامة التبويب نموذج، وفوق كل عينة لتأكد من أن هناك 2 أو 3 منحنيات التضخيم إيجابية لكل من النتائج الإيجابية في الجدول.
10. إيقاف آلة التضخيم.

Representative Results

وتظهر النتائج في أرقام 1 و 2 لفحص الحمض النووي الريبي التمثيلي (مصفوفة الانفلونزا) وفحص الحمض النووي (EHV-1) مع مجموعة من الضوابط الإيجابية والعينات السريرية المقدمة للاختبار التشخيص الروتيني. وتظهر إشارات مضان المنبعثة خلال هذا رد فعل نموذجي في الشكل رقم 1، الذي المؤامرات القيم مضان الخام لكل دورة. تم إنشاؤها فقط (ط) القيم عتبة دورة النسبية تلقائيا بواسطة برنامج آلة التضخيم. وقد استخدم مضان الخلفية كمقياس مستقل لتقييم جودة تحميل بدلا من إدراجه في قراءات مضان قبل حساب القيم ط.

الحد التحليلي للكشف (اللد) لكل هدف تم حسابها على أساس المتوسط ​​العام لقيم ط م على مستوى الكشف عن 95٪ زائد 2 الانحرافات المعيارية في مجموعة من الضوابط لجميع الأهداف. وكان أعلى التخفيف حيث كانت 95٪ على الأقل من مكررات إيجابية للفحوصات تمثيلية 50 نسخة. وكان الكشف عن 5 نسخ بنجاح في 50٪ من مكررات. تم الكشف لا مقايسة بأسعار أقل من نسخة واحدة. وحسبت LODs عن الحمض النووي الريبي والحمض النووي فحص في القيم ط م من 21.92 و 20.05. واعتبرت هذه القيم ليكون انقطاع للقيم التقارير كما إيجابية مقابل المشتبه به (يحتمل أن تكون قابلة للتكرار لا).

تم تقييم جوانب أخرى من الأداء التحليلي من الأهداف باستخدام التخفيفات المسلسل من الضوابط الإيجابية مجمعة تعمل على ثلاثة أيام مختلفة (الشكل 2). كان متوسط ​​الكفاءة من الحمض النووي الريبي والحمض النووي المقايسات تمثيلية 101.1٪ و 106.6٪. كان متوسط ​​الكفاءة الإجمالية لجميع الأهداف 101.3٪. كان المقايسات أيضا الخطي جيدة (R ^2> 0.98). من خلال الثقوب عادة كان الاختلاف في تكرار ضمن الانحرافات المعيارية من 0.2 لكل من العينات السريرية لضوابط د. ولم يلاحظ أي عبر التفاعل بين أي من الأهداف.

ورقة العمل النتائج النهائية في ملف التكميلي تظهر النتائج الكمية التمثيلية لمدة 10 عينات التشخيص السريري و 4 ضوابط. العينات السريرية هي مجموعة فرعية من أنواع العينات اختبار روتيني بما في ذلك الأنف / مسحات البلعوم، أنسجة الرئة، وعينات البراز. معارض واحد (الفروسية) عينة البراز في هذه المجموعة على الرقابة الداخلية MS2 فاشلة، مما يدل على وجود مثبطات في العينة. وعادة ما يدار هذا من خلال التخفيف من العينة مزال و / أو إعادة استخراج. كما هو الحال هنا، يجب أن تكون السيطرة التضخيم السلبية السلبي لجميع الأهداف، ومراقبة استخراج السلبية يجب أن تحتوي فقط على الرقابة الداخلية. في المجموعة السريري، أنتجت عينات القيم ط لbetacoronavirus، البورديتيلة قصبات، الكلاب نكد الفيروس A، فيروس نظير الانفلونزا الكلاب، pneumovirus الكلاب، والإنفلونزاا.

يتم رسم الشكل 1. المؤامرات التضخيم. القراءات الإسفار ضد دورات التضخيم لفحص الحمض النووي الريبي (A) وفحص الحمض النووي (B). وتظهر مثلثات تدل القيم ط. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2. منحنيات القياسية. منحنيات القياسية من الحمض النووي الريبي والحمض النووي فحص اختبار على ثلاثة أيام مختلفة يتم رسم من أجل إظهار الخطي ومجموعة من التضخيم باستخدام الضوابط الإيجابية. عتبة دورة يتم رسم (ط) القيم على سجل (10) من عدد نسخ الحمض النووي الريبي (A) أو الحمض النووي ( الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1. تخطيطي لوحة والهدف المواقع التضخيم. لوحات تستخدم لالنانو في الوقت الحقيقي PCR التجارب على هذا المنبر هم المجهر الشريحة الحجم ومرتبة في 48 subarrays من 64 من خلال الثقوب، مع ما مجموعه 3072 من خلال ثقوب لردود الفعل الفردية. ويرد واحد subarray هنا، مع 18 هدفا في ثلاث نسخ. يضاف كل عينة لsubarray واحدا تلو معالج السائل. والمغلفة لوحات مع المركبات المائية ومسعور الاحتفاظ الكواشف في ثقوب من خلال عبر التوتر السطحي. و"منقوشة photolithographically شرائح الفولاذ المقاوم للصدأ والرطب محفورا على تشكيل مجموعة مستقيمة من 3072 تشكيله الدقيقة، 320 ميكرون diamete. ص ثقوب 33 نيكولا لانغ كل ^"2 الاختصارات للأهداف هي كما يلي: BCOR، التاجى التنفسي الكلاب (betacoronavirus)؛ BORD، البورديتيلة قصبات الخيالة، اتش الكلاب، CPIV، الكلاب الفيروس نظير الانفلونزا، CPNV، pneumovirus الكلاب، DISTA / B، والكلاب نكد فيروس A و B، EADV1 / 2، اتش الخيول 1/2، EAV، فيروس الخيول الشرايين، EHV1 / 4، الخيول نوع هربس 1/4، ERVA / B، فرسي فيروس التهاب الأنف A / B، IVM، الأنفلونزا A مصفوفة. MCYNOS، الميكوبلازما cynos؛ MS2، والرقابة الداخلية (MS2 RNA فج)؛ SEQU، العقدية الخيلية.

ويظهر الجدول 2. نقل لوحة خريطة. صفيحة خريطة نقل مرمزة لاستخدام ثابت ماصة 8 قنوات لنقل من لوحة PREAMP 96-جيدا لوحة 384 جيدا. بدلا من ذلك، يمكن استخدام ماصة للتعديل. يتم تنفيذ الإجراء نفسه في كل مرة بغض النظر عن ح آه العديد من العينات في اللوحة.

يتم تقديم ملف تكميلي. ملف جدول تمكين ماكرو يحتوي على اثنين من وحدات الماكرو لنتائج التنسيق في جدول ملخص (كما هو موضح في البروتوكول). يتم تضمين جدول نتيجة النموذجية التي تم إنشاؤها بواسطة وحدات الماكرو في ملف (تحت النتائج النهائية). وكانت وحدات الماكرو اثنين في ملء أسماء عينة في العمود الأول (تصل إلى 48 عينة) ومتوسط ​​قيم ط م ثلاثة لكل هدف لذوي نتائج إيجابية. نلاحظ أن الأهداف التي لم تضخيم تظهر فارغة في هذا الجدول. هذا يمكن طباعتها بسهولة على قطعة واحدة من الورق ويستخدم كمرجع للتحقق من البيانات الخام بكفاءة. في علامة التبويب النتائج النهائية، وتظهر نتائج تمثيلية لمدة 10 عينات سريرية و 4 ضوابط. وترد الاختصارات لأسماء فحص في أسطورة من الجدول 1.www.jove.com/files/ftp_upload/54781/supplemental_code_file_R1.xlsm "الهدف =" _ فارغة "> اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Discussion

وقد استخدم هذا الإجراء لاختبار روتيني من مسببات الأمراض التنفسية في المختبر لدينا على مدى ستة أشهر (2-3 مرات في الأسبوع). كان لدينا أيضا نجاح استخدام نفس الإجراء لتحديد ملامح الممرض المعوية في عينات البراز والعزلات البكتيرية على لوحة مخصصة بشكل منفصل. مرة واحدة يتم إنتاج لوحات، ويمكن للموظفين ذوي الخبرة استكمال الخطوات 2-7 في غضون ساعات العمل القياسية واحد. الخطوات الأكثر أهمية هي ختم الصحيح من لوحة PREAMP، ونقل عينات preamplified بين لوحات (والذي يجب أن يتم بسرعة لمنع التبخر)، وتغطي النهائي للوحة التضخيم. كان استخدام جداول البيانات الكلي كدليل لتحليل نتيجة (فحص منحنيات للعينات والضوابط) بالغ الأهمية أيضا لأنها تقلص إلى حد كبير مقدار الوقت والأوراق اللازمة لهذه العملية. جدول الكلي قدمت مثالا. أنها تحتاج إلى تعديل أو إعادة إنشاء لوحات مع تكوينات مختلفة. هذا يمكن أن يكون بسهولة المؤسسة العامةrformed من قبل شخص ما مع معرفة جدول الأساسية.

ويرجع ذلك إلى كمية صغيرة جدا من العينة تحميلها على لوحة التضخيم (33 NL)، مطلوب قبل التضخيم. في الاستفادة المثلى من هذا البروتوكول (لا يظهر)، قارنا عدد من المعلمات preamplification بما في ذلك مزيج الرئيسي، إضافة البادئات العشوائية، عدد من الدورات، وقت الصلب، والتخفيف قبل التضخيم. وكان كل هدف الظروف المثلى الخاصة بها، وتلك التي وصفها هنا تمثل تلك التي حققت أفضل الحد من عموما الكشف عن لوحة لدينا. وتغطي هذه اللوحة مجموعة واسعة من الأهداف المسببة للأمراض وأنواع العينات التي واجهتها في الاختبار الروتيني التشخيص البيطري، ولكن تعديلات على إجراءات preamplification قد يكون ضروريا لوحات مختلفة. وتستند هذه الظروف التضخيم الأمثل المصنعة على بروتوكول قياسي القائم على التحقيق في الوقت الحقيقي PCR مع 10 دقيقة في 95 درجة مئوية تنشيط انزيم تليها تمسخ في 95 درجة مئوية وآنإيلينغ / تمديد في 60 درجة مئوية. الاشعال وتحقيقات هي على لوحات أيضا باستخدام الظروف الأمثل الشركة المصنعة، وبالتالي لا تتطلب المعايرة مطبوعة مسبقا. الجمع بين العكسية النسخ وقبل التضخيم الخطوات لجميع العينات (بغض النظر عن نوع الهدف) من الضروري من أجل الحفاظ على الكفاءة في العمل. وجود جميع عينات عكس كتب هو أيضا مفيد لتحقيق أقصى قدر من الحساسية. وعلاوة على ذلك، واستخدام مزيج الرئيسي لPREAMP التي يتم أمثل لمثبطات تقليل يسمح براعة في الجمع بين أنواع عينة مختلفة على نفس اللوحة.

مركز السيطرة على الأمراض (CDC) فحص مصفوفة الإنفلونزا التي وصفها شو وآخرون. ⁽⁷⁾ وتكييفها هنا لردود الفعل على نطاق ونانولتر هو انفلونزا عالمي وفحص غير مناسبة لفحص عينات من البشر والحيوانات الأليفة. وقد صمم هذا البرنامج للكشف الشامل على الجينات مصفوفة من جميع فيروسات الأنفلونزا A باستخدام الجرمية نطاق ميكروليترctions. وقد تم استخدامه في جميع أنحاء العالم كجزء من لوحة الفيروسات CDC الأنفلونزا البشرية ولوحة انفلونزا الخنازير CDC. فحص EHV-1 ⁸ تكييفها هنا بالكشف عن العوامل المسببة للأمراض في الجهاز التنفسي هاما من الخيول التي يمكن أن تسبب الإجهاض والأمراض العصبية (التي استعرضتها Pusterla وهاسي ^10). أهمية التكيف مع هذه الاختبارات إلى منصة عالية الإنتاجية مع الرقابة الداخلية المستقلة الأنواع هي التي يمكن إدراجها في نهج المراقبة OneHealth. وجود كل من هذه المقايسات على الإنتاجية العالية اختبار منصة تسهيل التأهب لحالات الطوارئ للمرافق الطبية، والملاجئ، والأحداث الأداء.

وكانت النتائج المذكورة أعلاه ممثلة لجميع الأهداف التي تظهر على لوحة باستثناء الميكوبلازما cynos، والتي أظهرت قدرا أكبر بكثير من التباين في الأداء التحليلي. كان هذا الأرجح بسبب درجة الحرارة دون المستوى الأمثل ذوبان (T _م) من الاشعال، الذي يجب أن يكون مثاليا 58-60 &# 176؛ ج (المثالي التحقيق تيم هو 68-70 درجة مئوية). وجود قيود على هذا المنبر هو ان الامر يستغرق وقتا أطول لتصميم وتصنيع لوحات من لترتيب تحقيقات الفردية، مما يحد من القدرة على تعديل بسرعة متواليات. الحد آخر في الوقت الحقيقي PCR بشكل عام هو عدم القدرة على الكشف عن رواية أو مسببات الأمراض غير متوقعة. ويمكن التغلب على هذه إلى حد ما من خلال تصميم فحوصات تطابق تسلسل في أنواع متعددة، ولكن منهجيات مشاركات كامل الجينوم التسلسل أساس أكثر ملاءمة لاكتشاف وكلاء الرواية. ^11،12

النانو في الوقت الحقيقي PCR يسمح نموذج جديد بدلا من التركيز على الاختبار التي تعتمد الأنواع، وهو أمر مفيد للحد من تكاليف كاشف والعمل في التشخيص الجزيئي عالية الإنتاجية القائمة على متلازمة. لوحة اختبار على نطاق واسع من قبل هذا النهج يمكن أن يسهل جهود المراقبة OneHealth مثل تلك التي وصفها دان وGurfield ¹³ و Moutailler وآخرون. ^14. جمع عينات مسحة في وقت مبكر،عادة في غضون 3 أيام من الإصابة السريرية، يوفر أفضل فرصة لتحديد وجود مسببات الأمراض في الجهاز التنفسي. ظهور الأمراض المعدية في كثير من الأحيان لا يمكن التنبؤ بها، والاختبارات التي يمكن القيام بها على الأنواع المختلفة من دون الحاجة لتعديل الكواشف هي مثالية للتأهب. من المحتمل أن تكون في pathotyping، التنميط مقاومة مضادات الميكروبات، والمزيد من لوحات التشخيص السريري على أساس متلازمة التطبيقات المستقبلية لهذه التكنولوجيا. النانو في الوقت الحقيقي PCR هو الأكثر فائدة للالسريع، وفحص عالية الإنتاجية من عدة عينة والممرض أنواع، وسوف تستكمل النهج مشاركات أو منحازة جزئيا على أساس التسلسل لتحديد مسببات الأمراض الجديدة والناشئة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zap-OGlobin II lytic reagent	Beckman Coulter	7546138	Optional reagent for preparing blood samples.
Extraction kit (MagMAX Total Nucleic Acid Isolation Kit)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	AM1840	Other extraction kits appropriate for the desired sample types may be substituted. This kit comes with PBS, lysis buffer, and wash buffer.
2x One-Step RT-qPCR mix (qScript XLT One-Step RT-qPCR ToughMix)	Quanta Biosciences	95134-500
Gene-specific primer pool	IDT	custom order	Can be generated by the user or purchased with the amplification plates.
Random primer mix	New England Biolabs	S1330S
Standard 96-well plate	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	N8010560	This can be any plate that fits into the conventional PCR machine used.
Amplification master mix (OpenArray master mix)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4462164
Clear adhesive seal	Thermo-Fisher	430611
Foil seal	Excel Scientific	AF-100
384-well plate	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4482221
Amplification plate (QuantStudio 12K Flex OpenArray plate)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4470813	Can be customized with any assays conforming to standard TaqMan conditions.
Accessories kit	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4469576	Contains the case lids, plugs, and immersion fluid.
AccuFill tips	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4457246
Amplification machine (QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4471090
Liquid handler (OpenArray AccuFill System)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4457243	This is purchased with the amplification machine.
Primer design software (Primer Express)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4363991	See manufacturer's instructions for detailed primer and probe specifications.
Image analysis program (ImageJ)	NIH		Available at http://imagej.nih.gov/ij/
Spreadsheet program (Excel)	Microsoft		Available at https://products.office.com/en-us/excel
DMEM	Thermo-Fisher/Gibco	11965-092
Tissue disruptor (TissueLyser II)	Qiagen	85300
Conventional thermal cycler (Veriti)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4375786	Any conventional thermal cycler with a heated lid can be used.
PCR plate spinner	VWR	89184-608	This device has only one speed (2,500 rpm); the rotor starts when the lid is closed and stops when the button is pushed.
TE buffer	Millipore	8890-100ML	10 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride, 1 mM Ethylenediaminetetraacetic acid, pH 8.0