High-throughput Påvisning af respiratoriske patogener i Animal Prøver af Nanoscale PCR

Summary

High-throughput test af DNA og RNA baserede patogener efter nanoskala PCR beskrives med en syndromiske hunde og heste respiratorisk PCR panel.

Abstract

Nanoliter skala real-time PCR bruger rumlig multiplexing at tillade flere analyser, der skal køres parallelt på en enkelt plade uden de typiske ulemper ved at kombinere reaktioner sammen. Vi har designet og evalueret et panel baseret på dette princip til hurtigt at identificere tilstedeværelsen af ​​fælles sygdom agenter i hunde og heste med akut respiratorisk sygdom. Dette håndskrift beskriver nanoskala diagnostisk PCR workflow for prøveforberedelse, forstærkning, og analyse af target patogene sekvenser, med fokus på procedurer, der er forskellige fra mikroliter skala reaktioner. I det respiratoriske panel præsenteret, blev 18 analyser hver oprettet i tre eksemplarer, plads til op til 48 prøver pr plade. En universel ekstraktion og præ-amplifikation arbejdsgang blev optimeret for høj-throughput prøveforberedelse at rumme flere matricer og DNA- og RNA-baserede patogener. Repræsentative data er præsenteret for et RNA-mål (influenza A-matrix) og en DNA-mål (equin herpesvirus1). Evnen til hurtigt og præcist at teste for en omfattende, syndrom-baserede gruppe af patogener er et værdifuldt redskab til at forbedre effektiviteten og ergonomi diagnostisk test og for akut luftvejssygdom diagnosticering og behandling.

Introduction

Med kravet om en hurtig og omfattende afsløring af flere agenter i klinisk diagnostik for mennesker og dyr, single-organisme molekylær-diagnostiske metoder til påvisning af patogener er belastende, medmindre der anvendes til et stort antal prøver bliver testet for en enkelt sygdom. På veterinærområdet sammenhæng højt gennemløb diagnostiske metoder er særligt vigtigt på grund af det yderligere behov for at dække patogener fra en lang række forskellige arter. OneHealth tilgange til ledelse af fødevarebåren sygdom og nye patogen overvågning er eksempler på test behov, der omfatter en række bakterier, virus (DNA eller RNA baseret), parasitter og svampe. Udfordringen til at kombinere test for multiple analytter sammen (multiplexing) for at forbedre undersøge effektiviteten er et muligt tab af følsomhed og en stor byrde for optimering og validering af assays.

Nanoliter skala realtid polymerasekædereaktion (PCR) er en alterindfødte til den praksis, multiplexing, der tillader mange forskellige reaktioner til at køre samtidigt på den samme prøve ^en. Den OpenArray platform er en anvendelse af dette princip ^2; det kombinerer microarray teknologi med real-time PCR. Baseret på begrebet rumlige multiplexing, hver prøve testet for en lang række mål i separate gennemgående huller. Denne platform blev oprindeligt brugt med cyanin-baserede dobbeltstrenget DNA bindende kemi ² og er nu tilgængelig for sonde-baseret kemi hjælp mørke quenching sonder ^3. Denne platform er primært blevet anvendt til genetiske profiler hos mennesker ⁴ og dyr ^5. Det blev for nylig indrettet til at detektere blodbårne DNA- og RNA patogener ved Grigorenko et al. ⁶ under anvendelse af en totrins-revers-transkription / præ-amplifikation (forforstærker) procedure.

Vi beskriver her en ettrins forforstærker-baseret procedure til påvisning begge typer patogener i respiratorisk secretions og en række andre prøvetyper der kan udføres helt i en standard arbejdsdag. Ved afslutningen af ​​en-trins forforstærker, er prøverne overført til en plade med 384 brønde, som er det format accepteres af automatisk håndtering systemet væske, der kommer med denne nanoskala PCR platform. Systemet trækker master mix og prøve hen over overfladen på op til 4 plader (192 prøver og kontroller) ad gangen. Efter denne lastning proces, vi beskriver, hvordan prøver forstærkes og analyseres ved hjælp af en makro regneark, der opsummerer gennemsnit på 3 tekniske replikater for hver prøve / target kombinationen i en tabel, der passer på én udskrevet side.

En ensartet metode til analyse af ekstraheret DNA og / eller RNA fra prøver ved hjælp af denne platform blev etableret. En lang række prøver blev ekstraheret, revers-transkriberet, og præ-amplificeret i et 96-brønds format, hvilket minimerer risikoen for fejl. Respiratoriske prøver testede inkluderet nasale podninger, dybe svælg podninger,trans-luftrør vasker, bronchoalveolær lavage og lungevæv. Da nogle af de afprøvede kan også være til stede i perifert blod eller afføring agenter, vi indarbejdet de typer af prøver til proceduren. Denne strømlinede workflow sparer tid og ressourcer i forhold til at køre eksperimenter på flere plader ved at muliggøre en effektiv test via panel-baserede patogen og toksin gen opdagelse i stedet for individuel test. Den respiratoriske panel demonstreret her havde 18 analyser hver trykt i tre eksemplarer gennemgående huller, plads til op til 48 prøver pr plade. De heste patogener påviste omfattede heste adenovirus 1 og 2, heste arteritis virus, heste rhinitis virus A og B, heste herpesvirus (EHV) type 1 og 4, og Streptococcus equi. De hunde patogener omfattede hunde respiratorisk coronavirus (betacoronavirus), hundesyge virus, hunde adenovirus, hunde parainfluenzavirus, hunde pneumovirus, Bordetella bronchiseptica og Mycoplasma cynos. ENuniversel influenza A assay og en intern kontrol (MS2 RNA fag) var også inkluderet.

Protocol

Ingen mennesker eller forsøgsdyr blev brugt til udvikling af denne protokol. Kontroller blev dannet ved oprensning af sekvensspecifikke bekræftet amplikoner og in vitro transkription til RNA-targets. Kliniske prøver blev indsendt til rutinemæssig diagnostisk test til Cornell Animal Health Diagnostic Center.

1. Plade Design

1. Brug primer design software til at kontrollere, at hvert assay i overensstemmelse med standard probebaserede realtids-PCR cyklusbetingelser med 60 ° C annealing anvendelse af primeren probetest værktøj (vælg kvantificering probe indstilling med default-parametre).
   BEMÆRK: repræsentativ RNA-target brugt blev tilpasset fra den universelle influenza A matrix målrettet analyse publiceret af Shu et al ^7.. Primerne og proben er som følger: Forward primer: GACCRATCCTGTCACCTCTGAC, reverse primer: AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA, Probe: Fam-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-QSY. Det repræsentative DNA-analysen bruges her blev tilpasset from heste herpesvirus type 1 (EHV-1) afsløring metode publiceret af Elia et al. ^8.. Primerne og proben er som følger: Forward primer: GCTCTCAGGTTTTACGACATC, reverse primer: CTTTACCCAGGCCCTTGAAA, Probe: FAM-TCAACGTGGACAATACCGCAGTGATTAT-QSY.
2. Bestille nanoskala PCR-amplifikation plader i den ønskede konfiguration.
   BEMÆRK: For denne undersøgelse blev 18x3 genekspression format, der bruges (tabel 1). Tilvejebringe sekvenser for alle primere og prober (eller fortegnelserne assay ID'er) for hvert mål til fabrikanten.

2. Nucleic Acid Extraction

1. Uddrag total nukleinsyre (DNA og RNA) med enhver ønsket metode.
   BEMÆRK: En automatiseret magnetisk perle-baserede ekstraktion kittet blev anvendt her i overensstemmelse med producentens anvisninger (se materialer tabellen for flere detaljer).
2. Forbered prøver som følger:
   1. Rengør ydersiden af ​​hver prøve beholder med 10% blegemiddel og tør grundigt. Tør behandsket fInger tips med 10% blegemiddel mellem prøver at forhindre krydskontaminering.
   2. Sted nasal eller dybe svælg svaberprøver i enhver steril, forseglet hætteglas (såsom en rød top blodopsamlingsrør) med flere dråber saltvand tilsat for at forhindre udtørring før bearbejdning.
      BEMÆRK: Bomuld, plast, træ-håndteret, og Dacron og andre syntetiske podninger er alle acceptable, men undgå calcium alginat podninger.
   3. For podninger og tracheale vasker, tilføje Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM), således at der er mindst 1-2 ml væske. Vortex vatpind og DMEM kraftigt i røret. Brug derefter en pipette til at overføre ca. 1 ml medier til et nyt rør.
   4. Mekanisk lyserer væv (100-200 mg i 1 ml DMEM) under anvendelse af et væv disruptor ifølge producentens instruktioner, efterfulgt af centrifugering i 3 minutter ved 825 x g. Overfør 500 ul af supernatanten til et nyt rør.
   5. For afføring, kombinere 400 mg fæces med 800 pi 1x phosphatpufret saline pH 7,4 (PBS). Vortexes suspensionen i 1 minut eller længere, indtil prøven homogeniseres eller helt suspenderet. Når homogeniseret, centrifugeres suspensionen i 10 minutter ved 18.000 xg, derefter overføre 400 pi til et nyt rør.
   6. For hele koaguleret blod, vortex prøven og lave en 250 pi portion. Tilføj seks dråber lytisk reagens og vortex at blande. Inkuber 15 minutter ved 37 ° C.
3. Forbered lyse- og vaskebuffere ifølge producentens anvisninger. Tilføj MS2 fag eller en intern kontrol af valg til lysis buffer som en intern positiv udtræk kontrol ^9.
4. Tilføj 235 pi lysisbuffer og 175 pi prøve (eller PBS i negativ kontrol) for at hver perle rør. Fortsæt med fabrikantens protokol.
   BEMÆRK: Oprenset total nukleinsyre blev elueret her i 90 pi.

3. Reverse-transskription / Pre-forstærkning (preamp)

BEMÆRK: Hold alle reagenser og prøver, der anvendes iforforstærker reaktion på is hele tiden. Efter preamp, holde alle reagenser ved stuetemperatur.

1. Saml elueret DNA og / eller RNA, PCR Reaction Mix, nuclease-frit vand som en negativ kontrol, og poolede standarder for positiv forstærkning kontrol.
   BEMÆRK: kan køres op til 48 prøver på en forstærkning plade herunder kontrol (omfatte mindst én negativ udvinding kontrol for hver ekstraktion plade, hvorfra prøverne skal trækkes).
2. Udskriv en prøve kort. Har en anden person, kontrollere, at kortet og prøve layout kamp.
3. I en 1,5 ml rør, tilføje følgende at forberede preamp mester mix.
   BEMÆRK: En slutvolumen på 14 pi blev anvendt her.
   1. Tilføj en pulje af færdigblandede primere fra hvert mål, således at slutkoncentrationen af ​​hver primer er 900 nM.
      BEMÆRK: bruges her pulje var forberedt på en 10 x koncentration, og 1,4 pi tilføjet per reaktion.
   2. Tilføj vilkårlige primere til en slutkoncentration på 600 nM eller 0,1x. Tilføj 2x RT-qPCR blanding til halvdelen af ​​det endelige volumen (7 pi her).
   3. Bland Master mix komponenterne sammen ved forsigtigt vortexing og nedspinning.
4. Udfør forforstærker i en standard 96-brønds plade under anvendelse af venstre side af pladen kun (kolonne 1-6).
5. Tilføj 8,5 pi preamp mester mix og 5,5 pi DNA / RNA-prøve til hver brønd.
6. Efter kombination alle reagenser (prøver, positive kontroller og negative kontroller med Preamp mix), grundigt forsegle standard 96-brønds plade med et klart selvklæbende forsegling. Fjern overskydende forsegling ved hjælp af et barberblad for at forhindre dannelse af sælprodukter huller under cykling. Centrifugeres den forseglede plade i 20 sekunder under anvendelse af en PCR-plade spinner. Kontrollér alle reagenser kombineres i bunden af ​​pladen brønde.
7. Kør preamp analysen på en konventionel thermocycleren under følgende betingelser: 15 min ved 50 ° C; 1 minut ved 95 ° C; 20 cykler af 15 sekunder ved 95 ° C, derefter 2 minutter ved 60 ° C; 99,9 & #176; C i 10 minutter; hold ved 4 ° C. Program disse betingelser før start.
8. Tænd for konventionelle thermocycleren, vælg preamp cykling program og start programmet. Placer plade med 96 brønde i thermocycler, når bunddelen af ​​thermocycler (ikke dækslet) når den temperatur, der kræves til cDNA-produktion (50 ° C) ved at overvåge temperatur målingen på skærmen. Forud for dette, holder pladen koldt at minimere risikoen for at generere falske positive resultater.
9. Når forforstærker løb er færdig, skal du kontrollere, at pladen har forblev lukket.
10. Fortsæt straks til trin 4.1. At gemme denne plade natten over, udføre fortynding som beskrevet i trin 4.2 til 4.5, undtagen i stedet for løst dækker pladen, forsegle pladen med en klar selvklæbende forsegling og sted inde i en lynlås-lock pose, opbevaret ved 4 ° C.

4. Fortynding af Preamp Plate

1. Fjern det passende antal forstærkning plader from fryseren (op til 4 kan køres på én gang). Åbn ikke emballagen. Lad pladen varme op i mindst 15 minutter ved stuetemperatur. Noter serienummeret og partinummeret af pladen.
   BEMÆRK: Uåbnede plader kan forblive ved stuetemperatur i op til 24 timer, men for bedste praksis, fjerne disse fra fryseren ikke mere end 30 minutter før brug for.
2. Centrifugeres afsluttet forforstærker plade i 20 sekunder under anvendelse af PCR-plade spinner. Tænd for amplifikation maskinen og computeren og starte det tilknyttede program.
3. Fjern alle unødvendige elementer fra en PCR opsætning område. Sæt på dobbelte handsker og ærme dækker.
4. Fjern forseglingen fra preamp pladen og fjern forsigtigt og kassér de yderste handsker. Fortynde forforstærker produkter til 1: 5 ved tilsætning af 56 pi TE-buffer til hver brønd i kolonne 1-6 af 96-brønd forforstærker plade og blanding ved pipettering op og ned. Gå kun til det første stop af pipetten, opsugning fra bunden og dispensering højere op, men ikke skabebobler. Tilføj TE buffer til alle 6 kolonner uanset ubrugte brønde.
5. Tillukkes pladen med enten en klar klæbemiddel eller folieforsegling, og centrifugeres det i 20 sekunder under anvendelse af PCR-plade spinner. Sæt denne plade til side (løst dækket), indtil trin 6.1 er færdig. Kassér resterende handsker og ærme dækker.

5. Forberedelse til 384-brønd Transfer til Amplification Plate

1. Opsætning af materialer, der er nødvendige for at dække og forsegle forstærkning plade: låg, plug, sprøjte af fordybelse væske, plade presse, ethanol sprøjteflaske, og fnugfri laboratorium klude. Fjern sprøjten hætte og låse et lille plastik tip på sprøjten (kræver kraft). Skub en lille mængde fordybelse væske på et stykke køkkenrulle for at fjerne luft oprustning (det er ok, hvis nogle små luftbobler tilbage i spidsen). Brug fordybelse væske inden 60 min for at fjerne sprøjten fra vakuum forseglet aluminium taske. Når en sprøjte er åbnet, skal du ikke vedhæfte hætten til senere brug.
2. Checkat skraldespanden af ​​pladen lastning flydende handleren er tom og åbne kassen tips. Skriv datoen for de tips på spidsen dæksel når en ny boks åbnes udløb, og sikre, at de tips ikke udløbet. Tænd for flydende handler og computer og åbne den flydende handleren software, som vil udføre en selvtest.
3. Klik på "Setup og Load". Klik på "Gennemse" for at vælge csv fil oprettet fra Sample Tracker software. Hvis filen ikke vises, skal du gå til "Instrument / rediger Indstillinger" og derefter klikke på "Change" af "Sample Plate File Folder". Vælg den mappe, hvor CSV-filen er gemt. Klik derefter på "Setup og Load", derefter "Gennemse" og vælg filen.
4. Klik derefter på "Gennemse" ved siden af ​​"Plate Holder Position 1" og vælg TPF fil (leveret af producenten), der har samme nummer som pladen.

6. Liquid Handler Transfer

Bemærk: Du må ikke begynde at filling den 384-brønds plade, indtil alle ovenstående trin er fuldført. Fordampning er en bekymring med små volumener - lad ikke 384 brønde sidde afdækket med væske indeni.

1. Når alle ovenstående trin er afsluttet sat på nye, godt udstyret dobbelt handsker og ærme dækker. Derefter tilsættes 2,5 pi amplifikation mastermix til en 384-brønds plade.
2. Overfør 2,5 pi fortyndet forforstærker produkt til 384-brønds plade ifølge kortet i tabel 2 og dækkes omgående plade tæt med en folie forsegling. Kassér ydre handsker og ærme dækker.
3. Centrifuger 384-brønds plade i 20 sekunder i PCR-plade spinner.
4. Fjern ikke folien segl, men placere 384 brønde i den flydende handleren.
5. Åbn pakken indeholder et indkapslet forstærkning plade og læg den forsigtigt i den flydende handleren i første slot med serienummeret på højre - hold tilfældet i kanterne uden at berøre overfladen of pladen. Brug uindpakkede plader inden for en time af åbningen.
   Bemærk: Formålet med sagen er at beskytte pladen mod at blive rørt, da dette kan forstyrre de små mængder af primere og prober inde de gennemgående huller.
6. Fjern folien forseglingen fra 384 brønde inde væskehåndteringsudstyret når alt er på plads. Klik på Næste og derefter kontrollere alle boksene som hvert trin er afsluttet. Klik på OK for at starte kørslen.
7. Lukke døren for den flydende handling og straks begynde påfyldningsprocessen. Bo ud for den flydende handleren og straks gå videre til det næste trin, når pladen er fyldt.
8. Mens den flydende handleren kører, fjerne den beskyttende film fra bunden af ​​en sag låg.
   BEMÆRK: Limen nederst sagen låget er dækket af et rødt bånd og en beskyttende film. skal fjernes først at få adgang til bureaukrati filmen.
   1. Lad den øverste film på plads, indtil trin 6.15. Prime bureaukratiet ved at trække lidt til RELEASe det fra klæbemidlet.
9. Fjern indlæst (fyldt) forstærkning plade fra den flydende handleren og forsigtigt placere den i pladen presse med serienummeret til højre.
10. Låget lægges oven på pladen med den udskårne ende til højre og limen i bunden (peger mod pladen).
11. Træk ned på pladen presse armen forsigtigt lukke det; lyset blinker i 20 sek. Rør ikke ved pladen presse i løbet af denne tid. Når lyset lyser konstant grønt, løfte armen forsigtigt, og fjern forsigtigt den forseglede plade ved at holde det på kanterne.
12. Mens du holder den forseglede forstærkning pladen lodret ved kanterne af sagen, straks indsætte sprøjtens spids ind lastehavnen i slutningen af ​​tilfældet, så dispensere nedsænkning væske langsomt i en blid kontinuerlig bevægelse for at fylde rummet mellem pladen og låg. Lad en lille luftboble i hjørnet, når pladen er nedsænket.
13. Samtidig med at hgamle pladen lodret ved kanterne, forsegle lastning port ved at indsætte stikket i porten og dreje stikket med uret, anvende tilstrækkeligt tryk, indtil håndtaget knækker. Grip kanterne af panelet fast således at kraften af ​​håndtaget bryde forårsager ikke tilfældet at falde. Hvis en plade tabes, kassere det.
14. Rengør tilfældet med en fnugfri tørre der er blevet grundigt sprøjtet med ethanol. At tørre sagen, tørre sagen nedad med en ren klud. Forsigtigt behandle sagen; være sikker på at ikke lægge pres på glasset over brøndene.
15. Bringe den forseglede plade til amplifikationen maskinen. Under "Instrument" fanen, skal du vælge "Instrument Console." Vælg forstærkning maskine og klik på knappen "Åben Dør".
16. Placer forstærkning plade i første slot af pladen adapter, kontrollere, at adapteren er korrekt linet op med A1 i øverste venstre hjørne. Vend pladen med stregkoden opad og modforsiden af ​​instrumentet. Klik på knappen "Luk døren". Bemærk brugen af ​​adapteren bakke - der er en grænse på 10 anvendelser.
17. Under fanen Start i bunden af ​​skærmen, under menuen Run, vælg OpenArray. Klik på "Hent Plate id'er." De tomme kasser vil automatisk blive udfyldt med oplysninger om pladen. Til at begynde kørslen, klik på "Start Kør".
18. Luk væskehåndteringsudstyret software og slukke for flydende handleren. Anbring skærkappen over spidsen rack. Kassér tips fra skraldespanden og rengør det. Rens og rense alle varer herunder arbejdsfladen, pipette, affald spand, og tips bokse.
19. Plombere preamp plade med en klar selvklæbende forsegling og opbevares ved -20 ° C.

7. Resultat Analyse

1. Når kørslen er færdig, gem filen og derefter klikke på "X" på fanen med run navn nederst på skærmen for at lukke filen.
2. Klik på "Open Door"Øverst på skærmen for at åbne døren. Fjern forstærkning plade, kontrollere, at der ikke fordybelse væske er lækket ud. Klik på" Close Door "øverst på skærmen for at lukke døren.
3. Klik på "Åbn" og vælg Kør filen for at åbne den. Tryk på den grønne Analyser knappen øverst til højre på skærmen. Klik på "Export" i venstre side af skærmen, og derefter "Start Export" for at eksportere resultater (som en .txt-fil). Minimer filen efter den åbnes. Klik derefter på "Export QC Images."
4. Gennemgå QC billeder i billedet analyseprogrammet efter følgende kriterier:
   1. Vurdere lastning kvalitet ved hjælp af PRE-READ_CHANNEL_4.tiff og POST-READ_CHANNEL_4.tiff, ved at kontrollere, at der ikke er nogen mørke pletter eller snavs.
      BEMÆRK: En farvestof detekteres af denne kanal er tilføjet af fabrikanten til primerne og proberne, som frigives i opløsning, når reaktionen indlæst. Aflæsningen i denne kanal viser, at reaktioner var korrektindlæst og at primerne og proben blandet med farvestof var til stede.
   2. Kontroller for lækager eller agitation til pladen efter læsning ved hjælp S02_C001_t03_p001_m1_x2_e1_cp # _spotfind.tiff. Hvis billedet ser mørkt, øge lysstyrken (tryk på Ctrl + Shift + C for at åbne kontroller), indtil hele pladen er synlig. Kontroller, at billedet ser ensartet uden skygger, bobler eller fordrevne prøver.
   3. Vurdere låg placering og snavs under låget (lyspunkter) ved hjælp STAGE2_CYCLE1_CHANNEL_1.tiff og STAGE2_CYCLE40_CHANNEL_1.tiff.
5. Valgfrit: Åbn et regneark, der indeholder den Results Makro (Supplemental kode fil). I den eksporterede datafil, højre klikke på fanen i bunden af ​​skærmen og vælg "Flyt eller Kopier". I "for at bestille" feltet, vælg "Resultater Macro.xlsm". Klik på "Flyt til ende", og marker afkrydsningsfeltet "Opret kopi". Klik derefter på OK.
   1. Hvis resultaterne Makro indstilling ikke vises i feltet "for at bestille", simlags kopiere indholdet af den eksporterede datafil regneark (klik på den øverste venstre celle for at markere alle celler og Ctrl-C) og indsætte det i en ny fane.
6. Slet det gamle "Export" fanen og omdøbe derefter den nyligt tilføjede fane som "Export".
7. Klik på "Alt-F8" (eller klikke på Vis og derefter Makroer) og derefter vælge "Macro" og klik på "Kør". Gentag derefter dette for Macro2 ved at klikke på "Alt-F8" og derefter vælge "Macro2" og klikke på "Kør".
8. Omdøb Resultater Macro fil ved hjælp af relevante oplysninger (dato og serienummer), sætte disse oplysninger over bordet, og gemme som det samme filnavn i de eksporterede Results mappen. Endelig udskrive makro-genererede resultater bord.
9. I forstærkning maskine software, kontrollere kurverne for hver prøve og kontrol i forhold til makro tabel ved at vælge Analyse / Amplification Plot på venstre side af skærmen. Vælg derefter fanen Sample, og klik på hver prøve tilbekræfter, at der er 2 eller 3 positive forstærkning kurver for hver af de positive resultater i tabellen.
10. Sluk amplifikationen maskinen.

Representative Results

Resultaterne er vist i figur 1 og 2 for et repræsentativt RNA assay (influenza-matrix) og DNA-analysen (EHV-1) med en kombination af positive kontroller og kliniske prøver indsendt til rutinemæssig diagnostisk test. Fluorescens signaler udsendt i hele denne typisk reaktion er vist i figur 1, som afbilder rå fluorescensværdier per cyklus. Alle relative tærskel cyklus (Ct) værdier blev automatisk genereret af forstærkning maskine software. Baggrundsfluorescens blev anvendt som en separat målestok for vurdering af lastning kvalitet i stedet for at integrere det i fluorescensaflæsninger før beregning Ct-værdier.

Den analytiske detektionsgrænse (LOD) for hvert mål blev beregnet baseret på det samlede gennemsnit af Ct-værdier på detektion på 95% plus 2 standardafvigelser i en pulje af styringer tilalle mål. Den højeste fortynding, hvor mindst 95% af replikater var positive for de repræsentative assays var 50 kopier; påvisning af 5 eksemplarer lykkedes i 50% af gentagelser. Hverken assay blev fundet på under én kopi. De bestemmelsesgrænseværdier til RNA og DNA-analysen blev beregnet på Ct-værdier på 21,92 og 20,05. Disse værdier blev anset for at være de cutoffs for rapportering af værdier som positive vs. mistænkt (potentielt ikke gentagelig).

Andre aspekter af analytisk præstation af målene blev vurderet ved anvendelse seriefortyndinger af poolede positive kontroller kørt på tre forskellige dage (figur 2). De gennemsnitlige virkningsgrader de repræsentative RNA- og DNA-assays var 101,1% og 106,6%; det samlede gennemsnit effektivitet for alle mål var 101,3%. Assayene havde også god linearitet ^(R2> 0,98). Variation inden kopiere gennemgående huller var typisk inden standardafvigelser af 0,2 til både kliniske prøver end kontroller. Ingen krydsreaktivitet mellem nogen af ​​målene blev observeret.

De endelige resultater regneark i den supplerende fil viser repræsentative kvantitative resultater for 10 kliniske diagnostiske prøver og 4 kontroller. De kliniske prøver er en delmængde af de typer af prøverne rutinemæssigt testet herunder nasal / svælg, lungevæv, og fækale prøver. En (heste) fækal prøve i dette sæt viser en mislykket MS2 intern kontrol, hvilket indikerer tilstedeværelsen af ​​inhibitorer i prøven. Dette er typisk administreres af fortynding af eluerede prøve og / eller re-ekstraktion. Som det er tilfældet her, bør den negative forstærkning kontrol være negativ for alle mål, og den negative udvinding kontrol bør kun indeholde den interne kontrol. I den kliniske sæt, prøver producerede Ct-værdier for betacoronavirus, Bordetella bronchiseptica, hundesyge virus A, hunde parainfluenzavirus, hunde pneumovirus og influenzaEN.

Figur 1. Amplification plots. Fluorescensaflæsninger afsættes mod amplifikationscykler for RNA assay (A) og DNA-assay (B). Trekanter er vist betegner Ct-værdier. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2. Standardkurver. Standardkurver fra testet på tre forskellige dage RNA og DNA assay afsættes for at demonstrere linearitet og vifte af amplifikation ved anvendelse positive kontroller. Cyklus tærskel (CT) værdier plottet mod log (10) af antallet af kopier af RNA (A) eller DNA ( Klik her for at se en større version af dette tal.

Tabel 1. Skematisk af forstærkning steder plade og mål. Pladerne anvendes til nanoskala realtids-PCR test på denne platform er objektglas størrelse og er arrangeret i 48 subarrays af 64 gennemgående huller, med i alt 3072 gennemgående huller for individuelle reaktioner. En undergruppering er vist her, med 18 mål i tre eksemplarer. Hver prøve sættes til en undergruppering af væsken handleren. Plader belægges med hydrofile og hydrofobe forbindelser at fastholde reagenser i gennemgående huller via overfladespænding. Den rustfri chip stål er "fotolitografisk mønstret og våd-ætset til dannelse af en retlinet matrix af 3.072 mikro-bearbejdet, 320 um diamete. r huller på 33 nl hver ^"2 Forkortelser for mål er som følger: BCOR, hunde respiratorisk coronavirus (betacoronavirus) BORD, Bordetella bronchiseptica CAV, hunde adenovirus, CPIV, hunde parainfluenzavirus, CPNV, hunde pneumovirus; Dista / B, hunde distemper virus A og B; EADV1 / 2, equin adenovirus 1/2; EAV, equin arteritis virus; EHV1 / 4, equin herpesvirus type 1/4; Erva / B, equin rhinitis virus A / B; IVM, influenza A matrix; MCYNOS, Mycoplasma cynos, MS2, intern kontrol (MS2-RNA-fag), sequi, Streptococcus equi.

Tabel 2. Plade overførsel kort. En farvekodet plade transfer kort til anvendelse af en fast 8-kanals pipette til at overføre fra 96-brønds forforstærker pladen til 384-brønds plade er vist. Alternativt kan en justerbar pipette anvendes. Den samme procedure udføres hver gang, uanset h ow mange prøver i pladen.

Supplerende fil. En makro-aktiveret regneark fil, der indeholder to makroer til formatering resultater i en oversigt (som beskrevet i protokollen) er tilvejebragt. Et typisk resultat tabel genereret af makroer er inkluderet i filen (under Final Results). De to makroer vil udfylde prøvenavne i den første kolonne (op til 48 prøver) og gennemsnittet af de tre Ct-værdier for hvert mål for dem med positive resultater; Bemærk, at mål, der ikke forstærker synes blank i denne tabel. Dette kan nemt udskrives på ét stykke papir og bruges som reference til kontrol rådata effektivt. På fanen endelige resultater, er vist repræsentative resultater for 10 kliniske prøver og 4 kontroller. Forkortelser for assay navne er anført i legenden om tabel 1.www.jove.com/files/ftp_upload/54781/supplemental_code_file_R1.xlsm "target =" _ blank "> Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Denne procedure er blevet anvendt til rutinemæssig afprøvning af respiratoriske patogener i vores laboratorium i løbet af seks måneder (2-3 gange om ugen). Vi har også haft succes under anvendelse af samme procedure for enterisk patogen profilering i fækale prøver og bakterielle isolater på en separat tilpasset plade. Når pladerne er produceret, kan erfarne medarbejdere udføre trin 2-7 inden for en standard arbejdsdag. De mest kritiske trin er korrekt forsegling af forforstærker plade, overførsel af forforstærkede prøver mellem plader (som skal gøres hurtigt for at forhindre fordampning), og den endelige dækning af amplifikationen plade. Anvendelse af makroen regneark som en guide til resultat analyse (kontrol kurver for prøver og kontroller) var også kritisk, da det i høj grad reduceret mængden af ​​tid og papirarbejde er nødvendig for denne proces. Den angivne makro regneark er et eksempel; det vil være nødvendigt at blive ændret eller genskabes for plader med forskellige konfigurationer. Dette kan let være performed af en person med grundlæggende regneark viden.

På grund af den meget lille mængde prøve fyldt på amplifikation plade (33 nl), er præ-amplifikation påkrævet. I optimering af denne protokol (ikke vist), sammenlignede vi en række Forforstærkning parametre herunder master mix, tilsætning af vilkårlige primere, antal cykler, annealing tid, og fortynding før amplifikation. Hvert mål havde sin egen optimale betingelser, og dem der er beskrevet her, repræsenterer dem, der gav den bedste detektionsgrænse samlet for vores panel. Dette panel dækker en bred vifte af patogene mål og prøvetyper, der opstår i rutinemæssige veterinær diagnostik, men ændringer af Forforstærkning procedurer kan være nødvendigt for forskellige paneler. Den producent-optimeret amplifikationsbetingelserne er baseret på en standard probe-baseret real-time PCR-protokol med en 10 min ved 95 ° C enzymaktivering efterfulgt af denaturering ved 95 ° C og annEaling / forlængelse ved 60 ° C. Primerne og proberne er fortrykt på pladerne også efter fabrikantens-optimerede betingelser og derfor ikke kræver titrering. Ved at kombinere den omvendte-transskription og pre-forstærkning trin for alle prøver (uanset hvilken type af mål) var nødvendig for at opretholde effektivitet i arbejdsgangen. Under alle prøver revers transkriberet er også gavnligt for at maksimere følsomhed. Desuden brug af en master mix for forforstærker, der er optimeret til at minimere hæmmere giver alsidighed i at kombinere forskellige typer prøve på den samme plade.

Center for Disease Control (CDC) influenza matrix beskrevet af Shu et al. ⁷ og tilpasset her nanoliter skala reaktioner er en universel influenza A assay, der er egnet til analyse af prøver fra mennesker og kæledyr. Det var designet til universel påvisning af matrixen genet af alle influenza A-vira under anvendelse af mikroliter skala reaORANSTALTNINGER. Det har været brugt over hele verden som en del af en CDC human influenzavirus Panel og en CDC svineinfluenza Panel. Den EHV-1 assay ⁸ tilpasset her registrerer en vigtig respiratorisk patogen af heste, der kan forårsage aborter og neurologisk sygdom (gennemgået af Pusterla og Hussey ^10). Betydningen af ​​tilpasning af disse prøver på en high-throughput platform med en art-uafhængig intern kontrol er, at de kan inkorporeres i en fremgangsmåde OneHealth overvågning. Under begge disse assays på en high-throughput test platform vil lette beredskabet til kliniske faciliteter, shelters og ydeevne begivenheder.

De ovenfor beskrevne resultater var repræsentative for alle de mål på pladen med undtagelse af Mycoplasma cynos, som viste betydelig mere variation i analytisk præstation. Det var sandsynligvis på grund af den sub-optimale smeltetemperatur (T _m) af primerne, som ideelt set bør være 58-60 &# 176; C (den ideelle sonde Tm er 68-70 ° C). En begrænsning af denne platform er, at det tager længere tid at designe og fremstille pladerne end for bestilling individuelle sonder, hvilket begrænser evnen til hurtigt at ændre sekvenser. En anden begrænsning ved real-time PCR generelt er den manglende evne til at påvise hidtil ukendte eller uventede patogener. Dette kan overvindes i nogen udstrækning ved at designe assays der svarer sekvenser i flere arter, men uvildige hele genomet sekventering metoder angives mere velegnet til opdagelse af hidtil ukendte midler. ^11,12

Nanoscale real-time PCR giver et nyt paradigme for syndrom-baseret i stedet for arter-baserede test, som er nyttig til at reducere reagenser og arbejdskraftomkostninger i højt gennemløb molekylær diagnostik. Storstilet testpanelet ved denne tilgang kan lette OneHealth overvågningsindsats såsom dem beskrevet af Dunne og Gurfield ¹³ og Moutailler et al. ^14. Indsamling af prøver podninger tidligt,generelt inden for 3 dage kliniske udbrud, giver de bedste chancer for at identificere tilstedeværelsen af ​​respiratoriske patogener. Smitsomme sygdomme fremkomsten er ofte uforudsigelige, og tests, der kan udføres på forskellige arter uden behov for ændring af reagenser er ideelle til beredskab. Fremtidige anvendelser af denne teknologi vil sandsynligvis være i patogentypebestemmelse, antibiotikaresistens profilering, og yderligere syndrom-baserede kliniske diagnostiske paneler. Nanoscale real-time PCR er mest nyttig til hurtig, high-throughput screening af flere prøver og patogene typer, og vil blive suppleret med upartiske eller delvist forudindtaget sekventering tilgange til at identificere nye og emergente patogener.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zap-OGlobin II lytic reagent	Beckman Coulter	7546138	Optional reagent for preparing blood samples.
Extraction kit (MagMAX Total Nucleic Acid Isolation Kit)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	AM1840	Other extraction kits appropriate for the desired sample types may be substituted. This kit comes with PBS, lysis buffer, and wash buffer.
2x One-Step RT-qPCR mix (qScript XLT One-Step RT-qPCR ToughMix)	Quanta Biosciences	95134-500
Gene-specific primer pool	IDT	custom order	Can be generated by the user or purchased with the amplification plates.
Random primer mix	New England Biolabs	S1330S
Standard 96-well plate	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	N8010560	This can be any plate that fits into the conventional PCR machine used.
Amplification master mix (OpenArray master mix)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4462164
Clear adhesive seal	Thermo-Fisher	430611
Foil seal	Excel Scientific	AF-100
384-well plate	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4482221
Amplification plate (QuantStudio 12K Flex OpenArray plate)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4470813	Can be customized with any assays conforming to standard TaqMan conditions.
Accessories kit	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4469576	Contains the case lids, plugs, and immersion fluid.
AccuFill tips	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4457246
Amplification machine (QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4471090
Liquid handler (OpenArray AccuFill System)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4457243	This is purchased with the amplification machine.
Primer design software (Primer Express)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4363991	See manufacturer's instructions for detailed primer and probe specifications.
Image analysis program (ImageJ)	NIH		Available at http://imagej.nih.gov/ij/
Spreadsheet program (Excel)	Microsoft		Available at https://products.office.com/en-us/excel
DMEM	Thermo-Fisher/Gibco	11965-092
Tissue disruptor (TissueLyser II)	Qiagen	85300
Conventional thermal cycler (Veriti)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4375786	Any conventional thermal cycler with a heated lid can be used.
PCR plate spinner	VWR	89184-608	This device has only one speed (2,500 rpm); the rotor starts when the lid is closed and stops when the button is pushed.
TE buffer	Millipore	8890-100ML	10 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride, 1 mM Ethylenediaminetetraacetic acid, pH 8.0