Detection High-throughput respiratorie patogeni nei campioni animali da Nanoscale PCR

Summary

test high-throughput di DNA e RNA patogeni a base di nanoscala PCR è descritto con un cane sindromica e equini pannello PCR respiratorio.

Abstract

scala nanoliter real-time PCR utilizza multiplexing spaziale per consentire a più test da eseguire in parallelo su un singolo piatto senza gli svantaggi tipici di combinare insieme le reazioni. Abbiamo progettato e valutato un pannello basato su questo principio per identificare rapidamente la presenza di agenti patogeni comuni nei cani e cavalli con malattia respiratoria acuta. Questo manoscritto descrive un flusso di lavoro PCR diagnostico su scala nanometrica per la preparazione del campione, l'amplificazione e l'analisi di sequenze bersaglio patogeni, concentrandosi sulle procedure che sono diverse dalle reazioni scala microlitro. Nel pannello respiratoria presentato, 18 saggi sono stati ogni istituiti in triplice copia, che possono ospitare fino a 48 campioni per piastra. Una estrazione e di pre-amplificazione del flusso di lavoro universale è stato ottimizzato per la preparazione dei campioni high-throughput per ospitare molteplici matrici e gli agenti patogeni a base di DNA e RNA. dati rappresentativi sono presentati per un obiettivo RNA (influenza A matrice) e un obiettivo di DNA (herpesvirus equino1). La possibilità di testare in modo rapido e preciso per un gruppo completo sindrome a base di agenti patogeni è uno strumento prezioso per migliorare l'efficienza e l'ergonomia di test diagnostici e per la diagnosi della malattia respiratoria acuta e gestione.

Introduction

Con la domanda per la rilevazione rapida e completa di molteplici agenti in diagnostica clinica per l'uomo e gli animali, unico organismo metodi diagnostici molecolari per il rilevamento degli agenti patogeni sono gravosi se non usato per un gran numero di campioni in fase di sperimentazione per una singola malattia. Nel contesto veterinaria, high throughput metodologie diagnostiche sono particolarmente importanti a causa della necessità supplementare per coprire patogeni da un'ampia varietà di specie. OneHealth approcci per la gestione delle malattie di origine alimentare e la sorveglianza degli agenti patogeni emergenti sono esempi di esigenze di test che includono un numero di batteri, virus (DNA o RNA based), parassiti e funghi. La sfida di combinare test per più analiti insieme (multiplexing) al fine di migliorare l'efficienza di test è una possibile perdita di sensibilità e un grande peso per l'ottimizzazione e la validazione di saggi.

in tempo reale scala nanoliter reazione a catena della polimerasi (PCR) è un alternativo per la pratica di multiplazione che permette molte reazioni separate di eseguire contemporaneamente sullo stesso campione ^1. La piattaforma OPENARRAY è un'applicazione di questo principio ^2; combina la tecnologia dei microarray con real-time PCR. Basato sul concetto di multiplexing spaziale, ogni campione viene testato per un gran numero di bersagli in separato fori passanti. Questa piattaforma è stata inizialmente utilizzata con legame al DNA a doppio filamento Cyanine a base chimica ² ed è ora disponibile per la chimica sonda-based utilizzando sonde tempra scuri ^3. Questa piattaforma è stata principalmente utilizzato per la profilazione genetica negli esseri umani e negli animali ^{4 5.} E 'stato recentemente adattato per rilevare il DNA e RNA agenti patogeni da Grigorenko et al. ⁶ utilizzando una procedura in due fasi inversa trascrizione / pre-amplificazione (preamplificatore).

Descriviamo qui di una procedura preamplificatore a base one-step per la rilevazione di entrambi i tipi di agenti patogeni nel sec respiratoriaretions e una varietà di altri tipi di campioni che possono essere eseguite interamente in una giornata lavorativa normale. Al completamento del preamplificatore one-step, i campioni vengono trasferiti ad una piastra a 384 pozzetti, che è il formato accettato dal sistema di gestione dei liquidi automatizzato che viene con questa piattaforma nanoscala PCR. Il sistema disegna il master mix e il campione su tutta la superficie di un massimo di 4 piastre (192 campioni e controlli) alla volta. In seguito a questo processo di caricamento, si descrive come i campioni sono amplificati e analizzati utilizzando un foglio di calcolo macro che riassume la media di 3 repliche tecnici per ogni combinazione campione / target in una tabella che si inserisce in una pagina stampata.

è stato stabilito un metodo uniforme per l'analisi del DNA e / o RNA estratto da campioni che utilizzano questa piattaforma. Un'ampia varietà di campioni sono stati estratti, retrotrascritto, e pre-amplificato in un formato a 96 pozzetti, minimizzando la possibilità di errori. campioni respiratori testati inclusi tamponi nasali, tamponi faringei profondi,lavaggi trans-tracheale, lavaggio broncoalveolare, e tessuto polmonare. Poiché alcuni degli agenti testati possono anche essere presenti nel sangue periferico o feci, abbiamo incorporato questi tipi di campioni nella procedura. Questo flusso di lavoro consente di risparmiare tempo e risorse rispetto alla corsa esperimenti in più piatti, permettendo test efficiente attraverso patogeno e la tossina rilevazione gene pannello a base al posto di test individuale. Il pannello respiratoria dimostrato qui aveva 18 saggi di ogni stampati in triplice copia fori passanti, che possono ospitare fino a 48 campioni per piastra. I patogeni equine rilevati inclusi adenovirus equina 1 e 2, il virus arterite equina, equina virus rinite A e B, equina herpesvirus (AAT) tipi 1 e 4, e Streptococcus equi. I patogeni canino incluso canine coronavirus respiratorio (betacoronavirus), virus del cimurro canino, adenovirus canino, virus parainfluenza canina, pneumovirus canina, Bordetella bronchiseptica e Mycoplasma CYNOS. UNl'influenza universale sono stati inclusi anche un saggio e un controllo interno (MS2 RNA fago).

Protocol

Non sono soggetti umani o animali da esperimento sono stati utilizzati per lo sviluppo di questo protocollo. I controlli sono stati generati da purificazione di ampliconi sequenza confermato e nella trascrizione vitro per bersagli di RNA. campioni clinici sono stati sottoposti ai test diagnostici di routine per la salute Centro Diagnostico Cornell animali.

1. Piastra design

1. Utilizzare il software di progettazione primer per verificare che ogni test è conforme alla real-time PCR condizioni di ciclismo sonda-based standard con 60 ° C di ricottura utilizzando lo strumento di misura della sonda Primer (selezionare la sonda quantificazione impostazione con parametri di default).
   NOTA: Il bersaglio rappresentante RNA usato è stato adattato dal influenzale universale Una matrice mirata saggio pubblicato da Shu et al ^7.. I primer e sonda sono i seguenti: primer forward: GACCRATCCTGTCACCTCTGAC, Reverse Primer: AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA, Sonda: Fam-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-QSY. Il saggio rappresentante DNA usato qui è stato adattato from il metodo di rilevamento equina a herpesvirus 1 (EHV-1) pubblicato da Elia et al. ^8. I primer e sonda sono i seguenti: primer forward: GCTCTCAGGTTTTACGACATC, Reverse Primer: CTTTACCCAGGCCCTTGAAA, Sonda: FAM-TCAACGTGGACAATACCGCAGTGATTAT-QSY.
2. Ordine nanoscala piastre di amplificazione PCR nella configurazione desiderata.
   NOTA: Per questo studio, il formato genica 18x3 stato usato (Tabella 1). Fornire sequenze per tutti i primer e sonde (o ID di analisi inventariati) per ogni destinazione per il produttore.

2. Nucleic Acid Extraction

1. Estrarre acido nucleico totale (DNA e RNA) da qualsiasi metodo desiderato.
   NOTA: Un kit di estrazione tallone a base magnetica automatizzata è stata utilizzata qui in base alle istruzioni del produttore (vedere la tabella materiali per maggiori dettagli).
2. Preparare campioni come segue:
   1. Pulire l'esterno di ciascun contenitore del campione con il 10% di candeggina e asciugare accuratamente. Pulire guantata fpunte Inger con il 10% di candeggina tra i campioni per evitare la contaminazione incrociata.
   2. Posizionare nasale o tamponi faringei profonde in ogni flaconcino sterile sigillato (quali un tubo rosso raccolta del sangue superiore) con alcune gocce di soluzione salina aggiunti prevenire l'essiccamento prima della trasformazione.
      NOTA: cotone, plastica, legno-trattati, e Dacron e altri tamponi sintetici sono tutti accettabili, ma evitare di calcio tamponi di alginato.
   3. Per tamponi e lavaggi tracheali, aggiungere Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) in modo che vi sia almeno 1-2 ml di liquido. Agitare il tampone e DMEM con forza nel tubo. Quindi, utilizzare una pipetta per trasferire circa 1 ml di media in una nuova provetta.
   4. tessuti meccanicamente lisare (100-200 mg in 1 ml di DMEM) utilizzando un disgregatore tessuto secondo le istruzioni del produttore, centrifugando per 3 min a 825 x g. Trasferire 500 microlitri del supernatante in una nuova provetta.
   5. Per le feci, unire 400 mg di feci con 800 ml di 1x tampone fosfato saLinea pH 7,4 (PBS). Agitare la sospensione per 1 min o più fino a quando il campione è omogeneizzato o completamente sospesa. Una volta omogeneizzata, centrifugare la sospensione per 10 min a 18.000 xg, quindi trasferire 400 microlitri in una nuova provetta.
   6. Per sangue intero non coagulato, Vortice il campione e fare una aliquota di 250 microlitri. Aggiungere sei gocce di litico reagente e agitare per miscelare. Incubare 15 minuti a 37 ° C.
3. Preparare lisi e lavaggio buffer in base alle istruzioni del produttore. Aggiungere MS2 fago o un controllo interno di scelta al tampone di lisi come controllo di estrazione positivo interno ^9.
4. Aggiungere 235 ml di tampone di lisi e 175 ml di campione (o PBS per il controllo negativo) per ciascun tubo tallone. Procedere con il protocollo del produttore.
   NOTA: purificato acido nucleico totale è stato eluito qui in 90 microlitri.

3. trascrizione inversa / pre-amplificazione (preamplificatore)

NOTA: Conservare tutti i reagenti ei campioni usati inla reazione preamplificatore in ghiaccio in ogni momento. A seguito di preamplificatore, tenere tutti i reagenti a temperatura ambiente.

1. Assemblare DNA eluito e / o RNA, PCR miscela di reazione, acqua priva di nucleasi come controllo negativo, e gli standard di pool per il controllo di amplificazione positivo.
   NOTA: Fino a 48 campioni può essere eseguito su una piastra di amplificazione compresi i controlli (includere almeno un controllo di estrazione negativo per ogni piastra di estrazione da cui i campioni devono essere tirato).
2. Stampare una mappa campione. Avere un secondo controllo persona che la mappa e il layout del campione partita.
3. In una provetta da 1,5 ml, aggiungere il seguente per preparare il master mix preamplificatore.
   NOTA: Un volume finale di 14 ml è stato usato qui.
   1. Aggiungere un pool di primer premiscelati da ogni target tale che la concentrazione finale di ciascun primer è 900 nM.
      NOTA: La piscina usato qui è stato preparato ad una concentrazione 10 volte, e 1,4 microlitri aggiunto per reazione.
   2. Aggiungere primer casuali per una concentrazione finale di 600 nm o 0.1x. Aggiungere 2x mix RT-qPCR per la metà del volume finale (7 ml qui).
   3. Miscelare i componenti Master Mix insieme da vortex delicatamente e girare verso il basso.
4. Eseguire il preamplificatore in una piastra a 96 pozzetti standard utilizzando il lato sinistro della piastra solo (colonne 1-6).
5. Aggiungere 8,5 microlitri di preamplificatore master mix e 5,5 ml di campione di DNA / RNA in ciascun pozzetto.
6. Dopo che unisce tutti i reagenti (campioni, controlli positivi e controlli negativi con preamplificatore mix), accuratamente sigillare la piastra a 96 pozzetti standard con un sigillo adesivo trasparente. Rimuovere qualsiasi sigillo in eccesso con una lama di rasoio per evitare la formazione di lacune di tenuta durante la pedalata. Centrifugare la piastra sigillata per 20 secondi utilizzando una piastra filatore PCR. Verificare tutti i reagenti sono combinati nel fondo dei pozzetti della piastra.
7. Eseguire il test preamplificatore in un termociclatore convenzionale nelle seguenti condizioni: 15 min a 50 ° C; 1 min a 95 ° C; 20 cicli di 15 secondi a 95 ° C, poi 2 min a 60 ° C; 99.9 & #176; C per 10 min; tenere a 4 ° C. Programma queste condizioni prima di iniziare.
8. Accendere il termociclatore convenzionale, selezionare il programma ciclismo preamplificatore e avviare il programma. Posizionare la piastra a 96 pozzetti in termociclatore solo quando la porzione inferiore del termociclatore (non il coperchio) raggiunge la temperatura necessaria per la produzione di cDNA (50 ° C) per il monitoraggio della temperatura lettura sullo schermo. Prima di questo, mantenere il freddo piastra per minimizzare il rischio di produrre risultati falsi positivi.
9. Una volta che la corsa preamplificatore è completa, verificare che il piatto è rimasto sigillato.
10. Procedere immediatamente al punto 4.1. Per memorizzare questa piastra overnight, eseguire la diluizione come descritto nei punti da 4.2 a 4.5, tranne che invece di vagamente coprire la piastra, sigillare la piastra con un chiaro sigillo adesivo e posto all'interno di un sacchetto della chiusura lampo-lock, conservato a 4 ° C.

4. La diluizione del preamplificatore Piastra

1. Rimuovere il numero appropriato di lastre di amplificazione from freezer (fino a 4 può essere eseguito in una sola volta). Non aprire la confezione. Lasciare che la piastra si riscaldi per almeno 15 minuti a temperatura ambiente. Registrare il numero di serie e il lotto della piastra.
   NOTA: piatti non aperti possono rimanere a temperatura ambiente per un massimo di 24 ore, ma per le migliori pratiche, rimuoverli dal congelatore non più di 30 minuti prima aveva bisogno.
2. Centrifugare la piastra di preamplificatore completato per 20 secondi utilizzando la piastra filatore PCR. Accendere la macchina di amplificazione e il computer e avviare il programma associato.
3. Rimuovere tutti gli oggetti inutili da una zona di installazione della PCR. Indossare doppi guanti e coperte manica.
4. Rimuovere il sigillo dalla piastra preamplificatore e rimuovere con attenzione e gettare i guanti esterni. Diluire i prodotti preamplificatore a 1: 5 con l'aggiunta di 56 microlitri di tampone TE in ciascun pozzetto di colonne 1-6 della piastra preamplificatore 96 e miscelazione pipettando su e giù. Vai solo alla prima fermata della pipetta, aspirazione dal basso ed erogazione più in alto ma non crearebolle. Aggiungere tampone TE a tutte le 6 colonne indipendentemente pozzetti non utilizzati.
5. Richiudere la piastra o con un adesivo trasparente o pellicola di sigillo, e centrifugare per 20 secondi utilizzando la piastra filatore PCR. Impostare questo piatto a parte (vagamente coperto) fino al punto 6.1 è stata completata. Eliminare rimanenti guanti e coperte manica.

5. Preparazione per 384 pozzetti di trasferimento alla Piastra Amplification

1. Impostare i materiali necessari per coprire e sigillare la piastra di amplificazione: coperchio, spina, siringa di liquido di immersione, premere piatto, bottiglia di etanolo spruzzo, e salviettine laboratorio privo di pelucchi. Togliere il tappo della siringa e bloccare una piccola punta di plastica sulla siringa (richiede forza). Espellere una piccola quantità di liquido di immersione su un tovagliolo di carta per rimuovere l'accumulo di aria (è ok se alcune piccole bolle d'aria restano nella punta). Utilizzare liquido di immersione entro 60 min di rimuovere la siringa dal sacchetto di alluminio sottovuoto. Una volta che una siringa è aperto, non riapplicare il cappuccio per un uso successivo.
2. Dai un'occhiatache il bidone dei rifiuti del gestore carico liquido piatto è vuoto e aprire la scatola di punte. Scrivere la data di scadenza delle punte sul coperchio della scatola punta quando si apre una nuova scatola, e assicurarsi che le punte non sono scaduti. Accendere il gestore del liquido e il computer e aprire il software gestore di liquido, che si esibirà in un auto-test.
3. Fai clic su "Impostazioni e Carica". Fai clic su "Sfoglia" per selezionare il file CSV creato dal software Tracker campione. Se il file non è visualizzato, andare a "/ Modifica preferenze dello strumento" e quindi fare clic su "Modifica" da "campione Piastra di cartella di file". Selezionare la cartella in cui è stato salvato il file CSV. Quindi, fai clic su "Imposta e carico", poi "Sfoglia" e selezionare il file.
4. Quindi, fare clic su "Sfoglia" accanto alla "Targa titolare Posizione 1" e selezionare il file TPF (fornito dal costruttore) che ha lo stesso numero di serie, come la piastra.

Trasferimento 6. Liquid Handler

Nota: Non avviare firiempiendo il piatto 384-bene fino a quando tutti i passaggi di cui sopra sono complete. L'evaporazione è una preoccupazione con piccoli volumi - non lasciare che la piastra a 384 pozzetti sedere scoperto con liquido all'interno.

1. Una volta che tutti i passaggi di cui sopra sono stati completati messi sui nuovi, guanti doppi ben attrezzati e manica copre. Quindi, aggiungere 2,5 ml di amplificazione master mix ad una piastra a 384 pozzetti.
2. Trasferire 2,5 ml di prodotto diluito preamplificatore alla piastra a 384 pozzetti secondo la mappa in Tabella 2 e coprire immediatamente bene la piastra con un sigillo di alluminio. Eliminare i guanti esterni e coperture manica.
3. Centrifugare la piastra a 384 pozzetti per 20 sec nella piastra filatore PCR.
4. Non rimuovere la pellicola di sigillo, ma posizionare la piastra a 384 pozzetti nel gestore liquido.
5. Aprire la confezione contenente una piastra di amplificazione incassato e posizionarla con cautela nel gestore liquido nel primo slot con il numero di serie sulla destra - tenere il caso per i bordi senza toccare la superficie of piastra. Usare piatti da scartare entro un'ora di apertura.
   Nota: Lo scopo del caso è quello di proteggere il piatto di essere toccato, poiché ciò potrebbe disturbare le piccole quantità di primer e sonde all'interno dei fori passanti.
6. Rimuovere il sigillo stagnola dalla piastra a 384 pozzetti all'interno del gestore di liquido una volta che tutto è a posto. Fare clic su Avanti e quindi controllare tutte le caselle come ogni passo è stato completato. Fare clic su OK per iniziare la corsa.
7. Chiudere la porta al gestore di liquido e avviare immediatamente il processo di riempimento. Resta accanto al gestore liquido e procedere immediatamente alla fase successiva quando il piatto è pieno.
8. Mentre il conduttore liquido è in esecuzione, rimuovere la pellicola protettiva dalla parte inferiore del coperchio caso.
   NOTA: L'adesivo nella parte inferiore del coperchio caso è coperto da un nastro rosso e un film protettivo. Il film deve essere rimosso prima di accedere il nastro rosso.
   1. Lasciare la pellicola superiore in vigore fino al punto 6.15. Primo il nastro rosso tirando leggermente verso releasvia e dal collante.
9. Rimuovere il (pieno) piastra di amplificazione caricati dal gestore liquido e delicatamente posizionarlo nella stampa targa con il numero di serie sulla destra.
10. Mettere il coperchio sulla parte superiore della piastra con l'estremità dentellata a destra e adesivo sul fondo (rivolto verso la piastra).
11. Abbassare la piastra di stampa leva di chiusura con attenzione; la luce lampeggia per 20 sec. Non toccare la piastra di stampa in questo periodo. Una volta che la luce diventa verde fisso, sollevare la leva con cautela e rimuovere con attenzione la piastra sigillata tenendolo sui bordi.
12. Tenendo la piastra di amplificazione saldato verticalmente dai bordi del caso, inserire immediatamente la punta della siringa nella porta di carico alla fine del caso, quindi erogare il liquido di immersione lentamente in un delicato movimento continuo per riempire lo spazio tra la piastra e la coperchio. Lasciare una piccola bolla d'aria in un angolo una volta che il piatto è immersa.
13. Pur continuando a hvecchia piastra verticale dai bordi, chiudere la porta di caricamento inserendo la spina nella porta e ruotando il tappo in senso orario, applicando una pressione sufficiente finché la maniglia interrompe. Grip i bordi del caso saldamente in modo che la forza di rottura del manico non provoca il caso a goccia. Se un piatto è caduto, scartarla.
14. Pulire il caso con un wipe che privo di lanugine è stato completamente spruzzato con etanolo. Per asciugare il caso, pulire il caso verso il basso con un panno pulito. maneggiato il caso; essere sicuri di non applicare pressione sul vetro sopra i pozzetti.
15. Portare la piastra sigillata alla macchina di amplificazione. Nella scheda "strumento", selezionare "Strumento Console." Selezionare la macchina di amplificazione quindi fare clic sul pulsante "Open Door".
16. Posizionare la piastra di amplificazione nel primo slot dell'adattatore piatto, controllando che l'adattatore sia allineato correttamente con A1 nell'angolo superiore sinistro. Orientare la piastra con il codice a barre rivolto verso l'alto e versola parte anteriore dello strumento. Fare clic sul pulsante "Chiudi porta". Si noti l'uso del vassoio adattatore - c'è un limite di 10 utilizzi.
17. Nella scheda Home nella parte inferiore dello schermo, sotto il menu Esegui, selezionare OPENARRAY. Fai clic su "Get ID piatto." Le scatole vuote verranno popolati automaticamente con le informazioni sul piatto. Per iniziare la corsa, cliccare su "Start Esegui".
18. Chiudere il software gestore liquido e spegnere il gestore di liquido. Posizionare lo sportello sulla cremagliera punta. Eliminare le punte del bidone dei rifiuti e pulirlo. Pulire e decontaminare tutte le voci, tra cui il piano di lavoro, pipette, secchio dei rifiuti, e scatole di suggerimenti.
19. Richiudere la piastra preamplificatore con una chiara sigillo adesivo e conservare a -20 ° C.

Analisi 7. Risultato

1. Una volta che la corsa è stata completata, salvare il file e quindi fare clic sulla "X" sulla scheda con il nome corsa nella parte inferiore dello schermo per chiudere il file.
2. Clicca su "Open Door"Nella parte superiore dello schermo per aprire la porta. Rimuovere la piastra di amplificazione, controllando che il liquido di immersione è fuoriuscito. Clicca su" Chiudere lo sportello "nella parte superiore dello schermo per chiudere la porta.
3. Fai clic su "Apri" e selezionare il file di esecuzione per aprirlo. Premere il pulsante verde Analizzare in alto a destra dello schermo. Fai clic su "Esporta" sul lato sinistro dello schermo e poi "Start Esporta" per esportare i risultati (come file di testo). Ridurre al minimo il file dopo si apre. Quindi fare clic su "Immagini Esporta QC".
4. Rivedere le immagini QC nel programma di analisi delle immagini in base ai seguenti criteri:
   1. Valutare la qualità carico con PRE-READ_CHANNEL_4.tiff e POST-READ_CHANNEL_4.tiff, verificando che non ci sono macchie scure o sbavature.
      NOTA: Un colorante rilevato da questo canale è aggiunto dal fabbricante alle primer e sonde, che viene rilasciato nella soluzione quando la reazione viene caricato. La lettura in questo canale indica che le reazioni sono bencaricati e che i primer e sonde mescolato con colorante erano presenti.
   2. Controllare eventuali perdite o agitazione alla piastra dopo il caricamento utilizzando S02_C001_t03_p001_m1_x2_e1_cp # _spotfind.tiff. Se l'immagine appare scura, aumentare la luminosità (premere Ctrl + Shift + C per aprire i controlli) fino a quando l'intera piastra è visibile. Verificare che l'immagine appare uniforme, senza ombre, bolle, o campioni sfollati.
   3. Valutare il posizionamento del coperchio e detriti sotto il coperchio (punti luminosi) utilizzando STAGE2_CYCLE1_CHANNEL_1.tiff e STAGE2_CYCLE40_CHANNEL_1.tiff.
5. Opzionale: Aprire un foglio di calcolo che contiene la macro Risultati (file di codice supplementare). Nel file di dati esportato, fare clic destro sulla scheda nella parte inferiore dello schermo e selezionare "Sposta o Copia". Nel campo "a libro", selezionare "Risultati Macro.xlsm". Clicca "Move to end" e selezionare la casella "Crea copia". Quindi fare clic su OK.
   1. Se l'opzione Risultati Macro non viene visualizzato nel campo "a libro", simply copiare il contenuto del foglio di lavoro esportato file di dati (cliccare sulla cella in alto a sinistra per evidenziare tutte le cellule e Ctrl-C) e incollarlo in una nuova scheda.
6. Eliminare la vecchia scheda "Export" e quindi rinominare la scheda appena aggiunto come "Esporta".
7. Fai clic su "Alt-F8" (o fare clic su Visualizza, quindi Macro) quindi selezionare "Macro" e fare clic su "Esegui". Quindi ripetere questo per Macro2 cliccando su "Alt-F8" quindi selezionando "Macro2" e facendo clic su "Esegui".
8. Rinominare il file dei risultati macro utilizzando le informazioni rilevanti (data e numero di serie), inserire le informazioni sopra il tavolo, e salvare come lo stesso nome del file nella cartella risultati esportati. Infine, stampare la tabella dei risultati macro-generated.
9. Nel software della macchina di amplificazione, controllare le curve per ciascun campione e controllo contro la tabella macro selezionando Analysis / Amplification Plot sul lato sinistro dello schermo. Quindi, selezionare la scheda del campione, e fare clic su ciascun campione diconfermano che ci sono 2 o 3 curve di amplificazione positive per ciascuno dei risultati positivi nella tabella.
10. Spegnere la macchina di amplificazione.

Representative Results

I risultati sono mostrati nelle figure 1 e 2 per un saggio rappresentante RNA (matrice influenza) e test DNA (EHV-1) con una combinazione di controlli positivi e campioni clinici presentati per test diagnostici di routine. I segnali di fluorescenza emessi durante questa reazione tipica sono mostrati in Figura 1, che riporta i valori di fluorescenza prime per ciclo. Tutti i valori di soglia relativo ciclo (CT) sono stati generati automaticamente dal software della macchina di amplificazione. Fluorescenza di fondo è stato utilizzato come metrica separata per la valutazione della qualità loading invece di inserirla nelle letture di fluorescenza prima di calcolare valori Ct.

Il limite analitico di rilevazione (LOD) per ogni obiettivo è stato calcolato sulla base della media complessiva dei valori Ct al livello di rilevamento del 95% più 2 deviazioni standard in una pozza di controlli pertutti gli obiettivi. La diluizione più alta in cui almeno il 95% dei replicati sono risultati positivi per la metodica di rappresentanza era di 50 copie; rilevamento di 5 copie avuto successo nel 50% dei replicati. Nessuno dei due test è stato rilevato al di sotto di una copia. I limiti di determinazione per il dosaggio RNA e DNA sono stati calcolati a valori Ct di 21.92 e 20.05. Questi valori sono stati considerati i tagli per i valori di segnalazione come positivi contro sospetti (potenzialmente non ripetibile).

Altri aspetti della performance analitica degli obiettivi è stata valutata utilizzando diluizioni seriali di controlli positivi pool eseguito in tre giorni diversi (Figura 2). Le efficienze medie delle analisi rappresentative RNA e DNA sono stati 101,1% e del 106,6%; l'efficienza media complessiva per tutti i target era 101,3%. I saggi avevano anche buona linearità (R ^2> 0,98). Variazione all'interno replicare fori passanti in genere era all'interno deviazioni standard di 0,2 per entrambi i campioni clinici di und controlli. Non è stata osservata cross-reattività tra uno qualsiasi dei bersagli.

Il foglio di lavoro Risultati finali nel file supplementare mostra risultati quantitativi rappresentativi per 10 campioni di diagnostica clinica e 4 controlli. I campioni clinici sono un sottoinsieme dei tipi di campioni di routine test, compresa nasali / orofaringei, tessuto polmonare, e campioni di feci. Un (equina) campione di feci in questa serie mostra un fallito controllo interno MS2, che indica la presenza di inibitori nel campione. Questo è tipicamente gestito dalla diluizione del campione eluito e / o ri-estrazione. Come è il caso qui, il controllo di amplificazione negativo deve essere negativo per tutte le destinazioni, e il controllo di estrazione negativo dovrebbe contenere solo il controllo interno. Nel set clinica, campioni prodotti valori Ct per betacoronavirus, Bordetella bronchiseptica, cimurro canino virus A, il virus parainfluenza canina, pneumovirus canino, e l'influenzaUN.

Figura 1. trame amplificazione. Letture di fluorescenza vengono riportati in cicli di amplificazione per il dosaggio RNA (A) e test DNA (B). I triangoli sono mostrati denota valori Ct. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Le curve standard. Le curve standard dal dosaggio RNA e DNA testato in tre giorni diversi sono tracciati per dimostrare la linearità e la gamma di amplificazione utilizzando controlli positivi. Ciclo soglia valori (R) sono in grafico contro log (10) del numero di copie di RNA (A) o DNA ( Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Tabella 1. Schema del piatto e di destinazione posizioni di amplificazione. Le lastre utilizzate per la scala nanometrica in tempo reale test PCR su questa piattaforma sono microscopio dimensioni e sono disposti in 48 sottoarray di 64 fori passanti, con un totale di 3.072 fori passanti per reazioni individuali. Un sottoarray è mostrato qui, con 18 bersagli in triplice copia. Ogni campione viene aggiunto a una sottomatrice dal gestore liquido. Le piastre sono rivestite con composti idrofili e idrofobi per mantenere i reagenti in fori passanti tramite tensione superficiale. Il chip in acciaio inox è "fotolitograficamente modellato e bagnato-attaccato per formare un allineamento rettilineo di 3.072 micro-lavorati, 320 micron diamete. R fori di 33 nl ogni ^"2 abbreviazioni per gli obiettivi sono i seguenti: BCOR, canino coronavirus respiratorio (betacoronavirus); BORD, Bordetella bronchiseptica CAV, adenovirus canino; CPIV, virus parainfluenza canina; CPNV, pneumovirus canino; DISTA / B, canino cimurro virus A e B; EADV1 / 2, adenovirus equina 1/2; EAV, equina virus arterite; EHV1 / 4, equina a herpesvirus 1/4; ERVA / B, equina virus rinite A / B; IVM, influenza A matrice; MCYNOS, Mycoplasma CYNOS, MS2, controllo interno (MS2 RNA del fago); SEQU, Streptococcus equi.

Viene mostrato Tabella 2. carta di trasferimento del piatto. Una mappa di trasferimento piatto color-coded per l'utilizzo di una pipetta a 8 canali fissi per il trasferimento dalla piastra preamplificatore a 96 pozzetti alla piastra a 384 pozzetti. In alternativa, una pipetta regolabile può essere utilizzato. La stessa procedura viene eseguita ogni volta, indipendentemente h ow molti campioni nella piastra.

Viene fornito il file supplementare. Un file di foglio di calcolo con attivazione macro che contiene due macro per i risultati di formattazione in una tabella di sintesi (come descritto nel protocollo). Un tipico tabella dei risultati generati dalle macro è incluso nel file (sotto Risultati finali). Le due macro riempiranno i nomi di esempio nella prima colonna (fino a 48 campioni) e la media dei tre valori Ct per ciascun bersaglio per quelli con risultati positivi; notare che gli obiettivi che non si amplificano appaiono vuoti in questa tabella. Questo può essere facilmente stampata su un pezzo di carta e utilizzato come riferimento per controllare efficacemente i dati grezzi. Nella scheda risultati finali, vengono mostrati risultati rappresentativi per i campioni clinici 10 e 4 controlli. Abbreviazioni per i nomi di analisi sono elencati nella legenda della tabella 1.www.jove.com/files/ftp_upload/54781/supplemental_code_file_R1.xlsm "target =" _ blank "> Clicca qui per scaricare il file.

Discussion

Questa procedura è stata utilizzata per il test di routine di patogeni respiratori nel nostro laboratorio nel corso di sei mesi (2-3 volte a settimana). Abbiamo anche avuto successo usando la stessa procedura per enterica profiling patogeno in campioni fecali e batteri isolati su un piatto personalizzato separatamente. Una volta che le piastre vengono prodotte, personale esperto in grado di completare i passaggi 2-7 entro una giornata lavorativa standard. Le fasi più critiche sono la corretta tenuta della piastra preamplificatore, il trasferimento dei campioni preamplificati fra piastre (che deve essere fatto rapidamente per evitare l'evaporazione), ed il rivestimento finale della piastra di amplificazione. L'uso del foglio di macro come guida per l'analisi risultato (controllo curve per campioni e controlli) era anche critica in quanto riduce notevolmente la quantità di tempo e lavoro di ufficio necessario per questo processo. Il foglio di calcolo macro fornito è un esempio; avrebbe bisogno di essere modificato o ricreato per piatti con diverse configurazioni. Questo può essere facilmente performed da qualcuno con conoscenze di base foglio di calcolo.

A causa della piccola quantità di campione caricato sulla piastra di amplificazione (33 nl), è necessario pre-amplificazione. Nella ottimizzazione di questo protocollo (non mostrato), abbiamo confrontato una serie di parametri di preamplificazione compreso il master mix, aggiunta di primer casuali, il numero di cicli, tempo di ricottura, e diluizione prima dell'amplificazione. Ogni bersaglio aveva le sue condizioni ottimali, e quelli qui descritti rappresentano quelli che ha dato il limite migliore della complessiva rilevazione per il nostro pannello. Questo pannello copre un'ampia gamma di obiettivi patogeni e tipi di campione che si incontrano nei test diagnostico veterinario di routine, ma le modifiche alle procedure di preamplificazione può essere necessaria per diversi pannelli. Le condizioni di amplificazione quelle ottimizzati sono basate su uno standard sonda basata protocollo in tempo reale PCR con un 10 min a 95 ° C attivazione enzimatica seguita da denaturazione a 95 ° C e AnnEaling / estensione a 60 ° C. I primer e le sonde sono pre-stampati sulle piastre anche utilizzando condizioni produttore ottimizzato e quindi non richiedono titolazione. Combinando i passaggi trascrizione inversa e pre-amplificazione per tutti i campioni (indipendentemente dal tipo di destinazione) è necessario per mantenere l'efficienza del flusso di lavoro. Avere tutti i campioni trascrizione inversa è anche utile per massimizzare la sensibilità. Inoltre, l'uso di una miscela master per il preamplificatore ottimizzata per inibitori riduce permette versatilità nel combinare diversi tipi di campione sulla stessa piastra.

Il Center for Disease Control (CDC) saggio matrice di influenza descritto da Shu et al. ⁷ e adattato qui per le reazioni scala nanolitro è una influenza universale Un test che è appropriato per i campioni di prova da esseri umani e animali da compagnia. E 'stato progettato per il rilevamento universale del gene matrice di tutti i virus dell'influenza A usando rea scala microlitroAZIONI. E 'stato utilizzato in tutto il mondo come parte di un Panel virus CDC influenza umana e di un pannello di influenza suina CDC. Il EHV-1 test ⁸ adattato qui rileva un importante patogeno respiratorio dei cavalli che possono causare aborti e malattie neurologiche (recensito da Pusterla e Hussey ^10). Il significato di adattare questi test per una piattaforma high-throughput con un controllo interno specie indipendente è che possono essere incorporati in un approccio di sorveglianza OneHealth. Avendo entrambi questi saggi su una piattaforma di test high-throughput faciliterà la preparazione alle emergenze per le strutture cliniche, ricoveri, e gli eventi di prestazioni.

I risultati sopra descritti erano rappresentative di tutti gli obiettivi sulla piastra con l'eccezione di Mycoplasma CYNOS, che ha mostrato considerevolmente più variazione delle prestazioni analitica. Questo è probabilmente dovuto alla temperatura di sub-ottimali di fusione (T _m) dei primer, che idealmente dovrebbe essere 58-60 &# 176; C (la sonda ideale Tm è 68-70 ° C). Una limitazione di questa piattaforma è che ci vuole più tempo per progettare e realizzare le piastre che per ordinare le singole sonde, che limita la capacità di modificare rapidamente le sequenze. Un'altra limitazione di PCR in tempo reale, in generale, è l'incapacità di rilevare romanzo o patogeni inattesi. Questo può essere superato in una certa misura progettando saggi che hanno sequenze di specie diverse, ma imparziali metodologie basate genoma sequenziamento sono più adatti per la scoperta di nuovi agenti. ^11,12

Nanoscale PCR in tempo reale permette un nuovo paradigma per la sindrome-based piuttosto che specie basati su test, che è utile per ridurre reagenti e costo del lavoro in diagnostica molecolare ad alto throughput. Su larga scala test panel da questo approccio può facilitare gli sforzi di sorveglianza OneHealth come quelli descritti da Dunne e Gurfield ¹³ e Moutailler et al. ^14. La raccolta dei campioni di tamponi precoce,generalmente entro 3 giorni di manifestazione clinica, offre la migliore possibilità di identificare la presenza di patogeni respiratori. Infettiva comparsa della malattia è spesso imprevedibile, e le prove che possono essere eseguite su diverse specie, senza la necessità di modifica dei reagenti sono ideali per la preparazione. Le future applicazioni di questa tecnologia sono suscettibili di essere in pathotyping, profilatura resistenza antimicrobica, ed ulteriori pannelli di diagnostica clinica sindrome-based. Nanoscale PCR in tempo reale è molto utile per lo screening rapido, high-throughput di molteplici tipi di campioni e patogeni, e sarebbe completato da approcci imparziali o parzialmente distorti sequenziamento-based per l'individuazione di nuove ed emergenti agenti patogeni.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zap-OGlobin II lytic reagent	Beckman Coulter	7546138	Optional reagent for preparing blood samples.
Extraction kit (MagMAX Total Nucleic Acid Isolation Kit)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	AM1840	Other extraction kits appropriate for the desired sample types may be substituted. This kit comes with PBS, lysis buffer, and wash buffer.
2x One-Step RT-qPCR mix (qScript XLT One-Step RT-qPCR ToughMix)	Quanta Biosciences	95134-500
Gene-specific primer pool	IDT	custom order	Can be generated by the user or purchased with the amplification plates.
Random primer mix	New England Biolabs	S1330S
Standard 96-well plate	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	N8010560	This can be any plate that fits into the conventional PCR machine used.
Amplification master mix (OpenArray master mix)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4462164
Clear adhesive seal	Thermo-Fisher	430611
Foil seal	Excel Scientific	AF-100
384-well plate	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4482221
Amplification plate (QuantStudio 12K Flex OpenArray plate)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4470813	Can be customized with any assays conforming to standard TaqMan conditions.
Accessories kit	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4469576	Contains the case lids, plugs, and immersion fluid.
AccuFill tips	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4457246
Amplification machine (QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4471090
Liquid handler (OpenArray AccuFill System)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4457243	This is purchased with the amplification machine.
Primer design software (Primer Express)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4363991	See manufacturer's instructions for detailed primer and probe specifications.
Image analysis program (ImageJ)	NIH		Available at http://imagej.nih.gov/ij/
Spreadsheet program (Excel)	Microsoft		Available at https://products.office.com/en-us/excel
DMEM	Thermo-Fisher/Gibco	11965-092
Tissue disruptor (TissueLyser II)	Qiagen	85300
Conventional thermal cycler (Veriti)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4375786	Any conventional thermal cycler with a heated lid can be used.
PCR plate spinner	VWR	89184-608	This device has only one speed (2,500 rpm); the rotor starts when the lid is closed and stops when the button is pushed.
TE buffer	Millipore	8890-100ML	10 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride, 1 mM Ethylenediaminetetraacetic acid, pH 8.0