Abstract
Muchas aplicaciones biomédicas importantes, tales como imágenes de células y la manipulación a distancia, se pueden lograr mediante el etiquetado de las células con nanopartículas de óxido de hierro superparamagnéticas (SPIONs). El logro suficiente captación celular de SPIONs es un reto que tradicionalmente se ha cumplido mediante la exposición de las células a concentraciones elevadas de SPIONs o mediante la prolongación de los tiempos de exposición (hasta 72 horas). Sin embargo, estas estrategias son propensos a mediar en la toxicidad. A continuación, presentamos la síntesis de la magnetoferritin SPION a base de proteínas, así como un protocolo de funcionalización de la superficie fácil de que permite una rápida magnetización celular utilizando concentraciones bajas de exposición. El núcleo de SPION magnetoferritin consiste en óxido de hierro cobalto-dopado con un diámetro medio de partículas de 8,2 nm mineralizada en el interior de la cavidad del bazo de caballo apo-ferritina. cationización química de magnetoferritin produjo una novela, SPION altamente membrana activa que magnetiza células madre mesenquimatosas humanas (hMSC) utilizando tiempos de incubación comoLas concentraciones más corto de un minuto y hierro como bajos como 0,2 mM.
Introduction
unión a la superficie o internalización de nanopartículas de óxido de hierro superparamagnéticas (SPIONs) ha permitido la magnetización de una variedad de tipos de células para aplicaciones tales como formación de imágenes y la manipulación a distancia. 1 Sin embargo, lograr suficiente magnetización celular puede ser un reto, especialmente cuando la interacción entre el SPION y la superficie celular es débil. 2 En las concentraciones anteriores, la exposición prolongada o alta SPION se han empleado como estrategias para superar este desafío. 3,4 Sin embargo, estas estrategias son problemáticos, ya que aumentan la toxicidad 5,6 y tienen un éxito muy limitado en tipos de células con bajas tasas de internalización, tales como linfocitos. 7 Para mejorar la captación celular de SPIONs, los enfoques de funcionalización varios de superficie se han explorado. Por ejemplo, los anticuerpos se han utilizado para promover la endocitosis mediada por receptor, 8 mientras que la captación no específica se puede lograr utilizando una transfeccióncaballeros 9,10 o especies penetran en las células, tales como tat-péptido del VIH. 11,12 Sin embargo, los enfoques de anticuerpos y de funcionalización péptido están limitados por reactivos caros y preparación sintética complejo, mientras que los agentes de transfección pueden inducir la precipitación de nanopartículas y afectar negativamente a la función celular. 13,14
Recientemente hemos informado de la síntesis de magnetoferritin cationizada químicamente, una novela SPION que era muy eficaz en las células madre mesenquimatosas humanas de magnetización (hMSC) utilizando tiempos de incubación tan corto como un minuto. 15 Magnetoferritin se sintetiza mediante la reconstitución de un SPION dentro de la cavidad desmineralizada de la ferritina proteína de almacenamiento de hierro. 16 Este SPION a base de proteínas combina muchas propiedades que lo hacen muy adecuado para la magnetización de células, tales como el control sobre las propiedades magnéticas del núcleo magnético, 17-19 y biocompatibilidad y la solubilidad acuosa conferidos por la cubierta de proteína. Promovermás, funcionalización de la superficie se consigue fácilmente debido a los aminoácidos direccionables que pueden ser químicamente o genéticamente modificadas 20-22. 23-25 Hemos demostrado que cationización química de los residuos de aminoácidos ácidos de la cubierta de proteína genera una nanopartícula estable que fácilmente interactuó con dominios aniónicos en la superficie celular que conduce a una rápida y persistente magnetización celular. Este procedimiento elimina la necesidad de funcionalización laborioso y protocolos de incubación largos, y debido al mecanismo de etiquetado no específica esta estrategia magnetización rápida debe encontrar aplicación muy extendida en otros tipos de células. A continuación, presentamos un informe en profundidad del procedimiento de marcaje celular ultra-rápida, incluyendo los protocolos detallados de la síntesis, la purificación y la superficie funcionalización de magnetoferritin cationizada.
Protocol
las células madre mesenquimales humanas (hMSC) se recogieron de la parte proximal del fémur de médula ósea de los pacientes artrósicos sometidos a cirugía de reemplazo total de cadera, en total acuerdo con las directrices del Comité de Ética de Investigación del Hospital Southmead de Bristol (referencia # 078/01) y después se obtuvo el consentimiento del paciente.
1. Síntesis y purificación Magnetoferritin
- Observaciones generales
- Realizar la síntesis magnetoferritin en un recipiente de reacción de doble camisa se puede sellar a 65 ° C en atmósfera de nitrógeno para restringir la oxidación de los precursores metálicos. Inyectar las soluciones de sal de metal y el peróxido de hidrógeno a través de los puertos de acceso de la tapa en el recipiente de reacción utilizando una bomba de jeringa.
- Después de la síntesis magnetoferritin, purificar la proteína por cromatografía de intercambio de aniones (ver sección 1.4) para eliminar las nanopartículas no encerrado en la cavidad de proteínas, seguido de cromatografía de exclusión por tamaño (ver sección 1.5) para aislar monómeros de proteínas. DelawareTermine la concentración de proteína usando un ensayo de Bradford (ver sección 1.6).
- Los preparativos antes de la síntesis
- Deoxygenate 500 ml de agua desionizada mediante la colocación de un tubo conectado a un cilindro de gas nitrógeno en el agua, sellando el recipiente con film transparente y burbujeante a través de gas de nitrógeno durante aproximadamente 60 min.
- Calentar un baño de agua conectado al recipiente de reacción de doble camisa a 65 ° C. Añadir 75 ml de 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinetanosulfónico (HEPES) 50 mM de tampón (pH 8,6) en el recipiente de reacción, sellar el recipiente, y deoxygenate por burbujeo de gas nitrógeno a través de la solución tampón durante aproximadamente 20 min. Al mismo tiempo, se agita la solución tampón utilizando un agitador magnético.
- Después de desoxigenación de la solución tampón HEPES, retirar el tubo de suministro de gas nitrógeno de la memoria intermedia y mantenerla en suspensión en el recipiente para mantener una atmósfera de nitrógeno. Añadir apo-ferritina para lograr una concentración final de 3 mg / ml. Continuar la agitación magnética, pero reduce la velocidad de agitación si se produce la formación de espuma.
- Preparar una solución madre 25 mM de heptahidrato de sulfato de cobalto por disolución de 0,19 g en 50 ml de agua desionizada desoxigenada.
- Preparar una solución de 25 mM de solución de sulfato hexahidrato de amonio y hierro mediante la disolución de 0,98 g en 100 ml de agua desionizada desoxigenada.
- Retirar 2,5 ml de la solución de sulfato hexahidrato de amonio y hierro y reemplazar con 2,5 ml de la heptahidrato de sulfato de cobalto.
- Preparar una solución 8,33 mM de peróxido de hidrógeno en agua desionizada desoxigenada añadiendo primero 965 l de una solución de peróxido de hidrógeno (30% w / w) a 9 ml de agua desionizada desoxigenada, y luego la adición de 1 ml de esta sub-Stock 99 ml de agua desionizada desoxigenada.
- síntesis Magnetoferritin
- Inyectar 10.1 ml de tanto el precursor de hierro-cobalto y el peróxido de hidrógeno al mismo tiempo en la solución de apo-ferritina (s magnéticamentetirred) a un caudal de 0,15 ml / min utilizando dos bomba de jeringa (volumen total inyectado: 20.2 ml).
- Durante el período de inyección, desoxigenar otros 500 ml de agua desionizada.
NOTA: El contenido del recipiente de reacción adoptan gradualmente un color marrón oscuro a medida que avanza la reacción. - Poco antes de la finalización de la primera inyección, preparar otros 100 ml de precursor de hierro-cobalto y solución de peróxido de hidrógeno usando el agua desionizada recién desoxigenada.
- Repetir la etapa de inyección descrito en 1.3.1 utilizando soluciones recién preparadas de hierro-cobalto y peróxido de hidrógeno.
- Durante el período de inyección, desoxigenar otros 500 ml de agua desionizada, y proceder como se describe en 1.3.3 y 1.3.4.
- Después de la tercera inyección, deje la solución a madurar durante 15 minutos con agitación.
- Añadir 1,5 ml de una solución de citrato de sodio 1 M al recipiente de reacción para quelar iones metálicos libres en solución.
- Retirar la solución de la reacciónbuque en 50 ml tubos de centrífuga, centrifugar durante 30 min a 4.350 xg y pasar el sobrenadante a través de un filtro de jeringa de 0,22 micras. En esta etapa, el sobrenadante filtrado se puede almacenar a 4 ° C hasta la purificación.
- Cromatografía de intercambio de iones
- Cargar la muestra en una columna (2,5 cm de diámetro, 20 cm de largo) que contiene una matriz catiónico usando una bomba peristáltica a un caudal de 10 ml / min.
- Lavar la columna con aproximadamente 100 ml de tampón (tampón Tris 50 mM (hidroximetil) aminometano (Tris), pH 8,0) que se ejecuta usando una bomba de gradiente a un caudal de 10 ml / min.
- Para eluir la proteína, se lava la columna a 10 ml / min con concentraciones crecientes de cloruro de sodio (NaCl) en tampón Tris: 150, 500 y 1.000 mM concentración final de NaCl, 150 ml de cada concentración.
- Como la proteína se eluye a una concentración de NaCl de 500 mM, recogerla en fracciones de 50 ml utilizando un colector de fracciones automatizado.
NOTA: Para unaprotocolo detallado de cromatografía de intercambio iónico consultar los protocolos publicados anteriormente. 26
- Cromatografía de exclusión por tamaños
- Se concentran los 150 ml de magnetoferritin a un volumen de aproximadamente 2 ml usando una unidad de filtro 15 ml centrífuga seguido de una unidad de volumen de 4 ml. Consulte las instrucciones del fabricante de las unidades de filtro centrífugo (véase la lista de materiales) para un protocolo detallado de este procedimiento.
- Cargar la muestra concentrada en una columna de filtración en gel utilizando un bucle de inyección.
- Lavar la columna con tampón de desarrollo (tampón Tris 50 mM, pH 8,0, que contiene NaCl 150 mM) a una velocidad de flujo de 1,3 ml / min.
- Recoger fracciones de 6 ml utilizando un colector de fracciones automático. monómeros de proteínas eluyen pasado. En este punto, magnetoferritin purificado se puede almacenar a 4 ° C hasta que cationización.
NOTA: Para un protocolo detallado de la cromatografía de exclusión por tamaños usando una columna de filtración en gel consultar Previously publicado protocolos. 27
- La determinación de la concentración de proteínas
- Preparar normas de ferritina de 0,06, 0,125, 0,25, 0,5 y 1 mg / ml en tampón Tris 50 mM utilizando comercialmente disponible de ferritina de bazo de caballo.
NOTA: La concentración de proteína de la ferritina está disponible en el mercado aparece en el frasco. Si no es así, póngase en contacto con el proveedor para obtener esta información. - Diluir las muestras de concentración desconocida magnetoferritin en tampón Tris 50 mM hasta que el color de la solución coincide aproximadamente el color de la norma 0,5 mg / ml. Anote el factor de dilución.
- Añadir 10 l de cada muestra estándar y magnetoferritin por triplicado en pocillos de una placa de 96 pocillos.
- Añadir 200 l de reactivo de Bradford ya preparada a cada pocillo (refiérase a la lista de materiales para Bradford detalles de reactivos de ensayo).
- Se incuba a temperatura ambiente durante 8 minutos.
- Medir la absorbancia a λ = 595 nm utilizandoun lector de microplacas.
- Trazar la absorbancia media de las normas de ferritina como una función de la concentración de proteínas y el uso de la pendiente y la intersección del ajuste lineal para calcular la concentración de la muestra magnetoferritin.
NOTA: Tener en cuenta el factor de dilución que se utiliza para ajustar la muestra magnetoferritin con la curva estándar.
- Preparar normas de ferritina de 0,06, 0,125, 0,25, 0,5 y 1 mg / ml en tampón Tris 50 mM utilizando comercialmente disponible de ferritina de bazo de caballo.
2. La cationización Magnetoferritin
- Observaciones generales
NOTA: Para cationización magnetoferritin, N, N -dimetil-1,3-propanodiamina (DMPA) se acopló a residuos de ácido aspártico y glutámico en la superficie MF usando N - (3-dimetilaminopropil) - etilcarbodiimida clorhidrato de N '(EDC).- Llevar a cabo la reacción a temperatura ambiente bajo agitación. El protocolo dado a continuación es para la cationización de 10 mg de magnetoferritin en un volumen total de 5 ml (concentración de proteína de 2 mg / ml). Sin embargo, aumentar o disminuirmanteniendo la proteína: DMPA: relaciones de EDC consistente, así como los volúmenes de la solución tampón y magnetoferritin.
- Antes de la reacción de cationización, dializar las muestras magnetoferritin en tampón de fosfato 50 mM (pH 7) que contiene NaCl 50 mM. Esto es importante para eliminar el tampón de elución Tris y evitar reacciones no deseadas entre la amina Tris y los residuos de ácido carboxílico activados-EDC. Determinar la concentración de proteína después de la diálisis y ajustarlo a 4 mg / ml antes de la cationización.
- protocolo de cationización
- Pesar 374 mg de DMPA y disolver en 2,5 ml de ácido etanosulfónico tampón 200 mM ácido 2- (N morfolino) (MES).
- Ajustar el pH de la solución a aproximadamente 7 usando (6 M) de ácido clorhídrico concentrado (HCl).
PRECAUCIÓN: Realice este paso en una campana de extracción, como la adición del ácido al DMPA libera gases tóxicos! - Añadir 2,5 ml de solución magnetoferritin a 4 mg / ml (final de concentración de MES es 100 mM, concentración final de magnetoferritin es 2 mg / ml, la cantidad total de proteínas es 10 mg).
- Añadir un agitador magnético y se agita durante 2 horas se equilibre.
- ajustar cuidadosamente la solución a pH 5,0 usando HCl 1 M.
- Añadir 141 mg de polvo de EDC a la solución de DMPA / magnetoferritin.
- Se continúa agitando durante 3,5 horas.
- Se filtra la solución a través de un filtro de jeringa de 0,22 micras para eliminar cualquier precipitado.
- Añadir la solución a un tubo de diálisis con un peso molecular de 12-14 kDa de corte y dializar contra 4 L de tampón de 50 mM de fosfato (pH 7) que contenía NaCl 50 mM durante 2 días a 4 ° C, en sustitución del tampón de diálisis por lo menos tres veces durante ese período.
NOTA: En este punto, magnetoferritin cationizado se puede almacenar a 4 ° C hasta su uso posterior.
3. mesenquimales humanas Etiquetado de células madre con cationizada Magnetoferritin
- Observaciones generales
- Células de cultivo como monocapas usando 175 cm 2 frascos y 20 ml de medio de cultivo, que se reponía cada 3 - 4 días. El medio de cultivo consistió de Dulbecco medio de Eagle modificado (DMEM), que contiene 1,000 mg / l de glucosa, 10% (v / v) de suero bovino fetal, 1% (v / v) de solución de penicilina / estreptomicina, 1% (v / v) L alanil-L-glutamina solución y el factor de crecimiento de fibroblastos humano 5 ng / ml recién suplementado.
- Etiquetado magnético de hMSC con magnetoferritin cationizada
- Semilla 150.000 hMSCs en 25 cm 2 frascos y dejar adherir durante la noche a 37 ° C.
- Filtrar esterilizar magnetoferritin cationizada a través de un filtro de 0,22 micras jeringa y determinar la concentración de proteína.
- Mantener condiciones estériles, preparar una solución de 0,5 M magnetoferri cationizadaestaño en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Mantenga tapado en una campana de cultivo estéril hasta su uso.
- Se lavan las células cultivadas en placas con 2 ml de PBS temperatura ambiente.
- Añadir 1 ml de la solución magnetoferritin cationizada esterilizada para las células cultivadas en placas y se incuba durante el período de tiempo deseado (1 min a 1 h).
- Lavar las células con PBS, y las células después de la cosecha mediante la adición de 0,5 ml de ácido tripsina / etilendiaminotetraacético (EDTA) e incubando a 37 ° C durante 5 min.
- Añadir 1 ml de medio de cultivo para inactivar la tripsina / EDTA, transferir la solución a un tubo de centrífuga de 15 ml y centrifugar durante 5 min a 524 x g.
- Eliminar el sobrenadante y volver a suspender el sedimento celular en 0,5 ml de tampón de separación magnética, que consta de 0,5% (w / v) de suero bovino fetal y EDTA 2 mM en PBS.
- Separación celular magnética
- Ponga el imán en el soporte de múltiples, y añadir una columna de separación magnética al imán. Colocar un filtro de pre-separación en el thcolumna de dirección.
- Colocar 0,5 ml de tampón de separación magnética en el filtro de separación y se deja correr tanto a través del filtro y la columna de lavar y humedecerlos.
- Colocar un tubo de centrífuga de 15 ml en la columna.
- Añadir 0,5 ml de la suspensión celular en el depósito del filtro de la columna de separación magnética.
- Cuando el depósito está vacío, añadir 0,5 ml de tampón de separación magnética.
- Cuando el depósito está vacío, añadir otros 0,5 ml de tampón de separación magnética.
- Repetir una vez más (el volumen total de tampón de separación magnética utilizada para el lavado debe ser de 1,5 ml). Esta etapa de lavado se eluye todas las células no magnetizadas de la (fracción de células no magnetizada) columna.
- Retirar la columna del imán y colocarlo en un nuevo tubo de centrífuga de 15 ml. Retirar filtro desde el depósito de la columna.
- Añadir 1 ml de tampón de separación magnética para el depósito e inmediatamente empujar a través de la columna usando el émbolo suministrado por la fabricaciónr. Este eluye las células magnetizadas de la columna en el tubo de centrífuga (fracción de células magnetizado).
- Centrifugar los dos tubos de 5 min a 524 x g.
- Eliminar el sobrenadante y volver a suspender los sedimentos celulares en 0,3 ml de PBS.
- Contar el número de números de células en cada fracción usando un hemocitómetro.
- Determinar la fracción de células magnetizadas, M (%), usando la siguiente ecuación:
donde n (M) es el número de células en la fracción imantada y n (M + NM) es la suma del número de células en las fracciones magnetizadas y no magnetizadas.
- Preparación hMSC marcadas con magnetoferritin cationizada para la cuantificación de hierro utilizando espectroscopia de emisión óptica con plasma acoplado inductivamente (ICP-OES)
NOTA: puede ser necesario adaptar para otros instrumentos ICP-OES El protocolo. Es aconsejable consultar con la retécnico responsable.- Centrifugar un número conocido de células durante 5 minutos a 524 x g.
- Eliminar el sobrenadante de PBS y añadir 0,25 ml de 50% (v / v) de ácido nítrico.
- Vortex mezclar la suspensión de células acidificada.
- Incubar a temperatura ambiente durante la noche.
- Añadir 4,75 ml de agua destilada a cada muestra y agitar la mezcla.
- Analizar con ICP-OES. 28
- Normalizar el contenido de hierro medido en el número de células para determinar un valor para el contenido de hierro celular.
Representative Results
TEM se utilizó para confirmar la mineralización de nanopartículas dentro de la cavidad apoferritina y determinar el tamaño del núcleo promedio (Figuras 1A y 1B). El análisis de imágenes de las muestras no teñidas magnetoferritin dio un diámetro de núcleo promedio de 8,2 ± 0,7 nm, y de la mancha aurothioglucose confirmó la presencia de las nanopartículas dentro de la jaula de proteínas. Tenga en cuenta que las imágenes muestran una muestra magnetoferritin que se purificó adicionalmente usando separación magnética para aislar núcleos de nanopartículas uniformes. muestras Magnetoferritin que no se purificaron magnéticamente tienen una distribución de tamaño de núcleo ligeramente más amplia. 29 Análisis de la estructura del núcleo magnetoferritin usando difracción de electrones área seleccionada se indica la posible presencia de la estructura espinela inversa basado en la magnetita (Fe 3 O 4) y / o maghemita (γ-Fe 2 O 3), así como la estructura de espinela debido a la Co 3 4. Además, los espectros de Raman reveló picos atribuidos a Fe 3 O 4, pequeñas cantidades de γ-Fe 2 O 3, y una ferrita de cobalto (Figura 1 C). análisis ICP-OES de magnetoferritin mostró un promedio de 102 g de hierro y 0,9 g de cobalto por miligramo de magnetoferritin.
Un esquema está incluido, que ilustra la etapa de cationización posterior (Figura 2 A). El diámetro hidrodinámico de magnetoferritin y magnetoferritin cationizada era 11,8 ± 1,1 nm y 12,5 ± 1,4 nm, respectivamente, como se determina por dispersión de luz dinámica. La eficiencia de cationización covalente DMPA-acoplamiento a magnetoferritin se evaluó mediante potenciometría zeta y el láser de desorción ionización tiempo de vuelo (MALDI-TOF) espectrometría de masas asistida por matriz. El potencial zeta cambió de -10.5 mV para MF a + 8,3 mV para magnetoferritin cationizada, lo que confirma unacambio en el potencial de superficie de negativo a positivo (Tabla 1). Experimentos de espectrometría de masas encontraron un peso molecular de 20,1 kDa subunidad nativa para apo-ferritina y 21,1 kDa para cationizada apo-ferritina (Figura 2 B). Este aumento de la masa corresponde a aproximadamente 12 moléculas de DMPA acopladas por subunidad de la proteína, y la cationización de 288 residuos de la proteína completa 24 de la subunidad.
la saturación magnética y la susceptibilidad se midieron utilizando magnetometría SQUID, y transversal y longitudinal de relajación se midieron usando imágenes de resonancia magnética. Las propiedades magnéticas fueron similares para magnetoferritin y magnetoferritin cationizada, lo que indica que cationización tuvo un impacto insignificante sobre las propiedades magnéticas de la SPION cerrado (Tabla 1). Además, estas propiedades son similares a otras nanopartículas a base de óxido de hierro, lo que demuestra que 19,30 cationizada magnetoferritin sería tan adecuados como agentes de contraste para MRI basados en SPION convencionales en la mejora de contraste de formación de imágenes.
Después de una exposición de 30 minutos, la superficie de la célula estaba densamente cubierta con magnetoferritin cationizada (Figura 3 A). Sin embargo, después de una semana, no hay nanopartículas se encuentran en la superficie celular (Figura 3 B). magnetoferritin cationizada era extraordinariamente eficaz en hMSCs magnéticamente etiquetado. En particular, la exposición de las células a magnetoferritin cationizada durante un minuto resultó en la magnetización de 92% de la población de células y la entrega de 3,6 pg de hierro por célula. El aumento del tiempo de incubación a 15 minutos dado lugar a la magnetización de toda la población celular (Figura 3 C).
Figura 1: Caracterización de magnetof núcleos erritin dopado con 5% de cobalto. Imágenes TEM de magnetoferritin teñidas con aurothioglucose (A) y sin teñir (B). El recuadro muestra la difracción de electrones correspondiente con índices de magnetita. Barra de escala: 20 nm. (C) Raman espectro para magnetoferritin. Las flechas indican los principales modos de vibración Raman para la ferrita de cobalto (T 2 g), magnetita y magemita (tanto A 1 g). 31,32 La longitud de onda del láser utilizado fue 532 nm. (Imagen adaptada de Okuda et al. 18). Tenga en cuenta que esta muestra magnetoferritin había sido purificado adicionalmente utilizando la separación magnética, que aisló partículas magnetoferritin uniformemente cargados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 2: La cationización de magnetoferritin. A) representaciones disolvente accesible superficie que muestran la distribución de ácido (rojo) y los residuos de aminoácidos básicos (amarillo) en la superficie de la proteína. Magnetoferritin (1) se modifica para cationizada magnetoferritin (2) por reticulación de carbodiimida mediada de DMPA a los residuos de aminoácidos ácidos en la superficie de la proteína (3). B) Análisis de espectrometría de masas de las subunidades de ferritina apo-apo-ferritina y cationizada. Masa-carga (m / z) espectro de apoferritina (ApoF) y apoferritina cationizada (cat-ApoF) generada por MALDI-TOF. Un aumento de la masa de 20,1 kDa a 21,1 kDa se observa después de cationización. (Imagen adaptada de Carreira Correia et al. 15) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: etiquetado magnética y separación de células de hMSC incubadas con magnetoferritin cationizada. A) Imagen TEM de hMSCs después de una incubación de 30 minutos con magnetoferritin cationizada. La flecha indica la presencia de núcleos magnetoferritin densamente empaquetadas en la superficie celular. Barras de escala: 200 nm. B) Imagen TEM de hMSC una semana después de etiquetado. La superficie de la célula esté libre de magnetoferritin cationizada. C) La investigación de la rapidez de etiquetado magnético: 92% de la población celular se magnetiza después de una exposición de un minuto con 0,5 M magnetoferritin cationizados, y toda la población de células se magnetiza el plazo de 15 minutos. El contenido de hierro por célula se determinó utilizando ICP-OES. se muestran promedio y desviación estándar de tres réplicas biológicas. (Imagen adaptada de Carreira Correia et al. 15) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| MF | cat-MF | |
| Diámetro hidrodinámico [nm] | 11,8 ± 1,1 | 12,5 ± 1,4 |
| Zeta potencial [mV] | (-) 10,4 ± 0,2 | 8,3 ± 0,7 |
| Momento magnético de saturación [Am 2 kg -1] | 54,9 ± 1,6 | 55,3 ± 1,4 |
| La susceptibilidad de masas [10 x 4 m 3 kg -1] | 1,75 ± 0,08 | 1,75 ± 0,07 |
| Capacidad de relajación longitudinal [seg mM -1 -1] | 2,6 ± 0,1 | 2,3 ± 0,1 |
| Capacidad de relajación transversal [seg mM -1 -1] | 44,6 ± 1,0 | 52,8 ± 0,8 |
Tabla 1: Caracterización físico-química de magnetoferritin (MF) y magnetoferritin cationizada (cat-MF). (Tabla adaptada de Correia Carreira et al. 15)
Discussion
TEM de las muestras teñidas con magnetoferritin aurothioglucose reveló la mineralización éxito de las nanopartículas dentro de la jaula de proteínas. difracción de electrones y el análisis Raman del núcleo de nanopartículas indicaron la presencia de una ferrita de cobalto, lo que indica el dopaje satisfactoria del núcleo de nanopartícula con cobalto. Esto demuestra que las nanopartículas de óxidos mixtos pueden ser mineralizada con éxito dentro de la cavidad apo-ferritina. Además, hemos demostrado previamente que el dopaje de cobalto se puede variar mediante la alteración de la cantidad de precursor de cobalto añadido a la mezcla de reacción, que permite un ajuste de las propiedades magnéticas. 18
Síntesis Magnetoferritin se puede realizar en una variedad de vasos, el tiempo que están estrechamente sellable y tienen puertos de acceso a través del cual se pueden introducir los reactivos (por ejemplo, una de tres bocas matraz de fondo redondo). La temperatura de reacción debe mantenerse a 65 ° C, ya sea colocando el recipiente ena / baño de aceite o de agua utilizando un recipiente de doble camisa. En este caso, se utilizó una configuración de doble camisa celda electroquímica para llevar a cabo la síntesis. Para garantizar síntesis exitosa, manteniendo el pH correcto y evitando la contaminación de oxígeno de las soluciones acuosas es crucial. soluciones de sales metálicas siempre deben prepararse recientemente antes de su uso en lugar de por adelantado. Además, las soluciones apoferritina comerciales pueden variar en calidad y afectar resultado la síntesis (por ejemplo., Tamaño de nanopartícula mineralizada núcleo). Puede ayudar a dializar la solución apoferritina en tampón HEPES 50 mM (pH 8,6) antes de la síntesis para eliminar cualquier agente reductor residual utilizado por el fabricante. Es útil hacer una nota del número de lote de la solución de apo-ferritina utilizado para la síntesis, por lo que puede ser solicitada específicamente por el fabricante debe necesidad adicional de material que se ha comprado. Por otra parte, la concentración de proteína disponible en el mercado apo-ferritina debe ser indicada en la botella, que puedeser utilizado para calcular el volumen de la solución de apo-ferritina necesario para la síntesis. Si este no es el caso, póngase en contacto con el proveedor para obtener esta información.
La ventaja de la adición gradual de sales metálicas y de peróxido de hidrógeno - tal como se presenta aquí y en informes anteriores - es que la mineralización del núcleo de nanopartículas puede ser controlado de tal manera que diferentes factores de carga (es decir, tamaños de nanopartículas) se puede lograr. 33 Además, es posible purificar magnetoferritin adicionalmente usando una columna de separación magnética, por ejemplo, una columna rellena con polvo de acero inoxidable asegurada dentro de un electroimán. 34 Por lo tanto, los núcleos de nanopartículas altamente monodispersas se puede aislar de la muestra magnetoferritin granel. Sin embargo, para el marcaje celular magnética como se presenta aquí esto no es necesario. Una limitación de la síntesis de magnetoferritin es el rendimiento de síntesis relativamente baja de aproximadamente 10%, y el costo relativamente alto de comercial apo-ferritin soluciones. Sin embargo, apo-ferritina también puede prepararse a partir de bazo de caballo barato disponible ferritina siguiendo protocolos de-mineralización establecidos. dieciséis
La cationización de magnetoferritin se logró mediante la adición de una relación molar de 250 moléculas de DMPA y 50 moléculas de EDC por residuo cargado negativamente (cálculos basados en la secuencia de aminoácidos de caballo ferritina de bazo). Este exceso de reactivo sobre la proteína resultó en altas eficiencias de cationización, comparable también para reportaron previamente resultado para la cationización de ferritina. 35 Para el análisis MALDI-TOF, apoferritina y apoferritina cationizada se utilizaron debido a la excesiva masa molecular del núcleo magnetoferritin. Para obtener altas eficiencias de cationización, pH óptimo es también crucial. entrecruzamiento mediado por EDC es más eficaz en condiciones ligeramente ácidas, y se encontró que el pH 5 dio resultados óptimos cationización para magnetoferritin. Sin embargo, para otras proteínas cpuede necesitar ser optimizado ationization pH. La cationización en o cerca del punto isoeléctrico de la proteína debe ser evitado, porque esto puede dar lugar a la precipitación severa.
magnetización de células madre con magnetoferritin cationizada era muy eficiente y podría lograrse usando tiempos de incubación muy por debajo de 30 minutos. Incluso una incubación de una minutos dio como resultado un contenido de hierro celular de 3,6 pg, que está dentro del rango informado necesario para influir en T2 y T2 * de contraste para MRI. 36,37 También es notable que este etiquetado eficiente se logra con concentraciones bajas de hierro extracelulares. Por ejemplo, estudios previos utilizando nanopartículas aniónicos reportan los niveles de hierro de 10 pg por célula después de un período de incubación de 30 minutos con hierro 5 mM. 38 En comparación, la incubación con una solución magnetoferritin cationizada que contiene 0,5 M de proteína corresponde a la incubación con hierro de aproximadamente 0,2 mM y también produce aproximadamente 10 pg de hierro por cell después de 30 minutos. No fuimos capaces de identificar claramente las vesículas endocytotic utilizando TEM. Sin embargo, estudios previos utilizando ferritina cationizada encontraron que la internalización se produjo dentro de los primeros diez minutos de exposición. 39,40 ferritina cationizada podría estar localizada en las vesículas recubiertas, lo que indica la endocitosis clathrin- o caveolina-dependiente. Los mismos estudios también informaron que después de 30 minutos de incubación, la ferritina cationizada todavía estaba presente en la superficie celular, así como en los cuerpos multivesiculares, asemejándose a los lisosomas.
Otras aplicaciones podrían incluir cationización de las jaulas de apo-ferritina cargados con otras nanopartículas y / o moléculas funcionales, tales como fármacos contra el cáncer 41 o 42 puntos cuánticos. La cationización de estas construcciones de ferritina podría dar lugar a una entrega más rápida y más eficiente de su carga a las células.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Fisher Scientific | BPE310-1 | powder; prepare a 1 M stock solution at pH 8.6 and dilute to 50 mM prior to use. Check the pH carefully prior to synthesis! |
| apoferritin from equine spleen | Sigma Aldrich | A3641 | we used LOT# 081M7011V |
| cobalt sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | C6768 | prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis |
| ammonium iron sulphate hexahydrate | Sigma Aldrich | F1543 | prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis |
| hydrogen peroxide solution (30%) | Sigma Aldrich | 216763 | prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis |
| sodium citrate | Sigma Aldrich | S1804 | powder; a 1 M solution can be prepared and kept at room temperature for several months |
| Millex GP filter unit, 0.22 micron | Merck Millipore | SLGP033RS | syringe filter |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | powder; prepare a 1 M stock solution at pH 8.0 and dilute to 50 mM prior to use |
| sodium chloride | Sigma Aldrich | 31434 | poweder; add to buffers as required |
| Centriprep centrifugal filter units | Merck Millipore | 4310 | Ultracel YM-50 membrane, 12 ml volume; use for initial concentration until the magnetoferritin solution has been concentrated from about 150 ml to 20 ml |
| Amicon Ultra-4 centrifugal filter untis | Merck Millipore | UFC801024 | Ultracel-10 membrane, 4 ml volume; use to concentrate magnetoferritin solution from about 20 ml to 2 ml |
| ANX Sepharose 4 Fast Flow | GE Healthcare | 17-1287-04 | we packed this column ourselves |
| HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR column | GE Healthcare | 17-1196-01 | this column was bought ready packed |
| ÄKTA purifier system | GE Healthcare | 28406264 | |
| sample pump P-960 | GE Healthcare | 18-6727-00 | load sample at a flow rate of 10 ml/min |
| automated fraction collector Frac-950 | GE Healthcare | 18-6083-00 | |
| Bradford assay reagent | Sigma Aldrich | B6916 | solution ready to use |
| Ferritin, Type I: from horse spleen | Sigma Aldrich | F4503 | prepare ferritin standards from this solution to determine magnetoferritin concentration |
| N,N-dimethyl-1,3-propanediamine (DMPA) | Sigma Aldrich | 308110 | CAUTION: when adjusting the pH of a DMPA solution, perform this step in a fume hood |
| N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma Aldrich | E6383 | keep in freezer but bring to room temperature before opening the bottle |
| 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | AppliChem | A0689,0500 | powder; prepare a 200 M stock solution at pH 5 |
| dialysis tubing cellulose membrane | Sigma Aldrich | D9652 | soak 10 min in deionized water before use |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), 1,000 mg/L glucose | Sigma Aldrich | D5546 | warm in 37 °C water bath before use |
| fetal bovine serum | Sigma Aldrich | F7524 | add to stock DMEM bottle, 10% (v/v) final concentration |
| penicillin/streptomycin solution | Sigma Aldrich | P0781 | add to stock DMEM bottle, 1% (v/v) final concentration |
| glutamax solution | Gibco | 35050-087 | add to stock DMEM bottle, 1% (v/v) final concentration |
| human fibroblast growth factor | PeproTech | 100-18B | add to DMEM freshly into cell culture flask with each media change; final concentration 5 ng/ml |
| phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | D8537 | sterile solution, for cell cultrue |
| trypsin/EDTA solution | Sigma Aldrich | E5134 | keep in freezer and defrost in 37 °C water bath before use |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E5134 | powder; make a 2 mM solution in PBS |
| bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7030 | add 0.5% (w/v) into 2 mM EDTA solution in PBS; carefully stir with magnetic stirrer, avoid foaming; filter sterilize through a 0.22 micron syringe filter |
| MACS multi stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | for attachment of MACS magnet |
| MACS MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | disposable; intended for single use, but if sterility is not required, they can re-used: wash with deionized water and 100% ethanol, and placed in a drying oven; discard if you observe rusty patches |
| MiniMACS separator magnet | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | can be bought as a starter kit, together with columns and stands |
| MACS column pre-separation filter | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | 30 mm filter |
| Nitric acid solution, 64-66% | Sigma Aldrich | 7006 | |
| Titrando 907, syringe pump | Metrohm | 2.907.0020 | |
| Equipment used to characterize magnetoferritin and cationized magnetoferritin | |||
| SpectraMax M5 | Molecular Devices | Used to measure absorbance in the Bradford assay | |
| JEM 1200 EX | JEOL | Used for TEM imaging of magnetoferritin | |
| InVia Raman spectrometer | Renishaw | Used for Raman spectroscopy | |
| Torus DPSS laser | Laser Quantum | Used for Raman spectroscopy | |
| Bruker UltrafleXtreme | Applied Biosystems | Used for MALDI-TOF analysis of apoferritin and cationized apoferritin | |
| ZetaSizer Nano-ZS | Malvern Instruments | Used to measure hydrodynamic diameter and zeta potential of magnetoferritin and cationized magnetoferritin | |
| Magnetic Property Measurement System | Quantum Design | Used to measure magnetic saturation moment and magnetic susceptibility | |
| Magnetom Skyra | Siemens | Used to determine longitudinal and transverse relaxivity | |
| Tecnai 12 BioTwin Spirit | FEI | Used for TEM imaging of hMSC labeled with cationized magnetoferritin | |
| 710 ICP-OES | Agilent | Used to determine iron content in cells | |
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