Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Syntese av kationiserte Magnetoferritin for Ultra-rask Magnetization Celler

Published: December 13, 2016 doi: 10.3791/54785

Abstract

Mange viktige biomedisinske applikasjoner, for eksempel celle bildebehandling og ekstern manipulasjon, kan oppnås ved å merke celler med superparamagnetiske jernoksid nanopartikler (SPIONs). Oppnå tilstrekkelig cellulært opptak av SPIONs er en utfordring som tradisjonelt har blitt møtt ved å utsette celler til forhøyede konsentrasjoner av SPIONs eller ved å forlenge eksponeringstider (opptil 72 timer). Men disse strategiene er sannsynlig å formidle toksisitet. Her presenterer vi syntesen av protein-baserte Spion magnetoferritin samt en lettvinte overflaten funksjon protokoll som muliggjør rask celle magnetisering ved hjelp av lave eksponeringskonsentrasjoner. Den spion kjerne av magnetoferritin består av kobolt-dopet jernoksyd med en gjennomsnittlig partikkeldiameter på 8,2 nm mineralisert inne i hulrommet av heste milt apo-ferritin. Kjemisk kationisering av magnetoferritin produsert en roman, høyt membran aktiv spion som magnetisert menneskelige stamceller (hMSCs) med inkubasjonstider somkorte som ett minutt og jernkonsentrasjoner som lows som 0,2 mm.

Introduction

Overflatebinding eller internalisering av superparamagnetiske jernoksid nanopartikler (SPIONs) har gjort det mulig magnetisering av en rekke celletyper for applikasjoner som bildebehandling og ekstern manipulasjon. En imidlertid oppnå tilstrekkelig celle magnetisering kan være en utfordring, spesielt når interaksjonen mellom Spion og celleoverflaten er svak. 2 I de siste, langvarig eksponering eller høy Spion konsentrasjoner har vært ansatt som strategier for å overvinne denne utfordringen. 3,4 Likevel, disse strategiene er problematisk fordi de øker toksisiteten 5,6 og har svært begrenset suksess i celletyper med lave priser internalisering, så som lymfocytter. 7 For å forbedre cellulært opptak av SPIONs, har flere overflatefunksjonalise tilnærminger blitt utforsket. For eksempel har antistoffer blitt anvendt for å fremme reseptormediert endocytose, 8 mens ikke-spesifikt opptak kan oppnås ved hjelp av en transfeksjongents 9,10 eller cellepenetrerende arter, slik som HIV tat-peptid. 11,12 er imidlertid antistoff og peptid funksjonalise tilnærminger begrenset av dyre reagenser og komplekse syntetisk forberedelse, mens transfeksjon agenter kan indusere nanopartikkel nedbør og påvirke cellefunksjon. 13,14

Vi har nylig rapportert syntese av kjemisk kationisert magnetoferritin, en roman spion som var svært effektive i magnetizing menneskelige stamceller (hMSCs) med inkubasjonstider så kort som ett minutt. 15 Magnetoferritin syntetiseres ved rekonstituering av en Spion inne i demineralisert hulrom av jernet lagring proteinet ferritin. 16 Dette proteinbaserte Spion kombinerer mange egenskaper som gjør det godt egnet for celle magnetisering, slik som kontroll av de magnetiske egenskaper av den magnetiske kjerne, 17-19 og biokompatibilitet og vandig oppløselighet er tillagt av proteinet skallet. Lengremer, blir overflatefunksjonalisering lett oppnås på grunn av adresser aminosyrer som kan være kjemisk eller genetisk modifisert 20-22. 23-25 Vi har vist at kjemisk kationisering av de sure aminosyrerestene i proteinet skallet genererer en stabil nanopartikkel som lett interaksjon med anioniske domener på celleoverflaten som fører til rask og vedvarende celle magnetisering. Denne fremgangsmåten eliminerer behovet for arbeidskrevende funksjonalisering og lange inkubasjonstider protokoller, og på grunn av den ikke-spesifikke merking mekanisme dette hurtig magnetisering strategien bør finne utbredt anvendelse i andre celletyper. Her presenterer vi en grundig rapport fra den ultra-raske celle merking metode, inkludert detaljerte protokoller av syntese, rensing og overflaten funksjonalisering av kationisert magnetoferritin.

Protocol

Menneskelige stamceller (HMSC) ble høstet fra den proksimale femur benmarg fra osteoarthritic pasienter som gjennomgår total hofteprotesekirurgi, i full overensstemmelse med Bristol Southmead Hospital forskningsetiske komité retningslinjer (referanse # 078/01), og etter pasientens samtykke ble innhentet.

1. Magnetoferritin Syntese og rensing

  1. Generelle bemerkninger
    1. Utføre magnetoferritin syntese i en lukkbar, dobbelt-mantlet reaksjonsbeholderen ved 65 ° C under nitrogenatmosfære for å begrense oksidasjon av metall forløpere. Injiser metallsaltoppløsninger og hydrogenperoksid gjennom aksessporter i lokket inn i reaksjonsbeholderen ved hjelp av en sprøytepumpe.
    2. Etter magnetoferritin syntese, rense proteinet ved anionbytterkromatografi (se avsnitt 1.4) for å fjerne nanopartikler ikke omsluttet i protein hulrom, etterfulgt av størrelse-eksklusjonskromatografi (se avsnitt 1.5) for å isolere protein monomerer. determine proteinkonsentrasjonen ved hjelp av en Bradford assay (se avsnitt 1.6).
  2. Forberedelser før syntese
    1. Oksygen fra 500 ml deionisert vann ved å anbringe et rør som er koblet til en nitrogengass sylinder i vannet, forsegling fartøyet med plastfolie og gjennombobling av nitrogengass i ca. 60 min.
    2. Varm et vannbad som er koblet til dobbeltkappet reaksjonskaret til 65 ° C. Legg 75 ml av 50 mM 4- (2-hydroksyetyl) -1-piperazinetansulfonsyre (HEPES) buffer (pH 8,6) inn i reaksjonsbeholderen, forsegle beholderen, og oksygen fra ved å boble nitrogengass gjennom bufferoppløsningen i ca. 20 min. På samme tid, rør bufferoppløsningen ved hjelp av en magnetrører.
    3. Etter deoxygenating den HEPES-buffer-løsning, fjerne røret tilførsel av nitrogengass fra bufferen og holde det suspendert i fartøyet for å opprettholde en nitrogenatmosfære. Legg apo-ferritin for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 3 mg / ml. Fortsett magnetisk omrøring, men redusere omrøringshastigheten hvis skumdannelse oppstår.
    4. Fremstille en 25 mM stamløsning av koboltsulfat-heptahydrat ved å oppløse 0,19 g i 50 ml deoksygenert avionisert vann.
    5. Fremstille en 25 mM løsning av ammonium-jern-sulfat heksahydrat oppløsning ved å oppløse 0,98 g i 100 ml deoksygenert avionisert vann.
    6. Fjern 2,5 ml av ammonium-jern-sulfat heksahydrat løsning og erstatte med 2,5 ml av koboltsulfat-heptahydrat.
    7. Fremstille en 8,33 mM oppløsning av hydrogenperoksyd i deoksygenert avionisert vann ved først å tilsette 965 ul av en hydrogenperoksidløsning (30% vekt / vekt) til 9 ml deoksygenert avionisert vann, og deretter tilsetning av 1 ml av denne sub-lager 99 ml av deoksygenert avionisert vann.
  3. Magnetoferritin syntese
    1. Injiser 10,1 ml av både jern-kobolt-forløperen og det hydrogenperoksyd samtidig i apo-ferritin-oppløsning (s magnetisktirred) ved en strømningshastighet på 0,15 ml / min ved hjelp av to sprøytepumpe (totalt volum injisert: 20,2 ml).
    2. Under injeksjonsperiode, oksygen fra en annen 500 ml avionisert vann.
      MERK: Innholdet i reaksjonsbeholderen etter hvert innta en mørk brun farge som reaksjonen skrider frem.
    3. Kort tid før ferdigstillelse av den første injeksjonen, forberede ytterligere 100 ml av jern-kobolt forløper og hydrogen peroxide løsning med den ferske deoxygenated avionisert vann.
    4. Gjenta innsprøytingstrinnet som er beskrevet i 1.3.1 ved hjelp av ferskt tilberedte oppløsninger av jern-kobolt og hydrogenperoksyd.
    5. I løpet av injeksjonsperiode, oksygen fra en annen 500 ml avionisert vann, og fortsetter som beskrevet i 1.3.3 og 1.3.4.
    6. Etter den tredje injeksjonen, la løsningen for å modne i 15 minutter under omrøring.
    7. Tilsett 1,5 ml av en 1 M natrium-citrat-løsning til reaksjonskaret for å chelatere frie metallioner i oppløsning.
    8. Fjerne løsningen fra reaksjonskar i 50 ml sentrifugerør, sentrifuger i 30 minutter ved 4350 xg og passere supernatanten gjennom et 0,22 um sprøytefilter. På dette stadium, kan den filtrerte supernatanten oppbevares ved 4 ° C inntil rensing.
  4. Ionebytterkromatografi
    1. Laste prøven på en kolonne (2,5 cm diameter, 20 cm lang) inneholdende en kationisk matrise ved hjelp av en peristaltisk pumpe ved en strømningshastighet på 10 ml / min.
    2. Vask kolonnen med ca. 100 ml buffer (50 mM Tris (hydroksymetyl) aminometan (Tris), pH 8,0) ved anvendelse av en gradient pumpe ved en strømningshastighet på 10 ml / min.
    3. For å eluere proteinet, vaskes kolonnen ved 10 ml / min med økende konsentrasjoner av natriumklorid (NaCl) i Tris-buffer: 150, 500 og 1000 mM endelig NaCl-konsentrasjonen, 150 ml av hver konsentrasjon.
    4. Som proteinet elueres ved en NaCl-konsentrasjon på 500 mM, samle det i 50 ml fraksjoner ved bruk av en automatisk fraksjonsoppsamler.
      MERK: For endetaljert protokoll for ionebyttekromatografi kontakt med tidligere publiserte protokoller. 26
  5. Utelukkelse størrelse kromatografi
    1. Konsentrer de 150 ml magnetoferritin til et volum på omtrent 2 ml ved anvendelse av en 15 ml sentrifugal-filterenhet, etterfulgt av en 4 ml volumenhet. Se produsentens instruksjoner av sentrifugalkreftene filterenhetene (se materialliste) for en detaljert protokoll for denne prosedyren.
    2. Legg den konsentrerte prøven på en gelfiltreringskolonne ved hjelp av en injeksjonssløyfe.
    3. Vask kolonnen med rennende buffer (50 mM Tris-buffer, pH 8,0, inneholdende 150 mM NaCl) ved en strømningshastighet på 1,3 ml / min.
    4. Samle 6 ml fraksjoner ved hjelp av en automatisert fraksjonssamler. Protein monomerer elueres sist. På dette punktet, kan renses magnetoferritin lagres ved 4 ° C inntil kationisering.
      MERK: For en detaljert protokoll av størrelse utelukkelse ved anvendelse av en gelfiltreringskolonne rådføre previously publisert protokoller. 27
  6. Bestemme proteinkonsentrasjonen
    1. Fremstille standarder for ferritin 0,06, 0,125, 0,25, 0,5 og 1 mg / ml i 50 mM Tris-buffer ved bruk av kommersielt tilgjengelig hest milt ferritin.
      MERK: Proteinkonsentrasjonen av kommersielt tilgjengelig ferritin er angitt på flasken. Hvis ikke, ta kontakt med leverandøren for denne informasjonen.
    2. Fortynn magnetoferritin prøver med ukjent konsentrasjon på 50 mM Tris-buffer inntil fargen på oppløsningen ca. tilsvarer fargen på 0,5 mg / ml standard. Noter fortynningsfaktoren.
    3. Tilsett 10 pl av hver standard og magnetoferritin prøve in triplo i brønner på en 96-brønners plate.
    4. Tilsett 200 mL av ferdiglaget Bradford reagens til hver brønn (se materiell liste for Bradford assay reagensstasjoner detaljer).
    5. Inkuber ved romtemperatur i 8 minutter.
    6. Mål absorbansen ved λ = 595 nm ved å brukeen mikroplateleser.
    7. Plott betyr absorbansen av ferritin-standarder som funksjon av proteinkonsentrasjonen og bruke helling og skjærings av lineær tilpasning for å beregne konsentrasjonen av den magnetoferritin prøven.
      MERK: ta hensyn til fortynningsfaktoren som ble brukt til å justere magnetoferritin prøven til standardkurven.

2. Magnetoferritin kationisering

  1. Generelle bemerkninger
    NB: For magnetoferritin kationisering, ble N, N-dimetyl-1,3-propandiamin (DMPA) koplet til asparagin og glutaminsyrerester på MF overflaten ved hjelp av N - (3-dimetylaminopropyl) - N'-etylkarbodiimidhydroklorid (EDC).
    1. Utføre reaksjonen ved værelsestemperatur under omrøring. Protokollen gitt nedenfor er for kationisering av 10 mg magnetoferritin i et totalvolum på 5 ml (proteinkonsentrasjon 2 mg / ml). Men skalere opp eller nedved å holde proteinet: DMPA: EDC-forhold konsistent, samt volumer av buffer og magnetoferritin løsning.
    2. Forut for kationisering reaksjonen, dialyser den magnetoferritin prøvene i 50 mM fosfatbuffer (pH 7) inneholdende 50 mM NaCl. Dette er viktig for å fjerne Tris elueringsbuffer og unngå uønskede reaksjoner mellom Tris amin og den EDC-aktiverte karboksylsyre-rester. Bestem proteinkonsentrasjonen etter dialyse og justere det til 4 mg / ml før kationisering.
  2. kationisering protokollen
    1. Vei ut 374 mg av DMPA og oppløses i 2,5 ml 200 mM 2- (N -morpholino) etansulfonsyre (MES) buffer.
    2. Justere oppløsningens pH til omtrent 7 ved anvendelse av konsentrert (6 M) saltsyre (HCl).
      FORSIKTIG: Utfør dette trinnet i en avtrekkshette, som tilsetning av syre til DMPA frigjør giftig røyk!
    3. Legg 2,5 ml magnetoferritin oppløsning ved 4 mg / ml (endelig konsensentrasjon av MES er 100 mM, sluttkonsentrasjon på magnetoferritin er 2 mg / ml, total mengde protein er 10 mg).
    4. Legg til en magnetisk rører og omrøres i to timer for å ekvilibrere.
    5. justeres nøye løsningen til pH 5,0 ved anvendelse av 1 M HCI.
    6. Legg 141 mg av EDC pulver til DMPA / magnetoferritin løsning.
    7. Fortsett omrøring i 3,5 timer.
    8. Filtrer løsningen gjennom et 0,22 um sprøytefilter for å fjerne eventuelle utfellinger.
    9. Tilsett oppløsningen til dialyserøret med et 12-14 kDa molekylvekt cut-off og dialyser mot 4 liter av 50 mM fosfatbuffer (pH 7) inneholdende 50 mM NaCl i 2 dager ved 4 ° C, ved å erstatte den dialysebuffer minst tre ganger i løpet av denne perioden.
      MERK: På dette punktet, kan kationisert magnetoferritin lagres ved 4 ° C inntil videre bruk.

3. Menneskelig Mesenchymale Stem Cell Merking med kationisert Magnetoferritin

  1. Generelle bemerkninger
    1. Kultur celler som monolagene bruker 175 cm 2 kolber og 20 ml kulturmedium, som var etterfylles hver 3 - 4 dager. Kulturmediet besto av Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) inneholdende 1000 mg / l glukose, 10% (v / v) føtalt bovint serum, 1% (volum / volum) penicillin / streptomycin-løsning, 1% (v / v) L -alanyl-L-glutamin-løsning og 5 ng / ml ferskt supplert human fibroblast vekstfaktor.
  2. Magnetisk merking av HMSC med kationisert magnetoferritin
    1. Seed 150.000 hMSCs til 25 cm 2 kolber og la til å følge natten ved 37 ° C.
    2. Filtersteriliser kationiserte magnetoferritin gjennom et 0,22 um sprøytefilter og bestemme proteinkonsentrasjonen.
    3. Holde sterile forhold, utarbeide en 0,5 mikrometer løsning av kationisert magnetoferritinn i fosfatbufret saltvann (PBS). Hold avkortet i en steril kultur hette før bruk.
    4. Vask cellene belagt med 2 ml romtemperatur PBS.
    5. Tilsett 1 ml av den steriliserte kationiserte magnetoferritin løsning på de pletterte cellene og inkuberes i den ønskede tidsperioden (1 min til 1 time).
    6. Vask cellene med PBS, og deretter høste cellene ved tilsetning av 0,5 ml trypsin / etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) og inkubering ved 37 ° C i 5 minutter.
    7. Tilsett 1 ml kulturmedium for å inaktivere trypsin / EDTA, overføre oppløsningen til et 15 ml sentrifugerør og sentrifuger i 5 minutter ved 524 x g.
    8. Kast supernatanten og re-suspen cellepelleten i 0,5 ml magnetisk separasjon buffer bestående av 0,5% (w / v) føtalt bovint serum og 2 mM EDTA i PBS.
  3. Magnetisk celleseparasjon
    1. Fest magneten til multi-stand, og legg til en magnetisk separasjon kolonne til magnet. Plasser et pre-separasjon filter på the-kolonne.
    2. Plassere 0,5 ml av magnetisk separasjon buffer i pre-separasjonsfilter og la den gå gjennom både filteret og kolonnen for å vaske og fukte dem.
    3. Plassere et 15 ml sentrifugerør under kolonnen.
    4. Tilsett 0,5 ml av cellesuspensjonen i filterbeholderen av den magnetiske separasjonskolonnen.
    5. Når beholderen er tom, tilsett 0,5 ml av magnetisk separasjon buffer.
    6. Når beholderen er tom, tilsett ytterligere 0,5 ml av magnetisk separasjon buffer.
    7. Gjenta en gang til (det totale volum av magnetisk separasjon buffer som brukes for vasking bør være 1,5 ml). Dette vasketrinn eluerer alle ikke-magnetiserte celler fra kolonnen (ikke-magnetisert cellefraksjon).
    8. Fjern kolonnen fra magneten og legg den i en frisk 15 ml sentrifugerør. Fjern filteret fra kolonnen reservoar den.
    9. Tilsett 1 ml av magnetisk separasjon buffer til reservoaret og straks presse gjennom kolonnen ved anvendelse av stempelet levert av produsentenr. Denne eluerer magnetisert cellene fra kolonnen til sentrifugerøret (magnetisert cellefraksjon).
    10. Sentrifuger begge rør i 5 minutter ved 524 x g.
    11. Kast supernatanten og re-suspendere cellen pellets i 0,3 ml PBS.
    12. Telle antall celler tall i hver fraksjon under anvendelse av et hemocytometer.
    13. Bestemme den fraksjon av magnetiserte celler, M (%), ved hjelp av følgende ligning:
      ligning
      der n (M) er antall celler i det magnetiserte fraksjon og n (M + NM) er summen av antall celler i magnetisert og ikke-magnetiserte fraksjoner.
  4. Forbereder hMSCs merket med kationisert magnetoferritin for jern kvantifisering ved hjelp av induktivt koplet plasma optisk emisjonsspektroskopi (ICP-OES)
    MERK: Protokollen må kanskje tilpasses for andre ICP-OES instrumenter. Det er lurt å rådføre seg med resvarlig tekniker.
    1. Sentrifuger et visst antall celler i 5 minutter ved 524 x g.
    2. Fjern PBS supernatanten og tilsett 0,25 ml av 50% (v / v) salpetersyre.
    3. Vortex blande syrnet cellesuspensjonen.
    4. Inkuber ved romtemperatur over natten.
    5. Legg 4,75 ml destillert vann til hver prøve og virvelblanding.
    6. Analyser med ICP-OES. 28
    7. Normaliser den målte jerninnholdet til antall celler for å bestemme en verdi for cellulær jerninnhold.

Representative Results

TEM ble benyttet for å bekrefte nanopartikkelmineralisering inne i Apoferritin hulrom og bestemme den gjennomsnittlige kjerne størrelse (figur 1A og 1B). Bildeanalyse av ufargede magnetoferritin prøvene ga en midlere kjernediameter på 8,2 ± 0,7 nm, og aurothioglucose flekk bekreftet tilstedeværelsen av nanopartikler innenfor proteinet buret. Legg merke til at bildene viser et magnetoferritin prøve som ble ytterligere renset ved anvendelse av magnetisk separasjon for å isolere ensartede nanopartikkelkjerner. Magnetoferritin prøver som ikke ble magnetisk renset ha en noe bredere kjerne størrelsesfordeling. 29 Analyse av strukturen av magnetoferritin kjernen ved hjelp av den valgte-område elektrondiffraksjon antydet det mulige nærvær av invers spinell struktur basert på magnetitt (Fe 3 O 4) og / eller maghemite (γ-Fe 2 O 3), samt spinell-struktur på grunn av Co 3 4. Videre Raman-spektrene viste topper som tilskrives Fe 3 O 4, små mengder av γ-Fe 2 O 3, og en kobolt ferritt (figur 1C). ICP-OES-analyse av magnetoferritin viste et gjennomsnitt på 102 mikrogram av jern og 0,9 ug av kobolt pr milligram magnetoferritin.

En skjematisk følger, illustrerer den påfølgende kationisering trinnet (figur 2 A). Den hydrodynamiske diameter av magnetoferritin og kationisert magnetoferritin var 11,8 ± 1,1 nm og 12,5 ± 1,4 nm, henholdsvis, som bestemt ved dynamisk lysspredning. Den kationisering effektiviteten av kovalent DMPA-kobling til magnetoferritin ble vurdert ved hjelp av zeta potensiometri og matrise-assistert laser desorpsjon ionisering time-of-flight (MALDI-TOF) massespektrometri. Zeta potensialet endret fra -10,5 mV for MF til + 8,3 mV for kationisert magnetoferritin, bekrefter enendring i overflatepotensial fra negative til positive (tabell 1). Massespektrometri eksperimenter funnet en subenhet molekylvekt på 20,1 kDa for naturlig forekommende Apo-ferritin og 21,1 kDa for kationisert apo-ferritin (figur 2 B). Denne masseøkning tilsvarer omtrent 12 koplet DMPA molekyler pr protein underenhet, og de kationisering av 288 rester på hele 24-underenhet-protein.

Magnetisk metning og mottakeligheten ble målt ved hjelp av SQUID magnetometri, og tverrgående og langsgående relaksasjon ble målt ved anvendelse av magnetisk resonans billeddannelse. Magnetiske egenskaper var like for magnetoferritin og kationisert magnetoferritin, noe som indikerer at kationisering hadde ubetydelig virkning på de magnetiske egenskapene til den vedlagte Spion (tabell 1). Videre disse egenskapene er lik andre jernoksid baserte nanopartikler, 19,30 demonstrere at kationisert magnetoferritin ville være like egnet som konvensjonelle Spion-baserte MRI-kontrastmidler i å forbedre bildekontrasten.

Etter en 30-minutters eksponering, ble celleoverflaten tett dekket med kationisert magnetoferritin (figur 3 A). Imidlertid, etter en uke, var det ikke noen nanopartikler som finnes på celleoverflaten (figur 3 B). Kationisert magnetoferritin var utrolig effektiv på magnetisk merking hMSCs. Spesielt, utsette cellene for å kationisert magnetoferritin i ett minutt, resulterte i magnetiseringen av 92% av cellepopulasjonen og levering av 3,6 pg av jern per celle. Økning av inkubasjonstiden til 15 minutter resulterte i magnetiseringen av hele cellepopulasjon (figur 3C).

Figur 1
Figur 1: Karakterisering av magnetof erritin kjerner som er dopet med 5% kobolt. TEM bilder av magnetoferritin farget med aurothioglucose (A) og unstained (B). Inset viser tilsvarende elektrondiffraksjon med magnetitt indekser. Skala: 20 nm. (C) Raman-spektrum for magnetoferritin. Pilene viser de viktigste Raman vibrasjonsmodi for kobolt ferritt (T 2 g), magnetitt og maghemite (begge A 1 g). 31,32 Laseren bølgelengde brukte var 532 nm. (Bilde tilpasset fra Okuda et al. 18). Merk at dette magnetoferritin prøven hadde blitt ytterligere renset ved hjelp av magnetisk separasjon, noe som isolert jevnt lastet magnetoferritin partikler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

785fig2.jpg "/>
Figur 2: kationisering av magnetoferritin. A) løsemiddeltilgjengelige overflatearealet fremstillinger som viser fordelingen av sure (rød) og basiske (gule) aminosyrerester på proteinoverflaten. Magnetoferritin (1) blir modifisert for å kationisert magnetoferritin (2) ved karbodiimid-mediert tverrbinding av DMPA til sure aminosyre-rester på protein overflaten (3). B) Massespektrometri analyse av apo-ferritin og kationisert apo-ferritin subenheter. Masse-til-ladning (m / z) spektrum av Apoferritin (ApoF) og kationisert Apoferritin (cat-ApoF) generert ved MALDI-TOF. En masse økning fra 20,1 kDa til 21,1 kDa er observert etter kationisering. (Bilde tilpasset fra Correia Carreira et al. 15) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.


Figur 3: Magnetisk merking og celle separasjon av hMSCs inkubert med kationisert magnetoferritin. A) TEM bilde av hMSCs etter en 30 minutters inkubering med kationisert magnetoferritin. Pilen indikerer tilstedeværelse av magnetoferritin kjerner tettpakkede på celleoverflaten. Skala barer: 200 Nm. B) TEM bilde av HMSC en uke etter merking. Celleoverflaten er klar av kationisert magnetoferritin. C) Undersøkelse av den hurtighet av magnetisk merking: 92% av cellepopulasjonen var magnetisert etter ett minutts eksponering med 0,5 uM kationisert magnetoferritin, og hele cellepopulasjonen ble magnetisert i løpet av 15 minutter. Jerninnhold per celle ble bestemt ved hjelp av ICP-OES. Gjennomsnitt og standardavvik fra tre biologiske replikater vises. (Bilde tilpasset fra Correia Carreira et al. 15) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

MF cat-MF
Hydrodynamisk diameter [nm] 11,8 ± 1,1 12,5 ± 1,4
Zeta potensial [mv] (-) 10,4 ± 0,2 8.3 ± 0.7
Magnetic metning øyeblikk [Am 2 kg -1] 54,9 ± 1,6 55,3 ± 1,4
Mass mottakelighet [x 10 4 m 3 kg -1] 1,75 ± 0,08 1,75 ± 0,07
Langsgående relaksiviteten [mm -1 sek -1] 2,6 ± 0,1 2,3 ± 0,1
Tverrgående relaksiviteten [mm -1 sek -1] 44,6 ± 1,0 52,8 ± 0,8

Tabell 1: Fysiokjemiske karakterisering av magnetoferritin (MF) og kationisert magnetoferritin (cat-MF). (Tabell tilpasset fra Correia Carreira et al. 15)

Discussion

TEM av magnetoferritin prøver farget med aurothioglucose avslørte vellykket mineralisering av nanopartikler inne i protein buret. Elektrondiffraksjon og Raman analyse av nanopartikkelkjernen indikerte tilstedeværelse av en kobolt ferritt, noe som indikerer vellykket doping av nanopartikkel kjerne med kobolt. Dette viser at mixed-oksid nanopartikler kan med hell være mineralisert innenfor apo-ferritin hulrom. Videre har vi vist tidligere at kobolt doping kan varieres ved å endre mengden av kobolt forløper tilsatt til reaksjonsblandingen, som muliggjør justering av de magnetiske egenskaper. 18

Magnetoferritin syntese kan utføres i en rekke fartøyer, så lenge de er tett lukkbare og har sideåpninger gjennom hvilke reaktantene kan innføres (for eksempel en tre-halset rundbunnet kolbe). Reaksjonstemperaturen bør holdes ved 65 ° C, enten ved å plassere beholderen ien vann / olje-bad eller ved hjelp av en dobbel-mantlet kar. Her har vi brukt en dobbel-mantlet elektrokjemisk celle oppsett for å utføre syntese. For å sikre vellykket syntese, opprettholde den riktige pH-verdi, og å unngå oksygen forurensning av de vandige oppløsninger er avgjørende. Metallsaltoppløsninger bør alltid være forberedt på ferskt før bruk i stedet for på forhånd. Videre kan kommersielle Apoferritin løsninger varierer i kvalitet og påvirker syntese utfall (f.eks., Størrelse på nanopartikkel kjerne mineralisert). Det kan hjelpe til dialyser den Apoferritin løsningen i 50 mM HEPES-buffer (pH 8,6) før syntese for å fjerne eventuelt resterende reduksjonsmiddel som anvendes av produsenten. Det er nyttig å notere batchnummer apo-ferritin løsning som brukes for syntese, så det kan være spesielt bedt om fra produsenten, skal ytterligere materiale må kjøpes. Videre bør proteinkonsentrasjonen av kommersielt tilgjengelige apo-ferritin være angitt på flasken, noe som kanbli brukt til å beregne volumet av apo-ferritin oppløsning som er nødvendig for syntese. Hvis dette ikke er tilfelle, kan du kontakte leverandøren for denne informasjonen.

Fordelen med gradvis tilsetning av metallsalter og hydrogenperoksyd - som presenteres her og i tidligere rapporter - er at mineralisering av nanopartikler kjerne kan kontrolleres slik at ulike belastningsfaktorer (dvs. nanopartikkelstørrelser) kan oppnås. 33 Videre er det mulig å rense magnetoferritin ytterligere ved anvendelse av en magnetisk separasjonskolonne, for eksempel en kolonne fylt med pulver av rustfritt stål festet inne i en elektromagnet. 34 Således kan sterkt monodisperse nanopartikkel kjerner isoleres fra bulk magnetoferritin prøven. Men for magnetisk cellemerking som presenteres her dette er ikke nødvendig. En begrensning av magnetoferritin syntese er den relativt lave syntese utbytte på ca. 10%, og den relativt høye prisen for kommersiell apo-ferritin løsninger. Imidlertid kan apo-ferritin også fremstilles fra billig tilgjengelig heste milt ferritin ved å følge etablerte de-mineraliseringsprotokoller. 16

Kationisering av magnetoferritin ble oppnådd ved tilsetning av et molart forhold på 250 molekyler av DMPA og 50 molekyler av EDC pr negativt ladet rest (beregninger basert på aminosyresekvensen av hest milt ferritin). Dette overskuddet av reagens enn protein resulterte i høye kationisering effektivitet, kan sammenlignes også til tidligere rapporterte resultater for kationisering av ferritin. 35 MALDI-TOF-analyse, Apoferritin og kationisert Apoferritin ble brukt på grunn av overdreven molekylære massen av magnetoferritin kjernen. For å gi høye kationisering effektivitet, er optimal pH også avgjørende. EDC-mediert kryssbinding er mest effektive under svakt sure betingelser, og vi fant ut at pH 5 gitt optimale kationisering resultater for magnetoferritin. Imidlertid, for andre proteiner cationization pH kan trenge å bli optimalisert. Kationisering ved eller nær det isoelektriske punkt av proteinet bør unngås, fordi dette kan føre til alvorlig utfellingen.

Stamcelle magnetisering med kationisert magnetoferritin var svært effektiv og kan oppnås ved bruk av inkubasjonstider godt under 30 minutter. Enda en ett minutts inkubasjon resulterte i et celledelt jerninnhold på 3,6 s, som er innenfor det rapporterte området som er nødvendig for å påvirke T2 og T2 * kontrast for MRI. 36,37 Det er også bemerkelsesverdig at dette effektiv merking er oppnådd med lave ekstracellulære jernkonsentrasjoner. For eksempel, tidligere studier ved hjelp av anioniske nanopartikler rapporterer jernnivåer på 10 pg pr celle etter en 30-minutters inkubasjonstid med 5 mM jern. 38 Til sammenligning inkubering med en kationisert magnetoferritin oppløsning inneholdende 0,5 mM protein tilsvarer inkubasjon med omtrent 0,2 mM jern og gir også omtrent 10 pg jern per cell etter 30 minutter. Vi var ikke i stand til å identifisere eventuelle endocytotic vesikler ved hjelp av TEM. Men tidligere studier med kationisert ferritin fant at intern skjedd i løpet av de første ti minuttene av eksponering. 39,40 kationisert ferritin kan være lokalisert i belagte vesikler, som indikerer clathrin- eller caveolin avhengig endocytose. De samme studier rapporterte også at etter 30 minutters inkubering, kationisert ferritin var fortsatt til stede på celleoverflaten, samt i multivesikulære legemer, ligner lysosomer.

Andre applikasjoner kan inkludere kationisering av apo-ferritin bur lastet med andre nanopartikler og / eller funksjonelle molekyler, slik som anti-kreft narkotika 41 eller kvanteprikker 42. Kationisering av disse ferritin konstruksjonene kan resultere i hurtigere og mer effektiv levering av sin last til celler.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) Fisher Scientific BPE310-1 powder; prepare a 1 M stock solution at pH 8.6 and dilute to 50 mM prior to use. Check the pH carefully prior to synthesis!
apoferritin from equine spleen Sigma Aldrich A3641 we used LOT# 081M7011V
cobalt sulfate heptahydrate  Sigma Aldrich C6768 prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis
ammonium iron sulphate hexahydrate  Sigma Aldrich F1543 prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis
hydrogen peroxide solution (30%) Sigma Aldrich 216763 prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis
sodium citrate Sigma Aldrich S1804 powder; a 1 M solution can be prepared and kept at room temperature for several months
Millex GP filter unit, 0.22 micron Merck Millipore SLGP033RS syringe filter
Trizma base Sigma Aldrich T1503 powder; prepare a 1 M stock solution at pH 8.0 and dilute to 50 mM prior to use
sodium chloride Sigma Aldrich 31434 poweder; add to buffers as required
Centriprep centrifugal filter units Merck Millipore 4310 Ultracel YM-50 membrane, 12 ml volume; use for initial concentration until the magnetoferritin solution has been concentrated from about 150 ml to 20 ml
Amicon Ultra-4 centrifugal filter untis Merck Millipore UFC801024 Ultracel-10 membrane, 4 ml volume; use to concentrate magnetoferritin solution from about 20 ml to 2 ml
ANX Sepharose 4 Fast Flow GE Healthcare 17-1287-04 we packed this column ourselves
HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR column  GE Healthcare 17-1196-01 this column was bought ready packed
ÄKTA purifier system GE Healthcare 28406264
sample pump P-960 GE Healthcare 18-6727-00 load sample at a flow rate of 10 ml/min
automated fraction collector Frac-950 GE Healthcare 18-6083-00
Bradford assay reagent Sigma Aldrich B6916 solution ready to use
Ferritin, Type I: from horse spleen Sigma Aldrich F4503 prepare ferritin standards from this solution to determine magnetoferritin concentration
N,N-dimethyl-1,3-propanediamine (DMPA) Sigma Aldrich 308110 CAUTION: when adjusting the pH of a DMPA solution, perform this step in a fume hood
N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) Sigma Aldrich E6383 keep in freezer but bring to room temperature before opening the bottle
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) AppliChem A0689,0500 powder; prepare a 200 M stock solution at pH 5
dialysis tubing cellulose membrane Sigma Aldrich D9652 soak 10 min in deionized water before use
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), 1,000 mg/L glucose Sigma Aldrich D5546 warm in 37 °C water bath before use
fetal bovine serum Sigma Aldrich F7524 add to stock DMEM bottle, 10% (v/v) final concentration
penicillin/streptomycin solution Sigma Aldrich P0781 add to stock DMEM bottle, 1% (v/v) final concentration
glutamax solution Gibco 35050-087 add to stock DMEM bottle, 1% (v/v) final concentration
human fibroblast growth factor PeproTech 100-18B add to DMEM freshly into cell culture flask with each media change; final concentration 5 ng/ml
phosphate buffered saline Sigma Aldrich D8537 sterile solution, for cell cultrue
trypsin/EDTA solution Sigma Aldrich E5134 keep in freezer and defrost in 37 °C water bath before use
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich E5134 powder; make a 2 mM solution in PBS 
bovine serum albumin Sigma Aldrich A7030 add 0.5% (w/v) into 2 mM EDTA solution in PBS; carefully stir with magnetic stirrer, avoid foaming; filter sterilize through a 0.22 micron syringe filter
MACS multi stand  Miltenyi Biotec 130-042-303 for attachment of MACS magnet
MACS MS columns Miltenyi Biotec 130-042-201 disposable; intended for single use, but if sterility is not required, they can re-used: wash with deionized water and 100% ethanol, and placed in a drying oven; discard if you observe rusty patches
MiniMACS separator magnet Miltenyi Biotec 130-042-102 can be bought as a starter kit, together with columns and stands
MACS column pre-separation filter Miltenyi Biotec 130-041-407 30 mm filter
Nitric acid solution, 64-66% Sigma Aldrich 7006
Titrando 907, syringe pump Metrohm 2.907.0020
Equipment used to characterize magnetoferritin and cationized magnetoferritin
SpectraMax M5 Molecular Devices Used to measure absorbance in the Bradford assay
JEM 1200 EX JEOL Used for TEM imaging of magnetoferritin
InVia Raman spectrometer Renishaw Used for Raman spectroscopy
Torus DPSS laser Laser Quantum Used for Raman spectroscopy
Bruker UltrafleXtreme Applied Biosystems Used for MALDI-TOF analysis of apoferritin and cationized apoferritin
ZetaSizer Nano-ZS Malvern Instruments Used to measure hydrodynamic diameter and zeta potential of magnetoferritin and cationized magnetoferritin
Magnetic Property Measurement System Quantum Design Used to measure magnetic saturation moment and magnetic susceptibility
Magnetom Skyra Siemens Used to determine longitudinal and transverse relaxivity 
Tecnai 12 BioTwin Spirit FEI Used for TEM imaging of hMSC labeled with cationized magnetoferritin
710 ICP-OES Agilent Used to determine iron content in cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gupta, A. K., Gupta, M. Synthesis and surface engineering of iron oxide nanoparticles for biomedical applications. Biomaterials. 26 (18), 3995-4021 (2005).
  2. Decuzzi, P., Ferrari, M. The role of specific and non-specific interactions in receptor-mediated endocytosis of nanoparticles. Biomaterials. 28 (18), 2915-2922 (2007).
  3. Cunningham, C. H., et al. Positive contrast magnetic resonance imaging of cells labeled with magnetic nanoparticles. Magn. Reson. Med. 53 (5), 999-1005 (2005).
  4. Song, H. T., et al. Surface modulation of magnetic nanocrystals in the development of highly efficient magnetic resonance probes for intracellular labeling. J. Am. Chem. Soc. 127 (28), 9992-9993 (2005).
  5. Daldrup-Link, H. E., et al. Targeting of hematopoietic progenitor cells with MR contrast agents. Radiology. 228 (3), 760-767 (2003).
  6. Singh, N., Jenkins, G. J., Asadi, R., Doak, S. H. Potential toxicity of superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION). Nano Rev. 1, (2010).
  7. Dodd, S. J., et al. Detection of single mammalian cells by high-resolution magnetic resonance imaging. Biophys. J. 76 (1), 103-109 (1999).
  8. Ahrens, E. T., Feili-Hariri, M., Xu, H., Genove, G., Morel, P. A. Receptor-mediated endocytosis of iron-oxide particles provides efficient labeling of dendritic cells for in vivo MR imaging. Magn. Reson. Med. 49 (6), 1006-1013 (2003).
  9. Arbab, A. S., et al. Efficient magnetic cell labeling with protamine sulfate complexed to ferumoxides for cellular MRI. Blood. 104 (4), 1217-1223 (2004).
  10. Bulte, J. W. M., et al. Magnetodendrimers allow endosomal magnetic labeling and in vivo tracking of stem cells. Nat. Biotechnol. 19 (12), 1141-1147 (2001).
  11. Josephson, L., Tung, C. H., Moore, A., Weissleder, R. High-efficiency intracellular magnetic labeling with novel superparamagnetic-tat peptide conjugates. Bioconjugate Chem. 10 (2), 186-191 (1999).
  12. Lewin, M., et al. Tat peptide-derivatized magnetic nanoparticles allow in vivo tracking and recovery of progenitor cells. Nat. Biotechnol. 18 (4), 410-414 (2000).
  13. Hunter, A. C. Molecular hurdles in polyfectin design and mechanistic background to polycation induced cytotoxicity. Adv. Drug Delivery Rev. 58 (14), 1523-1531 (2006).
  14. Montet-Abou, K., Montet, X., Weissleder, R., Josephson, L. Cell internalization of magnetic nanoparticles using transfection agents. Mol. Imaging. 6 (1), 1-9 (2007).
  15. Correia Carreira,, S,, et al. Ultra-fast stem cell labelling using cationised magnetoferritin. Nanoscale. 8 (14), 7474-7483 (2016).
  16. Meldrum, F. C., Heywood, B. R., Mann, S. Magnetoferritin: in vitro synthesis of a novel magnetic protein. Science. 257 (5069), 522-523 (1992).
  17. Klem, M. T., et al. Synthetic control over magnetic moment and exchange bias in all-oxide materials encapsulated within a spherical protein cage. J. Am. Chem. Soc. 129 (1), 197-201 (2007).
  18. Okuda, M., Eloi, J. C., Sarua, A., Jones, S. E. W., Schwarzacher, W. Energy barrier distribution for dispersed mixed oxide magnetic nanoparticles. J. Appl. Phys. 111 (7), (2012).
  19. Uchida, M., et al. A human ferritin iron oxide nano-composite magnetic resonance contrast agent. Magn. Reson. Med. 60 (5), 1073-1081 (2008).
  20. Danon, D., Skutelsk E, M. arikovsY., Goldstei, L. Use of Cationized Ferritin as a Label of Negative Charges on Cell Surfaces. J. Ultrastruc. Res. 38 (5-6), 500-510 (1972).
  21. Valero, E., et al. Magnetic Nanoparticles-Templated Assembly of Protein Subunits: A New Platform for Carbohydrate-Based MRI Nanoprobes. J. Am. Chem. Soc. 133 (13), 4889-4895 (2011).
  22. Zborowski, M., et al. Immunomagnetic isolation of magnetoferritin-labeled cells in a modified ferrograph. Cytometry. 24 (3), 251-259 (1996).
  23. Ikezoe, Y., et al. Growth of Giant Two-Dimensional Crystal of Protein Molecules from a Three-Phase Contact Line. Langmuir. 24 (22), 12836-12841 (2008).
  24. Uchida, M., et al. Targeting of cancer cells with ferrimagnetic ferritin cage nanoparticles. J. Am. Chem. Soc. 128 (51), 16626-16633 (2006).
  25. Yamashita, K., et al. Selective nanoscale positioning of ferritin and nanoparticles by means of target-specific peptides. Small. 2 (10), 1148-1152 (2006).
  26. Williams, A., Frasca, V., et al. UNIT 8.2 Ion-Exchange Chromatography. Current Protocols in Protein Science. Coligan, J. E., et al. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  27. Hagel, L., et al. UNIT 8.3 Gel-Filtration Chromatography. Current Protocols in Protein Science. Coligan, J. E., et al. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  28. Hou, X., Jones, B. T. Inductively coupled plasma-optical emission spectrometry. In Encyclopedia of Analytical Chemistry. Meyers, R.A. ed. , John Wiley & Sons, Ltd. 1 (2000).
  29. Correia Carreira, S., et al. Ultra-fast stem cell labelling using cationised magnetoferritin. Nanoscale. , (2016).
  30. Simon, G. H., et al. T1 and T2 relaxivity of intracellular and extracellular USPIO at 1.5 T and 3T clinical MR scanning. Eur. J. Radiol. 16 (3), 738-745 (2006).
  31. Jubb, A. M., Allen, H. C. Vibrational Spectroscopic Characterization of Hematite, Maghemite, and Magnetite Thin Films Produced by Vapor Deposition. ACS Appl. Mater. Interfaces. 2 (10), 2804-2812 (2010).
  32. Wang, Z. W., et al. High-pressure x-ray diffraction and Raman spectroscopic studies of the tetragonal spinel CoFe2O4. Phys. Rev. B. 68 (9), (2003).
  33. Wong, K. K., Douglas, T., Gider, S., Awschalom, D. D., Mann, S. Biomimetic synthesis and characterization of magnetic proteins (magnetoferritin). Chem. Mater. 10 (1), 279-285 (1998).
  34. Okuda, M., et al. Fe3O4 nanoparticles: protein-mediated crystalline magnetic superstructures. Nanotechnology. 23 (41), 415601 (2012).
  35. Perriman, A. W., Cölfen, H., Hughes, R. W., Barrie, C. L., Mann, S. Solvent-Free Protein Liquids and Liquid Crystals. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (34), 6242-6246 (2009).
  36. Billotey, C., et al. T-cell homing to the pancreas in autoimmune mouse models of diabetes: in vivo MR imaging. Radiology. 236 (2), 579-587 (2005).
  37. Smirnov, P., et al. In vivo cellular imaging of lymphocyte trafficking by MRI: a tumor model approach to cell-based anticancer therapy. Magn. Reson. Med. 56 (3), 498-508 (2006).
  38. Wilhelm, C., et al. Magnetic control of vascular network formation with magnetically labeled endothelial progenitor cells. Biomaterials. 28 (26), 3797-3806 (2007).
  39. MacLean, I., Sanders, E. Cationized ferritin and phosvitin uptake by coated vesicles of the early chick embryo. Anat. Embryol. 166 (3), 385-397 (1983).
  40. Van Deurs, B., Nilausen, K., Faergeman, O., Meinertz, H. Coated pits and pinocytosis of cationized ferritin in human skin fibroblasts. Eur. J. Cell Biol. 27 (2), 270-278 (1982).
  41. Xing, R. M., et al. Characterization and cellular uptake of platinum anticancer drugs encapsulated in apoferritin. J Inorg Biochem. 103 (7), 1039-1044 (2009).
  42. Wong, K. K., Mann, S. Biomimetic synthesis of cadmium sulfide-ferritin nanocomposites. Adv. Mater. 8 (11), 928-932 (1996).

Tags

Bioteknologi magnetoferritin magnetiske nanopartikler protein bur kationisering overflaten funksjonalisering magnetiske merking magnetiske cellen separasjon stamceller
Syntese av kationiserte Magnetoferritin for Ultra-rask Magnetization Celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Correia Carreira, S., Armstrong, J.More

Correia Carreira, S., Armstrong, J. P. K., Okuda, M., Seddon, A. M., Perriman, A. W., Schwarzacher, W. Synthesis of Cationized Magnetoferritin for Ultra-fast Magnetization of Cells. J. Vis. Exp. (118), e54785, doi:10.3791/54785 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter