Abstract
Molte importanti applicazioni biomediche, come l'imaging cellulare e la manipolazione a distanza, possono essere realizzati mediante l'etichettatura di cellule con superparamagnetiche nanoparticelle di ossido di ferro (SPIONs). Il raggiungimento sufficiente assorbimento cellulare di SPIONs è una sfida che è stata tradizionalmente incontrato esponendo le cellule a concentrazioni elevate di SPIONs o prolungando i tempi di esposizione (fino a 72 ore). Tuttavia, queste strategie sono suscettibili di mediare tossicità. Qui, presentiamo la sintesi del SPION magnetoferritin base di proteine, nonché una facile protocollo funzionalizzazione superficiale che consente una rapida magnetizzazione cellulare utilizzando concentrazioni di esposizione basse. Il nucleo SPION di magnetoferritin costituito da ossido di ferro-cobalto drogati con un diametro medio delle particelle di 8.2 nm mineralizzata all'interno della cavità del cavallo milza apo-ferritina. cationizzazione chimici di magnetoferritin prodotto un romanzo, SPION altamente membrana attivo che magnetizzato cellule staminali mesenchimali umane (hMSCs) con tempi di incubazione comebreve come le concentrazioni di un minuto e ferro come bassi come 0,2 mm.
Introduction
vincolanti superficie o internalizzazione di superparamagnetiche nanoparticelle di ossido di ferro (SPIONs) ha permesso di magnetizzazione di una varietà di tipi di cellule per applicazioni quali l'imaging e la manipolazione a distanza. 1 Tuttavia, ottenendo sufficiente magnetizzazione cellulare può essere una sfida, soprattutto quando l'interazione tra il SPION e la superficie cellulare è debole. 2 Negli ultimi concentrazioni, l'esposizione prolungata o ad alta spion sono stati impiegati come strategie per superare questa sfida. 3,4 Tuttavia, queste strategie sono problematici perché aumentano la tossicità 5,6 e hanno un successo molto limitato in tipi di cellule con i tassi bassi di interiorizzazione, come i linfociti. 7 Per migliorare l'assorbimento cellulare di SPIONs, approcci di funzionalizzazione diverse superfici sono state esplorate. Per esempio, gli anticorpi sono stati utilizzati per promuovere endocitosi mediata da recettori, 8 mentre assorbimento non specifico può essere ottenuto utilizzando una trasfezionesignori 9,10 o specie cellule penetrante, come l'HIV tat-peptide. 11,12 Tuttavia, anticorpi e peptidi funzionalizzazione approcci sono limitati dai reagenti costosi e preparazione di sintesi complessi, mentre gli agenti di trasfezione possono indurre nanoparticelle precipitazioni e influenzare negativamente la funzione delle cellule. 13,14
Recentemente abbiamo riportato la sintesi di magnetoferritin cationizzata chimicamente, un romanzo SPION che era molto efficace in cellule staminali mesenchimali umane di magnetizzazione (hMSCs) con tempi di incubazione più brevi di un minuto. 15 Magnetoferritin è sintetizzato dalla ricostituzione di una SPION all'interno della cavità de-mineralizzato della proteina ferritina deposito del ferro. 16 Questo SPION base di proteine combina molte proprietà che lo rendono particolarmente adatto per la magnetizzazione delle cellule, come il controllo sulle proprietà magnetiche del nucleo magnetico, 17-19 e la biocompatibilità e la solubilità acquosa conferiti dalla shell proteine. Ulteriorepiù, funzionalizzazione superficiale è facilmente ottenibile a causa aminoacidi indirizzabili che possono essere chimicamente 20-22 o geneticamente modificati. 23-25 Abbiamo dimostrato che cationizzazione chimica degli acidi residui di aminoacidi del guscio proteina genera una nanoparticella stabile che prontamente ha interagito con i domini anionici sulla superficie cellulare che porta alla magnetizzazione cellulare rapida e persistente. Questa procedura elimina la necessità di funzionalizzazione laboriosa e protocolli di incubazione lunghi, e grazie al meccanismo marcatura non specifica questa strategia magnetizzazione rapida dovrebbe trovare applicazione diffusa in altri tipi di cellule. Qui, vi presentiamo una profonda relazione del metodo di etichettatura delle cellule ultra-veloce, inclusi i protocolli dettagliati della sintesi, la purificazione e la superficie funzionalizzazione di magnetoferritin cationizzata.
Protocol
cellule staminali mesenchimali umane (hMSC) sono state raccolte dal prossimale del femore midollo osseo di pazienti artrosici sottoposti a chirurgia di sostituzione totale dell'anca, in pieno accordo con le linee guida Bristol Southmead Hospital Comitato Etico della Ricerca (riferimento # 078/01) e dopo il consenso del paziente è stato ottenuto.
1. Magnetoferritin Sintesi e purificazione
- Revisione generale
- Eseguire sintesi magnetoferritin in un recipiente di reazione a doppia camicia sigillabile a 65 ° C sotto atmosfera di azoto per limitare l'ossidazione dei precursori metallici. Iniettare soluzioni saline metallo e perossido di idrogeno attraverso porte di accesso nel coperchio nel recipiente di reazione con una pompa a siringa.
- Dopo la sintesi magnetoferritin, purificare la proteina da cromatografia a scambio anionico (vedi sezione 1.4) per rimuovere le nanoparticelle non racchiusi nella cavità di proteine, seguiti da cromatografia di esclusione molecolare (vedi sezione 1.5) per isolare monomeri di proteine. dela concentrazione di proteine Termine utilizzando un saggio Bradford (vedere paragrafo 1.6).
- I preparativi prima di sintesi
- Deoxygenate 500 ml di acqua deionizzata posizionando un tubo collegato ad una bombola di gas di azoto nell'acqua, sigillando il contenitore con pellicola trasparente e gorgogliare attraverso azoto gassoso per circa 60 min.
- Scaldare a bagnomaria collegato al recipiente doppia reazione camicia a 65 ° C. Aggiungere 75 ml di 50 mM 4- (2-idrossietil) -1-acido piperazineethanesulfonic (HEPES) tampone (pH 8.6) nel recipiente di reazione, sigillare il vaso e deoxygenate facendo gorgogliare azoto attraverso la soluzione tampone per circa 20 min. Allo stesso tempo, agitare la soluzione tampone con un agitatore magnetico.
- Dopo deoxygenating la soluzione tampone HEPES, rimuovere il tubo alimentazione del gas di azoto dal buffer e tenerlo sospeso nel recipiente per mantenere un'atmosfera di azoto. Aggiungere apo-ferritina per ottenere una concentrazione finale di 3 mg / ml. Continuare l'agitazione magnetica, ma riducono la velocità di agitazione, se si verifica la formazione di schiuma.
- Preparare una soluzione 25 mM magazzino di solfato di cobalto eptaidrato sciogliendo 0,19 g in 50 ml di acqua deionizzata deoxygenated.
- Preparare una soluzione 25 mM di ferro ammonio soluzione di solfato esaidrato sciogliendo 0,98 g in 100 ml di acqua deionizzata deossigenato.
- Rimuovere 2,5 ml della soluzione di solfato di ferro esaidrato ammonio e sostituirlo con 2,5 ml di solfato di cobalto eptaidrato.
- Preparare una soluzione 8,33 mM di perossido di idrogeno in acqua deionizzata deossigenata aggiungendo prima 965 ml di una soluzione di perossido di idrogeno (30% w / w) in 9 ml di acqua deionizzata deossigenato, e poi aggiungendo 1 ml di questa sub-stock da 99 ml di acqua deionizzata deoxygenated.
- sintesi Magnetoferritin
- Iniettare 10.1 ml sia il precursore di ferro-cobalto e il perossido di idrogeno simultaneamente nella soluzione apo-ferritina (magneticamente stirred) ad una portata di 0,15 ml / min utilizzando due pompa a siringa (volume totale iniettato: 20,2 ml).
- Durante il periodo di iniezione, deoxygenate altri 500 ml di acqua deionizzata.
NOTA: Il contenuto del recipiente di reazione adottare gradualmente un colore marrone scuro al procedere della reazione. - Poco prima del completamento della prima iniezione, preparare altri 100 ml di ferro-cobalto precursore e soluzione di perossido di idrogeno utilizzando acqua deionizzata appena deossigenato.
- Ripetere la fase di iniezione descritto in 1.3.1 utilizzando soluzioni preparate al momento di ferro-cobalto e perossido di idrogeno.
- Durante il periodo di iniezione, deoxygenate altri 500 ml di acqua deionizzata, e procedere come descritto in 1.3.3 e 1.3.4.
- Dopo la terza iniezione, lasciare la soluzione a maturare per 15 minuti sotto agitazione.
- Aggiungere 1,5 ml di una soluzione di citrato di sodio 1 M al recipiente di reazione per chelare ioni metallici liberi in soluzione.
- Rimuovere la soluzione dalla reazionenave in 50 ml provette da centrifuga, centrifuga per 30 minuti a 4.350 xg e passare il surnatante attraverso un filtro siringa da 0,22 micron. In questa fase, il surnatante filtrato può essere conservato a 4 ° C fino purificazione.
- Ion cromatografia a scambio
- Caricare il campione su una colonna (2,5 cm di diametro, lunghezza 20 cm) contenente una matrice cationico utilizzando una pompa peristaltica ad una portata di 10 ml / min.
- Lavare la colonna con circa 100 ml di tampone di corsa (tampone 50 mM Tris (idrossimetil) amminometano (Tris), pH 8,0) mediante una pompa di gradiente a una portata di 10 ml / min.
- Per eluire la proteina, lavare la colonna a 10 ml / min con concentrazioni crescenti di cloruro di sodio (NaCl) in tampone Tris: 150, 500 e 1000 mM finale concentrazione di NaCl, 150 ml di ciascuna concentrazione.
- Poiché la proteina eluisce ad una concentrazione di NaCl di 500 mM, raccoglierlo in 50 ml frazioni utilizzando un raccoglitore di frazioni automatizzato.
NOTA: Per unaprotocollo dettagliato della cromatografia a scambio ionico consultare i protocolli precedentemente pubblicati. 26
- Esclusione dimensioni cromatografia
- Concentrato 150 ml di magnetoferritin ad un volume di circa 2 ml utilizzando un gruppo di filtraggio 15 ml centrifuga seguita da una unità di volume 4 ml. Fare riferimento alle istruzioni del produttore delle unità di filtro centrifugo (vedi elenco dei materiali) per un protocollo dettagliato di questa procedura.
- Caricare il campione concentrato su una colonna di gel filtrazione utilizzando un ciclo di iniezione.
- Lavare la colonna con tampone di corsa (50 tampone mM Tris, pH 8,0, contenente 150 mM NaCl) a una portata di 1,3 ml / min.
- Raccogliere 6 ml frazioni utilizzando un raccoglitore di frazioni automatizzato. monomeri di proteine eluiscano scorso. A questo punto, magnetoferritin purificato può essere conservato a 4 ° C fino cationizzazione.
NOTA: Per un protocollo dettagliato di dimensioni esclusione cromatografia usando una colonna di gel filtrazione consultare previoamente pubblicato protocolli. 27
- Determinare la concentrazione di proteine
- Preparare standard ferritina di 0,06, 0,125, 0,25, 0,5 e 1 mg / ml in tampone 50 mM Tris utilizzando commercialmente disponibile cavallo milza ferritina.
NOTA: La concentrazione proteica di ferritina commercialmente disponibile è riportata sul flacone. In caso contrario, contattare il fornitore per queste informazioni. - Diluire i campioni magnetoferritin di concentrazione sconosciuta in 50 mM Tris tampone finché il colore della soluzione corrisponde a circa il colore dello standard 0,5 mg / ml. Prendere nota del fattore di diluizione.
- Aggiungere 10 ml di ogni campione standard e magnetoferritin in triplice copia in pozzetti di una piastra da 96 pozzetti.
- Aggiungere 200 ml di reagente di ready-made Bradford a ciascun bene (fare riferimento alla lista dei materiali per Bradford dettagli dosaggio reagenti).
- Incubare a temperatura ambiente per 8 minuti.
- Misurare l'assorbanza a λ = 595 nm utilizzandoun lettore di micropiastre.
- Tracciare la assorbanza media degli standard ferritina in funzione della concentrazione di proteine e utilizzare la pendenza e l'intercetta della regressione lineare per calcolare la concentrazione del campione magnetoferritin.
NOTA: Prendere in considerazione il fattore di diluizione che è stato utilizzato per regolare il campione magnetoferritin alla curva standard.
- Preparare standard ferritina di 0,06, 0,125, 0,25, 0,5 e 1 mg / ml in tampone 50 mM Tris utilizzando commercialmente disponibile cavallo milza ferritina.
2. Magnetoferritin cationizzazione
- Revisione generale
NOTA: Per magnetoferritin cationizzazione, N, N'-dimetil-1,3-propandiammina (DMPA) è stata accoppiata con residui di acido aspartico e glutammico sulla superficie MF usando N - (3-dimetilamminopropil) - N 'cloridrato -ethylcarbodiimide (EDC).- Effettuare la reazione a temperatura ambiente sotto agitazione. Il protocollo indicato di seguito è per la cationizzazione di 10 mg di magnetoferritin in un volume totale di 5 ml (concentrazione proteica 2 mg / ml). Tuttavia, scalare verso l'alto o verso il bassomantenendo la proteina: DMPA: rapporti EDC coerente, così come i volumi della soluzione tampone e magnetoferritin.
- Prima della reazione cationizzazione, dializzare i campioni magnetoferritin in 50 mM tampone fosfato (pH 7) contenente 50 mM NaCl. Questo è importante rimuovere tampone di eluizione Tris ed evitare reazioni indesiderate tra l'ammina Tris e residui EDC-attivati di acidi carbossilici. Determinare la concentrazione di proteine dopo la dialisi e regolarlo a 4 mg / ml prima cationizzazione.
- protocollo cationizzazione
- Pesare 374 mg di DMPA e sciogliere in 2,5 ml di 200 mM 2- (N -morpholino) di acido etansolfonico (MES) buffer.
- Regolare il pH della soluzione a circa 7 usando concentrato (6 M) di acido cloridrico (HCl).
ATTENZIONE: Eseguire questo passaggio in una cappa aspirante, come aggiunta dell'acido di DMPA rilascia fumi tossici! - Aggiungere 2,5 ml di soluzione magnetoferritin a 4 mg / ml (concen finalestrazione di MES è 100 mM, concentrazione finale di magnetoferritin è 2 mg / ml, la quantità totale di proteine è 10 mg).
- Aggiungere un agitatore magnetico e mescolare per 2 ore a equilibrare.
- regolare con cura la soluzione a pH 5,0 con 1 M HCl.
- Aggiungere 141 mg di EDC in polvere alla soluzione DMPA / magnetoferritin.
- Continuare a mescolare per 3,5 ore.
- Filtrare la soluzione attraverso un filtro a siringa da 0,22 micron per rimuovere eventuali precipitati.
- Aggiungere la soluzione al tubo di dialisi con un 12-14 kDa di peso molecolare cut-off e dializzare contro 4 L di tampone fosfato 50 mM (pH 7) contenente 50 mM NaCl per 2 giorni a 4 ° C, sostituendo il tampone di dialisi almeno tre volte in quel periodo.
NOTA: A questo punto, magnetoferritin cationizzato può essere conservato a 4 ° C fino all'utilizzo.
3. mesenchimali umane Stem Cell Etichettatura con cationizzato Magnetoferritin
- Revisione generale
- La cultura come cellule monostrato con 175 centimetri 2 fiaschi e 20 ml di terreno di coltura, che è stato rifornito ogni 3 - 4 giorni. Il terreno di coltura costituito da Modified mezzo di Eagle Dulbecco (DMEM) contenente 1,000 mg / L di glucosio, 10% (v / v) di siero fetale bovino, 1% (v / v) di penicillina / streptomicina, 1% (v / v) L -alanyl-L-glutammina soluzione e 5 ng / ml appena completato fattore di crescita dei fibroblasti umani.
- Etichettatura magnetica di hMSC con magnetoferritin cationizzato
- Seed 150.000 hMSCs in 25 cm 2 palloni e lasciare ad aderire notte a 37 ° C.
- Filtro sterilizzare magnetoferritin cationizzato attraverso un filtro di 0,22 micron siringa e determinare la concentrazione di proteine.
- Mantenere condizioni sterili, preparare una soluzione di magnetoferri cationizzata 0,5 micronlatta in tampone fosfato (PBS). Mantenere innevate in una cappa di coltura sterile fino al momento dell'uso.
- Lavare le cellule placcato con 2 ml di PBS a temperatura ambiente.
- Aggiungere 1 ml di soluzione magnetoferritin cationizzato sterilizzata alle cellule piastrate e incubare per il periodo di tempo desiderato (1 min a 1 ora).
- Lavare le cellule con PBS, e le cellule poi raccolto aggiungendo 0,5 ml di tripsina / acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) e incubando a 37 ° C per 5 min.
- Aggiungere 1 ml di mezzo di coltura per inattivare la tripsina / EDTA, trasferire la soluzione in un tubo da 15 ml centrifuga e centrifugare per 5 min a 524 x g.
- Eliminare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 0,5 ml di tampone di separazione magnetica, costituito da 0,5% (w / v) di siero fetale bovino e 2 mM EDTA in PBS.
- Separazione cellulare magnetica
- Fissare il magnete al più supporto, e aggiungere una colonna di separazione magnetica al magnete. Collocare un filtro pre-separazione su The colonna.
- Collocare 0,5 ml di tampone di separazione magnetica nel filtro pre-separazione e farlo funzionare sia attraverso il filtro e la colonna di lavare e bagnarle.
- Collocare un tubo da centrifuga da 15 ml sotto la colonna.
- Aggiungere 0,5 ml della sospensione cellulare nel serbatoio filtro della colonna di separazione magnetica.
- Quando il serbatoio è vuoto, aggiungere 0,5 ml di tampone di separazione magnetica.
- Quando il serbatoio è vuoto, aggiungere ulteriori 0,5 ml di tampone di separazione magnetica.
- Ripetere ancora una volta (volume totale di tampone di separazione magnetica utilizzata per il lavaggio deve essere 1,5 ml). Questa fase di lavaggio eluisce tutte le cellule non magnetizzati dal (frazione di cellule non magnetizzato) colonna.
- Rimuovere la colonna dal magnete e metterlo in un 15 ml provetta da centrifuga fresca. Rimuovere il filtro dal serbatoio colonna.
- Aggiungere 1 ml di tampone di separazione magnetica al serbatoio e immediatamente spingere attraverso la colonna usando lo stantuffo fornito dalla fabbricazioner. Questo eluisce le cellule magnetizzate dalla colonna nel tubo da centrifuga (frazione cellulare magnetizzata).
- Centrifugare entrambi i tubi per 5 min a 524 x g.
- Eliminare il surnatante e risospendere il pellet di cellule in 0,3 ml di PBS.
- Contare il numero di cellule numeri in ogni frazione con un emocitometro.
- Determinare la frazione di cellule magnetizzati, M (%), utilizzando la seguente equazione:
dove n (M) è il numero di cellule nella frazione magnetizzato e n (M + NM) è la somma del numero di cellule nelle frazioni magnetizzati e non magnetizzate.
- Preparazione hMSCs etichettati con magnetoferritin cationizzata per la quantificazione di ferro usando la spettroscopia di emissione ottica al plasma accoppiato induttivamente (ICP-OES)
NOTA: Il protocollo può avere bisogno di essere adattato per altri strumenti ICP-OES. Si consiglia di consultarsi con il retecnico sponsabile.- Centrifugare un numero noto di cellule per 5 min a 524 x g.
- Rimuovere il surnatante PBS e aggiungere 0,25 ml di 50% (v / v) di acido nitrico.
- Vortex miscelare la sospensione cellulare acidificato.
- Incubare a temperatura ambiente per una notte.
- Aggiungere 4,75 ml di acqua distillata per ogni miscela campione e vortex.
- Analizzare con ICP-OES. 28
- Normalizzare il contenuto di ferro misurato il numero di cellule per determinare un valore per contenuto di ferro cellulare.
Representative Results
TEM è stata utilizzata per confermare nanoparticella mineralizzazione all'interno della cavità apoferritin e determinare le dimensioni del nucleo medio (Figure 1A e 1B). L'analisi delle immagini di campioni non colorati magnetoferritin ha un diametro medio nucleo di 8,2 ± 0,7 nm e macchia aurothioglucose confermato la presenza di nanoparticelle all'interno della gabbia proteine. Si noti che le immagini mostrano un campione magnetoferritin che è stato ulteriormente purificato usando separazione magnetica per isolare nuclei di nanoparticelle uniformi. campioni Magnetoferritin che non sono stati depurati magneticamente hanno una distribuzione dimensionale nucleo leggermente più ampio. 29 Analisi della struttura del nucleo magnetoferritin usando-regione selezionata diffrazione elettronica indicata la possibile presenza della struttura inversa spinello basato su magnetite (Fe 3 O 4) e / o maghemite (γ-Fe 2 O 3), così come la struttura spinello a causa di Co 3 4. Inoltre, spettri Raman rivelato picchi attribuiti a Fe 3 O 4, piccole quantità di γ-Fe 2 O 3, e una ferrite di cobalto (Figura 1 C). analisi ICP-OES di magnetoferritin mostrato una media di 102 mg di ferro e 0,9 mg di cobalto per milligrammo di magnetoferritin.
Lo schema è inclusa, illustrante la successiva fase cationizzazione (Figura 2). Il diametro idrodinamica del magnetoferritin e magnetoferritin cationizzata era 11,8 ± 1,1 nm e 12,5 ± 1,4 nm, rispettivamente, come determinato dalla dispersione della luce dinamica. L'efficienza cationizzazione di covalente DMPA accoppiamento per magnetoferritin è stata valutata utilizzando potenziometria zeta e laser desorbimento di ionizzazione tempo di volo (MALDI-TOF) spettrometria di massa a matrice assistita. Il potenziale zeta cambiato da -10.5 mV per MF a + 8,3 mV per magnetoferritin cationizzata, confermando unacambiare in superficie potenziale da negativo a positivo (Tabella 1). Esperimenti di spettrometria di massa ha trovato un peso molecolare subunità di 20.1 kDa per nativo apo-ferritina e 21,1 kDa per cationizzata apo-ferritina (Figura 2 B). Questo aumento di massa corrisponde a circa 12 molecole DMPA accoppiati per subunità di proteine, e la cationizzazione di 288 residui sulla intera proteina 24-subunità.
saturazione magnetica e la suscettibilità sono stati misurati utilizzando magnetometria SQUID, e trasversale e longitudinale relassività sono stati misurati utilizzando la risonanza magnetica. Proprietà magnetiche erano simili per magnetoferritin e magnetoferritin cationizzato, indicando che cationizzazione avuto un impatto trascurabile sulle proprietà magnetiche della SPION allegato (Tabella 1). Inoltre, queste proprietà sono simili ad altri nanoparticelle a base di ossido di ferro, 19,30 dimostrando che cationizzato magnetoferritin sarebbe altrettanto adatto come agenti di contrasto convenzionali spion a base di MRI a migliorare il contrasto delle immagini.
Dopo esposizione di 30 minuti, la superficie cellulare densamente ricoperto da magnetoferritin cationizzato (Figura 3). Tuttavia, dopo una settimana, non nanoparticelle sono stati trovati sulla superficie cellulare (Figura 3 B). magnetoferritin cationizzata era notevolmente efficace a hMSCs magneticamente etichettatura. In particolare, esponendo le cellule a magnetoferritin cationizzato per un minuto portato alla magnetizzazione del 92% della popolazione cellulare e la consegna di 3,6 pg di ferro per cella. Aumentando il tempo di incubazione di 15 minuti comportato la magnetizzazione di tutta la popolazione di cellule (Figura 3 C).
Figura 1: Caratterizzazione di magnetof nuclei erritin drogati con 5% di cobalto. Immagini TEM di magnetoferritin colorati con aurothioglucose (A) e senza macchia (B). Inserto mostra diffrazione elettronica corrispondente con gli indici di magnetite. barra della scala: 20 nm. (C) Raman spettro per magnetoferritin. Le frecce indicano i principali modi di vibrazione per Raman ferrite di cobalto (T 2g), magnetite e maghemite (sia A 1g). 31,32 La lunghezza d'onda del laser utilizzato era 532 nm. (Immagine adattato da Okuda et al. 18). Si noti che questo campione magnetoferritin era stato ulteriormente purificato mediante separazione magnetica, che ha isolato le particelle magnetoferritin uniformemente caricati. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 2: cationizzazione di magnetoferritin. A) accessibili solvente rappresentazioni Superficie mostrano la distribuzione di acido (rosso) e) residui aminoacidici di base (giallo sulla superficie della proteina. Magnetoferritin (1) viene modificato per magnetoferritin cationizzato (2) mediante reticolazione carbodiimide-mediata di DMPA per residui amminoacidici acidi sulla superficie della proteina (3). B) l'analisi di spettrometria di massa di subunità apo-ferritina apo-ferritina e cationizzata. Mass-a-carica (m / z) spettro di apoferritin (APOF) e apoferritin cationizzata (cat-APOF) generato da MALDI-TOF. Un aumento di massa dal 20,1 al 21,1 kDa kDa si osserva dopo cationizzazione. (Immagine adattato da Correia Carreira et al. 15) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: etichettatura magnetica e la separazione delle cellule di hMSCs incubate con magnetoferritin cationizzata. A) immagine TEM di hMSCs dopo 30 minuti di incubazione con magnetoferritin cationizzata. La freccia indica la presenza di nuclei magnetoferritin densamente sulla superficie cellulare. Barre di scala: 200 nm. B) immagine TEM di hMSC una settimana dopo l'etichettatura. La superficie cellulare è chiaro di magnetoferritin cationizzata. C) indagare la rapidità di marcatura magnetica: 92% della popolazione cellulare sono stati magnetizzato dopo un'esposizione di un minuto con 0,5 mM magnetoferritin cationizzati, e l'intera popolazione di cellule è stato magnetizzato entro 15 minuti. Contenuto di ferro per cella è stata determinata utilizzando ICP-OES. media e deviazione standard dalla tre repliche biologiche sono mostrati. (Immagine adattato da Correia Carreira et al. 15) Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| MF | cat-MF | |
| Diametro idrodinamico [nm] | 11.8 ± 1.1 | 12.5 ± 1.4 |
| Zeta potenziale [mV] | (-) 10.4 ± 0.2 | 8.3 ± 0.7 |
| Saturazione momento magnetico [AM 2 kg -1] | 54.9 ± 1.6 | 55.3 ± 1.4 |
| Messa suscettibilità [x 10 4 m 3 kg -1] | 1,75 ± 0,08 | 1.75 ± 0.07 |
| Relassività longitudinale [mm -1 sec -1] | 2.6 ± 0.1 | 2.3 ± 0.1 |
| Relassività trasversale [mm -1 sec -1] | 44.6 ± 1.0 | 52.8 ± 0.8 |
Tabella 1: caratterizzazione fisico-chimiche della magnetoferritin (MF) e magnetoferritin cationizzata (cat-MF). (Tabella adattata da Correia Carreira et al. 15)
Discussion
TEM di campioni magnetoferritin colorati con aurothioglucose rivelato la mineralizzazione successo di nanoparticelle all'interno della gabbia di proteine. Electron diffrazione e analisi Raman del nucleo nanoparticella indicavano la presenza di una ferrite di cobalto, indicando drogaggio successo del nucleo nanoparticelle con cobalto. Ciò dimostra che le nanoparticelle ossidi misti possono essere correttamente mineralizzata entro la cavità apo-ferritina. Inoltre, abbiamo precedentemente dimostrato che il cobalto doping può essere variato modificando la quantità di cobalto precursore aggiunto alla miscela di reazione, che consente la sintonizzazione delle proprietà magnetiche. 18
Sintesi Magnetoferritin può essere eseguita in una varietà di navi, purché siano ermeticamente sigillato e hanno porte di accesso attraverso il quale possono essere introdotte reagenti (ad esempio, a tre colli rotonda pallone a fondo). La temperatura di reazione deve essere mantenuta a 65 ° C mediante l'immissione nel recipientea / a bagno d'olio d'acqua o usando un recipiente a doppia camicia. Qui, abbiamo utilizzato una configurazione a doppia camicia cella elettrochimica per eseguire la sintesi. Per garantire riuscita sintesi, mantenendo il pH corretto ed evitando la contaminazione di ossigeno delle soluzioni acquose è cruciale. soluzioni saline metallo dovrebbe sempre essere preparati appena prima dell'uso piuttosto che in anticipo. Inoltre, le soluzioni apoferritin commerciali possono variare in termini di qualità e di influenzare il risultato di sintesi (ad es., Le dimensioni di nanoparticelle nucleo mineralizzata). Può aiutare a dializzare soluzione apoferritin in 50 mM tampone HEPES (pH 8,6) prima della sintesi di rimuovere qualsiasi agente riducente residuo usata dal fabbricante. E 'utile per prendere nota del numero di lotto della soluzione apo-ferritina utilizzato per la sintesi, in modo che possa essere espressamente richiesto dal produttore dovrebbe aggiuntivo bisogno materiale da acquistare. Inoltre, la concentrazione di proteine commercialmente disponibile apo-ferritina deve essere riportata sul flacone, che puòessere utilizzato per calcolare il volume di soluzione di apo-ferritina necessaria per sintesi. Se questo non è il caso, contattare il fornitore per queste informazioni.
Il vantaggio di graduale aggiunta di sali metallici e perossido di idrogeno - come presentato qui e in relazioni precedenti - è che la mineralizzazione del nucleo nanoparticella può essere controllata in modo che i diversi fattori di carico (cioè, le dimensioni di nanoparticelle) possono essere raggiunti. 33 Inoltre, è possibile purificare ulteriormente magnetoferritin usando una colonna di separazione magnetica, ad esempio, una colonna impaccata con polvere di acciaio inox fissata all'interno un elettromagnete. 34 Così, nuclei di nanoparticelle altamente monodisperse può essere isolato dal campione magnetoferritin massa. Tuttavia, per l'etichettatura delle cellule magnetiche come presentato qui questo non è richiesto. Una limitazione della sintesi magnetoferritin è relativamente bassa resa di sintesi di circa il 10%, e il costo relativamente elevato del commerciale apo-feSoluzioni rritin. Tuttavia, apo-ferritina può anche essere preparato da milza cavallo economicamente disponibile ferritina seguendo protocolli di de-mineralizzazione stabiliti. 16
Cationizzazione di magnetoferritin è stata ottenuta aggiungendo un rapporto molare di 250 molecole di DMPA e 50 molecole di EDC per residuo di carica negativa (calcoli basati sulla sequenza aminoacidica del cavallo milza ferritina). Questo eccesso di reagente più di proteine ha portato efficienze elevate cationizzazione, paragonabile anche riportato in precedenza i risultati del cationizzazione di ferritina. 35 Per l'analisi MALDI-TOF, apoferritin e apoferritin cationizzato sono stati utilizzati a causa della massa molecolare eccessiva del nucleo magnetoferritin. Per produrre efficienze elevate cationizzazione, pH ottimale è fondamentale. reticolazione EDC-mediata è più efficace in condizioni leggermente acide, e abbiamo scoperto che il pH 5 ha dato risultati ottimali cationizzazione per magnetoferritin. Tuttavia, per altre proteine cpH ationization può avere bisogno di essere ottimizzato. Cationizzazione in corrispondenza o vicino al punto isoelettrico della proteina deve essere evitato, poiché questo può provocare gravi precipitazione.
magnetizzazione delle cellule staminali con magnetoferritin cationizzata era altamente efficiente e potrebbe essere raggiunto utilizzando i tempi di incubazione e sotto i 30 minuti. Anche una incubazione di un minuto determinato un contenuto di ferro cellulare di 3,6 pg, che è compreso nell'intervallo riportato necessaria per influenzare T2 e T2 * contrasto per MRI. 36,37 È anche notevole che questa etichettatura efficace si ottiene con basse concentrazioni di ferro extracellulari. Ad esempio, gli studi precedenti utilizzando nanoparticelle anionici riportano livelli di ferro di 10 pg per cella, dopo un periodo di 30 minuti di incubazione con 5 mM di ferro. 38 In confronto, l'incubazione con una soluzione magnetoferritin cationizzata contenente 0,5 mM di proteine corrisponde a incubazione con circa 0,2 mM ferro e produce anche circa il 10 pg di ferro per cell dopo 30 minuti. Non siamo stati in grado di identificare in modo chiaro tutte le vescicole di endocitosi mediante TEM. Tuttavia, studi precedenti utilizzando ferritina cationizzata scoperto che internalizzazione si è verificata entro i primi dieci minuti di esposizione. 39,40 ferritina cationizzata potrebbe essere localizzata in vescicole rivestite, indicando endocitosi clatrina o caveolina-dipendente. Gli stessi studi hanno anche riferito che dopo 30 minuti di incubazione, ferritina cationizzato era ancora presente sulla superficie cellulare, così come nei corpi multivesicular, simile lisosomi.
Ulteriori applicazioni potrebbero includere cationizzazione di gabbie apo-ferritina carichi di altre nanoparticelle e / o molecole funzionali, come i farmaci anti-cancro 41 o 42 punti quantici. Cationizzazione di questi costrutti ferritina potrebbe tradursi in una consegna più rapida e più efficiente del loro carico per le cellule.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Fisher Scientific | BPE310-1 | powder; prepare a 1 M stock solution at pH 8.6 and dilute to 50 mM prior to use. Check the pH carefully prior to synthesis! |
| apoferritin from equine spleen | Sigma Aldrich | A3641 | we used LOT# 081M7011V |
| cobalt sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | C6768 | prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis |
| ammonium iron sulphate hexahydrate | Sigma Aldrich | F1543 | prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis |
| hydrogen peroxide solution (30%) | Sigma Aldrich | 216763 | prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis |
| sodium citrate | Sigma Aldrich | S1804 | powder; a 1 M solution can be prepared and kept at room temperature for several months |
| Millex GP filter unit, 0.22 micron | Merck Millipore | SLGP033RS | syringe filter |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | powder; prepare a 1 M stock solution at pH 8.0 and dilute to 50 mM prior to use |
| sodium chloride | Sigma Aldrich | 31434 | poweder; add to buffers as required |
| Centriprep centrifugal filter units | Merck Millipore | 4310 | Ultracel YM-50 membrane, 12 ml volume; use for initial concentration until the magnetoferritin solution has been concentrated from about 150 ml to 20 ml |
| Amicon Ultra-4 centrifugal filter untis | Merck Millipore | UFC801024 | Ultracel-10 membrane, 4 ml volume; use to concentrate magnetoferritin solution from about 20 ml to 2 ml |
| ANX Sepharose 4 Fast Flow | GE Healthcare | 17-1287-04 | we packed this column ourselves |
| HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR column | GE Healthcare | 17-1196-01 | this column was bought ready packed |
| ÄKTA purifier system | GE Healthcare | 28406264 | |
| sample pump P-960 | GE Healthcare | 18-6727-00 | load sample at a flow rate of 10 ml/min |
| automated fraction collector Frac-950 | GE Healthcare | 18-6083-00 | |
| Bradford assay reagent | Sigma Aldrich | B6916 | solution ready to use |
| Ferritin, Type I: from horse spleen | Sigma Aldrich | F4503 | prepare ferritin standards from this solution to determine magnetoferritin concentration |
| N,N-dimethyl-1,3-propanediamine (DMPA) | Sigma Aldrich | 308110 | CAUTION: when adjusting the pH of a DMPA solution, perform this step in a fume hood |
| N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma Aldrich | E6383 | keep in freezer but bring to room temperature before opening the bottle |
| 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | AppliChem | A0689,0500 | powder; prepare a 200 M stock solution at pH 5 |
| dialysis tubing cellulose membrane | Sigma Aldrich | D9652 | soak 10 min in deionized water before use |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), 1,000 mg/L glucose | Sigma Aldrich | D5546 | warm in 37 °C water bath before use |
| fetal bovine serum | Sigma Aldrich | F7524 | add to stock DMEM bottle, 10% (v/v) final concentration |
| penicillin/streptomycin solution | Sigma Aldrich | P0781 | add to stock DMEM bottle, 1% (v/v) final concentration |
| glutamax solution | Gibco | 35050-087 | add to stock DMEM bottle, 1% (v/v) final concentration |
| human fibroblast growth factor | PeproTech | 100-18B | add to DMEM freshly into cell culture flask with each media change; final concentration 5 ng/ml |
| phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | D8537 | sterile solution, for cell cultrue |
| trypsin/EDTA solution | Sigma Aldrich | E5134 | keep in freezer and defrost in 37 °C water bath before use |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E5134 | powder; make a 2 mM solution in PBS |
| bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7030 | add 0.5% (w/v) into 2 mM EDTA solution in PBS; carefully stir with magnetic stirrer, avoid foaming; filter sterilize through a 0.22 micron syringe filter |
| MACS multi stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | for attachment of MACS magnet |
| MACS MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | disposable; intended for single use, but if sterility is not required, they can re-used: wash with deionized water and 100% ethanol, and placed in a drying oven; discard if you observe rusty patches |
| MiniMACS separator magnet | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | can be bought as a starter kit, together with columns and stands |
| MACS column pre-separation filter | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | 30 mm filter |
| Nitric acid solution, 64-66% | Sigma Aldrich | 7006 | |
| Titrando 907, syringe pump | Metrohm | 2.907.0020 | |
| Equipment used to characterize magnetoferritin and cationized magnetoferritin | |||
| SpectraMax M5 | Molecular Devices | Used to measure absorbance in the Bradford assay | |
| JEM 1200 EX | JEOL | Used for TEM imaging of magnetoferritin | |
| InVia Raman spectrometer | Renishaw | Used for Raman spectroscopy | |
| Torus DPSS laser | Laser Quantum | Used for Raman spectroscopy | |
| Bruker UltrafleXtreme | Applied Biosystems | Used for MALDI-TOF analysis of apoferritin and cationized apoferritin | |
| ZetaSizer Nano-ZS | Malvern Instruments | Used to measure hydrodynamic diameter and zeta potential of magnetoferritin and cationized magnetoferritin | |
| Magnetic Property Measurement System | Quantum Design | Used to measure magnetic saturation moment and magnetic susceptibility | |
| Magnetom Skyra | Siemens | Used to determine longitudinal and transverse relaxivity | |
| Tecnai 12 BioTwin Spirit | FEI | Used for TEM imaging of hMSC labeled with cationized magnetoferritin | |
| 710 ICP-OES | Agilent | Used to determine iron content in cells | |
References
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