Abstract
العديد من التطبيقات الطبية الحيوية الهامة، مثل التصوير الخلية والتلاعب عن بعد، ويمكن تحقيق ذلك عبر تسمية الخلايا مع مغنطيسية مسايرة فائقة superparamagnetic جزيئات أكسيد الحديد (SPIONs). تحقيق امتصاص الخلوية كاف من SPIONs هو التحدي الذي تقليديا التقى خلال تعريض الخلايا لتركيزات مرتفعة من SPIONs أو عن طريق إطالة التعرض مرات (تصل إلى 72 ساعة). ومع ذلك، من المرجح أن توسط سمية هذه الاستراتيجيات. هنا، نقدم تلخيصا للSPION magnetoferritin القائم على البروتين وكذلك سطحي بروتوكول functionalization سطح تمكن مغنطة خلية السريعة باستخدام تركيزات التعرض المنخفضة. جوهر SPION من magnetoferritin يتكون من مخدر الكوبالت أكسيد الحديد مع متوسط قطرها الجسيمات من تمعدن 8.2 نانومتر داخل تجويف الطحال الحصان APO-الفيريتين. cationization الكيميائي للmagnetoferritin أنتج رواية، عالية غشاء نشط SPION أن ممغنط خلايا اللحمة المتوسطة البشري الجذعية (hMSCs) باستخدام حضانة مرات كماباختصار كما دقيقة واحدة والحديد تركيزات كما أدنى مستوياته 0.2 ملم.
Introduction
وقد مكن ملزمة السطح أو استيعاب مغنطيسية مسايرة فائقة superparamagnetic جزيئات أكسيد الحديد (SPIONs) مغنطة من مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا لتطبيقات مثل التصوير والتلاعب بعيد. 1 ومع ذلك، تحقيق كافية مغنطة الخلوية يمكن أن يشكل تحديا، خاصة عندما يكون التفاعل بين SPION وسطح الخلية ضعيفة. 2 في الماضي، والتعرض لفترات طويلة أو SPION ارتفاع تركيزات استخدمت بوصفها استراتيجيات للتغلب على هذا التحدي. 3،4 ومع ذلك، فإن هذه الاستراتيجيات هي إشكالية لأنها تزيد سمية 5،6 ولها نجاح محدود جدا في أنواع الخلايا مع معدلات الاستيعاب المنخفضة، مثل الخلايا اللمفية. 7 لتعزيز امتصاص الخلوية من SPIONs، وقد تم استكشاف نهج functionalization العديد من السطح. على سبيل المثال، تم استخدام الأجسام المضادة لتعزيز الإلتقام مستقبلات بوساطة، 8 في حين امتصاص غير محددة يمكن تحقيقه باستخدام ترنسفكأيشن لأيها السادة 9،10 أو الأنواع اختراق الخلية، مثل فيروس نقص المناعة البشرية المتبادل الببتيد. 11،12 ومع ذلك، النهج الأجسام المضادة وfunctionalization الببتيد محدودة بسبب الكواشف مكلفة وإعداد الاصطناعية معقدة، في حين أن وكلاء ترنسفكأيشن يمكن أن تحدث جسيمات متناهية الصغر هطول الأمطار ويؤثر سلبا على وظائف الخلية. 13،14
بلغنا مؤخرا تركيب magnetoferritin cationized كيميائيا، وهو SPION الرواية التي كانت فعالة للغاية في الخلايا الجذعية الوسيطة الإنسان الممغنطة (hMSCs) باستخدام الأوقات حضانة قصيرة قدر دقيقة واحدة. ويتم تصنيع 15 Magnetoferritin خلال إعادة تأسيس وSPION داخل تجويف دي المعادن من البروتين الفريتين تخزين الحديد. 16 هذا SPION البروتين على أساس يجمع بين العديد من الخصائص التي تجعل من مناسبة تماما لمغنطة الخلية، مثل السيطرة على الخواص المغناطيسية للقلب المغناطيسي، 17-19 وتوافق مع الحياة والذوبان المائي التي تمنحها قذيفة البروتين. إضافيأكثر من ذلك، ويتحقق functionalization سطح بسهولة بسبب الأحماض الأمينية عنونة التي يمكن أن تكون كيميائيا 20-22 أو المعدلة وراثيا. 23-25 أظهرنا أن cationization الكيميائي للمخلفات الأحماض الأمينية الحامضية للقذيفة البروتين يولد جسيمات متناهية الصغر المستقرة التي تفاعلت بسهولة مع المجالات الأيونية على سطح الخلية مما يؤدي إلى مغنطة خلية السريعة والمستمرة. هذا الإجراء يلغي الحاجة لfunctionalization شاقة والبروتوكولات حضانة طويلة، وذلك بسبب آلية وضع العلامات غير محددة هذه الاستراتيجية مغنطة السريعة ينبغي أن تجد تطبيق واسعة الانتشار في أنواع الخلايا الأخرى. هنا، نقدم في عمق تقرير فائقة السرعة طريقة خلية وصفها، بما في ذلك بروتوكولات مفصلة من التوليف، وتنقية وسطح functionalization من magnetoferritin cationized.
Protocol
تم حصاد الخلايا الجذعية الوسيطة الإنسان (hMSC) من نخاع عظم الفخذ العظام القريبة من المرضى يعانون osteoarthritic تمر مجموع جراحة استبدال مفصل الورك، بما يتفق تماما مع المبادئ التوجيهية بريستول Southmead مستشفى جنة أخلاقيات البحوث (المرجع # 078/01) وبعد الحصول على موافقة المريض.
1. Magnetoferritin تحضير وتنقية
- تصريحات او ملاحظات عامه
- أداء التوليف magnetoferritin في اغلاقها باحكام، عاء التفاعل نقرا مزدوجا تغلف عند 65 درجة مئوية تحت جو النيتروجين لتقييد أكسدة السلائف المعادن. حقن المحاليل الملحية المعادن وبيروكسيد الهيدروجين من خلال منافذ الوصول في الغطاء في وعاء التفاعل باستخدام مضخة الحقنة.
- بعد تركيب magnetoferritin، تنقية البروتين أنيون تبادل اللوني (انظر القسم 1.4) لإزالة الجسيمات النانوية غير موضوعة في تجويف البروتين، تليها اللوني الحجم الاستبعاد (انظر القسم 1.5) لعزل أحادية البروتين. ديتيرمينى تركيز البروتين باستخدام مقايسة برادفورد (انظر القسم 1.6).
- الاستعدادات قبل التوليف
- ينزع الأكسجين 500 مل من الماء منزوع الأيونات عن طريق وضع أنبوب توصيل اسطوانة غاز النيتروجين في الماء، وختم السفينة مع التشبث الفيلم وظهرت على السطح من خلال غاز النيتروجين لحوالي 60 دقيقة.
- حرارة حمام الماء متصلا مزدوجة عاء التفاعل تغلف إلى 65 درجة مئوية. إضافة 75 مل من 50 ملي 4- (2-هيدروكسي) حامض -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) العازلة (درجة الحموضة 8.6) في وعاء التفاعل، وختم السفينة، وينزع الأكسجين التي ظهرت على السطح غاز النيتروجين من خلال حل العازلة لحوالي 20 دقيقة. في الوقت نفسه، وإثارة حل العازلة باستخدام محرك مغناطيسي.
- بعد deoxygenating حل العازلة HEPES، وإزالة أنبوب تزويد غاز النيتروجين من المخزن المؤقت والحفاظ عليه مع وقف التنفيذ في وعاء للحفاظ على جو النيتروجين. إضافة APO-الفيريتين لتحقيق تركيز النهائي من 3 ملغ / مل. مواصلة التحريك المغناطيسي، ولكن الحد من سرعة إثارة حالة حدوث الرغوة.
- يعد حل 25 ملي الأسهم من مائى الكوبالت سلفات عن طريق إذابة 0.19 غ في 50 مل من الماء منزوع الأيونات غير المؤكسج.
- يعد حل 25 ملم من الحديد الأمونيوم محلول كبريتات هيدرات عن طريق إذابة 0.98 غرام في 100 مل من الماء منزوع الأيونات غير المؤكسج.
- إزالة 2.5 مل من الحديد الأمونيوم محلول كبريتات هيدرات واستبدالها مع 2.5 مل من مائى الكوبالت سلفات.
- إعداد الحل 8.33 ملم من بيروكسيد الهيدروجين في الماء منزوع الأيونات غير المؤكسج بإضافة أول 965 ميكرولتر من محلول بيروكسيد الهيدروجين (30٪ ث / ث) إلى 9 مل من الماء منزوع الأيونات غير المؤكسج، ثم إضافة 1 مل من هذا الفرعية الأسهم إلى 99 مل من الماء منزوع الأيونات غير المؤكسج.
- التوليف Magnetoferritin
- ضخ 10.1 مل من كل من السلائف الحديد والكوبالت وبيروكسيد الهيدروجين في وقت واحد في حل APO فيريتين (مغناطيسيا الصورةtirred) بمعدل تدفق 0.15 مل / دقيقة باستخدام اثنين من ضخ حقنة (إجمالي حجم حقن: 20.2 مل).
- خلال فترة الحقن، وينزع الأكسجين 500 مل أخرى من الماء منزوع الأيونات.
ملاحظة: محتويات وعاء التفاعل تعتمد تدريجيا اللون البني الداكن مع تقدم رد فعل. - قبل الانتهاء من حقن الأول قريبا، وإعداد 100 مل أخرى من السلائف الحديد والكوبالت ومحلول فوق أكسيد الهيدروجين باستخدام الماء منزوع الأيونات غير المؤكسج حديثا.
- كرر الخطوة الحقن وصفها في 1.3.1 باستخدام حلول الطازجة من الحديد والكوبالت وبيروكسيد الهيدروجين.
- خلال فترة الحقن، وينزع الأكسجين 500 مل أخرى من الماء منزوع الأيونات، وتابع كما هو موضح في 1.3.3 و1.3.4.
- بعد حقن الثالث، وترك الحل لتنضج لمدة 15 دقيقة مع التحريك.
- إضافة 1.5 مل من محلول سترات الصوديوم 1 M في وعاء التفاعل إلى خلابة ايونات المعادن الحرة في الحل.
- إزالة الحل من رد فعلسفينة إلى 50 مل أنابيب الطرد المركزي، الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة في 4350 x ج وتمرير طاف من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرون. في هذه المرحلة، وطاف تصفيتها يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية حتى تنقية.
- التبادل الأيوني اللوني
- تحميل العينة على عمود (2.5 سم قطرها 20 سم) التي تحتوي على مصفوفة الموجبة باستخدام مضخة تحوي بمعدل تدفق 10 مل / دقيقة.
- غسل العمود مع ما يقرب من 100 مل من العازلة تشغيل (عازلة 50 ملي تريس (hydroxymethyl) aminomethane (تريس)، ودرجة الحموضة 8.0) باستخدام مضخة التدرج في معدل التدفق من 10 مل / دقيقة.
- إلى أزل البروتين، وغسل العمود في 10 مل / دقيقة مع زيادة تركيزات كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) في المخزن تريس: 150 و 500 و 1000 ملم تركيز كلوريد الصوديوم النهائي، 150 مل من كل التركيز.
- كما elutes البروتين في تركيز كلوريد الصوديوم 500 ملم، وجمع في 50 مل الكسور باستخدام جامع جزء الآلي.
ملاحظة: للحصولبروتوكول مفصلة الصرف اللوني ايون استشارة البروتوكولات التي تم نشرها مسبقا. 26
- استبعاد حجم اللوني
- تركيز 150 مل من magnetoferritin إلى وحدة تخزين ما يقرب من 2 مل باستخدام وحدة تصفية 15 مل الطرد المركزي تليها وحدة حجم 4 مل. الرجوع إلى إرشادات الشركة المصنعة لوحدات تصفية الطرد المركزي (انظر قائمة المواد) لبروتوكول مفصل لهذا الإجراء.
- تحميل عينة مركزة على عمود هلام الترشيح باستخدام حلقة الحقن.
- غسل العمود مع العازلة تشغيل (50 ملي تريس العازلة، ودرجة الحموضة 8.0، يحتوي على 150 ملي كلوريد الصوديوم) بمعدل تدفق 1.3 مل / دقيقة.
- جمع 6 مل الكسور باستخدام جامع جزء الآلي. أحادية البروتين أزل الماضية. عند هذه النقطة، magnetoferritin تنقيته يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية حتى cationization.
ملاحظة: للحصول على بروتوكول مفصلة من حجم الإقصاء اللوني باستخدام عمود الترشيح هلام استشارة previoنشرت usly البروتوكولات. 27
- تحديد تركيز البروتين
- إعداد معايير الفيريتين من 0.06، 0.125، 0.25، 0.5 و 1 ملغ / مل في 50 العازلة ملي تريس باستخدام المتاحة تجاريا الفيريتين الطحال الحصان.
وذكر تركيز البروتين من الفيريتين المتاحة تجاريا على الزجاجة: ملاحظة. إذا لم يكن كذلك، الاتصال المورد لهذه المعلومات. - تمييع عينات magnetoferritin التركيز مجهولين في 50 العازلة ملي تريس حتى لون من الحل مباريات تقريبا اللون من 0.5 ملغ / مل معيار. تقديم مذكرة للعامل التخفيف.
- إضافة 10 ميكرولتر من كل عينة القياسية وmagnetoferritin في ثلاث نسخ في الآبار من 96 لوحة جيدا.
- إضافة 200 ميكرولتر من الجاهزة كاشف برادفورد إلى كل بئر (يرجى الرجوع إلى قائمة المواد للبرادفورد تفاصيل الفحص الكاشف).
- يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 8 دقائق.
- قياس الامتصاصية في λ = 595 نانومتر باستخدامقارئ صفيحة.
- رسم يعني الامتصاصية للمعايير الفيرتين بوصفها وظيفة من تركيز البروتين واستخدام المنحدر واعتراض من صالح الخطي لحساب تركيز عينة magnetoferritin.
ملاحظة: يجب الأخذ بعين الاعتبار عامل التخفيف الذي تم استخدامه لضبط عينة magnetoferritin إلى منحنى القياسية.
- إعداد معايير الفيريتين من 0.06، 0.125، 0.25، 0.5 و 1 ملغ / مل في 50 العازلة ملي تريس باستخدام المتاحة تجاريا الفيريتين الطحال الحصان.
2. Magnetoferritin Cationization
- تصريحات او ملاحظات عامه
ملاحظة: للحصول على cationization magnetoferritin، وقد يقترن N، N -dimethyl-1،3-propanediamine (DMPA) إلى بقايا حمض الأسبارتيك والجلوتاميك على سطح MF باستخدام N - (3-dimethylaminopropyl) - N 'هيدروكلوريد -ethylcarbodiimide (EDC).- تنفيذ رد فعل في درجة حرارة الغرفة مع التحريك. بروتوكول الواردة أدناه هي لcationization من 10 ملغ من magnetoferritin في إجمالي حجم 5 مل (بروتين تركيز 2 ملغ / مل). ومع ذلك، تسلق أعلى أو لأسفلعن طريق الحفاظ على البروتين: DMPA: نسب EDC ثابت، فضلا عن كميات من حل العازلة وmagnetoferritin.
- قبل رد الفعل cationization، dialyze العينات magnetoferritin إلى 50 العازلة الفوسفات ملم (الرقم الهيدروجيني 7) التي تحتوي على 50 ملي كلوريد الصوديوم. وهذا أمر مهم لإزالة شطف العازلة تريس وتجنب ردود الفعل غير المرغوب فيه بين أمين تريس وبقايا حمض الكربوكسيلية تنشيط EDC. تحديد تركيز البروتين بعد غسيل الكلى وتعديله إلى 4 ملغ / مل قبل cationization.
- بروتوكول Cationization
- تزن من 374 ملغ من DMPA وتذوب في 2.5 مل من 200 ملي 2- (N -morpholino) حمض ethanesulfonic (MES) العازلة.
- ضبط درجة الحموضة حل لحوالي 7 باستخدام تتركز (6 م) حمض الهيدروكلوريك (حمض الهيدروكلوريك).
تنبيه: تنفيذ هذه الخطوة في غطاء الدخان، وإضافة حمض إلى DMPA النشرات أدخنة سامة! - إضافة 2.5 مل من محلول magnetoferritin في 4 ملغ / مل (تركيزات النهائيtration زارة التربية والعلم هو 100 ملم، تركيز النهائي من magnetoferritin هو 2 ملغ / مل، والمبلغ الإجمالي للبروتين هو 10 ملغ).
- إضافة محرك مغناطيسي ويقلب لمدة 2 ساعة لكي تتوازن.
- بعناية ضبط الحل لدرجة الحموضة 5.0 باستخدام 1 M حمض الهيدروكلوريك.
- إضافة 141 ملغ من مسحوق EDC إلى حل DMPA / magnetoferritin.
- يستمر التحريك لمدة 3.5 ساعة.
- تصفية حل من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرون لإزالة أي رواسب.
- إضافة حل لأنابيب غسيل الكلى مع 12-14 كيلو دالتون الوزن الجزيئي قطع وdialyze ضد 4 لتر من 50 العازلة الفوسفات ملم (الرقم الهيدروجيني 7) التي تحتوي على 50 ملي كلوريد الصوديوم لمدة 2 أيام في 4 درجات مئوية، لتحل محل المخزن المؤقت لغسيل الكلى ثلاث على الأقل مرات خلال تلك الفترة.
ملاحظة: عند هذه النقطة، يمكن تخزين magnetoferritin cationized في 4 درجات مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
3. الوسيطة الإنسان وصفها الخلايا الجذعية مع Cationized Magnetoferritin
- تصريحات او ملاحظات عامه
- خلايا الثقافة باعتبارها الطبقات الوحيدة باستخدام 175 سم 2 القوارير و 20 مل من مستنبت، الذي تتجدد كل 3 - 4 أيام. مستنبت يتكون من Dulbecco لتعديل المتوسطة النسر (DMEM)، التي تحتوي على 1000 ملغ / لتر جلوكوز، 10٪ (ت / ت) مصل بقري جنيني، 1٪ (ت / ت) حل البنسلين / الستربتومايسين، 1٪ (ت / ت) L -alanyl-L-الجلوتامين حل و 5 نانوغرام / مل تستكمل حديثا عامل نمو الخلايا الليفية الإنسان.
- وضع العلامات المغناطيسي للhMSC مع magnetoferritin cationized
- البذور 150،000 hMSCs إلى 25 سم 2 قوارير وترك التمسك يلا 37 درجة مئوية.
- فلتر تعقيم magnetoferritin cationized من خلال مرشح 0.22 ميكرون حقنة وتحديد تركيز البروتين.
- حفظ ظروف معقمة، وإعداد محلول 0.5 ميكرومتر من magnetoferri cationizedالقصدير في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). الحفاظ توج في غطاء الثقافة العقيمة حتى الاستخدام.
- غسل الخلايا مطلي مع 2 مل من درجة حرارة الغرفة في برنامج تلفزيوني.
- إضافة 1 مل من محلول magnetoferritin cationized تعقيم للخلايا مطلي واحتضان للفترة الزمنية المطلوبة (1 دقيقة إلى 1 ساعة).
- غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني، وخلايا ثم الحصاد عن طريق إضافة 0.5 مل من التربسين ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل / (EDTA) واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- إضافة 1 مل من مستنبت لإبطال نشاط التربسين / EDTA، ونقل الحل إلى أنبوب مل الطرد المركزي 15 وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 524 ز س.
- تجاهل طاف وإعادة تعليق بيليه خلية في 0.5 مل العازلة الفصل المغناطيسي، وتتألف من 0.5٪ (ث / ت) مصل بقري جنيني و 2 ملي EDTA في برنامج تلفزيوني.
- فصل الخلية المغناطيسي
- إرفاق المغناطيس إلى موقف متعددة، وإضافة عمود الفصل المغناطيسي للمغناطيس. وضع مرشح ما قبل الانفصال على العمود ه.
- ضع 0.5 مل من العازلة الفصل المغناطيسي في تصفية ما قبل الانفصال والسماح لها البعيد من خلال كل من المرشح وعمود لغسل والرطب لهم.
- وضع أنبوب الطرد المركزي 15 مل تحت العمود.
- إضافة 0.5 مل من تعليق الخلية في خزان مرشح للعمود الفصل المغناطيسي.
- عندما الخزان فارغ، إضافة 0.5 مل من العازلة الفصل المغناطيسي.
- عندما الخزان فارغ، إضافة مزيد من 0.5 مل من العازلة الفصل المغناطيسي.
- كرر أكثر مرة واحدة (الحجم الكلي من العازلة الفصل المغناطيسي تستخدم لغسل ينبغي أن يكون 1.5 مل). هذه الخطوة غسل elutes جميع الخلايا غير الممغنطة من العمود (جزء الخلية غير ممغنط).
- إزالة عمود من المغناطيس ووضعه في 15 مل أنبوب الطرد المركزي الطازجة. إزالة مرشح من الخزان العمود.
- إضافة 1 مل من العازلة الفصل المغناطيسي إلى الخزان ودفع على الفور من خلال العمود باستخدام المكبس المقدمة من تصنيعص. هذا elutes الخلايا الممغنطة من العمود في أنبوب الطرد المركزي (ممغنط جزء الخلية).
- أجهزة الطرد المركزي كل من الأنابيب لمدة 5 دقائق في 524 ز س.
- تجاهل طاف واعادة تعليق الكريات خلية في 0.3 مل برنامج تلفزيوني.
- حساب عدد الأرقام الخلايا في كل جزء باستخدام عدادة الكريات.
- تحديد جزء من خلايا الممغنطة، M (٪)، وذلك باستخدام المعادلة التالية:
حيث n (M) هو عدد الخلايا في جزء ممغنط و n (M + نيو مكسيكو) هو مجموع عدد الخلايا في أجزاء الممغنطة وغير الممغنطة.
- إعداد hMSCs المسمى مع magnetoferritin cationized لتقدير الحديد باستخدام إضافة بالحث البلازما الطيفي الانبعاث الضوئي (ICP-OES)
ملاحظة: قد تحتاج إلى أن تتكيف للأدوات ICP-OES أخرى البروتوكول. فإنه من المستحسن أن يتشاور مع إعادةفني المسئولة.- أجهزة الطرد المركزي لعدد معروف من الخلايا لمدة 5 دقائق في 524 ز س.
- إزالة طاف برنامج تلفزيوني وإضافة 0.25 مل من 50٪ (ت / ت) وحامض النتريك.
- دوامة مزيج تعليق خلية المحمض.
- يحضن في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
- إضافة 4.75 مل من الماء المقطر إلى كل مزيج عينة ودوامة.
- تحليل مع ICP-OES. 28
- تطبيع محتوى الحديد قياس لعدد من الخلايا لتحديد قيمة للمحتوى الحديد الخلوي.
Representative Results
وقد استخدم تيم لتأكيد تمعدن جسيمات متناهية الصغر داخل تجويف صميم الفريتين وتحديد متوسط حجم الأساسية (الشكلان 1A و 1B). أعطى تحليل الصور من عينات magnetoferritin غير ملوثين متوسط قطرها الأساسية من 8.2 ± 0.7 نانومتر، وأكدت وصمة عار أوروثيوغلوكوز وجود الجسيمات النانوية داخل قفص البروتين. لاحظ أن الصور تظهر عينة magnetoferritin التي تم تنقيتها باستخدام مزيد من الفصل المغناطيسي لعزل النوى جسيمات متناهية الصغر موحدة. عينات Magnetoferritin التي لم تنقيته مغناطيسيا لديها توزيع أوسع قليلا حجم الأساسية. وأشار 29 تحليل بنية الأساسية magnetoferritin باستخدام-المساحة المحددة حيود الإلكترون احتمال وجود بنية معكوس الإسبنيل بناء على أكسيد الحديد الأسود (الحديد 3 O 4) و / أو maghemite (γ-الحديد 2 يا 3)، وكذلك هيكل الإسبنيل نظرا لشركة 3 4. وعلاوة على ذلك، كشفت أطياف رامان قمم نسبت إلى الحديد 3 O 4، وكميات صغيرة من γ الحديد 2 O 3، والفريت الكوبالت (الشكل 1 C). وأظهر تحليل ICP-OES من magnetoferritin ما معدله 102 ميكروغرام من الحديد و 0.9 ميكروغرام من الكوبالت لكل مليغرام من magnetoferritin.
يتم تضمين التخطيطي، مما يدل على cationization الخطوة التالية (الشكل 2). كان قطرها الهيدروديناميكية من magnetoferritin وmagnetoferritin cationized 11.8 ± 1.1 نانومتر و 12.5 ± 1.4 نانومتر، على التوالي، على النحو الذي يحدده تشتت الضوء الديناميكي. تم تقييم كفاءة cationization من التساهمية DMPA اقتران لmagnetoferritin باستخدام تكمين زيتا والليزر الامتزاز التأين الوقت من الطيران (MALDI-TOF) مطياف الكتلة بمساعدة المصفوفة. تغيرت إمكانات زيتا من -10.5 بالسيارات لMF إلى + 8.3 فولت لmagnetoferritin cationized مؤكداتغيير في إمكانية السطح من سلبي إلى إيجابي (الجدول 1). وجدت التجارب مطياف الكتلة وحدة فرعية الوزن الجزيئي من 20.1 كيلو دالتون للمواطن APO-الفيريتين و 21.1 كيلو دالتون لcationized APO-فيريتين (الشكل 2 ب). هذه الزيادة كتلة يتوافق مع ما يقرب من 12 الجزيئات DMPA جانب في الوحدة الفرعية البروتين، وcationization من 288 المخلفات على كامل البروتين 24 فرعية.
تم قياس التشبع المغناطيسي وقابلية استخدام القياس المغنطيسي الحبار، وقيست عرضية وطولية relaxivity باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي. وكانت الخواص المغناطيسية مماثلة لmagnetoferritin وmagnetoferritin cationized، مشيرا إلى أن cationization كان لها تأثير يذكر على الخواص المغناطيسية للSPION المغلقة (الجدول 1). وعلاوة على ذلك، وهذه الخصائص هي مشابهة لالنانوية أخرى أكسيد الحديد القائمة، 19،30 التظاهر بأن cationized ماغنيسوف toferritin تكون مناسبة مثل التصوير بالرنين المغناطيسي عوامل التباين القائم SPION التقليدية في تعزيز النقيض من التصوير.
بعد التعرض لمدة 30 دقيقة، وتمت تغطية سطح الخلية كثيفة مع magnetoferritin cationized (الشكل 3). ومع ذلك، بعد أسبوع واحد، لا توجد الجسيمات النانوية على سطح الخلية (الشكل 3 B). كان magnetoferritin Cationized فعالة بشكل ملحوظ في hMSCs صفها مغناطيسيا. والجدير بالذكر أن تعريض الخلايا لmagnetoferritin cationized لمدة دقيقة واحدة أسفرت عن مغنطة من 92٪ من سكان الخلية وتقديم 3.6 خريج من الحديد في كل خلية. زيادة فترة حضانة لمدة 15 دقيقة أسفرت عن مغنطة من السكان خلية بأكمله (الشكل 3 C).
الشكل 1: توصيف magnetof النوى erritin مخدر مع 5٪ الكوبالت. صور تيم من magnetoferritin ملطخة أوروثيوغلوكوز (A) وغير ملوثين (B). يظهر أقحم حيود الإلكترون المقابلة مع مؤشرات المغنتيت. شريط النطاق: 20 نانومتر. (C) رامان الطيف لmagnetoferritin. وتشير الأسهم وسائط الاهتزاز رامان الرئيسية لالفريت الكوبالت (T 2G)، وأكسيد الحديد الأسود وmaghemite (على حد سواء و1G). كان 31،32 الطول الموجي الليزر المستخدمة 532 نانومتر. (صورة مقتبسة من أوكودا وآخرون. 18). لاحظ أن هذه العينة magnetoferritin تم تنقيتها باستخدام مزيد من الفصل المغناطيسي، والذي عزل جزيئات magnetoferritin المحملة بشكل موحد. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
785fig2.jpg "/>
الشكل 2: Cationization من magnetoferritin. أ) المذيبات الوصول تمثيل مساحة تبين توزيع الحمضية (الأحمر) و (الصفراء) بقايا الأحماض الأمينية الأساسية على سطح البروتين. Magnetoferritin (1) يتم تعديلها لmagnetoferritin cationized (2) من يشابك بوساطة carbodiimide من DMPA إلى بقايا الأحماض الأمينية الحمضية على سطح بروتين (3). ب) تحليل الطيف الكتلي مفارز APO-الفيرتين-APO فيريتين وcationized. الكتلة لتهمة (م / ض) الطيف من صميم الفريتين (ApoF) وصميم الفريتين cationized (القط ApoF) التي تم إنشاؤها من قبل MALDI-TOF. ويلاحظ وجود زيادة كتلة من 20.1 كيلو دالتون إلى 21.1 كيلو دالتون بعد cationization. (صورة مقتبسة من كوريا كاريرا وآخرون. 15) الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
EP-together.within الصفحات = "1"> 
الشكل (3): وضع العلامات المغناطيسي وفصل الخلايا من hMSCs حضنت مع magnetoferritin cationized. أ) صورة تيم من hMSCs بعد حضانة لمدة 30 دقيقة مع magnetoferritin cationized. يشير السهم وجود النوى magnetoferritin المزدحمة بالسكان على سطح الخلية. الحانات الحجم: 200 نانومتر. ب) صورة تيم من hMSC أسبوع واحد بعد وضع العلامات. سطح الخلية واضح من magnetoferritin cationized. تم ممغنط 92٪ من سكان الخلية بعد التعرض لدقيقة واحدة مع 0.5 ميكرومتر cationized magnetoferritin، وكان ممغنط السكان خلية بأكمله خلال 15 دقيقة: C) التحقيق في سرعة وضع العلامات المغناطيسي. محتوى الحديد في كل خلية تم تحديد باستخدام برنامج المقارنات الدولية لعملية التضامن الإماراتي. ويبين متوسط والانحراف المعياري من ثلاثة مكررات البيولوجية. (صورة مقتبسة من كوريا كاريرا وآخرون 1.5) يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
| MF | القط-MF | |
| قطر الهيدروديناميكية [نانومتر] | 11.8 ± 1.1 | 12.5 ± 1.4 |
| زيتا المحتملة [م ت] | (-) 10.4 ± 0.2 | 8.3 ± 0.7 |
| التشبع المغناطيسي لحظة [آم 2 كجم -1] | 54.9 ± 1.6 | 55.3 ± 1.4 |
| الشامل قابلية [× 10 4 م 3 كجم -1] | 1.75 ± 0.08 | 1.75 ± 0.07 |
| relaxivity طولية [ملي -1 ثانية -1] | 2.6 ± 0.1 | 2.3 ± 0.1 |
| relaxivity عرضية [ملي -1 ثانية -1] | 44.6 ± 1.0 | 52.8 ± 0.8 |
الجدول 1: توصيف فيزيائية من magnetoferritin (MF) وmagnetoferritin cationized (القط MF). (الجدول مقتبس من كوريا كاريرا وآخرون. 15)
Discussion
تيم العينات magnetoferritin ملطخة أوروثيوغلوكوز كشف تمعدن الناجح لالنانوية داخل القفص البروتين. وأشار الإلكترون حيود وتحليل رامان من جوهر جسيمات متناهية الصغر وجود الفريت الكوبالت، مشيرا إلى المنشطات بنجاح جوهر جسيمات متناهية الصغر مع الكوبالت. هذا يدل على أن الجسيمات النانوية أكسيد مختلط يمكن أن يكون بنجاح المعادن داخل تجويف APO فيريتين. وعلاوة على ذلك، لقد أظهرنا سابقا أن المنشطات الكوبالت يمكن أن تختلف عن طريق تغيير كمية من السلائف الكوبالت تضاف إلى خليط التفاعل، والتي تمكن ضبط الخواص المغناطيسية. 18
التوليف Magnetoferritin لا يمكن أن يؤديها في مجموعة متنوعة من السفن، طالما أنهم بإحكام قابل للغلق ولديها منافذ الوصول من خلالها الكواشف يمكن إدخال (على سبيل المثال، الرقبة ثلاثة دورق كروي). ينبغي الحفاظ على درجة حرارة التفاعل عند 65 درجة مئوية إما عن طريق وضع السفينة فيو/ حمام الزيت الماء أو باستخدام السفن المزدوج جاكت. هنا، استخدمنا الإعداد خلية كهروكيميائية المزدوج جاكت لأداء التوليف. لضمان التوليف الناجح، والحفاظ على درجة الحموضة الصحيحة وتجنب تلوث الأكسجين من المحاليل المائية أمر بالغ الأهمية. ينبغي أن يكون دائما على استعداد حلول الملح المعدني مسبق طازجة للاستخدام وليس في وقت مبكر. وعلاوة على ذلك، يمكن للحلول صميم الفريتين التجارية تختلف من حيث الجودة ويؤثر على نتيجة التوليف (على سبيل المثال، حجم جسيمات متناهية الصغر المتمعدنة الأساسية). يمكن أن يساعد على dialyze الحل صميم الفريتين إلى 50 ملي العازلة HEPES (درجة الحموضة 8.6) قبل تركيب لإزالة أي عامل مختزل المتبقية المستخدمة من قبل الشركة المصنعة. ومن المفيد تقديم مذكرة من العدد دفعة من حل APO فيريتين تستخدم لتخليق، لذلك يمكن أن يطلب على وجه التحديد من أن الحاجة المادية الإضافية التي سيتم شراؤها من الشركة المصنعة. وعلاوة على ذلك، يجب ذكر تركيز البروتين المتوفرة تجاريا الفيريتين APO على الزجاجة، والتي يمكنيتم استخدامها لحساب حجم حل APO فيريتين اللازمة لتخليق. إذا لم تكن هذه هي الحالة، اتصل المورد لهذه المعلومات.
ميزة إضافة تدريجية من الأملاح المعدنية وبيروكسيد الهيدروجين - كما وردت هنا وفي التقارير السابقة - هي أن تمعدن جوهر جسيمات متناهية الصغر يمكن التحكم هذا أن العوامل تحميل مختلفة (أي أحجام جسيمات متناهية الصغر) لا يمكن أن يتحقق. 33 وعلاوة على ذلك، فمن الممكن لتنقية magnetoferritin باستخدام مزيد من عمود الفصل المغناطيسي، على سبيل المثال، عمود معبأة مع مسحوق الفولاذ المقاوم للصدأ المضمون داخل الكهربائي. 34 وهكذا، النوى جسيمات متناهية الصغر monodisperse للغاية ويمكن أن تكون معزولة من العينة magnetoferritin السائبة. ومع ذلك، لوصفها خلية المغناطيسي كما هو مبين هنا هذا غير مطلوب. وجود قيود على التوليف magnetoferritin هو منخفض نسبيا العائد تركيب حوالي 10٪، والتكلفة المرتفعة نسبيا للالتجاري APO-FEحلول rritin. ومع ذلك، APO-الفيريتين ويمكن أيضا أن تكون مستعدة من الطحال الحصان متاح بثمن بخس الفيريتين باتباع أنشئت البروتوكولات دي تمعدن. 16
وقد تحقق Cationization من magnetoferritin بإضافة نسبة المولي من 250 الجزيئات من DMPA و 50 جزيئات EDC في بقايا الشحنة السالبة (الحسابات على أساس تسلسل الأحماض الأمينية من الحصان الطحال الفيريتين). نتج هذا الفائض من كاشف على البروتين في الكفاءة cationization عالية وقابلة للمقارنة أيضا ذكرت سابقا النتائج للcationization من الفيريتين. 35 لأجل تحليل MALDI-TOF، صميم الفريتين وصميم الفريتين cationized استخدمت بسبب الكتلة الجزيئية المفرطة من جوهر magnetoferritin. أن تسفر الكفاءة cationization عالية، ودرجة الحموضة المثلى هي أيضا حاسمة. يشابك بوساطة EDC هو الأكثر فعالية في الظروف الحمضية أقل ما يقال، ووجدنا أن الرقم الهيدروجيني 5 أثمرت نتائج cationization الأمثل لmagnetoferritin. ومع ذلك، لبروتينات أخرى جقد تحتاج إلى أن يكون الأمثل ationization درجة الحموضة. وينبغي تجنب Cationization في أو بالقرب من نقطة تساوي الكهربائية من البروتين، لأن هذا قد يؤدي إلى هطول الأمطار الشديد.
وكانت الخلايا الجذعية مغنطة مع magnetoferritin cationized ذات كفاءة عالية، ويمكن أن يتحقق باستخدام حضانة مرات أقل بكثير من 30 دقيقة. أسفرت حتى دقيقة واحدة حضانة في محتوى الحديد الخلوي 3.6 خريج، والتي تقع ضمن نطاق ذكرت المطلوبة للتأثير T2 و T2 * المقابل للتصوير بالرنين المغناطيسي. 36،37 ومن الملاحظ أيضا أن يتحقق هذا الوسم الفعال مع تركيزات الحديد خارج الخلية منخفضة. على سبيل المثال، والدراسات السابقة باستخدام الجسيمات النانوية الأيونية تقرير مستويات الحديد من 10 خريج في الخلية بعد فترة حضانة لمدة 30 دقيقة مع 5 ملي الحديد. 38 وعلى سبيل المقارنة، الحضانة مع حل magnetoferritin cationized تحتوي على 0.5 ميكرومتر بروتين يناظر الحضانة مع حوالي 0.2 ملي الحديد وأيضا ينتج ما يقرب من 10 خريج من الحديد في سللتر بعد 30 دقيقة. لم نكن قادرين على تحديد واضح أي الحويصلات endocytotic باستخدام تيم. ومع ذلك، وجدت دراسات سابقة باستخدام الفيريتين cationized بأن التدخيل حدث خلال أول عشر دقائق من التعرض. يمكن أن تكون مترجمة 39،40 الفيريتين Cationized في الحويصلات المغلفة، مشيرا إلى الإلتقام clathrin- أو التي تعتمد على caveolin. وأفاد نفس الدراسات أيضا أنه بعد 30 دقيقة من الحضانة، الفيريتين cationized لا تزال موجودة على سطح الخلية، وكذلك في الهيئات عديد الحويصلات، تشبه الجسيمات الحالة.
ويمكن أن تشمل تطبيقات أخرى cationization أقفاص-APO فيريتين محملة النانوية أخرى و / أو جزيئات الوظيفية، مثل الأدوية المضادة للسرطان 41 أو 42 نقاط الكم. Cationization من هذه التركيبات الفيرتين يمكن أن يؤدي إلى تسليم أسرع وأكثر كفاءة من حمولتها إلى الخلايا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Fisher Scientific | BPE310-1 | powder; prepare a 1 M stock solution at pH 8.6 and dilute to 50 mM prior to use. Check the pH carefully prior to synthesis! |
| apoferritin from equine spleen | Sigma Aldrich | A3641 | we used LOT# 081M7011V |
| cobalt sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | C6768 | prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis |
| ammonium iron sulphate hexahydrate | Sigma Aldrich | F1543 | prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis |
| hydrogen peroxide solution (30%) | Sigma Aldrich | 216763 | prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis |
| sodium citrate | Sigma Aldrich | S1804 | powder; a 1 M solution can be prepared and kept at room temperature for several months |
| Millex GP filter unit, 0.22 micron | Merck Millipore | SLGP033RS | syringe filter |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | powder; prepare a 1 M stock solution at pH 8.0 and dilute to 50 mM prior to use |
| sodium chloride | Sigma Aldrich | 31434 | poweder; add to buffers as required |
| Centriprep centrifugal filter units | Merck Millipore | 4310 | Ultracel YM-50 membrane, 12 ml volume; use for initial concentration until the magnetoferritin solution has been concentrated from about 150 ml to 20 ml |
| Amicon Ultra-4 centrifugal filter untis | Merck Millipore | UFC801024 | Ultracel-10 membrane, 4 ml volume; use to concentrate magnetoferritin solution from about 20 ml to 2 ml |
| ANX Sepharose 4 Fast Flow | GE Healthcare | 17-1287-04 | we packed this column ourselves |
| HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR column | GE Healthcare | 17-1196-01 | this column was bought ready packed |
| ÄKTA purifier system | GE Healthcare | 28406264 | |
| sample pump P-960 | GE Healthcare | 18-6727-00 | load sample at a flow rate of 10 ml/min |
| automated fraction collector Frac-950 | GE Healthcare | 18-6083-00 | |
| Bradford assay reagent | Sigma Aldrich | B6916 | solution ready to use |
| Ferritin, Type I: from horse spleen | Sigma Aldrich | F4503 | prepare ferritin standards from this solution to determine magnetoferritin concentration |
| N,N-dimethyl-1,3-propanediamine (DMPA) | Sigma Aldrich | 308110 | CAUTION: when adjusting the pH of a DMPA solution, perform this step in a fume hood |
| N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma Aldrich | E6383 | keep in freezer but bring to room temperature before opening the bottle |
| 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | AppliChem | A0689,0500 | powder; prepare a 200 M stock solution at pH 5 |
| dialysis tubing cellulose membrane | Sigma Aldrich | D9652 | soak 10 min in deionized water before use |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), 1,000 mg/L glucose | Sigma Aldrich | D5546 | warm in 37 °C water bath before use |
| fetal bovine serum | Sigma Aldrich | F7524 | add to stock DMEM bottle, 10% (v/v) final concentration |
| penicillin/streptomycin solution | Sigma Aldrich | P0781 | add to stock DMEM bottle, 1% (v/v) final concentration |
| glutamax solution | Gibco | 35050-087 | add to stock DMEM bottle, 1% (v/v) final concentration |
| human fibroblast growth factor | PeproTech | 100-18B | add to DMEM freshly into cell culture flask with each media change; final concentration 5 ng/ml |
| phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | D8537 | sterile solution, for cell cultrue |
| trypsin/EDTA solution | Sigma Aldrich | E5134 | keep in freezer and defrost in 37 °C water bath before use |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E5134 | powder; make a 2 mM solution in PBS |
| bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7030 | add 0.5% (w/v) into 2 mM EDTA solution in PBS; carefully stir with magnetic stirrer, avoid foaming; filter sterilize through a 0.22 micron syringe filter |
| MACS multi stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | for attachment of MACS magnet |
| MACS MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | disposable; intended for single use, but if sterility is not required, they can re-used: wash with deionized water and 100% ethanol, and placed in a drying oven; discard if you observe rusty patches |
| MiniMACS separator magnet | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | can be bought as a starter kit, together with columns and stands |
| MACS column pre-separation filter | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | 30 mm filter |
| Nitric acid solution, 64-66% | Sigma Aldrich | 7006 | |
| Titrando 907, syringe pump | Metrohm | 2.907.0020 | |
| Equipment used to characterize magnetoferritin and cationized magnetoferritin | |||
| SpectraMax M5 | Molecular Devices | Used to measure absorbance in the Bradford assay | |
| JEM 1200 EX | JEOL | Used for TEM imaging of magnetoferritin | |
| InVia Raman spectrometer | Renishaw | Used for Raman spectroscopy | |
| Torus DPSS laser | Laser Quantum | Used for Raman spectroscopy | |
| Bruker UltrafleXtreme | Applied Biosystems | Used for MALDI-TOF analysis of apoferritin and cationized apoferritin | |
| ZetaSizer Nano-ZS | Malvern Instruments | Used to measure hydrodynamic diameter and zeta potential of magnetoferritin and cationized magnetoferritin | |
| Magnetic Property Measurement System | Quantum Design | Used to measure magnetic saturation moment and magnetic susceptibility | |
| Magnetom Skyra | Siemens | Used to determine longitudinal and transverse relaxivity | |
| Tecnai 12 BioTwin Spirit | FEI | Used for TEM imaging of hMSC labeled with cationized magnetoferritin | |
| 710 ICP-OES | Agilent | Used to determine iron content in cells | |
References
- Gupta, A. K., Gupta, M. Synthesis and surface engineering of iron oxide nanoparticles for biomedical applications. Biomaterials. 26 (18), 3995-4021 (2005).
- Decuzzi, P., Ferrari, M. The role of specific and non-specific interactions in receptor-mediated endocytosis of nanoparticles. Biomaterials. 28 (18), 2915-2922 (2007).
- Cunningham, C. H., et al. Positive contrast magnetic resonance imaging of cells labeled with magnetic nanoparticles. Magn. Reson. Med. 53 (5), 999-1005 (2005).
- Song, H. T., et al. Surface modulation of magnetic nanocrystals in the development of highly efficient magnetic resonance probes for intracellular labeling. J. Am. Chem. Soc. 127 (28), 9992-9993 (2005).
- Daldrup-Link, H. E., et al. Targeting of hematopoietic progenitor cells with MR contrast agents. Radiology. 228 (3), 760-767 (2003).
- Singh, N., Jenkins, G. J., Asadi, R., Doak, S. H. Potential toxicity of superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION). Nano Rev. 1, (2010).
- Dodd, S. J., et al. Detection of single mammalian cells by high-resolution magnetic resonance imaging. Biophys. J. 76 (1), 103-109 (1999).
- Ahrens, E. T., Feili-Hariri, M., Xu, H., Genove, G., Morel, P. A. Receptor-mediated endocytosis of iron-oxide particles provides efficient labeling of dendritic cells for in vivo MR imaging. Magn. Reson. Med. 49 (6), 1006-1013 (2003).
- Arbab, A. S., et al. Efficient magnetic cell labeling with protamine sulfate complexed to ferumoxides for cellular MRI. Blood. 104 (4), 1217-1223 (2004).
- Bulte, J. W. M., et al. Magnetodendrimers allow endosomal magnetic labeling and in vivo tracking of stem cells. Nat. Biotechnol. 19 (12), 1141-1147 (2001).
- Josephson, L., Tung, C. H., Moore, A., Weissleder, R. High-efficiency intracellular magnetic labeling with novel superparamagnetic-tat peptide conjugates. Bioconjugate Chem. 10 (2), 186-191 (1999).
- Lewin, M., et al. Tat peptide-derivatized magnetic nanoparticles allow in vivo tracking and recovery of progenitor cells. Nat. Biotechnol. 18 (4), 410-414 (2000).
- Hunter, A. C. Molecular hurdles in polyfectin design and mechanistic background to polycation induced cytotoxicity. Adv. Drug Delivery Rev. 58 (14), 1523-1531 (2006).
- Montet-Abou, K., Montet, X., Weissleder, R., Josephson, L. Cell internalization of magnetic nanoparticles using transfection agents. Mol. Imaging. 6 (1), 1-9 (2007).
- Correia Carreira,, S,, et al. Ultra-fast stem cell labelling using cationised magnetoferritin. Nanoscale. 8 (14), 7474-7483 (2016).
- Meldrum, F. C., Heywood, B. R., Mann, S. Magnetoferritin: in vitro synthesis of a novel magnetic protein. Science. 257 (5069), 522-523 (1992).
- Klem, M. T., et al. Synthetic control over magnetic moment and exchange bias in all-oxide materials encapsulated within a spherical protein cage. J. Am. Chem. Soc. 129 (1), 197-201 (2007).
- Okuda, M., Eloi, J. C., Sarua, A., Jones, S. E. W., Schwarzacher, W. Energy barrier distribution for dispersed mixed oxide magnetic nanoparticles. J. Appl. Phys. 111 (7), (2012).
- Uchida, M., et al. A human ferritin iron oxide nano-composite magnetic resonance contrast agent. Magn. Reson. Med. 60 (5), 1073-1081 (2008).
- Danon, D., Skutelsk E, M. arikovsY., Goldstei, L. Use of Cationized Ferritin as a Label of Negative Charges on Cell Surfaces. J. Ultrastruc. Res. 38 (5-6), 500-510 (1972).
- Valero, E., et al. Magnetic Nanoparticles-Templated Assembly of Protein Subunits: A New Platform for Carbohydrate-Based MRI Nanoprobes. J. Am. Chem. Soc. 133 (13), 4889-4895 (2011).
- Zborowski, M., et al. Immunomagnetic isolation of magnetoferritin-labeled cells in a modified ferrograph. Cytometry. 24 (3), 251-259 (1996).
- Ikezoe, Y., et al. Growth of Giant Two-Dimensional Crystal of Protein Molecules from a Three-Phase Contact Line. Langmuir. 24 (22), 12836-12841 (2008).
- Uchida, M., et al. Targeting of cancer cells with ferrimagnetic ferritin cage nanoparticles. J. Am. Chem. Soc. 128 (51), 16626-16633 (2006).
- Yamashita, K., et al. Selective nanoscale positioning of ferritin and nanoparticles by means of target-specific peptides. Small. 2 (10), 1148-1152 (2006).
- Williams, A., Frasca, V., et al. UNIT 8.2 Ion-Exchange Chromatography. Current Protocols in Protein Science. Coligan, J. E., et al. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Hagel, L., et al. UNIT 8.3 Gel-Filtration Chromatography. Current Protocols in Protein Science. Coligan, J. E., et al. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Hou, X., Jones, B. T. Inductively coupled plasma-optical emission spectrometry. In Encyclopedia of Analytical Chemistry. Meyers, R.A. ed. , John Wiley & Sons, Ltd. 1 (2000).
- Correia Carreira, S., et al. Ultra-fast stem cell labelling using cationised magnetoferritin. Nanoscale. , (2016).
- Simon, G. H., et al. T1 and T2 relaxivity of intracellular and extracellular USPIO at 1.5 T and 3T clinical MR scanning. Eur. J. Radiol. 16 (3), 738-745 (2006).
- Jubb, A. M., Allen, H. C. Vibrational Spectroscopic Characterization of Hematite, Maghemite, and Magnetite Thin Films Produced by Vapor Deposition. ACS Appl. Mater. Interfaces. 2 (10), 2804-2812 (2010).
- Wang, Z. W., et al. High-pressure x-ray diffraction and Raman spectroscopic studies of the tetragonal spinel CoFe2O4. Phys. Rev. B. 68 (9), (2003).
- Wong, K. K., Douglas, T., Gider, S., Awschalom, D. D., Mann, S. Biomimetic synthesis and characterization of magnetic proteins (magnetoferritin). Chem. Mater. 10 (1), 279-285 (1998).
- Okuda, M., et al. Fe3O4 nanoparticles: protein-mediated crystalline magnetic superstructures. Nanotechnology. 23 (41), 415601 (2012).
- Perriman, A. W., Cölfen, H., Hughes, R. W., Barrie, C. L., Mann, S. Solvent-Free Protein Liquids and Liquid Crystals. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (34), 6242-6246 (2009).
- Billotey, C., et al. T-cell homing to the pancreas in autoimmune mouse models of diabetes: in vivo MR imaging. Radiology. 236 (2), 579-587 (2005).
- Smirnov, P., et al. In vivo cellular imaging of lymphocyte trafficking by MRI: a tumor model approach to cell-based anticancer therapy. Magn. Reson. Med. 56 (3), 498-508 (2006).
- Wilhelm, C., et al. Magnetic control of vascular network formation with magnetically labeled endothelial progenitor cells. Biomaterials. 28 (26), 3797-3806 (2007).
- MacLean, I., Sanders, E. Cationized ferritin and phosvitin uptake by coated vesicles of the early chick embryo. Anat. Embryol. 166 (3), 385-397 (1983).
- Van Deurs, B., Nilausen, K., Faergeman, O., Meinertz, H. Coated pits and pinocytosis of cationized ferritin in human skin fibroblasts. Eur. J. Cell Biol. 27 (2), 270-278 (1982).
- Xing, R. M., et al. Characterization and cellular uptake of platinum anticancer drugs encapsulated in apoferritin. J Inorg Biochem. 103 (7), 1039-1044 (2009).
- Wong, K. K., Mann, S. Biomimetic synthesis of cadmium sulfide-ferritin nanocomposites. Adv. Mater. 8 (11), 928-932 (1996).
