Abstract
Många viktiga biomedicinska tillämpningar, såsom cell imaging och fjärr manipulation, kan åstadkommas genom märkning av celler med superparamagnetiska järnoxidnanopartiklar (SPIONs). Att uppnå tillräcklig cellulärt upptag av SPIONs är en utmaning som traditionellt har mötts genom att exponera celler för förhöjda koncentrationer av SPIONs eller genom att förlänga exponeringstider (upp till 72 timmar). Emellertid dessa strategier kommer sannolikt att mediera toxicitet. Här presenterar vi syntesen av den proteinbaserade Spion magnetoferritin samt en enkel yta funktion protokoll som möjliggör snabb cell magnetisering använder låga koncentrationer exponering. Den Spion kärna magnetoferritin består av kobolt-dopade järnoxid med en medelpartikeldiameter av 8,2 nm mineraliserad inuti kaviteten av häst mjälte apo-ferritin. Kemisk katjonisering av magnetoferritin producerat en roman, starkt membran aktiv Spion som magnetiserade mänskliga mesenkymala stamceller (hMSCs) med hjälp av inkubationstider somkort som en minut och järnkoncentrationer som dalar som 0,2 mm.
Introduction
Yta bindning eller internalisering av superpara järnoxid nanopartiklar (SPIONs) har möjliggjort magnetisering av en mängd olika celltyper för tillämpningar som avbildning och fjärr manipulation. 1 Att uppnå tillräcklig cellulär magnetisering kan vara en utmaning, i synnerhet när interaktionen mellan Spion och cellytan är svag. 2 Under de senaste, långvarig exponering eller hög Spion koncentrationer har använts som strategier för att övervinna denna utmaning. 3,4 Trots dessa strategier är problematiska eftersom de ökar toxicitet 5,6 och har mycket begränsad framgång i celltyper med låg interna priser, såsom lymfocyter. 7 För att öka cellulärt upptag av SPIONs har flera ytfunktionalisering metoder undersökts. Exempelvis har antikroppar använts för att främja receptormedierad endocytos, 8 medan icke-specifikt upptag kan uppnås med användning transfektion ettgents 9,10 eller cellpenetrerande arter, såsom HIV tat-peptid. 11,12 emellertid antikropp och peptid funktionalise metoder begränsas av dyra reagens och komplexa syntetiska preparat, medan transfektion medel kan framkalla nanopartiklar nederbörd och påverka cellernas funktion. 13,14
Vi rapporterade nyligen syntesen av kemiskt katjoniserad magnetoferritin, en roman Spion som var mycket effektiva i magnetiserande humana mesenkyma stamceller (hMSCs) med användning av inkubationstider så korta som en minut. 15 Magnetoferritin syntetiseras genom att späda ut ett Spion inuti de-mineraliserade kavitet av järnlagringsprotein ferritin. 16 Denna proteinbaserad Spion kombinerar många egenskaper som gör den väl lämpad för cell magnetisering, såsom kontroll över de magnetiska egenskaperna hos den magnetiska kärnan, 17-19 och biokompatibilitet och vattenlöslighet är knutna till ett proteinskal. Ytterligaremer, är ytfunktionalisering lätt uppnås på grund av adresserbara aminosyror som kan vara kemiskt 20-22 eller genetiskt modifierade. 23-25 Vi har visat att kemisk katjonisering av de sura aminosyraresterna i proteinhöljet alstrar en stabil nanopartikel som lätt interagerade med anjoniska domäner på cellytan vilket leder till en snabb och ihållande cell magnetisering. Detta förfarande eliminerar behovet av mödosam funktionalisering och långa inkubationstider protokoll, och på grund av den icke-specifik mekanism märkning denna snabba magnetisering strategi bör finna utbredd tillämpning i andra celltyper. Här presenterar vi en djupgående rapport av den ultrasnabba cellmärkningsmetod, inklusive detaljerade protokoll för syntes, rening och yta funktionalisering av katjoniserad magnetoferritin.
Protocol
Humana mesenkymala stamceller (hMSC) skördades från den proximala lårbenet benmärgen hos osteoartrit patienter som genomgår höftledskirurgi, i full överensstämmelse med Bristol Southmead Hospital forskningsetisk kommitté riktlinjer (referens # 078/01) och efter patientens samtycke erhölls.
1. Magnetoferritin Syntes och rening
- Allmänna kommentarer
- Utföra magnetoferritin syntes i en förslutbar, dubbelmantlad reaktionskärl vid 65 ° C under kväveatmosfär för att begränsa oxidation av metall prekursorer. Injicera metallsaltlösningar och väteperoxid genom tillträdesöppningar i locket till reaktionskärlet med hjälp av en sprutpump.
- Efter magnetoferritin syntes, rena proteinet genom anjonbyteskromatografi (se avsnitt 1.4) för att avlägsna nanopartiklar inte är inneslutna i proteinet hålighet, följt av storlekssorterande kromatografi (se avsnitt 1.5) för att isolera protein monomerer. determine proteinkoncentration med hjälp av en Bradford-analys (se avsnitt 1.6).
- Förberedelser före syntes
- Deoxygenate 500 ml avjoniserat vatten genom att placera ett rör anslutet till en kvävgascylinder i vattnet, försegling av kärlet med plastfolie och bubblande genom kvävgas under ca 60 min.
- Värm ett vattenbad som är ansluten till dubbelmantlad reaktionskärlet till 65 ° C. Lägga 75 ml 50 mM 4- (2-hydroxietyl) -1-piperazinetansulfonsyra (HEPES) buffert (pH 8,6) in i reaktionskärlet, försegla kärlet och deoxygenate genom att bubbla kvävgas genom den buffertlösning under ca 20 min. Samtidigt, rör om buffertlösningen med användning av en magnetomrörare.
- Efter deoxygenering den HEPES-buffertlösning, att ta bort röret tillförsel av kvävgas från bufferten och hålla den upphängd i kärlet för att bibehålla en kvävgasatmosfär. Lägga apo-ferritin för att uppnå en slutkoncentration av 3 mg / ml. Fortsätt magnetomrörare, men minskar omrörningshastigheten om skumning uppträder.
- Bered en 25 mM stamlösning av koboltsulfat-heptahydrat genom upplösning 0,19 g i 50 ml deoxygenerat avjoniserat vatten.
- Bered en 25 mM lösning av ammoniumjärnsulfat hexahydrat lösning genom upplösning av 0,98 g i 100 ml deoxygenerat avjoniserat vatten.
- Ta bort 2,5 ml av ammoniumjärnsulfat hexahydrat lösning och ersätta med 2,5 ml av koboltsulfat heptahydrat.
- Framställ en 8,33 mM lösning av väteperoxid i deoxygenerat avjoniserat vatten genom att först sätta 965 pl av en väteperoxidlösning (30% vikt / vikt) till 9 ml deoxygenerat avjoniserat vatten och därefter tillsätta 1 ml av denna sub-lager till 99 ml av deoxygenerat avjoniserat vatten.
- Magnetoferritin syntes
- Injicera 10,1 ml för både järn-kobolt föregångare och väteperoxid samtidigt i apo-ferritin lösning (magnetiskt stirred) vid en flödeshastighet av 0,15 ml / min med användning av två sprutpump (total volym injicerad: 20,2 ml).
- Under injektionsperioden, deoxygenate ytterligare 500 ml avjoniserat vatten.
OBS: Innehållet i reaktionskärlet gradvis anta en mörkbrun färg när reaktionen fortskrider. - Strax före slutet av den första injektionen, förbereda ytterligare 100 ml av järn-kobolt föregångare och väteperoxidlösning med den nyligen deoxygenerat avjoniserat vatten.
- Upprepa injektionen steg som beskrivs i 1.3.1 med användning av nyberedda lösningar av järn-kobolt och väteperoxid.
- Under insprutningsperioden deoxygenate ytterligare 500 ml avjoniserat vatten, och fortsätt enligt beskrivningen i 1.3.3 och 1.3.4.
- Efter den tredje injektionen, lämnar lösningen att mogna under 15 min under omröring.
- Tillsätt 1,5 ml av en 1 M natriumcitratlösning till reaktionskärlet för att kelatera fria metalljoner i lösning.
- Avlägsna lösningen från reaktionenkärlet i 50 ml centrifugrör, centrifugera i 30 min vid 4350 xg och passera supernatanten genom ett 0,22 | j, m sprutfilter. I detta skede kan den filtrerade supernatanten lagras vid 4 ° C tills rening.
- Jonbyteskromatografi
- Ladda provet på en kolonn (2,5 cm diameter, 20 cm lång) som innehåller en katjonisk matris med användning av en peristaltisk pump med en flödeshastighet av 10 ml / min.
- Tvätta kolonnen med ca 100 ml körningsbuffert (50 mM Tris (hydroximetyl) aminometan (Tris) buffert, pH 8,0) med användning av en gradient pump vid en flödeshastighet av 10 ml / min.
- Att eluera proteinet, tvätta kolonnen med 10 ml / min med ökande koncentrationer av natriumklorid (NaCl) i Tris-buffert: 150, 500 och 1000 mM slutlig NaCl-koncentration, 150 ml av varje koncentration.
- Som proteinet eluerar vid en NaCl-koncentration av 500 mM, samla in det i 50 ml fraktioner med användning av en automatiserad fraktionsuppsamlare.
OBS: För endetaljerat protokoll av jonbyteskromatografi konsultera tidigare publicerade protokoll. 26
- Storleksuteslutningskromatografi
- Koncentrera de 150 ml magnetoferritin till en volym av ca 2 ml med användning av en 15 ml centrifugal filterenhet följt av en 4 ml volym enheten. Se tillverkarens anvisningar centrifugala filterenheterna (se materiallista) för ett detaljerat protokoll av detta förfarande.
- Ladda koncentrerades provet på en gelfiltreringskolonn med användning av en injektionsslinga.
- Tvätta kolonnen med rinnande buffert (50 mM Tris-buffert, pH 8,0, innehållande 150 mM NaCl) vid en flödeshastighet av 1,3 ml / min.
- Samla in 6 ml fraktioner med användning av en automatiserad fraktionsuppsamlare. Protein monomerer eluera sist. Vid denna punkt, kan renas magnetoferritin förvaras vid 4 ° C fram till katjonisering.
OBS: För ett detaljerat protokoll för gelkromatografi med användning av en gelfiltreringskolonn konsul previously publicerade protokoll. 27
- Fastställande proteinkoncentration
- Förbereda ferritin normer för 0,06, 0,125, 0,25, 0,5 och 1 mg / ml i 50 mM Tris-buffert med användning av kommersiellt tillgängliga häst mjälte ferritin.
OBS: Proteinkoncentrationen av kommersiellt tillgänglig ferritin anges på flaskan. Om inte, kontakta leverantören för denna information. - Späd magnetoferritin prover av okänd koncentration i 50 mM Tris-buffert till dess att lösningens färg matchar approximativt färgen på 0,5 mg / ml standard. Notera spädningsfaktorn.
- Tillsätt 10 | il av varje standard och magnetoferritin prov i triplikat i brunnar i en 96 brunnars platta.
- Tillsätt 200 pl färdiga Bradford reagens till varje brunn (se material lista för Bradford analysreagens detaljer).
- Inkubera vid rumstemperatur under 8 minuter.
- Mät absorbansen vid λ = 595 nm med användning aven mikroplattläsare.
- Plotta medelabsorbansen av de ferritin standarder som en funktion av proteinkoncentration och använda lutningen och skärningen av den linjära passar att beräkna koncentrationen av den magnetoferritin provet.
OBS: Ta hänsyn till spädningsfaktorn som används för att justera magnetoferritin provet till standardkurvan.
- Förbereda ferritin normer för 0,06, 0,125, 0,25, 0,5 och 1 mg / ml i 50 mM Tris-buffert med användning av kommersiellt tillgängliga häst mjälte ferritin.
2. Magnetoferritin katjonisering
- Allmänna kommentarer
OBS: För magnetoferritin katjonisering, N, N-dimetyl-1,3-propandiamin (DMPA) kopplad till asparaginsyra och glutaminsyrarester på MF ytan med användning av N - (3-dimetylaminopropyl) - N '-ethylcarbodiimide hydroklorid (EDC).- Utföra reaktionen vid rumstemperatur under omrörning. Det protokoll som anges nedan är för katjonisering av 10 mg magnetoferritin i en total volym av 5 ml (proteinkoncentration 2 mg / ml). Emellertid skalas upp eller nergenom att hålla proteinet: DMPA: EDC-förhållanden konsekvent, liksom volymer av bufferten och magnetoferritin lösning.
- Före katjonisering reaktionen, dialysera de magnetoferritin prover i 50 mM fosfatbuffert (pH 7) innehållande 50 mM NaCl. Detta är viktigt att ta bort Tris elueringsbuffert och undvika oönskade reaktioner mellan Tris amin och EDC-aktiverade karboxylsyrarester. Bestäm proteinkoncentrationen efter dialys och anpassa den till 4 mg / ml före katjonisering.
- katjonisering protokoll
- Väg upp 374 mg av DMPA och lös upp i 2,5 ml av 200 mM 2- (N morfolino) etansulfonsyra (MES) buffert.
- Justera lösningens pH till ca 7 med användning av koncentrerad (6 M) saltsyra (HCl).
VARNING: Utför detta steg i ett dragskåp, som tillsats av syran till DMPA avger giftiga ångor! - Tillsätt 2,5 ml magnetoferritin lösning vid 4 mg / ml (slutlig koncenstrering av MES är 100 mM, är slutkoncentrationen av magnetoferritin 2 mg / ml, är totala mängden protein 10 mg).
- Lägga till en magnetisk omrörare och rör om i 2 h för att uppnå jämvikt.
- Justera noggrant lösning till pH 5,0 med användning av 1 M HCl.
- Lägg 141 mg EDC pulver till DMPA / magnetoferritin lösning.
- Fortsätta omrörning i 3,5 h.
- Filtrera lösningen genom ett 0,22 | j, m sprutfilter för att avlägsna eventuella fällningar.
- Tillsätta lösningen till dialysrör med en 12 till 14 kDa molekylvikt cut-off och dialysera mot 4 liter 50 mM fosfatbuffert (pH 7) innehållande 50 mM NaCl under 2 dagar vid 4 ° C, som ersätter dialysbufferten minst tre gånger under denna period.
OBS: Vid denna punkt, kan katjoniserad magnetoferritin förvaras vid 4 ° C fram till vidare användning.
3. humana mesenkymala stamceller Märkning med katjoniserad Magnetoferritin
- Allmänna kommentarer
- Kultur celler som monolager med hjälp av 175 cm 2 kolvar och 20 ml odlingsmedium, som fylls var 3 - 4 dagar. Odlingsmedium bestod av Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM), innehållande 1000 mg / L glukos, 10% (volym / volym) fetalt bovint serum, 1% (volym / volym) penicillin / streptomycin-lösning, 1% (volym / volym) L alanyl-L-glutamin-lösning och 5 ng / ml färsk kompletterat human fibroblast tillväxtfaktor.
- Magnetisk märkning av hMSC med katjoniserad magnetoferritin
- Seed 150.000 hMSCs i 25 cm 2 kolvar och låt fästa över natten vid 37 ° C.
- Filtersterilisera katjoniserad magnetoferritin genom ett 0,22 | im sprutfilter och bestämma proteinkoncentrationen.
- Att hålla sterila förhållanden, förbereda en 0,5 iM lösning av katjoniserad magnetoferritenn i fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Håll tak i en steril kultur huva fram till användning.
- Tvätta de pläterade cellerna med 2 ml av rumstemperatur PBS.
- Tillsätt 1 ml av den steriliserade katjoniserad magnetoferritin lösning på de strukna cellerna och inkubera under den önskade tidsperioden (1 min till 1 h).
- Tvätta cellerna med PBS, och sedan skörda celler genom att tillsätta 0,5 ml av trypsin / etylendiamintetraättiksyra (EDTA) och inkubering vid 37 ° C under 5 min.
- Tillsätt 1 ml odlingsmedium för att inaktivera trypsin / EDTA, överför lösningen till en 15 ml centrifugrör och centrifugera i 5 minuter vid 524 x g.
- Kassera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 0,5 ml magnetisk separering buffert, bestående av 0,5% (vikt / volym) fetalt bovint serum och 2 mM EDTA i PBS.
- Magnetisk cellseparation
- Fäst magneten på flera montern, och lägg till en magnetisk separationskolonn till magneten. Placera en pre-separationsfilter på the kolumnen.
- Placera 0,5 ml av magnetisk separation buffert i pre-separationsfilter och låt den gå igenom både filtret och kolonnen för att tvätta och fukta dem.
- Placera ett 15 ml centrifugrör under kolumnen.
- Tillsätt 0,5 ml av cellsuspensionen i filterbehållaren av den magnetiska separationskolonnen.
- När behållaren är tom, tillsätt 0,5 ml av magnetisk separation buffert.
- När behållaren är tom, tillsätt ytterligare 0,5 ml magnetisk separation buffert.
- Upprepa en gång till (den totala volymen av magnetseparation-buffert användes för tvättning bör vara 1,5 ml). Detta tvättsteg eluerar alla icke-magnetiserade celler från kolonnen (icke-magnetiserade cellfraktionen).
- Ta kolonnen från magneten och placera den i en ny 15 ml centrifugrör. Ta bort filtret från kolonnen reservoaren.
- Tillsätt 1 ml magnetisk separation buffert till reservoaren och omedelbart driva igenom kolonnen med användning av kolven tillhandahålls av tillverkningenr. Detta eluerar de magnetiserade celler från kolonnen i centrifugröret (magnetiseras cellfraktion).
- Centrifugera båda rören i 5 minuter vid 524 x g.
- Kassera supernatanten och återsuspendera cell pellets i 0,3 ml PBS.
- Räkna antalet celler nummer i varje fraktion med hjälp av en hemocytometer.
- Bestämma fraktionen av magnetiserade celler, M (%), med användning av följande ekvation:
där n (M) är antalet celler i den magnetiserade fraktionen och n (M + NM) är summan av antalet celler i de magnetiserade och icke-magnetiserade fraktioner.
- Förbereda hMSCs märkta med katjoniserad magnetoferritin för järn kvantifiering med hjälp av induktivt kopplad plasma optisk emissionsspektroskopi (ICP-OES)
OBS: Protokollet kan behöva anpassas för andra ICP-OES instrument. Det är lämpligt att höra med återansvarig tekniker.- Centrifugera ett känt antal celler i 5 min vid 524 x g.
- Avlägsna PBS supernatanten och tillsätt 0,25 ml av 50% (volym / volym) salpetersyra.
- Vortex blanda den surgjorda cellsuspensionen.
- Inkubera vid rumstemperatur över natten.
- Lägg 4,75 ml destillerat vatten till varje prov och virvelblandning.
- Analysera med ICP-OES. 28
- Normalisera uppmätta järnhalten till det antal celler för att bestämma ett värde för cellulär järnhalt.
Representative Results
TEM användes för att bekräfta nanopartikel mineralisering inuti apoferritin hålrummet och fastställa den genomsnittliga kärnstorleken (figurerna 1A och 1B). Bildanalys av ofärgade magnetoferritin prover gav en medelkärndiameter av 8,2 ± 0,7 nm, och aurotioglukos fläck bekräftade närvaron av nanopartiklar inuti proteinet bur. Notera att bilderna visar en magnetoferritin prov som renades ytterligare med användning av magnetisk separation för att isolera enhetliga nanopartikelkärnor. Magnetoferritin prover som inte magnetiskt renade har en något bredare kärnstorleksfördelning. 29 Analys av strukturen av magnetoferritin kärnan med användning av utvalda-område elektrondiffraktion indikerade den möjliga närvaron av den inversa spinellstrukturen baserat på magnetit (Fe 3 O 4) och / eller maghemit (γ-Fe 2 O 3), liksom den spinellstruktur grund av Co 3 4. Vidare avslöjade Raman-spektra toppar som tillskrivs Fe 3 O 4, små mängder av γ-Fe 2 O 3, och en kobolt ferrit (figur 1 C). ICP-OES analys av magnetoferritin visade ett genomsnitt på 102 mikrogram av järn och 0,9 mikrogram av kobolt per milligram magnetoferritin.
En schematisk ingår, som illustrerar det efterföljande katjonisering steget (figur 2 A). Den hydrodynamiska diametern hos magnetoferritin och katjoniserad magnetoferritin var 11,8 ± 1,1 nm och 12,5 ± 1,4 nm, respektive, såsom bestämt genom dynamisk ljusspridning. Katjoniseringen effektiviteten av kovalent DMPA-koppling till magnetoferritin bedömdes med användning zeta potentiometri och matrisassisterad laserdesorptionsjonisering time-of-flight (MALDI-TOF) masspektrometri. Zeta-potentialen förändrades från -10,5 mV för MF till + 8,3 mV för katjoniserad magnetoferritin, bekräftar enändra i ytpotential från negativ till positiv (tabell 1). Masspektrometri experiment hittat en subenhet molekylvikt på 20,1 kDa för nativt apo-ferritin och 21,1 kDa för katjoniserad apo-ferritin (Figur 2 B). Denna massa Ökningen motsvarar cirka 12 kopplade DMPA molekyler per protein subenhet, och katjonisering av 288 rester på hela 24-subenhet-protein.
Magnetisk mättnad och känslighet mättes med hjälp av SQUID magnetometri, och tvärgående och längsgående relaxa mättes med hjälp av magnetisk resonanstomografi. Magnetiska egenskaper var likartade för magnetoferritin och katjoniserad magnetoferritin, vilket indikerar att katjonisering hade försumbar inverkan på de magnetiska egenskaperna hos den inneslutna Spion (tabell 1). Dessutom är dessa egenskaper liknar andra järnoxid baserade nanopartiklar, 19,30 som visar att katjoniserad Magnetoferritin skulle vara lika lämpliga som konventionella Spion-baserade MRI-kontrastmedel för att förbättra avbildning kontrast.
Efter en 30-minuters exponering, var cellytan tätt täckt med katjoniserad magnetoferritin (figur 3 A). Men efter en vecka, fanns inga nanopartiklar som finns på cellytan (figur 3 B). Katjoniserad magnetoferritin var anmärkningsvärt effektiv vid magnetiskt märknings hMSCs. Notably, exponering av cellerna för katjoniserad magnetoferritin under en minut gav magnetiseringen av 92% av cellpopulationen och leveransen av 3,6 pg av järn per cell. Öka inkubationstiden till 15 minuter resulterade i magnetiseringen av hela cell-populationen (figur 3 C).
Figur 1: Karakterisering av magnetof erritin kärnor som dopats med 5% kobolt. TEM-bilder av magnetoferritin färgade med aurotioglukos (A) och ofärgade (B). Infällda bilden visar motsvarande elektron diffraktion med magnetit index. Skala bar: 20 nm. (C) Raman-spektrum för magnetoferritin. Pilarna anger de viktigaste Raman vibrationslägen för kobolt ferrit (T 2g), magnetit och maghemit (både A 1 g). 31,32 Lasern våglängd som användes var 532 nm. (Bild anpassat från Okuda et al. 18). Observera att detta magnetoferritin provet hade renats ytterligare med hjälp av magnetisk separation, som isolerats jämnt belastade magnetoferritin partiklar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
785fig2.jpg "/>
Figur 2: katjonisering av magnetoferritin. A) Lösningsmedels åtkomliga yta representationer som visar fördelningen av sura (röd) och basiska (gula) aminosyrarester på proteinet ytan. Magnetoferritin (1) modifieras till katjoniserad magnetoferritin (2) genom karbodiimid-förmedlad tvärbindning av DMPA till sura aminosyrarester på proteinet ytan (3). B) Masspektrometri analys av apo-ferritin och katjoniserade apo-ferritin subenheter. Mass-till-laddning (m / z) spektrum av apoferritin (ApoF) och katjoniserad apoferritin (cat-ApoF) som genereras av MALDI-TOF. En viktökning från 20,1 kDa till 21,1 kDa observeras efter katjonisering. (Bild anpassad från Correia Carreira et al. 15) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: magnetisk märkning och cellseparation av hMSCs inkuberade med katjoniserad magnetoferritin. A) TEM bild av hMSCs efter en 30-minuters inkubation med katjoniserad magnetoferritin. Pilen indikerar närvaron av magnetoferritin kärnor tätt packade på cellytan. Skalstrecken: 200 nm. B) TEM bild av hMSC en vecka efter märkning. Cellytan är fri från katjoniserad magnetoferritin. C) Undersöka snabba magnetisk märkning: 92% av cellpopulationen var magnetiseras efter en minuts exponering med 0,5 iM katjoniserade magnetoferritin, och hela cellpopulationen magnetiseras inom 15 minuter. Järnhalt per cell bestämdes under användning av ICP-OES. Genomsnitt och standardavvikelse från tre biologiska replikat visas. (Bild anpassad från Correia Carreira et al. 15) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| MF | cat-MF | |
| Hydrodynamisk diameter [nm] | 11,8 ± 1,1 | 12,5 ± 1,4 |
| Zeta potential [mv] | (-) 10,4 ± 0,2 | 8,3 ± 0,7 |
| Magnetisk mättnad ögonblick [Am 2 kg -1] | 54,9 ± 1,6 | 55,3 ± 1,4 |
| Mass susceptibility [x 10 4 m 3 kg -1] | 1,75 ± 0,08 | 1,75 ± 0,07 |
| Längsgående relaxiviteten [mM -1 sek -1] | 2,6 ± 0,1 | 2,3 ± 0,1 |
| Tvärgående relaxiviteten [mM -1 sek -1] | 44,6 ± 1,0 | 52,8 ± 0,8 |
Tabell 1: Fysikalisk karakterisering av magnetoferritin (MF) och katjoniserad magnetoferritin (katt-MF). (Tabell anpassat från Correia Carreira et al. 15)
Discussion
TEM av magnetoferritin prover som färgats med aurotioglukos avslöjade framgångsrik mineralisering av nanopartiklar inne i proteinet bur. Elektrondiffraktion och Raman-analys av nanopartikelkärnan angav närvaron av en kobolt ferrit, vilket indikerar framgångsrik dopning av nanopartikelkärnan med kobolt. Detta visar att blandade oxidnanopartiklar framgångsrikt kan vara mineralis inom apo-ferritin hålighet. Vidare har vi visat tidigare att kobolt dopning kan varieras genom att förändra mängden av kobolt prekursor sättas till reaktionsblandningen, som möjliggör inställning av de magnetiska egenskaperna. 18
Magnetoferritin syntes kan utföras i en mängd olika fartyg, så länge som de är tätt förslutbar och har åtkomstöppningar, genom vilka reaktanter kan införas (t.ex. en tre-halsad rundbottnad kolv). Reaktionstemperaturen bör hållas vid 65 ° C antingen genom att placera kärlet ien vatten / oljebad eller med hjälp av en dubbel-mantlat kärl. Här har vi använt en dubbel-mantlad elektrokemisk cell setup för att utföra syntesen. För att garantera lyckad syntes, upprätthålla rätt pH och undvika förorening syre i vattenlösningar är avgörande. Metallsaltlösningar ska alltid beredas före användning snarare än i förväg. Dessutom kan kommersiella apoferritin lösningar varierar i kvalitet och påverka syntes resultatet (eg., Storleken av nanopartiklar kärna mineraliserad). Det kan hjälpa att dialysera den apoferritin lösningen i 50 mM HEPES-buffert (pH 8,6) före syntes för att avlägsna eventuellt kvarvarande reduktionsmedel som används av tillverkaren. Det är lämpligt att göra en del av batchnummer apo-ferritin lösning som används för syntes, så det kan vara specifikt begäras från tillverkaren skall ytterligare material måste köpas. Dessutom bör proteinkoncentrationen av kommersiellt tillgängliga apo-ferritin anges på flaskan, som kananvändas för att beräkna volymen av apo-ferritin lösning behövs för syntes. Om så inte är fallet, kontakta leverantören för denna information.
Fördelen med gradvis tillsats av metallsalter och väteperoxid - som presenteras här och i tidigare rapporter - är att mineralisering av den nanopartikelkärnan kan styras så att olika belastningsfaktorer (dvs nanopartiklar storlekar) kan uppnås. 33 Vidare är det möjligt att rena magnetoferritin ytterligare med användning av en magnetisk separationskolonn, t.ex. en kolonn packad med rostfritt pulverstål fäst inuti en elektromagnet. 34 Sålunda kan mycket monodispersa nanopartiklar kärnor isoleras från bulk magnetoferritin provet. Men för magnetisk cellmärkning som presenteras här detta är inte nödvändigt. En begränsning med magnetoferritin syntes är den relativt låga syntesutbyte av ca 10%, och den relativt höga kostnaden för kommersiellt apo-ferritin lösningar. Emellertid kan apo-ferritin också framställas från billigt tillgängliga häst mjälte ferritin genom att följa etablerade de-mineraliseringsprotokoll. 16
Katjonisering av magnetoferritin uppnåddes genom att tillsätta ett molförhållande av 250 molekyler av DMPA och 50 molekyler av EDC per negativt laddad rest (beräkningar baserade på aminosyrasekvensen av häst mjälte ferritin). Detta överskott av reagens över protein resulterade i höga katjonisering effektivitet, jämförbar också att tidigare rapporterade resultat för katjonisering av ferritin. 35 För MALDI-TOF-analys, apoferritin och katjoniserad apoferritin användes på grund av det alltför stora molekylvikt av magnetoferritin kärnan. För att ge höga katjonisering effektivitet, är optimalt pH också avgörande. EDC-medierad tvärbindning är mest effektiv under milt sura betingelser, och vi fann att pH 5 gav optimala katjonisering resultat för magnetoferritin. Men för andra proteiner cationization pH kan behöva optimeras. Katjonisering vid eller nära den isoelektriska punkten av proteinet bör undvikas, eftersom detta kan leda till allvarlig utfällning.
Stamcells magnetisering med katjoniserad magnetoferritin var effektiv och kan uppnås med hjälp av inkubationstider väl under 30 minuter. Även en minut inkubation resulterade i ett cellulärt järnhalt av 3,6 pg, som ligger inom det rapporterade intervallet som krävs för att påverka T2 och T2 * kontrast för MRI. 36,37 Det är också anmärkningsvärt att denna effektiva märkning uppnås med låga extracellulära järnkoncentrationer. Till exempel, tidigare studier med anjoniska nanopartiklar rapporterar järnnivåer 10 pg per cell efter 30 minuters inkubationstid med 5 mM järn. 38 I jämförelse, inkubation med en katjoniserad magnetoferritin lösning innehållande 0,5 | iM protein motsvarar inkubation med cirka 0,2 mM järn och även ger cirka 10 pg av järn per cell efter 30 minuter. Vi kunde inte klart identifiera endocytotisk vesiklar med hjälp av TEM. Men tidigare studier med katjoniserad ferritin fann att internalisering inträffade inom de första tio minuterna av exponering. 39,40 katjoniserade ferritin kunde lokaliseras i belagda vesikler, vilket indikerar clathrin- eller caveolin beroende endocytos. Samma studier rapporterade också att efter 30 minuters inkubation, katjoniserad ferritin var fortfarande närvarande på cellytan, liksom i multivesikulära organ, liknar lysosomer.
Ytterligare tillämpningar kan omfatta katjonisering av apo-ferritin burar laddade med andra nanopartiklar och / eller funktionella molekyler, såsom läkemedel mot cancer 41 eller kvantprickar 42. Katjonisering av dessa ferritin konstruktioner kan resultera i snabbare och mer effektiv leverans av sin last till celler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Fisher Scientific | BPE310-1 | powder; prepare a 1 M stock solution at pH 8.6 and dilute to 50 mM prior to use. Check the pH carefully prior to synthesis! |
| apoferritin from equine spleen | Sigma Aldrich | A3641 | we used LOT# 081M7011V |
| cobalt sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | C6768 | prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis |
| ammonium iron sulphate hexahydrate | Sigma Aldrich | F1543 | prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis |
| hydrogen peroxide solution (30%) | Sigma Aldrich | 216763 | prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis |
| sodium citrate | Sigma Aldrich | S1804 | powder; a 1 M solution can be prepared and kept at room temperature for several months |
| Millex GP filter unit, 0.22 micron | Merck Millipore | SLGP033RS | syringe filter |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | powder; prepare a 1 M stock solution at pH 8.0 and dilute to 50 mM prior to use |
| sodium chloride | Sigma Aldrich | 31434 | poweder; add to buffers as required |
| Centriprep centrifugal filter units | Merck Millipore | 4310 | Ultracel YM-50 membrane, 12 ml volume; use for initial concentration until the magnetoferritin solution has been concentrated from about 150 ml to 20 ml |
| Amicon Ultra-4 centrifugal filter untis | Merck Millipore | UFC801024 | Ultracel-10 membrane, 4 ml volume; use to concentrate magnetoferritin solution from about 20 ml to 2 ml |
| ANX Sepharose 4 Fast Flow | GE Healthcare | 17-1287-04 | we packed this column ourselves |
| HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR column | GE Healthcare | 17-1196-01 | this column was bought ready packed |
| ÄKTA purifier system | GE Healthcare | 28406264 | |
| sample pump P-960 | GE Healthcare | 18-6727-00 | load sample at a flow rate of 10 ml/min |
| automated fraction collector Frac-950 | GE Healthcare | 18-6083-00 | |
| Bradford assay reagent | Sigma Aldrich | B6916 | solution ready to use |
| Ferritin, Type I: from horse spleen | Sigma Aldrich | F4503 | prepare ferritin standards from this solution to determine magnetoferritin concentration |
| N,N-dimethyl-1,3-propanediamine (DMPA) | Sigma Aldrich | 308110 | CAUTION: when adjusting the pH of a DMPA solution, perform this step in a fume hood |
| N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma Aldrich | E6383 | keep in freezer but bring to room temperature before opening the bottle |
| 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | AppliChem | A0689,0500 | powder; prepare a 200 M stock solution at pH 5 |
| dialysis tubing cellulose membrane | Sigma Aldrich | D9652 | soak 10 min in deionized water before use |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), 1,000 mg/L glucose | Sigma Aldrich | D5546 | warm in 37 °C water bath before use |
| fetal bovine serum | Sigma Aldrich | F7524 | add to stock DMEM bottle, 10% (v/v) final concentration |
| penicillin/streptomycin solution | Sigma Aldrich | P0781 | add to stock DMEM bottle, 1% (v/v) final concentration |
| glutamax solution | Gibco | 35050-087 | add to stock DMEM bottle, 1% (v/v) final concentration |
| human fibroblast growth factor | PeproTech | 100-18B | add to DMEM freshly into cell culture flask with each media change; final concentration 5 ng/ml |
| phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | D8537 | sterile solution, for cell cultrue |
| trypsin/EDTA solution | Sigma Aldrich | E5134 | keep in freezer and defrost in 37 °C water bath before use |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E5134 | powder; make a 2 mM solution in PBS |
| bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7030 | add 0.5% (w/v) into 2 mM EDTA solution in PBS; carefully stir with magnetic stirrer, avoid foaming; filter sterilize through a 0.22 micron syringe filter |
| MACS multi stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | for attachment of MACS magnet |
| MACS MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | disposable; intended for single use, but if sterility is not required, they can re-used: wash with deionized water and 100% ethanol, and placed in a drying oven; discard if you observe rusty patches |
| MiniMACS separator magnet | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | can be bought as a starter kit, together with columns and stands |
| MACS column pre-separation filter | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | 30 mm filter |
| Nitric acid solution, 64-66% | Sigma Aldrich | 7006 | |
| Titrando 907, syringe pump | Metrohm | 2.907.0020 | |
| Equipment used to characterize magnetoferritin and cationized magnetoferritin | |||
| SpectraMax M5 | Molecular Devices | Used to measure absorbance in the Bradford assay | |
| JEM 1200 EX | JEOL | Used for TEM imaging of magnetoferritin | |
| InVia Raman spectrometer | Renishaw | Used for Raman spectroscopy | |
| Torus DPSS laser | Laser Quantum | Used for Raman spectroscopy | |
| Bruker UltrafleXtreme | Applied Biosystems | Used for MALDI-TOF analysis of apoferritin and cationized apoferritin | |
| ZetaSizer Nano-ZS | Malvern Instruments | Used to measure hydrodynamic diameter and zeta potential of magnetoferritin and cationized magnetoferritin | |
| Magnetic Property Measurement System | Quantum Design | Used to measure magnetic saturation moment and magnetic susceptibility | |
| Magnetom Skyra | Siemens | Used to determine longitudinal and transverse relaxivity | |
| Tecnai 12 BioTwin Spirit | FEI | Used for TEM imaging of hMSC labeled with cationized magnetoferritin | |
| 710 ICP-OES | Agilent | Used to determine iron content in cells | |
References
- Gupta, A. K., Gupta, M. Synthesis and surface engineering of iron oxide nanoparticles for biomedical applications. Biomaterials. 26 (18), 3995-4021 (2005).
- Decuzzi, P., Ferrari, M. The role of specific and non-specific interactions in receptor-mediated endocytosis of nanoparticles. Biomaterials. 28 (18), 2915-2922 (2007).
- Cunningham, C. H., et al. Positive contrast magnetic resonance imaging of cells labeled with magnetic nanoparticles. Magn. Reson. Med. 53 (5), 999-1005 (2005).
- Song, H. T., et al. Surface modulation of magnetic nanocrystals in the development of highly efficient magnetic resonance probes for intracellular labeling. J. Am. Chem. Soc. 127 (28), 9992-9993 (2005).
- Daldrup-Link, H. E., et al. Targeting of hematopoietic progenitor cells with MR contrast agents. Radiology. 228 (3), 760-767 (2003).
- Singh, N., Jenkins, G. J., Asadi, R., Doak, S. H. Potential toxicity of superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION). Nano Rev. 1, (2010).
- Dodd, S. J., et al. Detection of single mammalian cells by high-resolution magnetic resonance imaging. Biophys. J. 76 (1), 103-109 (1999).
- Ahrens, E. T., Feili-Hariri, M., Xu, H., Genove, G., Morel, P. A. Receptor-mediated endocytosis of iron-oxide particles provides efficient labeling of dendritic cells for in vivo MR imaging. Magn. Reson. Med. 49 (6), 1006-1013 (2003).
- Arbab, A. S., et al. Efficient magnetic cell labeling with protamine sulfate complexed to ferumoxides for cellular MRI. Blood. 104 (4), 1217-1223 (2004).
- Bulte, J. W. M., et al. Magnetodendrimers allow endosomal magnetic labeling and in vivo tracking of stem cells. Nat. Biotechnol. 19 (12), 1141-1147 (2001).
- Josephson, L., Tung, C. H., Moore, A., Weissleder, R. High-efficiency intracellular magnetic labeling with novel superparamagnetic-tat peptide conjugates. Bioconjugate Chem. 10 (2), 186-191 (1999).
- Lewin, M., et al. Tat peptide-derivatized magnetic nanoparticles allow in vivo tracking and recovery of progenitor cells. Nat. Biotechnol. 18 (4), 410-414 (2000).
- Hunter, A. C. Molecular hurdles in polyfectin design and mechanistic background to polycation induced cytotoxicity. Adv. Drug Delivery Rev. 58 (14), 1523-1531 (2006).
- Montet-Abou, K., Montet, X., Weissleder, R., Josephson, L. Cell internalization of magnetic nanoparticles using transfection agents. Mol. Imaging. 6 (1), 1-9 (2007).
- Correia Carreira,, S,, et al. Ultra-fast stem cell labelling using cationised magnetoferritin. Nanoscale. 8 (14), 7474-7483 (2016).
- Meldrum, F. C., Heywood, B. R., Mann, S. Magnetoferritin: in vitro synthesis of a novel magnetic protein. Science. 257 (5069), 522-523 (1992).
- Klem, M. T., et al. Synthetic control over magnetic moment and exchange bias in all-oxide materials encapsulated within a spherical protein cage. J. Am. Chem. Soc. 129 (1), 197-201 (2007).
- Okuda, M., Eloi, J. C., Sarua, A., Jones, S. E. W., Schwarzacher, W. Energy barrier distribution for dispersed mixed oxide magnetic nanoparticles. J. Appl. Phys. 111 (7), (2012).
- Uchida, M., et al. A human ferritin iron oxide nano-composite magnetic resonance contrast agent. Magn. Reson. Med. 60 (5), 1073-1081 (2008).
- Danon, D., Skutelsk E, M. arikovsY., Goldstei, L. Use of Cationized Ferritin as a Label of Negative Charges on Cell Surfaces. J. Ultrastruc. Res. 38 (5-6), 500-510 (1972).
- Valero, E., et al. Magnetic Nanoparticles-Templated Assembly of Protein Subunits: A New Platform for Carbohydrate-Based MRI Nanoprobes. J. Am. Chem. Soc. 133 (13), 4889-4895 (2011).
- Zborowski, M., et al. Immunomagnetic isolation of magnetoferritin-labeled cells in a modified ferrograph. Cytometry. 24 (3), 251-259 (1996).
- Ikezoe, Y., et al. Growth of Giant Two-Dimensional Crystal of Protein Molecules from a Three-Phase Contact Line. Langmuir. 24 (22), 12836-12841 (2008).
- Uchida, M., et al. Targeting of cancer cells with ferrimagnetic ferritin cage nanoparticles. J. Am. Chem. Soc. 128 (51), 16626-16633 (2006).
- Yamashita, K., et al. Selective nanoscale positioning of ferritin and nanoparticles by means of target-specific peptides. Small. 2 (10), 1148-1152 (2006).
- Williams, A., Frasca, V., et al. UNIT 8.2 Ion-Exchange Chromatography. Current Protocols in Protein Science. Coligan, J. E., et al. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Hagel, L., et al. UNIT 8.3 Gel-Filtration Chromatography. Current Protocols in Protein Science. Coligan, J. E., et al. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Hou, X., Jones, B. T. Inductively coupled plasma-optical emission spectrometry. In Encyclopedia of Analytical Chemistry. Meyers, R.A. ed. , John Wiley & Sons, Ltd. 1 (2000).
- Correia Carreira, S., et al. Ultra-fast stem cell labelling using cationised magnetoferritin. Nanoscale. , (2016).
- Simon, G. H., et al. T1 and T2 relaxivity of intracellular and extracellular USPIO at 1.5 T and 3T clinical MR scanning. Eur. J. Radiol. 16 (3), 738-745 (2006).
- Jubb, A. M., Allen, H. C. Vibrational Spectroscopic Characterization of Hematite, Maghemite, and Magnetite Thin Films Produced by Vapor Deposition. ACS Appl. Mater. Interfaces. 2 (10), 2804-2812 (2010).
- Wang, Z. W., et al. High-pressure x-ray diffraction and Raman spectroscopic studies of the tetragonal spinel CoFe2O4. Phys. Rev. B. 68 (9), (2003).
- Wong, K. K., Douglas, T., Gider, S., Awschalom, D. D., Mann, S. Biomimetic synthesis and characterization of magnetic proteins (magnetoferritin). Chem. Mater. 10 (1), 279-285 (1998).
- Okuda, M., et al. Fe3O4 nanoparticles: protein-mediated crystalline magnetic superstructures. Nanotechnology. 23 (41), 415601 (2012).
- Perriman, A. W., Cölfen, H., Hughes, R. W., Barrie, C. L., Mann, S. Solvent-Free Protein Liquids and Liquid Crystals. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (34), 6242-6246 (2009).
- Billotey, C., et al. T-cell homing to the pancreas in autoimmune mouse models of diabetes: in vivo MR imaging. Radiology. 236 (2), 579-587 (2005).
- Smirnov, P., et al. In vivo cellular imaging of lymphocyte trafficking by MRI: a tumor model approach to cell-based anticancer therapy. Magn. Reson. Med. 56 (3), 498-508 (2006).
- Wilhelm, C., et al. Magnetic control of vascular network formation with magnetically labeled endothelial progenitor cells. Biomaterials. 28 (26), 3797-3806 (2007).
- MacLean, I., Sanders, E. Cationized ferritin and phosvitin uptake by coated vesicles of the early chick embryo. Anat. Embryol. 166 (3), 385-397 (1983).
- Van Deurs, B., Nilausen, K., Faergeman, O., Meinertz, H. Coated pits and pinocytosis of cationized ferritin in human skin fibroblasts. Eur. J. Cell Biol. 27 (2), 270-278 (1982).
- Xing, R. M., et al. Characterization and cellular uptake of platinum anticancer drugs encapsulated in apoferritin. J Inorg Biochem. 103 (7), 1039-1044 (2009).
- Wong, K. K., Mann, S. Biomimetic synthesis of cadmium sulfide-ferritin nanocomposites. Adv. Mater. 8 (11), 928-932 (1996).
