Abstract
マウスモデルにおける遺伝物質の心筋送達を通して、特定の遺伝子の発現または活性を制御する遺伝子機能の調査を可能にします。心臓におけるそれらの治療可能性を決定することもできます。マウス心臓におけるin vivo分子介入のための限られたアプローチがあります。組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）ベースのゲノム工学は、インビボ心臓遺伝子操作のための不可欠なツールとして利用されています。この技術の具体的な利点は、最小の高効率、高特異性、低ゲノム組込み率を含みます 免疫原性、および最小の病原性。ここでは、パッケージを構築し、rAAV9ベクターを精製するための詳細な手順を説明します。新生児の仔へrAAV9の皮下注射は、肝臓や他の組織に強い発現またはマウス心臓における目的の遺伝子（複数可）の効率的なノックダウンになりますが、ありません。心臓仕を使用しましたC TnnT2プロモーター、心臓におけるGFP遺伝子の高発現が得られました。さらに、rAAV9-U6-shRNAをを利用したときにmRNAが中心部に阻害されたターゲット。 rAAV9技術の知識を作業は、心血管の研究に有用であり得ます。
Introduction
様々な生物学的システムにおける特定の遺伝子の発現または活性を制御する遺伝子機能1の研究に貴重な戦略となっています。この目標を達成する直接的な手段は、ヌクレオチド配列を操作し、突然変異対立遺伝子を生成することです。生きた細胞のゲノムに正確な、ターゲットに変更を加えることはまだですが、 時間がかかり、労働集約的な練習、強力なTALENおよびCRISPR / Cas9ツールの開発は、ゲノム編集2-5の新時代を開きました。遺伝子操作のためのより多くのルーチンの実験室方法は、対象1,6の遺伝子（複数可）を発現またはノックダウンするために細胞に遺伝物質（DNAおよびコード配列またはsiRNAを/ shRNAを含有するRNA）の導入に焦点を当ててきました。
多くの場合、遺伝子操作のための主要なボトルネックは、細胞へのDNA、RNA、またはタンパク質の送達です。 in vitro試験、効率的なtransfectiに関してシステム上の多くの培養細胞株で確立されています。しかし、特に、マウスモデルにおいて、 インビボでの遺伝子送達は、より困難です。外因性の試薬の効率的な細胞取り込みを達成するためにバイパスする必要が細胞外および細胞内の障壁のシリーズがあります。追加の障害物は、急速なクリアランスと納入材料7,8の短い期間が含まれます。これらの問題を回避する1つの戦略は、 インビボ遺伝子送達のための「担体」または「ビヒクル」としてウイルスベクターを使用することです。ウイルスの自然に進化した伝達特性は、細胞7,9,10への目的の遺伝子の効率的な送達を可能にします。ウイルスベクターの多くのタイプが開発されたマウスにおける異なる細胞型および器官におけるインビボ遺伝子操作で柔軟可能にされています。
最も一般的に使用されるウイルス系は、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス（AAV）を含みます
これらの異なるタイプと比較してウイルスベクターのSは、組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）は、理想的な遺伝子送達系21,22であるように見えます。それは、最小限の免疫原性および病原性23,24を示します。また、rAAVのは、分割および非分裂細胞の両方を含む広範囲の細胞型に感染します。ほとんどの場合、のrAAVは、宿主ゲノムに組み込まれません。従って、標的細胞における望ましくない遺伝子またはゲノムの変化の危険性が低い22です。
最近では、rAAVのシステムが正常マウス心筋23,25-29にタンパク質をコードするDNA、miRNAは、shRNAは、およびCRISPR-gRNAsのインビボ送達のために使用されています。この方法論は、心血管研究の分野における基本的な調査と遺伝子治療の研究を容易にしました。ここでは、詳細な手順を効率的に記述された過剰発現またはマウス心臓における目的の遺伝子をノックダウンrAAV9ベクトルを生成します。プロトコルは、簡単かつ効果的な方法を提供しますマウス実験モデルにおける心臓遺伝子発現を操作します。
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Protocol
すべての記載されたステップは、バイオセーフティ委員会とボストン小児病院の施設内動物管理使用委員会によって承認されたプロトコルの下で行われました。ボストン小児病院は、規制明/暗サイクル、室温調節器が病原体を含まないマウス施設を併設しています。獣医や動物のケアスタッフの変更ケージとマウスの健康を確保します。施設はAAALAC認定され、アクティブな動物福祉保証の認証（AAALACの認定は1992年2月24日に付与された動物福祉保証番号。：A3303-01）を有しています。マウスには、圧縮ガス源から送達CO 2により安楽死させました。組織サンプルは、心拍数、動き、動物の呼吸が止まったことを確認した後に採取しました。新生児げっ歯類は、CO 2安楽死に耐性があると鋭いハサミを使用して断頭により安楽死させました。これらの方法は、アメリカの獣医メディカの安楽死に関するパネルの勧告と一致していますリットル協会。
プラスミド骨格へのcDNAまたはshRNA発現カセットをクローニングすることによってrAAV9構築物の1世代
注：rAAV9プラスミド、AAV2の逆方向末端反復配列（ITR）を含有する、遺伝子の過剰発現のために使用されるニワトリTNNT2を保有するように改変されています 形質導入された遺伝子25,26,29の心筋細胞特異的な発現を可能にするプロモーター（rAAV9.cTNT）、。ユニークなNheIおよびKpnI部位は、プロモーターの下流に、プラスミドに導入されています。関心対象の遺伝子をコードするcDNA断片を、これら2つの制限部位25,26,29を用いrAAV9バックボーンにクローニングすることができます。ここでは、一例として、マウス心臓におけるGFP遺伝子の過剰発現のためにrAAV9ベクターを作製しました。得られたプラスミドは、2 ITRのサイト（ 図1）によって隣接cTnTの:: GFPカセットを含みます。 rAAV9.U6 ::のshRNA構築物25をノックダウンする遺伝子に使用しました。使用したデザインのshRNAオンラインのshRNAの設計・サーバー。 rAAV9.U6 ::のshRNAは、「シームレス」アニールによりおよびU6プロモーターを保有制限酵素消化rAAV9ベクターにDNAオリゴ含有shRNA配列を連結、またはロングレンジPCRおよび分子内ギブソンアセンブリベースのいずれかによって生成することができます建設30。得られたプラスミドは、2 ITRのサイト（ 図2）により隣接U6-shRNAのカセットを含むべきです。ここでは、一例として、rAAV9.U6 :: shRNAベクターは、mRNAのTRBP（：GCAGTGATGGATATGCATCTTCTCGAGAAGATGCATATCCATCACTCG TRBP shRNA配列）をノックダウンするために構築しました。スクランブルshRNAをネガティブコントロール（CCTAAGGTTAAGTCGCCCTCGCTCGAGCGAGGGCGACTTAACCTTAGG）として使用しました。
- rAAV9のプラスミド骨格へのcDNAまたはshRNA発現カセットを複製します。コンピテントE. coli細胞25にDNAを変換します。
注：望ましくないITR再結合を最小限に抑えるためにrAAV9 DNA形質転換のために使用しSTBL2またはstbl3 大腸菌細胞。 - ピックアップ形質転換された大腸菌細胞からの陽性クローン。リリー・バーネット培地500ml中に文化を増幅し、細菌細胞25-30からrAAV9プラスミドを抽出します。
注：MIDI /マキシは、DNA（>100μgの）の高い量を得るためにrAAV9プラスミドを分取ウイルスを生成する前に、常に（http://www.vvf.uzh.ch/cloningservice/11bpdeletion/itrintegrity.html）前述のように、制限消化及びアガロースゲル電気泳動によりAAVプラスミドの配列の完全性を分析します。
rAAV9プラスミドとHEK293細胞の2トランスフェクション
- リニアポリエチレンイミン（PEI）の溶液を1μg/μLを準備します。 70〜80℃に加熱されたエンドトキシンフリーのdH 2 O中のPEI粉末を溶かします。 RTまで冷却後、1M HClでpHを7.0に溶液を中和します。フィルター滅菌し（0.22μm）のソリューション。 1μg/μlのPEIストック溶液（1400μL/チューブ）を等分し、solutを保存-20℃でのイオン。
- 10％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン/ストレプトマイシンを有するダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）中で培養HEK293細胞。 5±0.5％の二酸化炭素（CO 2）で培養物を37℃のインキュベーター中で細胞。
- 2希釈：0日目に、10 150-mmディッシュに1で分割> 90％コンフルエント細胞によるトランスフェクションの前に18-20時間をHEK293細胞をプレート。
注：1日目に、細胞が90％コンフルエンスに到達する必要があります。 - 1日目に、rAAV9プラスミド（ 例えば、rAAV9.cTNT :: GFPまたはrAAV6.U6 :: shRNAの構築）、広告ヘルパープラスミド、およびPEI 25,26,29を使用して、AAV-REP /キャッププラスミドでHEK293細胞をトランスフェクション。
- 90％コンフルエンスで細胞の10皿のために、AAV-REP /キャッププラスミド、70μgのPF rAAV9プラスミド、および50mlの遠心管中でのAd-ヘルパープラスミド200μgの70μgのを混ぜます。
- 細胞が少ないコンフルエントであれば、比例DNAの量を調整します。例えば、細胞が75％コンフルエントである場合、軽減DNAの量に比例し（ステップ2.4.1に示す量の90分の75）：70のx 90分の75 = 58.3μgのAAV-REP /キャッププラスミドの、70 rAAV9プラスミドのX 90分の75 = 58.3μgの、および200×を混ぜます50-ml遠心チューブ内のAd-ヘルパープラスミドの90分の75 = 166.7μgの。
- 50 mlチューブに（FBSを含まない）RT DMEMの49ミリリットルを加え、よく混ぜます。
- PEIを作るためにPEI溶液の1360μLを加える：1：DNA比（w / vでは）4です。よく混ぜます。 30分 - 15 RTでインキュベートします。
- 各150-mmディッシュ（10 150-mmディッシュのための混合物の50ミリリットル）にステップ2.4.4で調製した混合物の5ミリリットルを追加します。
- 文化60-72時間、5±0.5％のCO 2で37℃のインキュベーター内で細胞。
トランスフェクトしたHEK293細胞とrAAV9ベクターの精製の3収穫
- トランスフェクション後、細胞を60から72時間を収穫。取り除くとサスペンド皿で細胞をピペッティングすることにより、培養培地とダウン。滅菌にすべての細胞懸濁液を移し50 mlチューブ。
- 5分間、500×gで細胞を遠心。各チューブに5mlのPBSで細胞ペレットを再懸濁一50mlチューブにすべての細胞懸濁液を組み合わせます。
- 5分間、500×gで細胞を遠心。上清を捨てます。このステップでは、-80℃で細胞ペレットを保存するか、すぐにステップ3.4から3.15に記載されているように、ペレットからAAVを浄化します。
- 150mMのNaClおよび20mMのTris-HCl、pHが8.0：溶解バッファーを準備します。フィルター滅菌し（0.22μM）。 4°Cでバッファに保管してください。
- 溶解緩衝液10mlでペレットを再懸濁。
- それ融解37℃で、-80℃で、またはドライアイス/エタノール浴中で溶解液をフリーズします。 1分間ボルテックス。溶解液を3回凍結融解。
- （溶解物中のMgCl 2の最終濃度が1 mMのこと作る）を解凍し、溶解物へのMgCl 2溶液を加えます。 250 U / mlの最終濃度にヌクレアーゼを追加します。 DNA /タンパク質AGGRを溶解し、15分間37℃でインキュベートegation。
注：DNA /タンパク質凝集をヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼ処理後に溶解されない場合は、ダウンスライセートを20回均質化します。 - 4℃で20分間、4800×gでサンプルを遠心。上清を収集します。
- 一方、イオジキサノール勾配溶液を調製：
- 10倍の5 mlのPBS、1 MのKClの1 MのMgCl 2、0.125ミリリットル、5 M NaClを10ミリリットル、及び勾配培地ofdensity 12.5ミリリットルの0.05ミリリットルを混合することにより、勾配液の17％を準備します。 H 2 Oを使用して、50ミリリットルの総容量を調整
- 10×PBSを5ml、1MのMgCl 2を0.05 mlの1 MのKCl 0.125 mlの密度勾配培地20ml、および0.5％0.2ミリリットル（w / v）のフェノールレッドを混合することにより、25％の溶液を調製します。 H 2 Oを使用して、50ミリリットルの総容量を調整
- 10×5mlのPBS、0.05 1 MのMgCl 2 mlの1 MのKCl 0.125ミリリットル、および密度勾配媒体33.3ミリリットルを混合して40％溶液を調製します。使用して、50ミリリットルの総容量を調整H 2 O.
- フェノールレッド（w / v）の1 MのKCl、1MのMgCl 2 0.125 mlの0.5％の密度勾配培地50ml、0.1 mlの0.05 mlと混合することにより、60％の溶液を調製します。
- 針およびシリンジを用いて、底部から出発して、17％の5 mlを、25％の5 mlを、5 mlの40％と60％の5ミリリットルのためにポリプロピレンチューブにイオジキサノール勾配溶液を読み込みます。勾配の上にステップ3.8（14〜16ミリリットル）から得られた全てのライセートをロードします。下から上に記載されている勾配は、60％、40％、25％、17％、および溶解物層です。溶解緩衝液でチューブを記入し、コルクでそれをカバーしています。
- 16℃で90分間、185,000×gで遠心分離します。
- シリンジを用いて、ウイルス画分（40％の層）を収穫。わずか40％の層を吸引し、40％および60％の画分との交点に針（21ゲージ）を挿入します。
注：25％層のいずれかを吸引しないでください。 - 滅菌ポリオキシエチレン - polyoxyproでウイルスの割合をミックス15 mlに総容量まで：pyleneブロック共重合体のPBS溶液（10,000 PBSで希釈した10％ポリオキシエチレン - ポリオキシプロピレンブロックコポリマーストック1）。フィルターチューブ（カットオフMW = 100 kD）の中に、混合物をロードします。 4℃で30分間、2000×gで遠心分離します。
- 一番下で溶液を捨てます。 15 mlに全量をポリオキシエチレン - ポリオキシプロピレンブロックコポリマーPBS溶液とフィルターチューブを補充。 4℃で20分間、2000×gで遠心分離します。このステップをさらに2回繰り返します。精製されたrAAV9ウイルス（フィルタ上記分数）を収集します。
- 1.7-mLのチューブにフィルターチューブに精製rAAV9を転送します。精製rAAV9をアリコート（100から400μL/チューブ、AAVのボリュームと力価に応じて）および-80℃でウイルスを保管してください。
注：繰り返しの凍結解凍を避けてください。
rAAV9の力価の4測定
- 標準DNAサンプルを準備します。
- 具体的かつ効率的なPCRをデザインrAAV9ベクターのためのプライマーおよびPCR条件を最適化します。
注：本研究で使用したプライマーは、「フォワード：TCGGGATAAAAGCAGTCTGG;リバース：TCGGACGGAGATACGTGAGT "です。 PCR反応を以下の条件で行った：95℃で3分間の初期変性。 20秒、15秒、60℃、10秒間72℃、95℃の35サイクル。そして72℃で10分間の最終伸長。 rAAV9ベクターの挿入図の配列がPCR 31の特異性および効率に影響を与える可能性がしかし、最適化されたプライマー及びPCR条件は、プラスミド特異的です。 - ステップ4.1.1に示す条件でPCR反応を行います。ゲル抽出キットを用いてPCR産物を精製します。
- 分光光度計を使用して精製DNAの濃度を測定します。 PCR生成物の分子量/長さに基づいて、DNA分子の数の濃度を計算します。
- MO：以下の式を用いた分子の濃度を計算しますlecular濃度（DNA分子またはその断片/ mlで）= 6.23×10 23モル-1 Xコン。 ×10 -6 / MW。注：（6.23×10 23モル-1 Avagadroの数であり、コン：DNA濃度/ mlの中で、MW：グラム/モルの分子量）。 PCR生成物の得られた濃度は、100μg/ mlのであり、その長さは200 bpである場合、例えば、二本鎖DNAの分子量は、各ヌクレオチドの2×200×310 = 124,000（平均分子量であります一本鎖DNAは、約310グラム/モル）です。分子濃度（DNA分子/ ml）を6.23×10 23モル-1×100 / mlの×10 -6 / 124,000グラム/モル= 5.18×10 14 DNA分子/ mlに=。
- DNAフラグメントの希釈系列を行い、10 13分子/ mlの濃度の標準試料を準備し、10 12分子/ mlで、10 11分子/ mlで、10 10分子/ mlで、10 9分子/ mlで、10
- 具体的かつ効率的なPCRをデザインrAAV9ベクターのためのプライマーおよびPCR条件を最適化します。
- 10倍のDNAseバッファーを5μl、DNアーゼの1μlの（10,000 U / ml）を、およびのddH 2 Oを39μlの総体積は50μlのであるべきで精製したrAAV9溶液5μlを混ぜます。
- 残留パッケージされたプラスミドDNAを除去するために30分間37℃でバイアルをインキュベートします。
- 10分間95℃でDNアーゼを不活性化します。ソリューションをクールダウン、H 2 Oの44μlを、10倍のDNAseバッファーを5μl、およびプロテイナーゼKのストックを1μl（10mg / ml）を追加します。
- 2時間、50℃で溶液をインキュベートします。反応を停止し、95℃で10分間プロテイナーゼKを不活性化します。
- 定量的PCR（定量PCR）アッセイのための試料1μLを使用してください。力価を計算します。
- サンプルのFRを使用して、ステップ4.1.1に設計されたプライマーを用いて定量的PCR（定量PCR）を実行しますオムステップ4.1.4（標準試料）、ステップ4.5から（サンプルが測定されます）。
- 各反応について、（Taqポリメラーゼ、dNTPミックス、バッファー、MgCl 2を、そして緑の色素を含む）2×グリーンマスターミックス10μlの、フォワードプライマー（5μM）の0.5μlを、逆方向プライマー（5μM）の0.5μLを混ぜますH 2 O8μlの、試料の1μlを測定します。以下の条件で定量PCRを実行します。2分および10分間95℃、50℃でサンプルを保持します。 1分15秒間、60℃で95°Cで40サイクルを実行します。溶融段階のために、30秒、15秒60℃、95℃でサンプルをインキュベートします。標準試料（ 図3）のC T番号に基づいて標準曲線を生成します。
- 標準曲線に対するAAVサンプルの分子濃度/力価を計算します。 rAAV9は、一本鎖DNAゲノムを有しているので、分子の濃度よりも2倍高くなります算出された値（2×電力（10、y）は、 図3B）。また、精製rAAV9の力価が原因DNアーゼとプロテイナーゼK反応（100μlの合計で5μl）をにおけるウイルスの1時20希釈に計算から得られるものよりも20倍高くなります。
- サンプルのFRを使用して、ステップ4.1.1に設計されたプライマーを用いて定量的PCR（定量PCR）を実行しますオムステップ4.1.4（標準試料）、ステップ4.5から（サンプルが測定されます）。
ハート新生児マウスおよび遺伝子発現アッセイで5 rAAV9インジェクション
- ポリオキシエチレン - ポリオキシプロピレンブロックコポリマーPBS溶液中rAAV9ワーキング溶液を調製します。 1-7×10 12粒子/ mlの力価を有するウイルスストックを作ります。
注：皮下注射することにより、各生後日に0.5から1.5にマウスをrAAV9液の50〜70μLを配信します。効率的な遺伝子の過剰発現またはノックダウンを達成するために、注入されたAAVの量を最適化するために、それぞれの研究のためのパイロット試験を行うことが推奨されます。バイアスを最小限に抑えるために、それぞれの研究のためにrAAV9.cTNT ::リュックやrAAV9.U6 ::スクランブルコントロールの同じ量を使用してください。
注：私たちは、1〜1.5を使用しました×10 11粒子/子犬過剰発現のためおよび2.5 -生後0.5から1.5マイルCE）でのノックダウンのための5×10 11粒子/子犬。 - 皮下注射によってP0.5-P2.5でrAAV9で新生児マウスを扱います。
- rAAV9溶液と29G1 / 2、0.33のx 12.7ミリメートルのインスリン注射器を事前に記入してください。気泡を除去するように注意してください。
- 親指と人差し指で片手で低温麻酔子犬を保持します。注射の前に、無菌状態を維持するために、70％イソプロピルアルコールで飽和した綿棒スティックと子犬の背部皮膚をスワイプします。 5〜10°の角度で動物の前部 - 背部皮下に注射針を挿入します。インスリンシリンジを用いてrAAV9溶液の50-70μLを注入します。
注：rAAV9はまた、腹腔内または静脈内注射26,27を介してマウスに送達することができます。心の中で配信する遺伝子の効率的な発現を得ることができます。しかし、腹腔内注入イオンは時々、肝臓における漏出性発現をもたらすことがあります。注射後、仔の状態を毎日モニターしました。
- 心臓における遺伝子発現のレベルは、定量PCR、免疫蛍光、またはウェスタンブロット（代表的な結果を図4及び5に示されている）25,26で監視することができます。
注：マウスは、圧縮ガス源から送達CO 2により安楽死させました。組織サンプルは、動物の心拍数、運動、呼吸が停止したことを確認した後に採取しました。新生児げっ歯類は、CO 2安楽死に耐性があると鋭いハサミを使用して断頭により安楽死させました。この方法は、アメリカ獣医師会の安楽死に関するパネルの勧告と一致しています。
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Representative Results
rAAV9.cTNT :: GFPまたはrAAV9.U6 ::のshRNAプラスミドのrAAV9構築のための戦略は、それぞれ図1及び2に示されています。例として、rAAV9ベクターは、マウス心臓にGFP遺伝子を過剰発現するように生成されました。得られたプラスミドは、2 ITRのサイト（ 図1）によって隣接cTnTの:: GFPカセットを含みます。 rAAV9.U6 :: shRNAベクターがTRBPのmRNAをノックダウンするために構築した（ 図2）
rAAV9滴定のための標準曲線は直線回帰によってのqPCRデータを用いて生成されました。操作量yは、各標準試料のDNA分子の濃度のlog 10値を示し、対応する変数xはC T値を表しています。ログ10（濃度）値（y）とC T数 （x）をいい線形相関を示す（R 2 = 0.9971）と方程式y = -0.2832x + 14.616（ 図3A）に適合。 rAAV9サンプルの力価は、線形方程式（ 図3B）に基づいて計算しました。プロトコル（ステップ4.6.2および図3B）に記載された方法、rAAV9ベクターの高力価（50-200μL、> 6×10 13粒子/ ml）で代表的な研究で得られました。
rAAV9.cTNTベクターの効率及び組織特異性を監視するには、P0.5仔は、同じ量rAAV9.cTNT ::ルシフェラーゼ（AAV-リュック）の（1×10 11粒子/子犬）またはrAAV9.cTNT :: GFPで処理しました（AAV-GFP）の皮下注射による。二週間注射後、GFPシグナルは、マウスの種々の組織においてモニターしました。 GFPの強い発現は、他の臓器（ 図4、N> 3）で中心部に検出されたが、されませんでした。したがって、効率的な心臓特異的遺伝子発現はrAAV9.cTNTベクターを用いて達成されました。
「FO：キープtogether.within-ページ=「jove_content 1 ">ノックダウン効率とrAAV9.U6ベクトルの組織特異性を監視するには、P0.5マウスを同じ量rAAV9の（3×10 11粒子/子犬）で処理しました皮下注射による.U6 ::スクランブル（AAV-スクランブル）またはrAAV9.U6 :: TRBPのshRNA（AAV-shTrbp）。二週間注射した後の種々の組織におけるTRBPの発現は、図5（qPCRにより監視し、n = 3でましたTRBPの）。中心部にTRBPのmRNAレベルが実質的にrAAV9.U6 :: shTrbp（68％ダウンレギュレーション、P = 0.0004452）削減しました。ダウンレギュレーションもrAAV9.U6からの肝臓組織で検出された:: shTrbp処理されましたマウスは、しかしながら、変化ははるかに低いです。
図1： 戦略rAAV9.cTNT :: GFPプラスミドを構築しました。 （A）のcTnT :: GFPカセットのスキーム。 （B TNNT2プロモーター （rAAV9.cTNT）を保有するように改変されています。 GFPオープンリーディングフレームはrAAV9.cTNT :: GFPプラスミドを生成するための制限部位が媒介するライゲーションによりrAAV9.cTNTベクターにクローニングしました。 （B）rAAV9.cTNT :: GFPプラスミドはギブソンアセンブリによって構築することができます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2： 戦略rAAV9.U6 ::のshRNAプラスミドを構築しました。 （A）U6のスキーム::のshRNAカセットを示しています。 shRNAの発現は、U6プロモーター（ブルー）によって駆動されます。 （B）rAAV9-U6-shRNAのカセットはアニールによって生成することができ、連結DNAオリゴを含有しますU6プロモーターを保有する制限酵素消化rAAV9ベクター中にshRNA配列をる。 （C）rAAV9.U6 ::のshRNAカセットは、長距離PCR及び分子内ギブソンアセンブリ基づく「シームレス」構造によって生成することができます。 5 'アーム、ループ、および3' shRNAのアームは、それぞれ、緑、オレンジ、赤で示されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：rAAV9 力価の計算。 （A）rAAV9滴定の標準曲線は、定量PCRデータを用いた線形攻撃によって生成されました。操作量yは 、各標準試料のDNA分子濃度のログ10値、および対応する変数xを表し、C T値を表しています。 rAAV9サンプル（B）力価は、標準曲線の線形式に基づいて計算されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4： マウス組織における rAAV9.cTNT :: GFPの発現パターン 。 P0.5仔は、皮下注射によってrAAV9.cTNT ::ルシフェラーゼ（AAV-Lucを、陰性対照）またはrAAV9.cTNT :: GFP（AAV-GFP）の同量（1×10 11粒子/ PUP）で処理しました。二週間注入後、組織サンプルを採取しました。 GFPの発現は、蛍光解剖顕微鏡下でモニターしました。明視野および蛍光画像の両方が提示されています。実験は、（N> 3）以上3回繰り返されてきました。スケールバー= 2.0ミリメートル。 SKM、骨格筋。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5：AAV-shRNAをノックダウン遺伝子発現。 P0.5マウスに皮下注射によってrAAV9.U6 ::スクランブル（AAV-スクランブル）またはrAAV9.U6 :: TRBPのshRNA（AAV-shTrbp）の同量（3×10 11粒子/ PUP）で処理しました。二週間注射後、種々の組織におけるTRBPのmRNAレベルをqPCRによりモニターした（N = 3）。データは、平均±SEMとして提示されています。カットオフのP値は0.05です。 NS、P> 0.05、有意ではありません。 **、P <0.01。 SKM、骨格筋。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
プラスミド構築の際に望ましくないITR再結合を最小限にすることが重要です。ウイルスを生成する前に、人は必ず制限消化及びアガロースゲル電気泳動を使用してAAVプラスミドのITRの完全性を監視しなければなりません。 100％完全なプラスミドを得ることは不可能であるが、再結合率が可能な限り少なくする必要があります。 20％未満が成功rAAV9包装のために許容可能です。注目すべきは、下振とう速度（180〜200回転）で低い温度（30℃）で細菌を培養しITR組換えの可能性を減らすことができます。
HEK293細胞はトランスフェクションが成功し、rAAV9包装のために健康であることを保証するために不可欠です。 「健康な」細胞は、通常、高度に増殖性であり、急速に成長します。しかし、急速な増殖およびHEK293細胞の成長は、必ずしもrAAV9パッケージの高効率を保証するものではありません。したがって、新鮮な細胞を用いた実験を開始することが重要です。それrAAV9パッケージングのために（細胞は2〜3日毎に継代され、<10継代）の低継代HEK293細胞を使用することをお勧めします。注目すべきは、のrAAVの他の血清型は異なる手順32を使用して精製する必要があるかもしれません。
研究者はrAAV9プラスミドの生成に柔軟性が付与されます。いずれかの制限部位が媒介するライゲーションまたはギブソン・アセンブリ30を使用することができます。 rAAV9.U6 :: shRNAの構築のため、分子内ギブソンアセンブリベースの戦略が有効な方法である（ 図1及び2）。複数のAAV-のshRNAプラスミドまたはプールされたAAV-shRNAは、迅速に構築することができます。 rAAV9を使用して遺伝子を過剰発現するように、挿入されたcDNA配列のサイズ制限が存在します。一般に、ITRの間のサイズの断片を小さく5 KBより33である必要があります。インテイン触媒タンパク質スプライシングは、rAAV9ベクトル34のパッケージサイズ制限を回避するために使用することができます。
他のウイルスシステムレトロウイルス、レンチウイルスおよびアデノウイルスを含むsは、また開発され、柔軟な遺伝子操作を可能にされています。高効率、高特異性、低ゲノム組み込み率、最小：ウイルスベクターのこれらの異なるタイプと比較して、rAAVの特定の利点を有しています 免疫原性、および最小の病原性。このように、のrAAVベースのゲノム工学は、in vivoでの遺伝子操作のための理想的なツールとして浮上しています。
以前の研究は、rAAV9システムがインビボで送達する遺伝子の効率的な発現を可能にすることを示しています。 CTNT（ニワトリTnnT2）プロモーターを用いて、心臓特異的な遺伝子発現は（ 図4）25,26を得ました。 U6プロモーターは、rAAV9.U6による標的mRNAの（TRBP）の最も顕著な阻害マウス組織における遍在アクティブですが::のshRNAは、心臓ではなく、他の臓器（ 図5）で観察されました。肝臓は、異なる血清型によって形質導入の最も一般的な臓器でありますrAAV 35,36。しかし、肝臓でノックダウン効率（mRNAレベルの36％の減少）は、心臓（mRNAレベルの68％の減少）よりもはるかに低いです。これは、肝臓における高いウイルスゲノムの存在にもかかわらず、rAAV9によってshRNAの全身送達は、心臓35に、より効率的な遺伝子ノックダウンを提供することを示す以前の研究と一致しています。肝組織の実質的なベクターゲノムの希釈をもたらす、肝細胞が心筋細胞よりも増殖性であり、より積極的に新生児の年齢でrAAV9投与後の細胞分裂を受けている可能性があります。しかし、これはまた、rAAV9の血清型は、より効率的に他の細胞型と比較して心筋細胞に形質導入することができることを示唆しています。 Lovric らによって実証されるように、分化した筋細胞において、DNA損傷応答MRN複合体タンパク質が抑制されます。 MRN複合タンパク質は、AAVゲノムに結合し、転写サイレンシングを通じてAAV伝達を阻害します。このように、当たりAAV導入へmissivityは、心臓内の遺伝子操作のために非常に適した他のウイルスベクターに比べ、rAAV9システムを作り、心筋細胞36の最終分化によって誘導することができます。さらに他の器官において望ましくないノックダウン効果（ 例えば、肝臓）を最小化するためには、また、心臓29の関心の遺伝子を抑制するために心臓特異的cTnTのプロモーター駆動のmiR-30aのベースshmiRを使用することができます。この原稿は、心血管系の調査でrAAV9技術に生かしための具体的な手法を読者に提供します。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyethylenimine, Linear (MW 25,000) | Polysciences, Inc. | #23966-2 | |
| Tube, Polypropylene, 36.2 ml, 25 x 87 mm, (qty. 56) | Beckman Coulter, Inc | # 362183 | |
| Nuclease, ultrapure | SIGMA | #E8263-25KU | |
| Density Gradient Medium(Iodixanol) | SIGMA | #D1556-250ML | |
| Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane | EMD Millipore Corporation | #UFC910008 | |
| Laboratory pipetting needle with 90° blunt ends,gauge 14, L 6 in., nickel plated hub | SIGMA | #CAD7942-12EA | |
| Poloxamer 188 solution (Pluronic® F-68 solution) | SIGMA | P5556-100ML | |
| Proteinase K | SIGMA | 3115828001 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Centrifuge machine | Thermo Scientific | 75004260 | |
| Centrifuge System | Beckman Coulter | 363118 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| DMEM medium | Fisher Scientific | SH30243FS | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| rAAV9 vector | Penn Vector Core | P1967 |
References
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