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Immunology and Infection

एचआईवी -1 संक्रमित कोशिकाओं से Exosomes की SILAC आधारित प्रोटिओमिक विशेषता

Published: March 3, 2017 doi: 10.3791/54799
Automatic Translation
1, 1, 1, 2,3, 3
1Brown University, 2COBRE Center for Cancer Research, Lifespan Laboratories, Rhode Island and Miriam Hospitals, 3Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, Warren Alpert Medical School, Brown University

Summary

यहाँ, हम सेल संस्कृति (SILAC) में अमीनो एसिड से स्थिर आइसोटोप लेबलिंग की तकनीक का उपयोग कर मेजबान exosomal proteomes पर एचआईवी -1 संक्रमण के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए एक मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स विधि का वर्णन है। इस प्रोटोकॉल आसानी से अलग तनाव या संक्रमण की शर्तों के तहत कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Introduction

वायरल संक्रमण सहित कई मानव रोगों, अक्सर विशिष्ट सेलुलर प्रक्रियाओं है कि में और प्रभावित कोशिकाओं के आसपास जगह लेने के साथ जुड़े रहे हैं। प्रोटीन, अक्सर परम सेलुलर प्रभावोत्पादक के रूप में अभिनय, इन प्रक्रियाओं मध्यस्थता। प्रोटीन का विश्लेषण अक्सर प्रभावित कोशिकाओं के स्थानीय पर्यावरण के लिए के रूप में अमूल्य जानकारी प्रदान करते हैं और रोग रोगजनन की अंतर्निहित तंत्र को समझने के लिए हमें मदद कर सकते हैं। विभिन्न प्रोटीन विश्लेषण तकनीक के अलावा, प्रोटिओमिक्स विशेष रूप से महान वादा है। एक शक्तिशाली, बड़े पैमाने पर उपकरण के रूप में, प्रोटिओमिक्स सेलुलर प्रक्रियाओं की एक प्रणालीगत समझ प्रदान कर सकते हैं, विशेष रूप से समारोह और प्रोटीन की बातचीत के क्षेत्र में। विशिष्ट प्रोटीन का विश्लेषण लेबलिंग तकनीक है, जो जांचकर्ताओं सेलुलर घटकों, विशेष रूप से प्रोटीन की अभिव्यक्ति की निगरानी करने की अनुमति के विकास के माध्यम से सरल बना दिया है, जांच की साइट में। कई प्रोटिओमिक विश्लेषण सेलुलर पर प्रदर्शन किया गया है हालांकिproteome पैमाने पर, subcellular डिब्बों पर प्रोटिओमिक अभिलक्षण विशेष रूप से जानकारीपूर्ण 1 साबित हुई है। यह एचआईवी -1 संक्रमण की पढ़ाई में अच्छी तरह से उदाहरण है।

Exosomes, 30-100 एनएम झिल्ली पुटिकाओं सेल प्रकार 2, 3, की एक विस्तृत श्रृंखला से स्रावित कहनेवाला संचार और आणविक परिवहन के महत्वपूर्ण घटक हैं। वे पहले से एचआईवी -1 नवोदित प्रक्रिया 4, 5 में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए खोज रहे थे। कार्यात्मक विच्छेदन के साथ प्रोटिओमिक विश्लेषण के संयोजन से, हमने पाया कि एचआईवी -1 से संक्रमित कोशिकाओं से जारी exosomes एक अद्वितीय और मात्रात्मक अलग प्रोटीन हस्ताक्षर और बंदरगाह नियामक अणुओं है कि पड़ोसी सेलुलर apoptosis और प्रसार 6 सहित ग्रहणशील कोशिकाओं, पर सेलुलर गुण के प्रभाव से बना रहे हैं। तरीकों इस प्रोटोकॉल में वर्णित हैं,अर्थात् SILAC एचआईवी -1 से संक्रमित कोशिकाओं से exosomes के 7 आधारित प्रोटिओमिक लक्षण वर्णन (सेल संस्कृति में अमीनो एसिड से स्थिर आइसोटोप लेबलिंग)। इसी तरह के दृष्टिकोण बेहतर विशिष्ट डिब्बे या ब्याज के अंश को प्रयोगात्मक तनाव समायोजन और वर्णित प्रक्रियाओं के लिए आवश्यक परिवर्तन करने से रोगजनन के दौरान अन्य subcellular डिब्बों को समझने के लिए लागू किया जा सकता है।

मात्रात्मक प्रोटिओमिक तरीकों का हाल ही में विकास को देखते हुए जब एक विशेष प्रयोग के लिए सबसे कारगर तरीका चयन से चुनने के लिए कई हैं। इनमें रासायनिक आधारित iTRAQ (सापेक्ष और निरपेक्ष मात्रा का ठहराव के लिए समदाब रेखीय टैग) 8 और लेबल मुक्त एमआरएम (एकाधिक प्रतिक्रिया निगरानी) 9 तकनीक है। दोनों ही तरीकों से शक्तिशाली उपकरण हैं और विशिष्ट सेटिंग्स के लिए अच्छा विकल्प हैं। एक ठेठ प्रयोगशाला मुख्य रूप से सेल लाइनों के साथ काम करने के लिए, हालांकि, इन दोनों तरीकों relativel हैY उच्च लागत और कर रहे हैं और अधिक समय लेने वाली है जब SILAC आधारित पद्धति की तुलना में। SILAC एक चयापचय आधारित लेबलिंग तकनीक है कि सेलुलर प्रोटीन में संस्कृति मीडिया से एमिनो एसिड की nonradioactive समस्थानिक रूपों को शामिल किया गया है। आमतौर पर, SILAC प्रयोगों दो सेल आबादी, उदाहरण के लिए, संक्रमित और असंक्रमित के साथ शुरू करते हैं। प्रत्येक विभिन्न अपनी विशिष्ट समस्थानिक वातावरण में लेबल तक पूर्ण लेबलिंग हासिल की है। इन कोशिकाओं के लेबल exosomes तो प्रोटीन निकासी के अधीन हैं। एक बार निकाले, लेबल exosomal प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी मिलकर जन स्पेक्ट्रोस्कोपी 10 का उपयोग विश्लेषण कर रहे हैं। अंत में, मास स्पेक्ट्रोमेट्री परिणाम और काफी लेबल प्रोटीन सांख्यिकीय के अधीन हैं और जैव सूचना विज्ञान कठोर जैव रासायनिक सत्यापन के रूप में रूप में अच्छी तरह विश्लेषण करती है। हमारे पिछले खोजी रिपोर्टों का सुझाव है कि SILAC / exosome प्रक्रियाओं, के रूप में सेल लाइनों एक में आमतौर पर प्राथमिक कोशिकाओं की तुलना में सेल लाइनों के लिए अधिक उपयुक्त हैंकुशल समस्थानिक लेबलिंग के लिए सक्रिय proliferating राज्य,

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Protocol

1. सेल संस्कृति और एचआईवी -1 संक्रमण

नोट: प्रयोगों के शुरू करने से पहले, यह एक MTT परख 12 के माध्यम से Trypan ब्लू धुंधला 11 के माध्यम से कोशिकाओं 'व्यवहार्यता और उनके प्रसार की जांच करने के लिए सिफारिश की है। यह भी नव तैयार SILAC माध्यम का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है। विभिन्न सेल लाइनों का इस्तेमाल किया जा सकता है, जब तक वे एक सक्रिय रूप से proliferative चरण में हैं, और एचआईवी -1 संक्रमण, या पसंद का परीक्षण हालत के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं। इस प्रोटोकॉल में, उदाहरण के रूप में H9 सेल लाइन का उपयोग करें।

  1. बीज 2 एक्स 10 6 H9 कोशिकाओं को एक सेल संस्कृति फ्लास्क में। लेबल RPMI 1640 10% dialyzed भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 100 मिलीग्राम / एल 13 सी 6 एल लाइसिन और 100 मिलीग्राम / एल 13 सी 6 15 एन 4 एल arginine युक्त मध्यम 10 मिलीलीटर में एक समूह के लिए आगे बढ़ें। dialyzed FBS 10%, 100 मिलीग्राम / एल एल Lysine और 100 मिलीग्राम / एल एल Arginine के साथ, 10 मिलीलीटर लेबल हटाया गया RPMI 1640 मध्यम में दूसरे समूह के लिए आगे बढ़ें।
  2. भारी एमिनो एसिड के साथ छह दोहरीकरण पर जो बात लेबल माध्यम से कोशिकाओं के प्रोटीन व्यावहारिक रूप से पूरी तरह से चिह्नित कर रहे हैं (> 99%) के लिए कोशिकाओं को विकसित। (सेल के प्रकार पर निर्भर करता है हर 1-3 दिनों के लिए। H9 सेल के लिए, मध्यम हर 3 दिन बदल) ताजा मीडिया जोड़ें या मीडिया को नियमित रूप से बदल जाते हैं। लेबलिंग के अंत में, अधिक कोशिकाओं के विकास को समायोजित करने के लिए संस्कृति मात्रा (जैसे ~ 30 एमएल) वृद्धि हुई है।
    नोट: सटीक सेल Trypan ब्लू धुंधला और सेल गिनती के माध्यम से प्रयोग की शुरुआत में दुगनी होने का समय निर्धारित करते हैं।
  3. एचआईवी -1 NL4-3 48 घंटे के लिए मानक एचआईवी -1 संक्रमण प्रोटोकॉल का उपयोग कर 13 के साथ लेबल कोशिकाओं को संक्रमित। (MOI) संक्रमण की बहुलता 0.3 चारों ओर के साथ वायरस की उचित मात्रा के साथ कोशिकाओं को सेते हैं। एक एचआईवी -1 पी 24 प्रतिजन एलिसा किट का उपयोग संस्कृति supernatants की मात्रा का ठहराव पी 24 से एचआईवी -1 संक्रमण की जाँच करें। कोशिकाओं के सफल संक्रमण की पुष्टि के लिए एक immunofluorescence परख 14 प्रदर्शन करना। Keeपी एचआईवी -1 संक्रमण के बिना लेबल हटाया गया मध्यम में unlabeled कोशिकाओं बढ़ रहा है।
  4. संक्रमण के अंत (2.1 कदम) में दोनों समूहों के supernatants हार्वेस्ट।

2. Exosome अलगाव

नोट: ultracentrifugation कदम की एक श्रृंखला के माध्यम से, संस्कृति supernatants से exosomal अंशों 15 समृद्ध कर रहे हैं। 4 डिग्री सेल्सियस पर सभी निम्नलिखित कदम है कि कम से कम 100,000 x जी की गति तक पहुँच सकते हैं ultracentrifuge एक रोटर के साथ, प्रदर्शन करना।

  1. 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में संस्कृतियों के supernatants लीजिए, कोशिकाओं से परहेज। उन्हें 300 XG पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र शेष कोशिकाओं को हटा दें।
  2. नया 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में supernatants लीजिए और 2,000 XG पर 10 मिनट के लिए उन्हें अपकेंद्रित्र मृत कोशिकाओं को हटाने के लिए। स्थानांतरण वाणिज्यिक रोटर-संगत ट्यूबों कि ultracentrifugation झेलने में सक्षम हैं करने के लिए supernatants जिसके परिणामस्वरूप।
  3. ultracentrifuge ट्यूबों को संतुलित करने के लिए सुनिश्चित करें। 10,000 XG पर 30 मिनट के लिए ट्यूबों अपकेंद्रित्र दूर करने के लिएकोशिका अवशेष।
  4. पर 1,00,000 x जी 70 मिनट के लिए ultracentrifuge ट्यूबों में supernatants और सेंट्रीफ्यूज लीजिए। supernatants त्यागें।
  5. ताजा पीबीएस के 5 मिलीलीटर में exosome युक्त छर्रों Resuspend। समाधान में 100,000 x जी 70 मिनट के लिए फिर से ताजा ultracentrifuge ट्यूब और सेंट्रीफ्यूज के लिए स्थानांतरण।
  6. त्यागें supernatants। exosomes स्टोर करने के लिए लंबे समय तक, -80 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस और दुकान के 50 μl में छर्रों resuspend। वैकल्पिक रूप से, के रूप में नीचे दिखाया गया है प्रोटीन निकासी के लिए सीधे आगे बढ़ना।

3. प्रोटीन निष्कर्षण और तैयारी

  1. जोड़ा protease अवरोध कॉकटेल के साथ 100-200 μl RIPA सेल और निष्कर्षण बफर में अलग-थलग exosomal छर्रों भंग। बफर, 25 मिमी Tris-हाइड्रोक्लोराइड, 150 मिमी सोडियम क्लोराइड, 1% एनपी 40, 1% सोडियम deoxycholate, और 0.1% एसडीएस (सोडियम सल्फेट dodecyl) से बना है पीएच 7.6 पर। protease अवरोध कॉकटेल ऐसे aprotinin, bestatin, एल के रूप में प्रोटीज अवरोधकों की एक किस्म को शामिल करना चाहिएeupeptin, ए और EDTA (ethylenediaminetetraacetic एसिड) pepstatin, कि proteases की एक पूरी श्रृंखला को बाधित कर सकते हैं।
  2. 13,000 XG (4 डिग्री सेल्सियस) पर 10 मिनट के लिए भंग समाधान अपकेंद्रित्र, और नए 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों के लिए मंजूरी दे दी supernatants हस्तांतरण।
  3. Bicinchoninic एसिड (बीसीए) या ब्रैडफोर्ड परख 16 का उपयोग exosomes के प्रत्येक नमूने की प्रोटीन एकाग्रता यों।
  4. लेबल और लेबल हटाया गया नमूनों से प्रोटीन के बराबर राशि (2 माइक्रोग्राम) मिश्रण और 120 मा पर एक 4-20% एसडीएस पृष्ठ जेल पर बराबर मिश्रण चलाने / 200 के लिए 30 वी मिनट।
  5. Coomassie ब्लू के साथ दाग जेल 17 destaining द्वारा पीछा किया।
  6. एक रेजर ब्लेड का प्रयोग, जेल से नमूना लेन काटा। फिर 10-15 बराबर टुकड़ों में जेल लेन काटा। 10-15 नलियों की कुल के लिए एक ताजा 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में प्रत्येक टुकड़ा डाल दिया।
  7. 50% acetonitrile, भंवर में 25 मिमी एनएच 4 HCO 3 में क्यूब्स को विसर्जित कर दिया, और supernatants त्यागें। दो बार दोहराएँ। सूखाएक शून्य concentrator 18, 19 में क्यूब्स।
  8. 10 मिमी dithiothreitol (डीटीटी), भंवर, और सेंट्रीफ्यूज संक्षिप्त के साथ क्यूब्स rehydrate। 1 घंटे के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  9. में 55 मिमी iodoacetamide, भंवर, और स्पिन जेल क्यूब्स विसर्जित कर दिया। 45 मिनट के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर सेते हैं। सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  10. 25 मिमी एनएच 4 HCO 3, भंवर, स्पिन में क्यूब्स को विसर्जित कर दिया, और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  11. में 50% acetonitrile, भंवर, और स्पिन 25 मिमी एनएच 4 HCO 3 में क्यूब्स विसर्जित कर दिया। 3.9 और 3.10 दोहराएँ।
  12. एक शून्य concentrator में क्यूब्स सूखी। 25 मिमी एनएच 4 HCO 3 में 25 μl अनुक्रमण ग्रेड संशोधित trypsin जोड़ें, 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं, और अतिरिक्त समाधान त्यागें। Trypsin के बिना 25 मिमी एनएच 4 HCO 3 में क्यूब्स को विसर्जित कर दिया, और रात भर में 37 डिग्री सेल्सियस सेते हैं।
  13. संक्षेप में नीचे क्यूब्स स्पिन और जिसके परिणामस्वरूप पेप्टाइड अतिरिक्त हस्तांतरणएक नया ट्यूब सीटी। 30 मिनट के लिए, और स्पिन के लिए क्यूब्स को 50% acetonitrile में 5% फार्मिक एसिड के 30 μl जोड़ें, भंवर। निकालने के साथ सतह पर तैरनेवाला का मिश्रण। कम से कम 5 μl करने के लिए एक वैक्यूम concentrator के साथ पेप्टाइड अर्क सूखी।
  14. नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस विश्लेषण के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री कोर सुविधा के लिए नमूने जमा करें। एमएस विश्लेषण डेटा है, जो खुला स्रोत सॉफ्टवेयर से उत्पन्न किया जा सकता है, आमतौर पर प्रत्येक प्रोटीन की पहचान के लिए एक परिग्रहण संख्या, लेबल / लेबल हटाया गया अनुपात और पहचान अद्वितीय पेप्टाइड्स की संख्या भी शामिल है।

4. पश्चिमी सोख्ता सत्यापन

नोट: पश्चिमी सोख्ता मास स्पेक्ट्रोमेट्री परिणामों की पुष्टि करने के लिए सिफारिश की है।

  1. मानक पश्चिमी सोख्ता प्रोटोकॉल का पालन करें और प्रत्येक समूह से प्रोटीन की है कि बराबर मात्रा में लोड कर रहे हैं। ब्याज की प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी (जैसे Annexin A5, लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज बी श्रृंखला) एमएस द्वारा की पहचान का प्रयोग करें। पश्चिमी सोख्ता का पता लगाने, densitometry विश्लेषण करने के साथ-साथएस, पुन: पुष्टि कर सकते हैं कि एमएस प्रोटीन की पहचान और मात्रा का ठहराव सही हैं।

5. प्रोटिओमिक डेटा विश्लेषण

नोट: डेटा की गुणवत्ता मूल्यांकन, डेटा pretreatment, गणना और महत्वपूर्ण प्रोटीन उम्मीदवारों के निर्धारण अलग से किया जाता है प्रत्येक एमएस के लिए पेश करता है। उपरोक्त विश्लेषण पूरा कर रहे हैं एक बार, प्रतिकृति से डेटा का विश्लेषण की तुलना में और 6 संयुक्त, 20, 21 कर रहे हैं।

  1. एमएस डेटा की गुणवत्ता का आकलन।
    1. सबसे पहले, बदलना log2 SILAC-एमएस एक स्प्रेडशीट कार्यक्रम में लेबल / मात्रा निर्धारित प्रोटीन का लेबल हटाया गया अनुपात।
    2. वैज्ञानिक रेखांकन और सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर, समूह में 40-100 अनुपात डिब्बे में अनुपात और बिन प्रति अनुपातों की संख्या साजिश एक हिस्टोग्राम उत्पन्न करते हैं। हिस्टोग्राम की एक सामान्य वितरण एमएस डेटा 6 की अच्छी गुणवत्ता को इंगित करता है। के लिए सभी एमएस प्रतिकृति इस कदम है।
  2. आत्मविश्वास और एमएस पेप्टाइड अनुपात की शुद्धता बढ़ाने के लिए, प्रोटीन है कि कम से कम दो मात्रा निर्धारित पेप्टाइड्स को हटाने पर विचार करें।
  3. काफी ऊपर और नीचे विनियमित प्रोटीन उम्मीदवारों को निर्धारित करने के लिए, महत्व थ्रेसहोल्ड 22 गणना करने के लिए निम्न चरणों का उपयोग।
    1. वैज्ञानिक रेखांकन और सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर में, एक गैर रेखीय प्रतिगमन या आवृत्ति वितरण के आंकड़ों के वक्र फिट उत्पन्न करते हैं। यह कदम मूल्यों है कि कटऑफ मूल्यों की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता अर्जित करता है। 99% आत्मविश्वास सीमा के लिए ± 1.96 95% आत्मविश्वास सीमा के लिए σ या 2.56 σ मंझला के रूप में कट-ऑफ मूल्यों की गणना।
      नोट: cutoffs की गणना के विशिष्ट विवरण Emmott एट अल में पाया जा सकता है। 22।
    2. प्रोटीन उम्मीदवारों जिसका अनुपात हैं का चयन करें या तो औसत से नीचे मंझला (काफी अधिक व्यक्त) के ऊपर एक से अधिक 1.96 (या 2.56) मानक विचलन या से कम 1.96 (या 2.56) मानक विचलन (काफी तहत व्यक्त)।
  4. ऊपर-पहचान महत्वपूर्ण उम्मीदवारों की प्रतिकृति की तुलना स्थिरता प्राप्त करने के लिए। सुनिश्चित करें कि वे निम्नलिखित मानदंडों को पूरा इस अंतिम चयन कदम पारित करने के लिए: उम्मीदवारों को लगातार सभी प्रतिकृति में पहचान की जानी चाहिए; और एक उम्मीदवार की प्रतिकृति के नियमन के अपने दिशा में लगातार होना चाहिए (अधिमानतः, एक उम्मीदवार के 3 प्रतिकृति के बाहर कम से कम 2 या तो होना चाहिए विनियमित या नीचे विनियमित)।
  5. उम्मीदवारों है कि उनकी प्रतिकृति 'डेटा मर्ज करके उपर्युक्त मानदंडों को पूरा करने के लिए डेटा को अंतिम रूप।

6. जैव सूचना विज्ञान सत्यापन और विशेषता

नोट: मौजूदा जीनोमिक और bioinformatic जानकारी लगभग हर प्रोटीन के लिए जानकारी का खजाना प्रदान करता है। डाटा खनन और कहा कि सूचना के आधार पर जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण संपत्ति और महत्वपूर्ण उम्मीदवारों के कार्यों में अंतर्दृष्टि का एक बड़ा सौदा पाने में मदद कर सकते हैं। इस प्रक्रियाएसएस आमतौर पर उचित नीचे की ओर गीला प्रयोगशाला प्रयोगों डिजाइन करने के लिए आवश्यक है।

  1. उनकी परिग्रहण संख्या या UniProt आईडी, खोज वर्तमान exosome डेटाबेस के खिलाफ उम्मीदवार (Exocarta 23, Evpedia 24) का उपयोग करना है कि उम्मीदवार प्रोटीन पहले exosome में पाया गया है सत्यापित करने के लिए। यह कदम विश्वास की एक परत है कि उम्मीदवारों exosomes में वास्तव में कर रहे हैं कहते हैं।
    1. पहुँच http://www.exocarta.org/, "प्रश्न" और इनपुट या तो जीन या प्रोटीन नाम / परिग्रहण संख्या पर क्लिक करें। एक सारांश पृष्ठ दिखाई देगा और exosome में सबूत प्रदान की अगर कोई है, दिखाया जाएगा।
  2. एचआईवी -1 और मानव प्रोटीन बातचीत डाटाबेस 25 के खिलाफ उम्मीदवार खोजें। वैकल्पिक रूप से, विशिष्ट डेटाबेस है कि उम्मीदवार प्रोटीन की बातचीत और परीक्षण हालत के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं खोज करते हैं।
    1. www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/HIV में डेटाबेस का उपयोगसहभागिता। 'प्रोटीन डोमेन नाम' प्रविष्टि पर, उम्मीदवारों के नाम या परिग्रहण संख्या दर्ज करें, और खोज पर क्लिक करें। खोज परिणामों एचआईवी -1 और प्रोटीन उम्मीदवारों के बीच बातचीत में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं और सुझाव है जो उम्मीदवारों की सही मायने में एचआईवी -1 जुड़ा हो सकता है कर सकते हैं।
  3. आयात परिग्रहण संख्या या जाने विश्लेषण सॉफ्टवेयर (जैसे FunRich, कार्यात्मक संवर्धन विश्लेषण उपकरण 26) के रूप में उम्मीदवारों की UniProt आईडी और सॉफ्टवेयर चलाते हैं।
    1. http://www.funrich.org/ पर सॉफ्टवेयर डाउनलोड करें। स्थापना के बाद, सॉफ्टवेयर को खोलने के संवर्धन के विश्लेषण के तहत, क्लिक करें "डेटा सेट करें", और प्रोटीन / जीन की सूची अपलोड करें। अगले, चार्ट प्रकार जाओ विश्लेषण कल्पना करने के लिए चयन करें।
      नोट: जाओ विश्लेषण के परिणाम पाई चार्ट के रूप में देखे जा जाएगा। यह कदम जैविक प्रक्रिया (बीपी), सेलुलर घटक के क्षेत्रों में उम्मीदवारों के साथ जुड़े वैश्विक जानकारी हासिल करने के लिए हमें मदद करता है (सीसी), और आणविक समारोह (एमएफ)।
  4. पहुँच डेविड http://david.ncifcrf.gov/ 27 पर, अपनी वेबसाइट पर "कार्यात्मक एनोटेशन उपकरण" पर क्लिक करें। उम्मीदवार की सूची दर्ज करें, जैसे कि "UniProt आईडी" के रूप में जीन के "पहचानकर्ता" का चयन करें, "जीन सूची" और खोज का चयन करें। समृद्ध जाओ शर्तों, पी-मूल्यों, और अन्य मानकों "Gene_Ontology" श्रेणी के अंतर्गत "एनोटेशन सारांश परिणाम" पृष्ठ पर क्लिक करके पाया जा सकता है।
  5. अन्य प्रोटीन के साथ उम्मीदवारों की संभावित बातचीत की जांच करने के लिए, संभावित प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत और संभव जैव रासायनिक रास्ते स्पष्ट करने के लिए खुले तौर पर सुलभ स्ट्रिंग डेटाबेस 28 का उपयोग करें।
    नोट: जाओ विश्लेषण और कार्यात्मक एनोटेशन (धारा 6.3-6.4) भी नवीनतम STRING सॉफ्टवेयर का उपयोग किया जा सकता है।
    1. http://string-db.org/ में डेटाबेस का उपयोग। इनपुट प्रोटीन आईडी या अनुक्रम नामित रों मेंearch बॉक्स और विश्लेषण के लिए सही प्रजातियों का चयन करें। "खोज" पर क्लिक करें। परिणाम दोनों डायरेक्ट (शारीरिक) और अप्रत्यक्ष (कार्य) संघों के बारे में जानकारी दे देंगे। exosomal उम्मीदवार के लिए शीर्ष दस में जाना जाता मैचों प्रदर्शित किया जाएगा और महत्वपूर्ण पद के उम्मीदवार के चयन के लिए विचार किया जाना चाहिए।
      ध्यान दें: उम्मीदवारों के साथ जुड़े जानकारी का एक बड़ा सौदा उपरोक्त चरणों का उपयोग का विश्लेषण किया जा सकता है। सबसे महत्वपूर्ण उम्मीदवारों आगे बहाव के आणविक और जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए चुना जा सकता है।

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Representative Results

चित्रा 1 ए एक फ़्लोचार्ट SILAC लेबलिंग प्रक्रिया 21 रूपरेखा है। आदेश exosomes को शुद्ध करने के लिए, नमूने सेंट्रीफ्यूज के माध्यम से नीचे काता किया जाना चाहिए। चित्रा 1 बी सीरियल ultracentrifugation 21 से exosome शुद्धि के कदम से पता चलता। एक बार शुद्ध, exosomes के रूप में उल्लिखित प्रक्रिया प्रयोगात्मक प्रोटिओमिक विश्लेषण के अधीन हैं।

चित्रा 2A प्रोटिओमिक डेटा 21 से महत्वपूर्ण प्रोटीन उम्मीदवारों को निर्धारित करने के लिए एक फ़्लोचार्ट है। चयनित उम्मीदवारों फिर नीचे की ओर प्रोटिओमिक्स विश्लेषण के लिए उपयोग किया जाता है। चित्रा 2 बी SILAC हिस्टोग्राम का एक उदाहरण ठेठ प्रोटीन मात्रा का ठहराव परिणामों के प्रतिनिधि अनुपात में प्रदर्शित (यह आंकड़ा ली एट अल से संशोधित किया गया है। 6) है, और तालिका 1 एक हैइन SILAC अनुपात histograms से महत्वपूर्ण उम्मीदवारों 6 के लिए कटऑफ मूल्यों को निर्धारित करने के एन उदाहरण है। कदम धारा 6.3 में वर्णित का पालन करके, काफी ऊपर या नीचे विनियमित प्रोटीन का निर्धारण करने के लिए कटऑफ मूल्यों की गणना की गई। इस प्रतिनिधि डाटासेट में, एक भारी / प्रकाश (एच / एल) ऊपरी कटऑफ मूल्य से ऊपर अनुपात के साथ प्रोटीन के रूप में काफी विनियमित है, जबकि कम कटऑफ मूल्य से कम एक एच / एल अनुपात के साथ प्रोटीन के रूप में काफी नीचे विनियमित विचार किया गया माना जाता था । गौरतलब है कि विनियमित उम्मीदवार प्रोटीन आगे की जांच के अधीन किया जाएगा।

चित्रा 3 दिखाता चुने गए महत्वपूर्ण उम्मीदवारों के लिए समग्र जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण और डेटा खनन प्रक्रियाओं। तालिका 2 एक डेटा खनन उदाहरण है कि exosome और एचआईवी -1 / मेजबान बातचीत डेटाबेस का इस्तेमाल 6 (उम्मीदवारों के बारे में जानकारी इकट्ठा करने के लिए है यह टैबLe ली एट अल से संशोधित किया गया है। 6)। वर्तमान exosome और एचआईवी -1 / मेजबान बातचीत डेटाबेस खनन से, तेरह चौदह उम्मीदवारों में से exosomes के साथ संबद्ध करने के लिए पाए गए। पांच चौदह बाहर उम्मीदवारों को भी एचआईवी -1 के साथ बातचीत करने के लिए जाने जाते थे। उनमें से, चार उम्मीदवारों (HSPA4, गर्मी झटका 70 केडीए प्रोटीन 4; NUTF2, परमाणु परिवहन कारक 2; PTGES3, प्रोस्टाग्लैंडीन ई synthase 3; LDHB, एल लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज बी श्रृंखला) दोनों exosome और एचआईवी -1 के साथ संबद्ध करने के लिए पाए गए। HSPA4, NUTF2, PTGES3 और LDHB में केवल LDHB लगातार था तहत व्यक्त संक्रमित अंश में (भारी लेबल)। विश्लेषण की एक श्रृंखला के माध्यम से, हम सबसे महत्वपूर्ण पद के उम्मीदवार है, जो आगे के अध्ययन के अधीन हो सकता है LDHB का चयन किया। नीचे की ओर प्रोटिओमिक्स विश्लेषण चित्रा में प्रदर्शित कर रहे हैं 4. चित्रा -4 ए जीन आंटलजी (जाओ) विश्लेषण का संक्षिप्त कदम से पता चलता; चित्रा 4 बी प्रदर्शन DAVI के कदम को सूची बद्धडी विश्लेषण; चित्रा 4C कैसे स्ट्रिंग का उपयोग कर नेटवर्क विश्लेषण प्रदर्शन को दर्शाता है। आंकड़े 5 ए, 5 ब, और 5C बीपी, सीसी और म्यूचुअल फंड में चौदह प्रोटीन का एक सेट के डेविड विश्लेषण कर रहे हैं; चित्रा 5 डी LDHB के शीर्ष दस बातचीत भागीदारों पता चलता है; चित्रा 5E पता चलता है कि LDHB की बातचीत भागीदारों के बहुमत भी exosome और एचआईवी -1 के साथ जुड़े रहे हैं। प्रारंभिक डेविड विश्लेषण के परिणाम सुझाव दिया है कि कई उम्मीदवारों apoptosis से संबंधित हैं और संभावना प्रोटीन बाध्यकारी में भाग लेते हैं। इसके अलावा स्ट्रिंग विश्लेषण की पुष्टि की LDHB बाध्यकारी कि भागीदारों भी कार्यात्मक और locationally exosome और एचआईवी -1 से संबंधित हैं। इन सभी परिणाम संभावित डाउनस्ट्रीम जांच के लिए बहुमूल्य जानकारी दे।

आकृति 1
चित्रा 1: SILAC लेबलिंग और exosome शुद्धि अंतर ultracentrifugation का उपयोग कर।(ए) कोशिकाओं के दो समूहों में अलग से बड़े हो रहे हैं। एक समूह पूरा लेबलिंग के लिए छह दोहरीकरण के लिए लेबल माध्यम में उगाया जाता है। दूसरे समूह की इसी अवधि के लिए सामान्य लेबल हटाया गया मध्यम में उगाया जाता है। अगले, लेबल की कोशिकाओं, एचआईवी -1 से संक्रमित है, जबकि लेबल हटाया गया कोशिकाओं नहीं कर रहे हैं। अंत में, दोनों समूहों से exosomes समानांतर में अलग कर रहे हैं। (बी) नमूने (supernatants या छर्रों) हर कदम पर centrifugation में इस्तेमाल टेस्ट ट्यूब में संकेत कर रहे हैं। भिन्न टेस्ट ट्यूब के सही पक्ष पर नोट कर रहे हैं त्याग किया। गति और प्रत्येक centrifugation की लंबाई भी दिखाए जाते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: प्रोटिओमिक डाटासेट (s) मान्य और महत्वपूर्ण समर्थक का निर्धारण करने के लिए कदमTein उम्मीदवारों। (ए) प्रोटिओमिक डाटासेट (एस) से महत्वपूर्ण प्रोटीन उम्मीदवारों का निर्धारण करने के फ़्लोचार्ट। इन चार चरणों महत्वपूर्ण उम्मीदवारों की विश्वसनीय चयन किया जाता है। सबसे पहले, एक SILAC अनुपात हिस्टोग्राम डेटा की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए साजिश रची है। अगले, कम आदर्श उम्मीदवार है कि सटीकता को कम कर सकता हटा रहे हैं। तीसरे चरण में, सांख्यिकीय तरीकों संभावित उम्मीदवारों के लिए प्रोटीन महत्व थ्रेसहोल्ड स्थापित करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। अंत में, महत्वपूर्ण उम्मीदवारों में से दोहराने डेटा स्थिरता के लिए विश्लेषण कर रहे हैं और अंत में विलय कर रहे हैं। (बी) SILAC अनुपात के प्रतिनिधि हिस्टोग्राम। हिस्टोग्राम अनुपात = 1 (log2 = 0) प्रवृत्ति रेखा के साथ सममित वितरण का पता चला। log2 तब्दील अनुपात के अनुपात डिब्बे में बांटा जाता है, और y अक्ष बिन प्रति का पता चला अनुपात की रिश्तेदार संख्या दर्शाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: महत्वपूर्ण उम्मीदवारों के लिए कुल मिलाकर जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण और डेटा खनन प्रक्रियाओं। प्रक्रियाओं exosomal और एचआईवी -1 / मेजबान डेटा खनन, जीन आंटलजी लक्षण वर्णन, डेविड विश्लेषण और नेटवर्क पूर्वानुमान होते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: जीन आंटलजी लक्षण वर्णन, संवर्धन प्रदर्शन करने के लिए कदम है, और मार्ग का विश्लेषण करती है। (ए) जीन आंटलजी (जाओ) लक्षण वर्णन प्रदर्शन करने के लिए कदम। एप्लिकेशन का उपयोग कर जाने विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए कार्य करता है और महत्वपूर्ण उम्मीदवारों की subcellular localizations, कदम की जानकारी हासिल करने के लिएropriate सॉफ्टवेयर 26 सचित्र हैं। (बी) जाओ टर्म संवर्धन विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए कदम। महत्वपूर्ण उम्मीदवारों के संवर्धन में जानकारी हासिल करने के लिए, डेविड विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए संक्षिप्त कदम दिखाए जाते हैं। (सी) और बातचीत के मार्ग विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए कदम। संभावित रास्ते को स्पष्ट और कार्यात्मक भागीदारों, STRING से बातचीत या नेटवर्क विश्लेषण प्रदर्शन दिखाए जाते हैं, करने के लिए कदम लगता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: के प्रतिनिधि डेविड और स्ट्रिंग विश्लेषण का परिणाम है। डेविड विश्लेषण द्वारा चौदह उम्मीदवारों की (ए) बीपी संवर्धन का परिणाम है। कोशिका मृत्यु से संबंधित प्रक्रियाओं में काफी समृद्ध है। (बी) सीसी enrichmen डेविड विश्लेषण द्वारा चौदह उम्मीदवारों की टी का परिणाम है। कई प्रोटीन एक intracellular मूल है। डेविड विश्लेषण द्वारा चौदह उम्मीदवारों की (सी) बीपी संवर्धन का परिणाम है। उम्मीदवारों के अधिकांश बाध्यकारी प्रोटीन में भाग लेते हैं। (डी) शीर्ष दस STRING द्वारा की पहचान LDHB के भागीदारों बातचीत। (ई) LDHB भागीदारों के बहुमत भी exosome और एचआईवी -1, जो आगे exosome / एचआईवी -1 में LDHB की भूमिका का समर्थन करता है के साथ जुड़े रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका एक
तालिका 1: महत्वपूर्ण प्रोटीन गड़बड़ी के लिए कटऑफ मूल्यों के प्रतिनिधि गणना।

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तालिका 2: एचआईवी -1 के साथ SILAC उम्मीदवारों और उनके exosomal localizations और बातचीत के बीच संघों।

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Discussion

प्रक्रियाओं इस पत्र में वर्णित में, हम मेजबान exosomal proteome पर एचआईवी -1 संक्रमण के प्रभाव की जांच करने के लिए SILAC तकनीक के आवेदन का प्रदर्शन किया। प्रारंभ में, असंक्रमित और एचआईवी -1 से संक्रमित कोशिकाओं विभिन्न आइसोटोप-लेबल रहे हैं। विभिन्न लेबल exosomes तो प्रोटीन निकासी के प्रदर्शन से पहले शुद्ध कर रहे हैं। अगले, तरल क्रोमैटोग्राफी-मिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री exosomal proteome विश्लेषण करने के लिए कार्यरत है। अंत में, जिसके परिणामस्वरूप मास स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा और संभावित उम्मीदवार प्रोटीन सांख्यिकीय और जैव सूचना विज्ञान के अधीन हैं बहाव के जैव रासायनिक विच्छेदन से पहले का विश्लेषण करती है।

प्रोटोकॉल भर में महत्वपूर्ण कदम अनुकूलित परिणाम प्राप्त करने के लिए पीछा किया जा करने की जरूरत है। प्रोटोकॉल के प्रारंभिक दौर में, SILAC लेबलिंग सेल प्रकार और लेबलिंग मध्यम से प्रभावित किया जा सकता है। स्वस्थ और अत्यधिक proliferative कोशिकाओं को एक उच्च लेबलिंग दक्षता प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। गंभीर, लेबलिंग मीटरedium हौसले dialyzed भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के बजाय नियमित FBS का उपयोग कर तैयार किया जाना चाहिए। Dialyzed FBS अमीनो एसिड और पेप्टाइड्स के समाप्त हो और, इसलिए, कम SILAC लेबलिंग के साथ हस्तक्षेप करने की संभावना है। यह, हालांकि, ध्यान दिया जाना चाहिए कि dialyzed सीरम कुछ सेल लाइनों, विशेष रूप से प्राथमिक कोशिकाओं के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता। dialyzed FBS के साथ मध्यम में सामान्य वृद्धि SILAC रणनीति काम करने से पहले पुष्टि की जानी चाहिए। इसके अलावा, डबल "भारी" आइसोटोप लेबलिंग का उपयोग (13 सी 6 एल लाइसिन और 13 सी 6 15 एन 4 एल arginine) 13 सी 6 एल Lysine अकेले उपयोग करने के बजाय, मास स्पेक्ट्रोमेट्री में मात्रा निर्धारित पेप्टाइड्स की संख्या में वृद्धि कर सकते हैं विश्लेषण। सफल बाद proteome विश्लेषण के लिए आवश्यक कोशिकाओं की न्यूनतम संख्या कई कारकों पर निर्भर करता है, मास स्पेक्ट्रोमीटर, प्रत्येक कोशिका के जन, और proteome की ऐसी संवेदनशीलता लक्षित (पूरे proteome या बाद translational संशोधित प्रोटीन)। हमारे निष्कर्ष के आधार पर हमने मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए आवश्यक कोशिकाओं की उपयुक्त संख्या का आकलन करने में एक प्रारंभिक राशि के रूप में दस लाख कोशिकाओं सलाह देते हैं।

सेल संस्कृति supernatants से Exosome अलगाव के रूप में निम्नानुसार एक निस्पंदन कदम जोड़कर में सुधार किया जा सकता है। कोशिकाओं के निलंबन के लिए, 10 मिनट के लिए 200 XG पर एक प्रारंभिक centrifugation कदम एक 0.22 माइक्रोन फिल्टर के 29, 30 के माध्यम से सतह पर तैरनेवाला में निलंबित कर दिया कोशिकाओं, निस्पंदन द्वारा पीछा दूर करने के लिए किया जाता है। पक्षपाती कोशिकाओं के लिए, सतह पर तैरनेवाला संस्कृति से सीधे एकत्र की है और एक ही तरीके से फ़िल्टर किया जा सकता है। छानने का काम इस तरह के छोटे अणुओं और पेप्टाइड्स के रूप में दूषित सामग्री, से exosomes अलग करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है। exosomes तो शास्त्रीय ultracentrifugation विधि का उपयोग कर, या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध exosome अलगाव अभिकर्मकों किट का उपयोग कर सतह पर तैरनेवाला से अलग किया जा सकता है। exosome की पवित्रता nanoparti द्वारा सत्यापित किया जा सकताCLE ट्रैकिंग विश्लेषण या इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 31।

चूंकि एचआईवी -1 virions आम तौर पर exosomes के आकार में समान हैं, वे एचआईवी -1 से संक्रमित नमूनों से शुद्ध exosomes दूषित हो सकता है। प्रोटिओमिक स्क्रीन में, संभावित वायरल दूषित पदार्थों को केवल मानव प्रोटीन के लिए डेटाबेस खोज को सीमित करके बाहर फ़िल्टर किया जा सकता है। ऐसे iodixanol घनत्व ढ़ाल और immunoaffinity अलगाव के रूप में स्थापित तरीकों का उपयोग कर आगे अलगाव की तकनीक भी exosomes 32 से अलग करने के लिए एचआईवी -1 virions, 33 का इस्तेमाल किया जा सकता है।

अगला, हम विश्वसनीय डेटा विश्लेषण सुनिश्चित करने के लिए एक बार एमएस परिणाम पृथक exosomes से प्राप्त कर रहे हैं संभावित महत्वपूर्ण उम्मीदवारों की पहचान करने के लिए कुछ सुझाव पर चर्चा की। विश्लेषण के प्रारंभिक चरण में, SILAC अनुपात हिस्टोग्राम एक सामान्य वितरण का पालन करना चाहिए। डेटा वितरण एक विशेष दिशा में विषम है, तो पाठक वें निर्धारित करने की आवश्यकता होगीई विश्लेषण के साथ आगे बढ़ने से पहले का कारण। उदाहरण के लिए, लेबल और लेबल हटाया गया नमूने बराबर अनुपात में मिलाया नहीं हो सकता है। इसके अलावा, कुछ पेप्टाइड्स भारी / प्रकाश SILAC अनुपात मूल्यों नहीं हो सकता है, और संभावित प्रोटीन उम्मीदवारों से समाप्त किया जाना चाहिए। बाद उम्मीदवारों का चयन कर रहे हैं, सॉफ्टवेयर और डेटाबेस के परीक्षण की स्थिति, और संभव रास्ते के साथ exosome संवर्धन, बातचीत सत्यापित करने के लिए नियोजित किया जा सकता है। उम्मीदवार प्रोटीन और परीक्षण हालत के बीच बातचीत जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण से पहले विशिष्ट डेटाबेस के माध्यम से खनन किया जाना चाहिए। जैव सूचना विज्ञान अभिलक्षण के लिए, जीन आंटलजी एनोटेशन विभिन्न सॉफ्टवेयर और डेटाबेस का उपयोग कर पहचाना जा सकता है,

यहाँ कार्यरत SILAC तकनीक मेजबान exosomal proteome का विश्लेषण करने के लिए एक व्यवस्थित और स्पष्ट दृष्टिकोण प्रदान करता है। अधिकांश जैव चिकित्सा प्रयोगशालाओं न्यूनतम अतिरिक्त उपकरण और अतिरिक्त लागत के साथ प्रक्रियाओं को अपनाने में सक्षम हो जाएगा। SILAC तकनीक, हालांकि, मुख्य रूप से डे हैसेल लाइनों का उपयोग कर अध्ययन के लिए हस्ताक्षर किए। जैसे, अन्य तरीकों अलग अलग जैविक नमूने का अध्ययन करने के लिए नियोजित किया जाना पड़ सकता है। उदाहरण के लिए, लेबल मुक्त एमआरएम (एकाधिक प्रतिक्रिया निगरानी) विधि नैदानिक नमूनों 9, 34 में प्रोटीन और पेप्टाइड्स की लक्षित मात्रा का ठहराव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। कई अध्ययनों से प्रोटीन सामग्री का निर्धारण करने के मामले में रहते हुए, SILAC तकनीक को भी दो या दो से अधिक नमूनों की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। रासायनिक लेबलिंग विधि iTRAQ या टीएमटी आधारित (मिलकर बड़े पैमाने पर टैग) के तरीकों में काफी ज्यादा बहुसंकेतन की अनुमति है और कई नमूने के लिए बेहतर अनुकूल होगा (सापेक्ष और निरपेक्ष मात्रा का ठहराव के लिए समदाब रेखीय टैग)।

यहाँ वर्णित प्रक्रिया एचआईवी -1 से संक्रमित कोशिकाओं से exosomes की प्रोटिओमिक लक्षण वर्णन करने के लिए सीमित नहीं है। संशोधनों के साथ, यह इस तरह के जीवाणु संक्रमण, वायरल संक्रमण, और रेड के रूप में परीक्षण और तनाव की स्थिति की एक विस्तृत श्रृंखला के तहत exosomes का विश्लेषण करने के लिए अनुकूलित किया जा सकताiation। यह भी अन्य subcellular डिब्बों के अध्ययन के लिए उपयुक्त है।

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Acknowledgments

इस काम के लिए बीआर उम्र / टफ्ट्स / ब्राउन CFAR, P30AI042853-13S1, एनआईएच P20GM103421, P01AA019072, R01HD072693, और K24HD080539 के लिए एक ARRA पूरक द्वारा समर्थित किया गया। यह काम भी उम्र पायलट रिसर्च फंड (# 701- 5857), रोड आइलैंड फाउंडेशन चिकित्सा अनुसंधान अनुदान (# 20133969), और एनआईएच COBRE URI / RIH पायलट अनुसंधान माले के लिए अनुदान (P20GM104317) द्वारा समर्थित किया गया। हम पांडुलिपि और आंकड़ा तैयारी के साथ मदद के लिए जेम्स मेयॉल और Vy डांग धन्यवाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
H9 cell line ATCC HTB-176
Trypan Blue Thermo Fisher 15250061
MTT assay kit Thermo Fisher V13154
Dialyzed fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher 26400044
SILAC Protein Quantitation Kit – RPMI 1640 Thermo Fisher 89982 DMEM version (89983)
L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 for SILAC Thermo Fisher 88434
L-Lysine-2HCl, 13C6 for SILAC Thermo Fisher 88431
HIV-1 NL4-3 NIH AIDS Reagent Program 2480
Alliance HIV-1 p24 Antigen ELISA kit PerkinElmer NEK050001KT
Refrigerated super-speed centrifuge Eppendorf 22628045
Refrigerated ultracentrifuge Beckman Coulter 363118 Should be able to reach 100,000 x g
50 mL Conical Centrifuge Tubes Thermo Fisher 14-432-22
Ultracentrifuge Tubes Beckman Coulter 326823
SW 32 Ti Rotor Beckman Coulter 369694
RIPA buffer Thermo Fisher 89900
Protease Inhibitor Cocktails Thermo Fisher  78430
ThermoMixer  Eppendorf 5384000020
BCA Protein Assay Kit  Thermo Fisher 23250
Spectrophotometer Biorad 1702525
SDS PAGE Gel apparatus Thermo Fisher EI0001
Novex 4-20% Tris-Glycine Mini Gels Novex XV04200PK20
Gel staining reagent Sigma Aldrich G1041
Sequencing Grade Modified Trypsin Promega V5111
SpeedVac Concentrator Thermo Fisher SPD131DDA
Antibody to human annexin A5 Abcam ab14196
Antibody to human lactate dehydrogenase B chain Abcam ab53292
Graphing and Statistical Software Systat  SigmaPlot  Or GraphPad Prism
Quantitative proteomics software suite Max Planck Institue of Biochemistry Maxquant 
Software and databases Various vendors Refer to main text for details

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References

  1. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), 968-977 (2016).
  2. Schorey, J. S., Bhatnagar, S. Exosome function: from tumor immunology to pathogen biology. Traffic. 9 (6), 871-881 (2008).
  3. Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
  4. Booth, A. M., et al. Exosomes and HIV Gag bud from endosome-like domains of the T cell plasma membrane. J Cell Biol. 172 (6), 923-935 (2006).
  5. Van Engelenburg, S. B., et al. Distribution of ESCRT machinery at HIV assembly sites reveals virus scaffolding of ESCRT subunits. Science. 343 (6171), 653-656 (2014).
  6. Li, M., et al. Quantitative proteomic analysis of exosomes from HIV-1-infected lymphocytic cells. Proteomics. 12 (13), 2203-2211 (2012).
  7. Ong, S. E., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
  8. Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
  9. Anderson, L., Hunter, C. L. Quantitative mass spectrometric multiple reaction monitoring assays for major plasma proteins. Mol Cell Proteomics. 5 (4), 573-588 (2006).
  10. Ong, S. E., Mann, M. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture for quantitative proteomics. Methods Mol Biol. 359, 37-52 (2007).
  11. Strober, W. Current Protocols in Immunology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  12. Verma, A., et al. Evaluation of the MTT lymphocyte proliferation assay for the diagnosis of neurocysticercosis. J Microbiol Meth. 81 (2), 175-178 (2010).
  13. Cepko, C., Pear, W. Retrovirus infection of cells in vitro and in vivo. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 9 Unit9.14 (2001).
  14. Lennette, E. T., Karpatkin, S., Levy, J. A. Indirect immunofluorescence assay for antibodies to human immunodeficiency virus. J Clin Microbiol. 25 (2), 199-202 (1987).
  15. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3 22 (2006).
  16. Olson, B. J. S. C., Markwell, J. Current Protocols in Protein Science. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  17. Gauci, V. J., Padula, M. P., Coorssen, J. R. Coomassie blue staining for high sensitivity gel-based proteomics. J Proteom. 90, 96-106 (2013).
  18. Soldi, M., Bonaldi, T. The ChroP approach combines ChIP and mass spectrometry to dissect locus-specific proteomic landscapes of chromatin. J Vis Exp. (86), (2014).
  19. Trompelt, K., Steinbeck, J., Terashima, M., Hippler, M. A new approach for the comparative analysis of multiprotein complexes based on 15N metabolic labeling and quantitative mass spectrometry. J Vis Exp. (85), (2014).
  20. Li, M., et al. Stem-loop binding protein is a multifaceted cellular regulator of HIV-1 replication. J Clin Invest. 126 (8), 3117-3129 (2016).
  21. Li, M., Ramratnam, B. Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1-Infected Cells. Methods Mol Biol. 1354, 311-326 (2016).
  22. Emmott, E., Goodfellow, I. Identification of protein interaction partners in mammalian cells using SILAC-immunoprecipitation quantitative proteomics. J Vis Exp. (89), (2014).
  23. Keerthikumar, S., et al. ExoCarta: A Web-Based Compendium of Exosomal Cargo. J Mol Biol. 428 (4), 688-692 (2016).
  24. Kim, D. K., et al. EVpedia: a community web portal for extracellular vesicles research. Bioinformatics. 31 (6), 933-939 (2015).
  25. Fu, W., et al. Human immunodeficiency virus type 1, human protein interaction database at NCBI. Nucleic Acids Res. 37, Database issue 417-422 (2009).
  26. Pathan, M., et al. FunRich: An open access standalone functional enrichment and interaction network analysis tool. Proteomics. 15 (15), 2597-2601 (2015).
  27. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).
  28. Szklarczyk, D., et al. The STRING database in 2011: functional interaction networks of proteins, globally integrated and scored. Nucleic Acids Res. 39, Database issue 561-568 (2011).
  29. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3.22 (2006).
  30. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).
  31. Webber, J., Clayton, A. How pure are your vesicles. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
  32. Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. Discrimination between exosomes and HIV-1: purification of both vesicles from cell-free supernatants. J Immunol Methods. 338 (1-2), 21-30 (2008).
  33. Chertova, E., et al. Proteomic and biochemical analysis of purified human immunodeficiency virus type 1 produced from infected monocyte-derived macrophages. J Virol. 80 (18), 9039-9052 (2006).
  34. Nikolov, M., Schmidt, C., Urlaub, H. Quantitative mass spectrometry-based proteomics: an overview. Methods Mol Biol. 893, 85-100 (2012).

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संक्रमण अंक 121 Exosomes बाह्य वाहन एचआईवी -1 प्रोटिओमिक्स मास स्पेक्ट्रोमेट्री SILAC जैव सूचना विज्ञान
एचआईवी -1 संक्रमित कोशिकाओं से Exosomes की SILAC आधारित प्रोटिओमिक विशेषता
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Cheruiyot, C., Pataki, Z., Williams, … More

Cheruiyot, C., Pataki, Z., Williams, R., Ramratnam, B., Li, M. SILAC Based Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1 Infected Cells. J. Vis. Exp. (121), e54799, doi:10.3791/54799 (2017).

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