Summary
在这里，我们描述了使用通过在细胞培养物（SILAC）氨基酸稳定同位素标记的技术来分析HIV-1感染的主机外来体蛋白质组的作用的定量蛋白质组学方法。该协议可以很容易地适应于不同的压力或感染的条件下的细胞。
Introduction
许多人类疾病，包括病毒感染，通常与所发生和周围的影响的细胞独特的细胞过程有关。蛋白质，经常充当最终细胞效应，调解这些进程。蛋白质的分析往往可以提供宝贵的资料，受影响细胞的局部环境，并帮助我们理解疾病的发病机制的基本机制。在各种蛋白质分析技术，蛋白质组学拥有特别大的承诺。作为一个强大的，大规模的工具，蛋白质组学可以提供细胞过程的全身性的了解，特别是在功能和蛋白质相互作用的区域。判断特定蛋白质是通过标记技术，它允许研究者监测细胞成分，特别是蛋白质的表达的发展作出了简单，在调查的部位。虽然许多蛋白质组学分析都在细胞被执行蛋白质组的规模，对亚细胞区室蛋白质组学表征已被证明是特别信息1。这是在HIV-1感染的研究很好的例子。
外来体，通过广泛的细胞类型2，3，分泌30-100纳米膜囊泡间通讯以及分子运输的关键组成部分。他们先前发现的HIV-1出芽过程4,5发挥重要作用。通过蛋白质组学分析与解剖功能结合起来，我们发现，从HIV-1感染的细胞释放的外来体是由一个独特的和定量不同的蛋白质的签名和港口监管分子在邻国接受细胞，包括细胞凋亡与增殖6影响细胞特性的。该方法在此协议中描述，即SILAC从HIV-1感染细胞的外来体7基于蛋白质组学表征（在细胞培养物中的氨基酸稳定同位素标记）。类似的方法可以适用于通过调整试验应力的特定隔室或感兴趣的级分，使对所描述的程序进行必要的更改更好地理解发病期间其他亚细胞区室。
鉴于最近的定量蛋白质组学方法的发展，有许多从选择最有效的方法为一个特定的实验时选择。其中包括基于化学的iTRAQ（用于相对和绝对定量的等压标记）8和无标记MRM（多反应监测）9技术。这两种方法是强大的工具，并且是特定的设置很好的选择。对于一个典型的实验室主要与细胞系的工作，然而，这两种方法具有relativelÿ较高的成本，而且更费时相比SILAC基础的方法时。 SILAC是一个基于代谢标记技术并入的氨基酸从培养基进入细胞蛋白质的非放射性的同位素形式。通常情况下，SILAC实验开始与两种细胞群体，例如，感染和未感染的。每个不同标记在其特定的同位素环境满为止标注的实现。然后这些细胞的标记的外来体经受蛋白提取。一旦萃取，将标记的外来体的蛋白质是使用液相色谱串联质谱法10进行分析。最后，质谱结果和显著标记的蛋白质经受统计和生物信息学分析以及严格生物化学验证。我们以前的研究报告表明，SILAC /外来体程序更适合的细胞系比初级细胞，如细胞系通常是在一个活跃的增殖状态高效同位素标记，
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Protocol
1.细胞培养和HIV-1感染
注：在开始实验之前，建议通过MTT法12以检查细胞的通过台盼蓝染色11和生存能力它们的增殖。它也使用新制备SILAC介质的关键。各种细胞系都可以使用，只要它们是在一个主动增殖阶段，很容易受到HIV-1感染，或所选择的测试条件。在这个协议中，使用的H9细胞系作为例子。
- 种子2×10 6个 H9细胞到每个细胞培养瓶。生长一组在标有含有10％透析的胎牛血清（FBS），100毫克/升13 C 6 -L-赖氨酸和100毫克/升13 C- 6 15 N 4 L-精氨酸的RPMI 1640培养基中10毫升生长另一组在10毫升的未标记的RPMI 1640培养基中，用透析的FBS 10％，100毫克/升的L-赖氨酸和100mg / L的L-精氨酸。
- 生长的细胞与重氨基酸在该点在标记的培养基中的细胞的蛋白质实际上完全标记6倍增（> 99％）。 （取决于细胞类型每1-3天。对于H9细胞，改变每3天培养基）添加新鲜的培养基或定期更换介质。在标记结束时，增加培养物体积（ 例如约30毫升），以容纳更多的细胞的生长。
注：确定确切细胞在通过台盼蓝染色和细胞计数实验开始倍增时间。 - 感染标记细胞HIV-1 NL4-3使用标准的HIV-1感染的协议13 48小时用。孵育适当量的病毒与感染的周围0.3复数（MOI）将细胞。通过使用HIV-1 p24抗原ELISA试剂盒培养上清液的P24定量检查HIV-1感染。执行免疫荧光法14来确认细胞的成功感染。记p在不断增加中未标记的未标记的细胞无HIV-1感染。
- 在感染结束时（步骤2.1）收获两组上清液。
2.外来体隔离
注：通过一系列的步骤，超速离心从培养上清液外体组分富集15。执行在4℃以下所有步骤，用超速离心机转子，可以达到至少100,000×g的速度。
- 收集培养物上清液在50ml锥形管中，避免了细胞。离心他们在300 xg离心10分钟以除去剩余的细胞。
- 收集在新50ml锥形管中的上清液并在2000 xg离心离心它们10分钟，以去除死细胞。转让所得上清液商业转子兼容管是能够承受超离心。
- 一定要平衡超速离心管。离心30分钟试管以10,000 xg离心以除去细胞碎片。
- 收集70分钟的超速离心管上清和离心机在100,000×g的。弃去上清液。
- 悬浮丰富的外来体颗粒在5毫升新鲜的PBS。在100,000×g的重新传送解决方案，以新鲜的超速离心管，离心70分钟。
- 丢弃上清液。来存储外来体长期，悬浮颗粒在50μlPBS中并存储在-80℃。或者，如下所示直接进行蛋白质提取。
3.蛋白提取和准备
- 溶解在添加了蛋白酶抑制剂鸡尾酒100-200微升的RIPA裂解和提取缓冲液分离外来体粒料。缓冲区是由25毫摩尔Tris-盐酸盐，150mM氯化钠，1％NP-40，1％脱氧胆酸钠和0.1％SDS（十二烷基硫酸钠）的，在pH 7.6。蛋白酶抑制剂鸡尾酒应含有多种蛋白酶抑制剂，如抑肽酶，苯丁抑制素，升eupeptin，胃蛋白酶抑制素A和EDTA（乙二胺四乙酸），能够抑制全方位的蛋白酶。
- 以13,000 xg离心（4℃）离心10分钟溶解的解决方案，以及清除上清液转移至新的1.5 ml微量离心管。
- 量化使用二辛可宁酸（BCA）或Bradford测定16的外来体的各样品的蛋白质浓度。
- 混合蛋白质从标记和未标记的样品等量（2微克），并在120毫安/运行在4-20％SDS-PAGE凝胶的等量混合物200伏30分钟。
- 随后脱色17用考马斯蓝染色凝胶。
- 用刀片从凝胶上切样品车道。然后切泳道成10-15等份。把每一块到一个新的1.5 ml离心管，总共10-15管。
- 沉浸在立方体25毫米NH 4 HCO 3在50％乙腈，旋涡，并丢弃上清液。重复两次。干立方体在真空浓缩器18，19。
- 再水合用10mM二硫苏糖醇（DTT），涡旋，并短暂离心立方体。孵育在56℃进行1小时。弃上清。
- 沉浸凝胶立方体55毫米碘乙酰胺，漩涡和旋转。在室温下孵育在黑暗中45分钟。弃上清。
- 浸入25毫米NH 4 HCO 3，旋涡，旋转立方体，弃上清。
- 沉浸在立方体25毫米NH 4 HCO 3在50％乙腈，涡旋和旋转。重复3.9和3.10。
- 干燥，在真空浓缩的立方体。添加25μl的测序级改良的胰蛋白酶在25mM的NH 4 HCO 3，孵育在4℃下进行30分钟，并弃去过量的溶液。浸入25毫米NH 4 HCO 3立方体没有胰蛋白酶，和孵育过夜在37℃。
- 旋转简要立方体下来，转移所产生的肽的额外克拉到新管中。在50％乙腈中添加30微升的5％的甲酸的立方体，涡旋30分钟，和自旋。结合上清液用提取物。干燥用真空浓缩所述肽萃取到小于5微升。
- 提交样品质谱核心设施用于LC-MS / MS分析。该MS分析数据，其可以从开放源码软件来产生，典型地包括用于标识的每个蛋白的登录号，标记/未标记的比率，并确定了独特肽的数量。
4.免疫印迹验证
注：Western印迹，建议以验证质谱结果。
- 遵循标准Western印迹协议和保证蛋白的从各组等量装载。使用由MS来识别针对目标蛋白的抗体（ 例如膜联蛋白A5，乳酸脱氢酶B链）。免疫印迹检测，符合密度analysi一起S，可以重申，MS蛋白质鉴定和定量是正确的。
5.蛋白质组数据分析
注：每个MS复制显著蛋白质候选人的数据质量评估，数据预处理，计算和确定单独完成。一旦上述分析完成后，从重复分析的数据进行比较和组合6，20，21。
- 评估MS数据的质量。
- 首先，LOG2改造SILAC-MS标记/定量蛋白质未标记的比例在电子表格程序。
- 在科学绘图和统计软件，组的比例为40-100比箱并绘制每仓比的数目，以产生一个直方图。直方图的正态分布表示MS数据6的优良品质。做到这一步对所有MS复制。
- 为了提高MS肽比率的信心和准确性，考虑取消有不到两个量化肽蛋白。
- 要确定显著上调和下调的蛋白质的考生，请使用以下步骤计算阈值的意义22。
- 在科学绘图和统计软件，生成一个非线性回归或曲线拟合到频率分布数据。此步骤产生可用于计算截止值的值。计算的截止值作为平均±1.96σ为95％置信限或2.56σ为99％置信限。
注：计算临界值的具体情况可以在艾默特等人发现。 22。 - 选择的候选蛋白质的比例，其要么是大于1.96（或2.56）的标准偏差的中位数（显著过表达）高于或低于1.96（或2.56）标准差低于中位数（显著下表达）。
- 在科学绘图和统计软件，生成一个非线性回归或曲线拟合到频率分布数据。此步骤产生可用于计算截止值的值。计算的截止值作为平均±1.96σ为95％置信限或2.56σ为99％置信限。
- 比较上述标题显著候选人的重复来实现的一致性。确保它们符合以下条件，通过这最后的选择步骤：考生必须在所有重复被一致确定;和候选的重复必须在其调节的方向是一致的（优选地，至少2选自候选的3个重复的要么是上调或下调）。
- 最终确定由合并他们重复'数据符合上述标准的候选人的数据。
6.生物信息学检验和检定
注：现有基因组和生物信息学的信息提供了丰富的信息，几乎所有的蛋白质。数据挖掘和生物信息学分析这些信息可以深入了解大量进入显著候选人的财产和功能的帮助。这PROCESS通常是必要的，以设计恰当下游湿实验室实验。
- 使用他们的GenBank登记号或的UniProt的ID，搜索针对当前外来体数据库的候选人（Exocarta 23 Evpedia 24），以验证该候选蛋白已在外来体先前已经找到。这一步增加了信心层的考生确实在外来体。
- 访问http://www.exocarta.org/，点击“查询”输入无论是基因或蛋白质名称/登录号。摘要页面将出现，并在外来体的证据将显示，提供，如果有任何。
- 搜索针对HIV-1和人类蛋白质相互作用数据库25的候选者。可替代地，搜索特定数据库能够提供关于所述候选蛋白质的相互作用和测试条件的信息。
- 在www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/HIV访问数据库互动。在“蛋白质域名”条目，输入候选人的名称或登录号，然后点击搜索。搜索结果可以提供深入的HIV-1与蛋白质候选人之间的相互作用，并提出它的候选人可能是真正的HIV-1相关联。
- 进口GenBank登记号或考生进入GO分析软件（如FunRich，功能丰富的分析工具26）的UniProt ID和运行该软件。
- 下载在http://www.funrich.org/软件。安装完成后，打开软件，在富集分析，单击“添加数据集”，并上传的蛋白质/基因名单。接下来，选择图表类型的可视化分析GO。
注：GO的分析结果将在饼图的形式显示。此步骤有助于我们获得与生物过程（BP），蜂窝组件等领域的考生有关环球透视（CC）和分子功能（MF）。
- 下载在http://www.funrich.org/软件。安装完成后，打开软件，在富集分析，单击“添加数据集”，并上传的蛋白质/基因名单。接下来，选择图表类型的可视化分析GO。
- 访问DAVID在http://david.ncifcrf.gov/ 27，点击其网站上的“功能性注释工具”。进入候选列表中，选择基因“标识”，如“的UniProt ID”，选择“基因名单”和搜索。富集的GO术语，p值等参数可以通过点击在“Gene_Ontology”类别中的“注释摘要结果”页面中找到。
- 调查与其他蛋白质的候选潜在的相互作用，可以使用公开地可访问STRING数据库28阐明潜在的蛋白-蛋白相互作用和可能的生化途径。
注：GO分析和功能注释（6.3-6.4节），也可以使用最新的软件STRING执行。- 在http://string-db.org/访问数据库。输入的蛋白质ID或子序列插入为S操作搜索框，然后选择分析正确的物种。点击“搜索”。结果会就直接（物理）和间接（功能）协会的信息。对于外来体的候选人的十大知名匹配结果将显示，并应考虑显著候选人的选择。
注：与考生相关的大量信息可以使用上面的步骤进行分析。最显著候选可以被选择用于进一步下游分子和生化分析。
- 在http://string-db.org/访问数据库。输入的蛋白质ID或子序列插入为S操作搜索框，然后选择分析正确的物种。点击“搜索”。结果会就直接（物理）和间接（功能）协会的信息。对于外来体的候选人的十大知名匹配结果将显示，并应考虑显著候选人的选择。
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Representative Results
图1A是概述SILAC标记程序21的流程图。为了净化外来体，样品必须通过离心纺丝下来。 图1B示出了通过串行超速离心21外来体纯化的步骤。一旦纯化，如在程序中概述的外来体受实验蛋白质组学分析。
图2A是用于从蛋白质组数据21确定显著蛋白候选的流程图。选定的候选随后用于下游蛋白质组学分析。 图2B是显示SILAC直方图的一个例子的典型蛋白质定量的结果代表比（该图是从Li 等修改。6），和表1是一个确定从这些SILAC比率柱状图显著候选人6临界值的n个例子。按照6.3节中描述的步骤，计算确定显著上调或下调蛋白质的临界值。在该代表性数据集，与上截断值之上的重/轻（H / L）比值蛋白作为显著上调考虑，而与下面的下截止值的H / L比率的蛋白质作为显著下调考虑。显著监管候选蛋白会遭到进一步的调查。
图3显示所选候选人显著的整体生物信息学分析和数据挖掘的过程。 表2是利用外来体和HIV-1 /宿主相互作用数据库6收集（对考生信息此选项卡数据挖掘的例子乐已从Li 等改性。 6）。通过挖掘现有外来体和HIV-1 /宿主相互作用的数据库，十三出十四个候选人被发现有外来体关联。另据了解五出十四个候选人与HIV-1相互作用。其中，四名候选人（HSPA4，热休克70 kDa蛋白4; LDHB，L-乳酸脱氢酶B链NUTF2，核运输因子2; PTGES3，前列腺素E合成酶3）被发现与两个外来体和HIV-1相关联。其中HSPA4，NUTF2，PTGES3和LDHB，只有LDHB是一贯低表达在受感染的部分（重标记）。通过一系列的分析中，我们选择LDHB是最显著候选，这可能进行进一步的研究。下游蛋白质组学分析显示在图4图4A显示了基因本体（GO）分析简要步骤; 图4B所示执行DAVI的步骤三维分析; 图4C显示了如何使用字符串来执行网络分析。 图5A，5B，和5C是一组中的BP，CC和MF 14蛋白质的DAVID数据; 图5D显示LDHB十大交互伙伴; 图5E显示大多数LDHB的互动合作伙伴也与外来体和HIV-1有关。初步分析DAVID结果表明，很多考生都是凋亡相关并有可能参与蛋白结合。另外STRING分析证实，LDHB约束力的合作伙伴也功能上和locationally有关切体和HIV-1。所有这些结果给潜在的下行调查的有价值的信息。
图1：SILAC标记和使用差分超速离心纯化的外来体。（A）细胞的两组分别种植。一组是生长在培养基标记六个倍增完整标签。另一组是生长在同一时期正常未标记的网上平台。接着，将标记的细胞感染了HIV-1，而未标记细胞不是。最后，来自两组外来体被隔离在平行。 （B）中的样品在每个步骤中的离心分离使用（上清液或粒料）在试管表示。要被丢弃的级分上试管的右侧被注意到。的速度和每个离心长度也示。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：步骤验证蛋白质组学数据集（S），并确定显著亲蛋白质的候选人。从蛋白质组学数据集（S）确定显著蛋白候选人（A）流程图。这四个步骤确保显著候选人的可靠选择。首先，SILAC比直方图绘制评估数据的质量。能够降低准确性接着，少的理想候选都被删除。在第三步骤中，统计方法被用于设置为潜在的蛋白的候选意义的阈值。最后，显著候选人的复制数据进行分析的一致性，并最终合并。 （B）的SILAC比率的代表性直方图。直方图显示沿比= 1（LOG2 = 0）趋势线对称分布。所述LOG2转化率被分成比仓，而y轴示出每个仓检测比的相对数。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：显著考生总体的生物信息学分析和数据挖掘的过程。该过程包含外来体和HIV-1 /主机数据挖掘，基因本体特征，DAVID分析和网络预测。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：步骤进行基因本体特征，丰富和途径分析。 （A）的步骤进行基因本体论（GO）的表征。为了获得的功能和显著候选人的亚细胞定位，步骤有识之士使用的应用程序进行分析GOropriate软件26中示出。 （B）的步骤执行GO期限富集分析。为了获得显著考生充实资料，进行分析DAVID简要步骤所示。 （C）的步骤进行互动和路径分析。为了阐明可能的途径和发现功能的合作伙伴，步骤都经STRING进行交互或网络分析。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5：代表DAVID和STRING分析结果。十四候选人DAVID分析（ 一 ）BP富集的结果。细胞死亡相关的流程显著丰富。 （B）CC enrichmen十四候选人DAVID分析Ť结果。许多蛋白质有一个内起源。十四候选人DAVID分析（ 三 ）BP富集的结果。大多数考生参加蛋白结合。 （ 四 ）前十名交互由字符串标识LDHB的合作伙伴。 （E）大多数LDHB合作伙伴也与外来体和HIV-1，这进一步支持LDHB的外来体/ HIV-1的作用有关。 请点击此处查看该图的放大版本。
表1：显著蛋白质的摄临界值的计算代表。
e2.jpg“/>
表2：SILAC考生和外体本地化和互动之间的关联与HIV-1。
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Discussion
在本文中描述的方法，我们证明了SILAC技术的应用来调查HIV-1感染的主机上的外来体蛋白质组的效果。最初，未感染和HIV-1感染的细胞中差异同位素标记。然后差异标记外泌体进行蛋白质提取前进行纯化。接着，液相色谱 - 串联质谱法被用来分析外来体的蛋白质组。最后，将得到的质谱数据以及潜在的候选蛋白质进行统计和生物信息学的前下游生化解剖分析。
整个协议的关键步骤需要遵循以达到最优化的效果。在该协议的初始阶段，SILAC标记可以由细胞类型和标记介质的影响。健康和高度增殖性细胞，应使用以获得高标记效率。重要的是，标签米edium应用透析的胎牛血清（FBS），而不是常规的FBS新鲜配制。透析FBS的耗尽的氨基酸和肽的，因此，不太可能与SILAC标记干涉。它应，然而，应当注意，透析血清可能不适合于某些细胞系，特别是初级细胞。在透析FBS介质正常生长之前应采用SILAC策略得到证实。此外，使用双“重”同位素标记（13 C 6 -L-赖氨酸和13 C 6 15 N 4 L-精氨酸），而不是使用13 C 6 -L-赖氨酸单独使用，可以增加在质谱量化肽的数量分析。需要成功的后续蛋白质组分析单元的最小数量取决于许多因素，质谱仪，每个小区的质量，和蛋白质组的这样的灵敏度靶向（整个蛋白质组或翻译后修饰的蛋白）。根据我们的发现，我们建议千万细胞作为初始量估计为质谱所需的细胞的适当数量。
从细胞培养物上清液外来体隔离可以通过添加过滤步骤如下加以改进。对于悬浮细胞，在200 XG初始离心步骤10分钟完成通过0.22微米的过滤器29，30，以除去悬浮在上清液的细胞，然后进行过滤。对于贴壁细胞，上清液可以直接从培养物中回收并以同样的方式过滤。过滤是用于从污染的材料，例如小分子和肽分离外来体的关键步骤。外来体然后可以从上清液采用经典超速离心法，或使用市售的外来体分离试剂盒分离。外来体的纯度可通过nanoparti验证CLE跟踪分析或电子显微镜31。
由于HIV-1病毒颗粒的大小，以典型的外来体相似，它们可能会污染从HIV-1感染的样本纯化外来体。在蛋白质组学屏幕，潜在的病毒杂质可以通过限制数据库搜索只对人类蛋白被过滤掉。使用已建立的方法，如碘克沙醇密度梯度和免疫隔离进一步分离技术也可用于对HIV-1病毒体从外来体32 33分开，。
接下来，我们讨论了一些建议，以确保可靠的数据分析，一旦MS结果是从孤立的外来体获得识别潜在显著的候选人。在分析的初始步骤中，SILAC比率直方图应遵循正态分布。如果数据的分布是在一个特定的方向倾斜，读者需要确定第e为分析之前引起。例如，标记的和未标记的样品可能没有以相等的比例混合。此外，一些肽可能没有重/轻SILAC比率值，应该从潜在的候选蛋白质被淘汰。候选被选择后，软件和数据库可以被用来验证外来体富集，相互作用与试验条件和可能的途径。候选蛋白质和测试条件之间的相互作用应通过具体的数据库之前，生物信息学分析开采。生物信息学表征，基因本体注解可以使用各种软件和数据库来识别
这里采用的SILAC技术提供了一个系统的，直接的方法来分析主机外体蛋白质组。大多数生物医学实验室将能够通过以最小的额外设备和额外的成本的步骤。的SILAC技术，但是，主要是脱利用细胞系研究签署。因此，其他方法可能需要用于研究不同的生物样品。例如，可以临床样品9，34中用于蛋白质和肽的靶向量化标签-自由MRM（多反应监测）方法。而在确定从多个研究蛋白质含量的情况下，SILAC技术也可以用来研究两个或更多的样品。化学标记方法的iTRAQ或基于TMT-（串联质谱标签）方法允许高得多的复用和效果会更好适合于多种样品（用于相对和绝对定量等压标记）。
此处描述的方法不是从HIV-1感染的细胞不限于外来体的蛋白质组鉴定。与修改，它可以适合于分析在广泛的测试和压力条件如细菌感染，病毒感染，和弧度外来iation。它也适用于研究其他亚细胞区室。
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Acknowledgments
这项工作是由ARRA补充，寿命/塔夫茨/布朗恒虚警，P30AI042853-13S1，NIH P20GM103421，P01AA019072，R01HD072693和K24HD080539为BR支持。这项工作也是由寿命试验研究基金（＃701- 5857），罗得岛基金会医学研究资助（＃20133969），和NIH COBRE URI / RIH试点研究基金（P20GM104317）到ML支持。我们感谢詹姆斯的美荷和Vy党与手稿图制作提供帮助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| H9 cell line | ATCC | HTB-176 | |
| Trypan Blue | Thermo Fisher | 15250061 | |
| MTT assay kit | Thermo Fisher | V13154 | |
| Dialyzed fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher | 26400044 | |
| SILAC Protein Quantitation Kit – RPMI 1640 | Thermo Fisher | 89982 | DMEM version (89983) |
| L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 for SILAC | Thermo Fisher | 88434 | |
| L-Lysine-2HCl, 13C6 for SILAC | Thermo Fisher | 88431 | |
| HIV-1 NL4-3 | NIH AIDS Reagent Program | 2480 | |
| Alliance HIV-1 p24 Antigen ELISA kit | PerkinElmer | NEK050001KT | |
| Refrigerated super-speed centrifuge | Eppendorf | 22628045 | |
| Refrigerated ultracentrifuge | Beckman Coulter | 363118 | Should be able to reach 100,000 x g |
| 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher | 14-432-22 | |
| Ultracentrifuge Tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| SW 32 Ti Rotor | Beckman Coulter | 369694 | |
| RIPA buffer | Thermo Fisher | 89900 | |
| Protease Inhibitor Cocktails | Thermo Fisher | 78430 | |
| ThermoMixer | Eppendorf | 5384000020 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher | 23250 | |
| Spectrophotometer | Biorad | 1702525 | |
| SDS PAGE Gel apparatus | Thermo Fisher | EI0001 | |
| Novex 4-20% Tris-Glycine Mini Gels | Novex | XV04200PK20 | |
| Gel staining reagent | Sigma Aldrich | G1041 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
| SpeedVac Concentrator | Thermo Fisher | SPD131DDA | |
| Antibody to human annexin A5 | Abcam | ab14196 | |
| Antibody to human lactate dehydrogenase B chain | Abcam | ab53292 | |
| Graphing and Statistical Software | Systat | SigmaPlot | Or GraphPad Prism |
| Quantitative proteomics software suite | Max Planck Institue of Biochemistry | Maxquant | |
| Software and databases | Various vendors | Refer to main text for details |
References
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