Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

SILAC Based proteomiske Karakterisering af Exosomer fra HIV-1 inficerede celler

Published: March 3, 2017 doi: 10.3791/54799

Summary

Her beskriver vi en kvantitativ proteomics metode ved hjælp af teknikken af ​​stabile isotoper mærkning af aminosyrer i cellekultur (SILAC) at analysere virkningerne af HIV-1 infektion på host exosomal proteomer. Denne protokol kan let tilpasses til celler under forskellige stress eller infektion betingelser.

Introduction

Mange humane sygdomme, herunder virale infektioner, er ofte forbundet med karakteristiske cellulære processer, der finder sted i og omkring de ramte celler. Proteiner, der ofte fungerer som den ultimative cellulære effektorer, mægle disse processer. Analyse af proteinerne ofte kan give uvurderlig oplysninger om det lokale miljø af berørte celler og hjælpe os til at forstå den underliggende mekanisme af sygdom patogenese. Blandt de forskellige protein analyseteknikker, proteomics holder særligt meget lovende. Som en stærk, storstilet værktøj, kan proteomics tilvejebringe en systemisk forståelse af cellulære processer, især med hensyn til funktion og interaktion af proteiner. Analysere specifikke proteiner er blevet forenklet gennem udvikling af mærkningsteknikker, som giver forskere for at overvåge ekspressionen af ​​cellulære bestanddele, især proteiner, i stedet for undersøgelsen. Selv om mange proteomikanalyser er blevet udført på celleniveauproteom skala, proteomiske karakteriseringer på subcellulære afsnit har vist sig at være særligt informativ 1. Dette er eksemplificeret godt i undersøgelser af HIV-1-infektion.

Exosomer, 30-100 nm membranvesikler udskilles af en lang række celletyper 2, 3, er kritiske komponenter i intercellulær kommunikation og molekylær transport. De blev tidligere opdaget at spille vigtige roller i HIV-1 celleafsnørringsproces 4, 5. Ved at kombinere proteomisk analyse med funktionelle dissektion, fandt vi, at exosomer frigivet fra HIV-1-inficerede celler er sammensat af en unik og kvantitativt forskellige protein signatur og havnen regulatoriske molekyler, der påvirker cellulære ejendomme i nabolandet receptive celler, herunder cellulær apoptose og proliferation 6. Metoderne er beskrevet i denne protokol,nemlig SILAC (stabil isotop mærkning af aminosyrer i cellekultur) 7 baseret proteomisk karakterisering af exosomer fra HIV-1-inficerede celler. kan anvendes lignende metoder til bedre at forstå andre subcellulære rum under patogenese ved at justere den eksperimentelle stress til den specifikke rum eller brøkdel af interesse og foretage de nødvendige ændringer af de beskrevne procedurer.

I betragtning af den seneste udvikling af kvantitative proteom metoder, der er mange at vælge imellem, når du vælger den mest effektive metode til et bestemt eksperiment. Blandt disse er den kemisk-baserede iTRAQ (isobare tags for relativ og absolut kvantificering) 8 og etiketten fri MRM (multiple overvågning reaktion) 9 teknikker. Begge metoder er effektive værktøjer og er gode valg for specifikke indstillinger. For en typisk laboratorium arbejder hovedsageligt med cellelinier, men disse to metoder har relatively højere omkostninger og er mere tidskrævende sammenlignet med den SILAC metode. SILAC er en metabolisk baseret mærkning teknik, der inkorporerer ikke-radioaktive isotopiske former af aminosyrer fra dyrkningsmediet i cellulære proteiner. Typisk SILAC eksperimenter starter med to cellepopulationer, for eksempel, inficerede og ikke-inficerede. Hver er forskelligt mærket i sin specifik isotopisk miljø indtil fuld mærkning er opnået. De mærkede exosomer af disse celler underkastes derefter proteinekstraktion. Når ekstraheret, de mærkede exosomal proteiner analyseres ved anvendelse væskekromatografi tandem massespektroskopi 10. Endelig er massespektrometri resultater og betydeligt mærkede proteiner underkastet statistisk og bioinformatik analyser samt streng biokemisk verifikation. Vores tidligere efterforskningsmæssige rapporter antyder, at de SILAC / exosom procedurer er mere passende for cellelinier end primære celler, som cellelinier er normalt i enaktiv prolifererende tilstand til effektiv isotopisk mærkning,

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cell Culture og HIV-1-infektion

BEMÆRK: Før du starter eksperimenter, anbefales det at kontrollere cellernes levedygtighed gennem Trypan blå farvning 11 og deres spredning gennem en MTT assay 12. Det er også vigtigt at bruge frisklavet SILAC medium. Forskellige cellelinier kan anvendes, så længe de er i en aktivt proliferative fase, og er modtagelige for HIV-1-infektion, eller test valgte tilstand. I denne protokol, bruge H9 cellelinje som eksempel.

  1. Seed 2 x 10 6 H9-celler i hver celle dyrkningskolbe. Grow én gruppe i 10 ml mærket RPMI 1640 medium indeholdende 10% dialyseret føtalt bovint serum (FBS), 100 mg / L 13 C 6 L-lysin og 100 mg / L 13 C 6 15 N 4 L-arginin. Grow den anden gruppe i 10 ml umærket RPMI 1640 medium, med 10% dialyseret FBS, 100 mg / L L-lysin og 100 mg / L L-Arginine.
  2. Grow cellerne i seks fordoblinger på hvilket tidspunkt proteinerne af cellerne i det mærkede medium praktisk taget fuldstændigt mærket (> 99%) med tunge aminosyrer. Læg frisk medium eller ændre medier regelmæssigt (hver 1-3 dage afhængig af typen af ​​celle. For H9-celle, ændre medium hver 3 dage). Ved udgangen af mærkning, øge volumen kultur (f.eks ~ 30 ml) til at rumme væksten af flere celler.
    BEMÆRK: Bestem nøjagtige celle fordoblingstid ved begyndelsen af ​​eksperimentet via Trypan Blue-farvning og celletælling.
  3. Inficere mærkede celler med HIV-1 NL4-3 anvendelse af standard HIV-1-infektion protokol 13 i 48 timer. Inkubér cellerne med passende mængder af virus med en infektionsmultiplicitet (MOI) omkring 0,3. Check HIV-1 infektion ved p24 kvantificering af kultursupernatanter under anvendelse af en HIV-1 p24-antigen ELISA-kit. Udfør en immunofluorescensbestemmelse 14 for at bekræfte vellykket infektion af celler. keep dyrkning af umærkede celler i umærket medium uden HIV-1-infektion.
  4. Høst supernatanterne fra begge grupper ved enden af ​​infektion (trin 2.1).

2. exosome Isolering

BEMÆRK: Gennem en række ultracentrifugering trin, er exosomal fraktioner fra dyrkningssupernatanter beriget 15. Udfør alle de følgende trin ved 4 ° C, med en ultracentrifuge rotor, der kan nå en hastighed på mindst 100.000 x g.

  1. Indsamle supernatanterne fra kulturerne i 50 ml koniske rør, undgå celler. Centrifuger dem i 10 minutter ved 300 xg for at fjerne resterende celler.
  2. Saml supernatanterne i nye 50 ml koniske rør og centrifugeres dem i 10 minutter ved 2.000 xg for at fjerne døde celler. Overførsel resulterer supernatanter til kommercielle rotor-kompatible rør, der er i stand til at modstå ultracentrifugering.
  3. Vær sikker på at afbalancere ultracentrifugerør. Centrifugeres rørene i 30 minutter ved 10.000 xg for at fjernecellerester.
  4. Saml supernatanterne i ultracentrifugerør og centrifugeres i 70 min ved 100.000 x g. Kassér supernatanterne.
  5. Resuspendere exosom-rige pellets i 5 ml frisk PBS. Overfør løsninger til friske ultracentrifugerør og centrifugeres igen i 70 min ved 100.000 x g.
  6. Kassér supernatanter. For at gemme exosomer langsigtede, opblande pillerne i 50 pi PBS og opbevares ved -80 ° C. Alternativt fortsætte direkte til proteinekstraktion som vist nedenfor.

3. Protein Extraction og klargøring

  1. isolerede exosomal pellets i 100-200 pi RIPA lysis og ekstraktionsbuffer tilsat proteasehæmmere cocktails Opløs. Bufferen er sammensat af 25 mM Tris-hydrochlorid, 150 mM natriumchlorid, 1% NP-40, 1% natriumdeoxycholat og 0,1% SDS (natriumdodecylsulfat), ved pH 7,6. Proteaseinhibitoren cocktails bør indeholde en række proteaseinhibitorer, såsom aprotinin, bestatin, leupeptin, pepstatin A og EDTA (ethylendiamintetraeddikesyre), der kan inhibere en bred vifte af proteaser.
  2. Centrifuger opløste opløsninger i 10 minutter ved 13.000 xg (4 ° C), og overføre de clearede supernatanter til nye 1,5 ml mikrocentrifugerør.
  3. Kvantificer proteinkoncentrationen af hver prøve af exosomer under anvendelse af bicinchoninsyre (BCA) eller Bradford assay 16.
  4. Bland en lige stor del af proteiner (2 ug) fra mærkede og umærkede prøver og køre lige blanding på en 4-20% SDS-PAGE-gel ved 120 mA / 200 V i 30 min.
  5. Stain gel med Coomassie Blue efterfulgt af affarvning 17.
  6. Brug af et barberblad, sender en prøve lane fra gelen. Derefter skæres gelen vognbane i 10-15 lige store stykker. Sætte hvert stykke til en frisk 1,5 ml mikrocentrifugerør i alt 10-15 rør.
  7. Fordyb terninger i 25 mM NH4 HCO 3 i 50% acetonitril, vortex, og kassér supernatanter. Gentag to gange. Tørkuber i et vakuum koncentrator 18, 19.
  8. Rehydrere kuber med 10 mM dithiothreitol (DTT), vortex, og centrifuger kortvarigt. Inkuber ved 56 ° C i 1 time. Supernatanten kasseres.
  9. Fordyb gel terninger i 55 mM iodacetamid, vortex, og spin. Der inkuberes ved stuetemperatur i mørke i 45 min. Supernatanten kasseres.
  10. Fordyb terninger i 25 mM NH4 HCO 3, vortex, centrifugering, og kassér supernatanten.
  11. Fordyb terninger i 25 mM NH4 HCO 3 i 50% acetonitril, vortex, og spin. Gentag 3.9 og 3.10.
  12. Tør kuber i en vakuumkoncentrator. 25 pi sekventeringskvalitet modificeret trypsin i 25 mM NH4 HCO 3, inkuberes ved 4 ° C i 30 minutter, og kassér overskydende opløsning. Fordybe kuber i 25 mM NH4 HCO 3 uden trypsin, og inkuberes natten over ved 37 ° C.
  13. Kort spinde terninger ned og overføre den resulterende peptid ekstract til et nyt rør. Tilsæt 30 pi 5% myresyre i 50% acetonitril til kuberne, vortex i 30 minutter, og centrifugering. Kombiner supernatanten med ekstraktet. Tør peptid ekstrakter med et vakuumkoncentrator til under 5 pi.
  14. Indsend prøver til massespektrometri core facilitet til LC-MS / MS-analyse. MS-analyse af data, der kan genereres fra open source-software, indeholder typisk et stammesamlingsnummer for hvert protein identificeret, mærket / umærkede nøgletal og antallet af unikke peptider identificeret.

4. vestlige Blotting Verifikation

BEMÆRK: Western blotting anbefales at verificere massespektrometri resultater.

  1. Følg standard western blotting-protokoller og sikre, at lige store mængder af protein fra hver gruppe er indlæst. Brug antistoffer mod proteiner af interesse (f.eks annexin A5, lactatdehydrogenase B kæde) identificeret af MS. Western blotting påvisning, sammen med densitometri analysis, kan bekræfte, at MS protein identifikation og kvantificering er korrekte.

5. proteomiske Dataanalyse

BEMÆRK: datakvalitet vurdering data forbehandling, beregning og fastsættelse af signifikante protein kandidater er færdig separat for hver MS kopiere. Når ovenstående analyser er afsluttet, bliver de analyserede data fra replikater sammenlignet og kombineret 6, 20, 21.

  1. Vurdere kvaliteten af ​​MS-data.
    1. Først log2 omdanne SILAC-MS mærkede / umærkede forhold mellem kvantificerede proteiner i et regnearksprogram.
    2. I videnskabelig graftegning og statistisk software, gruppe forholdene i 40-100 forholdet placeringer og plotte antallet af nøgletal pr bin til at generere et histogram. En normal fordeling af histogram indikerer god kvalitet af MS-data 6. Gør dette trin for alle MS replikater.
  2. For at øge tilliden og nøjagtigheden af ​​de MS peptid nøgletal, overveje at fjerne proteiner, der har mindre end to kvantificerede peptider.
  3. For at bestemme betydeligt op- og ned-reguleret protein kandidater, bruge følgende trin til at beregne betydning tærsklerne 22.
    1. I videnskabelig graftegning og statistisk software, generere en ikke-lineær regression eller kurve-fit til data frekvens fordeling. Dette trin giver værdier, der kan anvendes til beregning af cutoffværdier. Beregn afskæringsværdier som median ± 1,96 σ for 95% konfidensgrænser eller 2,56 σ for 99% sikkerhedsgrænser.
      BEMÆRK: Specifikke oplysninger om beregning af cutoffs kan findes på Emmott et al. 22.
    2. Vælg de protein kandidater, hvis nøgletal er enten større end 1,96 (eller 2,56) standardafvigelser over medianen (væsentligt over-udtrykte) eller lavere end 1,96 (eller 2,56) standardafvigelser under medianen (betydeligt under-udtrykt).
  4. Sammenlign gentagelser af de ovenfor identificerede væsentlige kandidater at opnå konsistens. Sørg for, at de opfylder følgende kriterier for at videregive denne endelige udvælgelse trin: kandidater skal konsekvent identificeret i alle replikater; og replikater af en kandidat skal være konsekvent i deres retning af regulering (helst mindst 2 ud af 3 gentagelser af en kandidat skal enten være opreguleret eller nedreguleret).
  5. Afslut data for kandidater, der opfylder de ovennævnte kriterier ved at fusionere deres gentagelser data.

6. Bioinformatik Verifikation og karakterisering

BEMÆRK: Eksisterende genomisk og bioinformatik information byder på et væld af oplysninger til næsten alle protein. Data mining og bioinformatik analyse på disse oplysninger kan hjælpe med at få en stor indsigt i ejendommen og funktioner af de store kandidater. Denne process normalt nødvendigt at udforme passende downstream wet-lab forsøg.

  1. Brug deres GenBank numre eller UniProt id'er, søge kandidaterne mod nuværende exosom databaser (Exocarta 23, Evpedia 24) for at kontrollere, at kandidatlandene proteiner er blevet tidligere fundet i exosome. Dette trin tilføjer et lag af tillid til, at kandidaterne er faktisk i exosomer.
    1. Adgang http://www.exocarta.org/, klik på "Forespørgsel" og input enten genet eller protein navn / tiltrædelse nummer. Et resumé side vises, og beviserne i exosomet vises, forudsat hvis der er nogen.
  2. Søg kandidaterne mod HIV-1 og det humane protein Interaction Database 25. Du kan også søge de specifikke databaser, der kan give oplysninger om samspillet mellem kandidatlandene proteiner og testen tilstand.
    1. Få adgang til databasen på www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/HIVInteraktioner. På "protein domænenavn ', indtast kandidaternes navne eller numre tiltrædelsesforhandlingerne, og klik på søg. Søgeresultaterne kan give indsigt i samspillet mellem HIV-1 og proteinet kandidater, og foreslå, hvilke af kandidaterne kan være virkelig HIV-1 forbundet.
  3. Import GenBank numre eller UniProt id'er af kandidaterne i GO analyse software (såsom FunRich, Functional Berigelse analyseværktøj 26) og køre softwaren.
    1. Download softwaren på http://www.funrich.org/. Efter installationen, åbne softwaren, under berigelse analyse, klik på "Tilføj Data Set", og uploade en liste over protein / gener. Dernæst skal du vælge diagramtypen at visualisere GO analyse.
      BEMÆRK: GO analyseresultater vil blive visualiseret i form af cirkeldiagrammer. Dette trin hjælper os til at opnå global indsigt i forbindelse med kandidaterne inden for biologisk proces (BP), Cellular Komponent (CC), og molekylære funktion (MF).
  4. Adgang DAVID på http://david.ncifcrf.gov/ 27, klik på "Functional Annotation Tool" på sin hjemmeside. Indtast kandidatlisten, skal du vælge "Identifier" af genet såsom "UniProt ID", vælg "Gene List" og søg. De berigede GO vilkår, p-værdier, og andre parametre kan findes ved at klikke på "Annotation Resumé Results" side under kategorien "Gene_Ontology".
  5. For at undersøge potentielle interaktioner af kandidaterne med andre proteiner, brug åbent tilgængelig STRING database 28 at belyse potentielle protein-protein interaktioner og mulige biokemiske veje.
    BEMÆRK: GO Analyse og Functional Annotation (afsnit 6,3-6,4) kan også udføres ved hjælp af nyeste STRING software.
    1. Få adgang til databasen på http://string-db.org/. Input proteinet id eller sekvens i de udpegede search kasse og vælg de korrekte arter til analyse. Klik på "Søg". Resultaterne vil give oplysninger om både direkte (fysisk) og indirekte (funktionelle) foreninger. De ti kendte kampe for exosomal kandidat vil blive vist, og bør overvejes for betydelige kandidat udvælgelse.
      BEMÆRK: En stor del af oplysninger i forbindelse med kandidaterne kan analyseres ved hjælp af ovenstående trin. De væsentligste kandidater kan vælges til yderligere nedstrøms molekylære og biokemiske analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1A er et rutediagram der skitserer SILAC mærkningsproceduren 21. For at oprense exosomer, skal prøven centrifugeret ned via centrifuge. Figur 1B viser trinnene exosome Oprensning ved seriel ultracentrifugering 21. Når oprenset, exosomerne underkastes eksperimentel proteom analyse som skitseret i proceduren.

Figur 2A er et flowchart til at bestemme væsentlige protein kandidater fra proteomiske data 21. De udvalgte kandidater anvendes derefter til downstream proteomics analyse. Figur 2B er et eksempel på SILAC histogram viser repræsentative forhold af typiske protein kvantificering resultater (Dette tal er blevet ændret fra Li et al. 6), og tabel 1 er enn eksempel bestemme cutoff-værdier for væsentlige kandidater 6 fra disse SILAC forholdet histogrammer. Ved at følge de trin, der er beskrevet i afsnit 6.3, blev cutoff henblik på fastsættelse markant op- eller ned-regulerede proteiner beregnet. I dette repræsentative datasæt blev proteiner med en tung / let (H / L) ligger over den øvre cutoff-værdien anses for signifikant opreguleret, mens proteiner med en H / V-forhold under den nedre cutoff-værdien blev betragtet som signifikant nedreguleret . Markant regulerede kandidat proteiner ville blive udsat for yderligere undersøgelser.

Figur 3 viser de overordnede bioinformatik analyse og data mining procedurer for de valgte betydelige kandidater. Tabel 2 er en data mining eksempel som anvender exosom og HIV-1 / host Interaktionsdatabasen 6 at indsamle oplysninger om kandidaterne (Dette fanebladle er blevet modificeret fra Li et al. 6). Ved minedrift aktuelle exosom og HIV-1 / host Interaktionsdatabasen, tretten ud af de fjorten kandidater blev fundet at associere med exosomer. Fem ud af fjorten kandidater blev også kendt for at interagere med HIV-1. Blandt dem, fire kandidater (HSPA4, varmechok 70 kDa protein 4; NUTF2, nuklear transport faktor 2; PTGES3, prostaglandin E syntase 3; LDHB, L-lactat dehydrogenase B-kæde) fandtes at associere med både exosom og HIV-1. Blandt HSPA4, NUTF2, PTGES3 og LDHB, kun LDHB var konsekvent under-udtrykt i det inficerede fraktion (tung mærket). Gennem en række analyser, valgte vi LDHB at være den mest betydelige kandidat, som kunne underkastes yderligere undersøgelse. Downstream proteomics analyser er vist i figur 4. Figur 4A viser korte trinnene gen ontologi (GO) -analyse; Figur 4B angiver de trinnene udførelse DAVID-analyse; Figur 4C viser, hvordan du udfører netværksanalyse hjælp STRING. Figur 5A, 5B og 5C er DAVID analyse af et sæt af fjorten proteiner i BP, CC og MF; Figur 5D viser top ti interagerende partnere LDHB; Figur 5E viser, at størstedelen af interagerende partnere LDHB også er forbundet med exosom og HIV-1. De første DAVID analyseresultater foreslog, at mange kandidater er apoptose-relaterede og sandsynligvis deltage i proteinbinding. Yderligere STRING analyse bekræftede, at LDHB bindingspartnere er også funktionelt og locationally relateret til exosom og HIV-1. Alle disse resultater giver værdifulde oplysninger for potentielle downstream undersøgelser.

figur 1
Figur 1: SILAC mærkning og exosome rensning ved hjælp forskellen ultracentrifugering.(A) To grupper af celler dyrkes separat. En gruppe dyrkes i mærket medium i seks fordoblinger for fuldstændig mærkning. Den anden gruppe er vokset i den normale umærket medium for den samme periode. Dernæst mærkede celler inficeret med HIV-1, mens umærkede celler ikke. Endelig exosomer fra begge grupper isoleret parallelt. (B) De prøver (ovenstående væsker eller pellets), der anvendes i centrifugering ved hvert trin er angivet i reagensglassene. Fraktioner, der skal kasseres noteres på højre side af reagensglas. Hastigheden og længden af ​​hver centrifugering er også vist. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2: Skridt til validering proteomisk datasæt (er) og bestemme betydelig proTEIN kandidater. (A) Rutediagram bestemme signifikante protein kandidater fra proteomisk datasæt (s). Disse fire trin sikrer pålidelig udvælgelse af væsentlige kandidater. Først en SILAC forholdet histogram plottet at vurdere kvaliteten af ​​dataene. Næste, mindre ideelle kandidater, der kan reducere nøjagtigheden fjernes. I det tredje trin, er statistiske metoder bruges til at indstille betydning tærskler for potentielle protein kandidater. Endelig er replikat data for de betydelige kandidater analyseret for konsistens og flettes til sidst. (B) repræsentant histogram af SILAC nøgletal. Histogrammet afslørede symmetrisk fordeling langs ratio = 1 (log2 = 0) trend linje. De log2 forvandlet nøgletal er grupperet i forholdet skraldespande, og y-aksen viser det relative antal af fundne nøgletal pr bin. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3: Samlet bioinformatik analyse og data mining procedurer for betydelige kandidater. Procedurerne indeholder exosomal og HIV-1 / host data mining, Gene ontologi karakterisering, DAVID analyse og forudsigelse af netværk. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4: Skridt til at udføre gen ontologi karakterisering, berigelse, og sti analyser. (A) trin til at udføre gen ontologi (GO) karakterisering. For at få indsigt i de funktioner og subcellulære lokaliseringer af de betydelige kandidater, trin til at udføre GO analyse ved hjælp appropriate software 26 er illustreret. (B) Trin til at udføre GO Term berigelse analyse. For at få berigelse information af de betydelige kandidater, vises korte skridt til at udføre DAVID analyse. (C) trin til at udføre interaktion og sti analyse. For at belyse mulige veje og finde funktionelle partnere, skridt til at udføre interaktion eller netværk analyse fra STRING vises. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5: Repræsentant DAVID og STRING analyseresultater. (A) BP berigelse resultaterne af de fjorten kandidater ved DAVID analyse. Celledød relaterede processer betydeligt beriget. (B) CC enrichmen t resultaterne af de fjorten kandidater ved DAVID analyse. Mange proteiner har en intracellulær oprindelse. (C) BP berigelse resultaterne af de fjorten kandidater ved DAVID analyse. De fleste af kandidaterne deltage i proteinbinding. (D) Top ti interagerende partnere LDHB identificeret ved STRING. (E) De fleste af LDHB partnere er også forbundet med exosome og HIV-1, hvilket yderligere understøtter roller LDHB i exosom / HIV-1. Klik her for at se en større version af dette tal.

tabel 1
Tabel 1: Repræsentant beregning af cutoff værdier for signifikant protein forstyrrelse.

e2.jpg "/>
Tabel 2: Foreninger mellem SILAC kandidater og deres exosomal lokaliseringer og interaktioner med HIV-1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I procedurerne i dette papir, demonstrerede vi anvendelsen af ​​SILAC teknik til at undersøge effekten af ​​HIV-1 infektion på værten exosomal proteomanalyse. Oprindeligt uinficerede og HIV-1-inficerede celler er differentielt isotopmærket. De differentielt mærkede exosomer renses derefter før udførelse protein ekstraktion. Dernæst væskekromatografi-tandem-massespektrometri anvendt til at analysere exosomal proteom. Endelig er de resulterende massespektrometri data og potentielle kandidatlande proteiner udsat for statistisk og bioinformatik analyser før downstream biokemiske dissektioner.

Kritiske trin i hele protokollen skal følges for at opnå optimale resultater. I de indledende faser af protokollen, kunne SILAC mærkning blive påvirket af den celletype og mærkning medium. Sunde og stærkt proliferative celler bør anvendes til at opnå en høj effektivitet mærkning. Kritisk, den m mærkningedium bør frisk fremstillet ved hjælp dialyseret føtalt bovint serum (FBS) snarere end almindelig FBS. Dialyseret FBS er tømt af aminosyrer og peptider og er derfor mindre tilbøjelige til at gribe ind i SILAC mærkning. Det skal dog bemærkes, at dialyseret serum ikke kan være egnet for nogle cellelinjer, især primære celler. Normal vækst på mellemlang med dialyserede FBS bør bekræftes forud for ansættelse af SILAC strategi. Desuden, ved hjælp dobbelt "tunge" isotop mærkning (13C 6 L-lysin og 13 C 6 15 N 4 L-arginin) i stedet for anvendelse af 13C 6 L-lysin alene, kan øge antallet af kvantificerede peptider i massespektrometri analyse. Det mindste antal celler, der er nødvendige for en vellykket efterfølgende proteomanalyse afhænger af mange faktorer, såsom følsomheden af ​​massespektrometret, massen af ​​hver celle, og proteomanalyse målrettet (hel proteom eller posttranslationelle modificerede proteiner). Baseret på vores resultater, anbefaler vi ti millioner celler som et indledende beløb estimere det passende antal celler, der kræves for massespektrometri.

Exosom isolation fra cellekultursupernatanter kan forbedres ved tilsætning af et filtreringstrin som følger. For suspensionen af celler, der er en indledende centrifugering skridt ved 200 xg i 10 minutter gøres for at fjerne celler suspenderet i supernatanten, efterfulgt af filtrering gennem et 0,22 um filter 29, 30. For adhærente celler, kan supernatanten opsamles direkte fra kulturen og filtreres på samme måde. Filtrering er et kritisk trin til adskillelse exosomer fra kontaminerende materialer, såsom små molekyler og peptider. Exosomerne kan derefter isoleres fra supernatanten under anvendelse af klassiske ultracentrifugering, eller ved anvendelse af kommercielt tilgængelige exosom isolation reagenser kits. Renheden af ​​exosomet kan verificeres ved nanoparticle sporing analyse eller elektronmikroskopi 31.

Eftersom HIV-1-virioner er typisk svarer i størrelse til exosomer, kan de forurene exosomer oprenset fra HIV-1-inficerede prøver. I proteomiske skærme kan potentielle virale kontaminanter blive filtreret ved at begrænse databasesøgning kun til humane proteiner. Yderligere isolation teknikker under anvendelse af etablerede metoder såsom iodixanol massefyldegradienter og immunaffinitetskromatografi isolation kan også anvendes til at separere HIV-1-virioner fra exosomer 32, 33.

Dernæst diskuterer vi nogle forslag til at sikre pålidelig data analyse for at identificere potentielt betydningsfulde kandidater, når MS resultater opnås fra isolerede exosomer. I det indledende trin af analysen bør SILAC forholdet histogram følger en normalfordeling. Hvis fordelingen data skæv i en bestemt retning, vil læseren nødt til at bestemme the forårsage før du fortsætter med analysen. For eksempel kan de mærkede og umærkede prøver ikke have blandet i lige dele. Desuden kan nogle peptider ikke har tung / let SILAC forholdstallene, og bør fjernes fra de potentielle protein kandidater. Efter kandidater valgt, kan software og databaser anvendes til at kontrollere exosome berigelse, interaktioner med testbetingelser, og mulige veje. Samspillet mellem ansøgerlandene proteiner og test tilstand bør udvindes gennem specifikke databaser før bioinformatik analyse. For bioinformatik karakteriseringer, kan gen-ontologi anmærkninger identificeres ved hjælp af forskellige software og databaser,

Den SILAC anvendte teknik her byder på en systematisk og enkel tilgang til at analysere vært exosomal proteomanalyse. De fleste biomedicinske laboratorier ville være i stand til at vedtage procedurer med minimal ekstra udstyr og ekstra omkostninger. Den SILAC teknik er imidlertid primært deunderskrevet for undersøgelser med anvendelse af cellelinjer. Som sådan kan andre fremgangsmåder skal anvendes til at studere forskellige biologiske prøver. For eksempel kan etiketten-free MRM (overvågning multipel reaktion) metode anvendes til målrettet kvantificering af proteiner og peptider i kliniske prøver 9, 34. Mens der i tilfælde af bestemmelse af proteinindholdet fra flere undersøgelser, kan SILAC teknik også anvendes til at undersøge to eller flere prøver. Metoden kemiske mærkning iTRAQ (isobare tags for relativ og absolut kvantificering) eller TMT-baserede (tandem mass tag) metoder tillader meget højere multiplexing og ville være bedre velegnet til flere prøver.

Den her beskrevne procedure er ikke begrænset til proteomisk karakterisering af exosomer fra HIV-1-inficerede celler. Med modifikationer, kan det være indrettet til at analysere exosomer under en lang række af test- og stress betingelser såsom bakterieinfektion, virusinfektion, og radiation. Den er også egnet til undersøgelse af andre subcellulære afsnit.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af en arra supplement til Levetid / Tufts / Brown CFAR, P30AI042853-13S1, NIH P20GM103421, P01AA019072, R01HD072693, og K24HD080539 til BR. Dette arbejde blev også støttet af Levetid Research Fund Pilot (# 701- 5857), Rhode Island Foundation Medical Research Grant (# 20.133.969), og NIH COBRE URI / RIH Pilot Research Grant (P20GM104317) til ML. Vi takker James Myall og Vy Dang efter hjælp til manuskriptet og figur forberedelse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
H9 cell line ATCC HTB-176
Trypan Blue Thermo Fisher 15250061
MTT assay kit Thermo Fisher V13154
Dialyzed fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher 26400044
SILAC Protein Quantitation Kit – RPMI 1640 Thermo Fisher 89982 DMEM version (89983)
L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 for SILAC Thermo Fisher 88434
L-Lysine-2HCl, 13C6 for SILAC Thermo Fisher 88431
HIV-1 NL4-3 NIH AIDS Reagent Program 2480
Alliance HIV-1 p24 Antigen ELISA kit PerkinElmer NEK050001KT
Refrigerated super-speed centrifuge Eppendorf 22628045
Refrigerated ultracentrifuge Beckman Coulter 363118 Should be able to reach 100,000 x g
50 mL Conical Centrifuge Tubes Thermo Fisher 14-432-22
Ultracentrifuge Tubes Beckman Coulter 326823
SW 32 Ti Rotor Beckman Coulter 369694
RIPA buffer Thermo Fisher 89900
Protease Inhibitor Cocktails Thermo Fisher  78430
ThermoMixer  Eppendorf 5384000020
BCA Protein Assay Kit  Thermo Fisher 23250
Spectrophotometer Biorad 1702525
SDS PAGE Gel apparatus Thermo Fisher EI0001
Novex 4-20% Tris-Glycine Mini Gels Novex XV04200PK20
Gel staining reagent Sigma Aldrich G1041
Sequencing Grade Modified Trypsin Promega V5111
SpeedVac Concentrator Thermo Fisher SPD131DDA
Antibody to human annexin A5 Abcam ab14196
Antibody to human lactate dehydrogenase B chain Abcam ab53292
Graphing and Statistical Software Systat  SigmaPlot  Or GraphPad Prism
Quantitative proteomics software suite Max Planck Institue of Biochemistry Maxquant 
Software and databases Various vendors Refer to main text for details

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), 968-977 (2016).
  2. Schorey, J. S., Bhatnagar, S. Exosome function: from tumor immunology to pathogen biology. Traffic. 9 (6), 871-881 (2008).
  3. Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
  4. Booth, A. M., et al. Exosomes and HIV Gag bud from endosome-like domains of the T cell plasma membrane. J Cell Biol. 172 (6), 923-935 (2006).
  5. Van Engelenburg, S. B., et al. Distribution of ESCRT machinery at HIV assembly sites reveals virus scaffolding of ESCRT subunits. Science. 343 (6171), 653-656 (2014).
  6. Li, M., et al. Quantitative proteomic analysis of exosomes from HIV-1-infected lymphocytic cells. Proteomics. 12 (13), 2203-2211 (2012).
  7. Ong, S. E., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
  8. Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
  9. Anderson, L., Hunter, C. L. Quantitative mass spectrometric multiple reaction monitoring assays for major plasma proteins. Mol Cell Proteomics. 5 (4), 573-588 (2006).
  10. Ong, S. E., Mann, M. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture for quantitative proteomics. Methods Mol Biol. 359, 37-52 (2007).
  11. Strober, W. Current Protocols in Immunology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  12. Verma, A., et al. Evaluation of the MTT lymphocyte proliferation assay for the diagnosis of neurocysticercosis. J Microbiol Meth. 81 (2), 175-178 (2010).
  13. Cepko, C., Pear, W. Retrovirus infection of cells in vitro and in vivo. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 9 Unit9.14 (2001).
  14. Lennette, E. T., Karpatkin, S., Levy, J. A. Indirect immunofluorescence assay for antibodies to human immunodeficiency virus. J Clin Microbiol. 25 (2), 199-202 (1987).
  15. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3 22 (2006).
  16. Olson, B. J. S. C., Markwell, J. Current Protocols in Protein Science. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  17. Gauci, V. J., Padula, M. P., Coorssen, J. R. Coomassie blue staining for high sensitivity gel-based proteomics. J Proteom. 90, 96-106 (2013).
  18. Soldi, M., Bonaldi, T. The ChroP approach combines ChIP and mass spectrometry to dissect locus-specific proteomic landscapes of chromatin. J Vis Exp. (86), (2014).
  19. Trompelt, K., Steinbeck, J., Terashima, M., Hippler, M. A new approach for the comparative analysis of multiprotein complexes based on 15N metabolic labeling and quantitative mass spectrometry. J Vis Exp. (85), (2014).
  20. Li, M., et al. Stem-loop binding protein is a multifaceted cellular regulator of HIV-1 replication. J Clin Invest. 126 (8), 3117-3129 (2016).
  21. Li, M., Ramratnam, B. Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1-Infected Cells. Methods Mol Biol. 1354, 311-326 (2016).
  22. Emmott, E., Goodfellow, I. Identification of protein interaction partners in mammalian cells using SILAC-immunoprecipitation quantitative proteomics. J Vis Exp. (89), (2014).
  23. Keerthikumar, S., et al. ExoCarta: A Web-Based Compendium of Exosomal Cargo. J Mol Biol. 428 (4), 688-692 (2016).
  24. Kim, D. K., et al. EVpedia: a community web portal for extracellular vesicles research. Bioinformatics. 31 (6), 933-939 (2015).
  25. Fu, W., et al. Human immunodeficiency virus type 1, human protein interaction database at NCBI. Nucleic Acids Res. 37, Database issue 417-422 (2009).
  26. Pathan, M., et al. FunRich: An open access standalone functional enrichment and interaction network analysis tool. Proteomics. 15 (15), 2597-2601 (2015).
  27. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).
  28. Szklarczyk, D., et al. The STRING database in 2011: functional interaction networks of proteins, globally integrated and scored. Nucleic Acids Res. 39, Database issue 561-568 (2011).
  29. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3.22 (2006).
  30. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).
  31. Webber, J., Clayton, A. How pure are your vesicles. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
  32. Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. Discrimination between exosomes and HIV-1: purification of both vesicles from cell-free supernatants. J Immunol Methods. 338 (1-2), 21-30 (2008).
  33. Chertova, E., et al. Proteomic and biochemical analysis of purified human immunodeficiency virus type 1 produced from infected monocyte-derived macrophages. J Virol. 80 (18), 9039-9052 (2006).
  34. Nikolov, M., Schmidt, C., Urlaub, H. Quantitative mass spectrometry-based proteomics: an overview. Methods Mol Biol. 893, 85-100 (2012).

Tags

Infektion exosomer Ekstracellulære Køretøjer HIV-1 Proteomics massespektrometri SILAC Bioinformatik
SILAC Based proteomiske Karakterisering af Exosomer fra HIV-1 inficerede celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cheruiyot, C., Pataki, Z., Williams, More

Cheruiyot, C., Pataki, Z., Williams, R., Ramratnam, B., Li, M. SILAC Based Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1 Infected Cells. J. Vis. Exp. (121), e54799, doi:10.3791/54799 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter