Summary
Hier beschreiben wir eine quantitative Proteomik Verfahren die Technik der Silac (SILAC) mit Hilfe der Wirkung von HIV-1-Infektion auf Host exosomalen Proteome zu analysieren. Dieses Protokoll kann leicht an Zellen unter verschiedenen Stress oder Infektionsbedingungen angepasst werden.
Introduction
Viele menschliche Erkrankungen, einschließlich Virusinfektionen sind häufig mit ausgeprägten zellulären Prozessen verbunden, die stattfinden und um in den betroffenen Zellen. Die Proteine, die oft als die ultimative zelluläre Effektoren wirken, diese Prozesse vermitteln. Die Analyse der Proteine können oft wertvolle Informationen über die lokale Umgebung der betroffenen Zellen liefern und uns helfen, die zugrunde liegenden Mechanismus der Pathogenese der Erkrankung zu verstehen. Unter den verschiedenen Techniken der Proteinanalytik, hält Proteomik besonders vielversprechend. Als leistungsstarker, groß angelegte Tool können Proteomik ein systemisches Verständnis zellulärer Prozesse schaffen, vor allem im Bereich der Funktion und Interaktion von Proteinen. spezifische Proteine zu analysieren ist einfacher durch die Entwicklung von Markierungstechniken hergestellt, die Forscher ermöglichen, die Expression von zellulären Komponenten zu überwachen, insbesondere Proteine, in den Ort der Untersuchung. Obwohl viele Proteom-Analysen wurden auf zellulärer durchgeführt worden istProteom - Skala, Proteomik Charakterisierungen auf subzellulärer Kompartimente haben sich als besonders informativ 1 zu sein. Dies wird beispielhaft auch in den Studien von HIV-1-Infektion.
Exosomen, 30-100 nm Membranvesikel von einer Vielzahl von Zelltypen sekretiert 2, 3, sind kritische Komponenten der interzellulären Kommunikation und molekularen Transport. Sie waren zuvor eine wichtige Rolle bei der HIV-1 - Knospungsvorgang 4, 5 zu spielen entdeckt. Durch die Proteomanalyse mit funktionellen Dissektion kombiniert, fanden wir , dass von HIV-1 - infizierten Zellen freigesetzt Exosomen bestehen aus einer einzigartigen und quantitativ unterschiedliche Proteinsignatur und Hafen regulatorische Moleküle , die auf benachbarten empfänglichen Zellen zelluläre Eigenschaften beeinflussen, einschließlich der zellulären Apoptose und Proliferation 6. Die Verfahren werden in diesem Protokoll beschrieben ist,nämlich SILAC (Silac) 7 basierend proteomic Charakterisierung von Exosomen aus HIV-1 - infizierten Zellen. Ähnliche Ansätze können durch Einstellen der experimentellen Spannung auf den bestimmten Kompartiment oder einen Bruchteil von Interesse und die erforderlichen Änderungen an den beschriebenen Verfahren besser verstehen zu anderen subzellulären Kompartimenten während der Pathogenese angewendet werden.
In Anbetracht der jüngsten Entwicklung von quantitativen Proteomik Methoden gibt es viele zur Auswahl, wenn die effizienteste Methode für ein bestimmtes Experiment ausgewählt. Unter diesen sind die chemisch-basierte iTRAQ (isobar Tags für relative und absolute Quantifizierung) 8 und die markierungsfreie MRM (multiple reaction monitoring) 9 Techniken. Beide Methoden sind leistungsfähige Werkzeuge und sind eine gute Wahl für spezifische Einstellungen. Für eine typische Labor hauptsächlich mit Zelllinien arbeiten, jedoch sind diese beiden Methoden relatively höheren Kosten und sind zeitaufwendig, wenn sie der SILAC basierte Methode verglichen. SILAC ist eine Stoffwechsel basierten Markierungstechnik, die Formen der Aminosäuren aus dem Kulturmedium in zelluläre Proteine nicht-radioaktiven Isotopen enthält. Typischerweise beginnen, SILAC Experimente mit zwei Zellpopulationen, beispielsweise infizierte und nicht infizierte. Jedes Zimmer ist unterschiedlich in seiner spezifischen Isotopen Umgebung markiert bis zur vollständigen Kennzeichnung erreicht wird. Die markierten Exosomen dieser Zellen werden dann an die Proteinextraktion unterzogen. Sobald extrahiert, werden die markierten exosomalen Proteine analysiert Flüssigchromatographie Tandem - Massenspektroskopie 10. Schließlich werden die Ergebnisse der Massenspektrometrie und deutlich markierten Proteine zu statistischen unterworfen und Bioinformatik-Analysen sowie strenge biochemische Überprüfung. Unsere bisherigen Untersuchungsberichte deuten darauf hin, dass die SILAC / exosome Verfahren besser geeignet sind für Zelllinien als primäre Zellen, wie Zelllinien sind in der Regel in einaktiv proliferierenden Zustand für eine effiziente Isotopenmarkierung,
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Protocol
1. Zellkultur und HIV-1-Infektion
HINWEIS: Bevor Experimente starten, wird empfohlen , 12 der Zellen Lebensfähigkeit durch Trypan - Blau - Färbung 11 und deren Proliferation durch einen MTT - Test zu überprüfen. Es ist auch wichtig neu vorbereitet SILAC Medium zu verwenden. Verschiedene Zelllinien können verwendet werden, solange sie in einem aktiv proliferative Phase, und sind anfällig gegenüber HIV-1-Infektion, oder die Testbedingung der Wahl. In diesem Protokoll verwenden H9-Zelllinie als Beispiel.
- Seed 2 x 10 & sup6 ; H9 - Zellen in jeder Zellkulturflasche. Wachsen eine Gruppe in 10 ml RPMI 1640 - markiertem Medium , enthaltend 10% dialysiertes fötales Rinderserum (FBS), 100 mg / L 13 C 6 L-lysin und 100 mg / L 13 C 6 15 N 4 L-Arginin. Wachsen die andere Gruppe in 10 ml unmarkierten RPMI 1640-Medium, das mit 10% dialysiertem FBS, 100 mg / l L-Lysin und 100 mg / l L-Arginin.
- Wachsen die Zellen für sechs Verdopplungen an welchem Punkt der Proteine der Zellen in dem markierten Medium praktisch vollständig markiert (> 99%) mit schweren Aminosäuren. Fügen Sie frische Medien oder Medien regelmäßig zu ändern (alle 1-3 Tage, je nach der Art der Zelle. Für H9 Zelle ändern Medium alle 3 Tage). Am Ende der Markierung erhöhen Kulturvolumen (zB ~ 30 ml) das Wachstum von Zellen unterzubringen.
HINWEIS: Bestimmen genaue Zellenzeit am Beginn des Experiments über den Trypan-Blau-Färbung und Zellzählung zu verdoppeln. - Infect die markierten Zellen mit HIV-1 NL4-3 mit Standard - HIV-1 - Infektion Protokoll 13 für 48 Stunden. Inkubieren der Zellen mit geeigneten Mengen an Virus mit einer Multiplizität der Infektion (MOI) etwa 0,3. Überprüfen, HIV-1-Infektion durch p24 Quantifizierung der Kulturüberstände unter Verwendung eines HIV-1 p24-Antigen-ELISA-Kit. Führen Sie eine Immunfluoreszenztest 14 erfolgreiche Infektion von Zellen zu bestätigen. Keep wächst die unmarkierten Zellen in unmarkierten Medium ohne HIV-1-Infektion.
- Ernte der Überstände beider Gruppen am Ende der Infektion (Schritt 2.1).
2. exosome Isolation
Hinweis: Durch eine Reihe von Schritten Ultrazentrifugation, exosomalen Fraktionen aus Kulturüberstände werden 15 angereichert. Führen alle folgenden Schritte wurden bei 4 ° C mit einer Ultrazentrifuge Rotor, der eine Geschwindigkeit von mindestens 100.000 x g erreichen kann.
- Sammle den Überständen der Kulturen in 50 ml konischen Röhrchen, die Vermeidung Zellen. Zentrifugieren für 10 min bei 300 xg, um die verbleibenden Zellen zu entfernen.
- Sammeln Sie die Überstände in neue 50 ml konische Röhrchen und zentrifugieren 10 min bei 2000 × g tote Zellen zu entfernen. Übertragungsüberstände auf kommerzielle Rotor-kompatiblen Röhren führt, die fähig sind Ultrazentrifugation zu widerstehen.
- Achten Sie darauf, die Ultrazentrifugenröhrchen zu balancieren. Zentrifugieren der Röhrchen für 30 min bei 10.000 × g zu entfernenZelltrümmer.
- Sammeln Sie die Überstände in Ultraröhrchen und Zentrifuge für 70 min bei 100.000 x g. Die Überstände verwerfen.
- Resuspendieren der exosome reichen Pellets in 5 ml frischem PBS. Übertragen Sie die Lösungen an die frische Ultrazentrifuge Rohre und Zentrifuge wieder für 70 min bei 100.000 x g.
- Verwerfen Stände. Zum Speichern der Exosomen langfristig Resuspendieren der Pellets in 50 ul PBS und bei -80 ° C. Alternativ gehen Sie direkt zur Proteinextraktion, wie unten gezeigt.
3. Proteinextraktion und Vorbereitung
- Löse isoliert exosomalen Pellets in 100-200 ul RIPA-Lyse und Extraktionspuffer mit zusätzlichen Protease-Inhibitor-Cocktails. Der Puffer besteht aus 25 mM Tris-Hydrochlorid, 150 mM Natriumchlorid, 1% NP-40, 1% Natriumdesoxycholat und 0,1% SDS (Natriumdodecylsulfat) bei pH 7,6. Die Protease-Inhibitor-Cocktails sollte eine Vielzahl von Protease-Inhibitoren enthalten, wie Aprotinin, Bestatin, leupeptin, Pepstatin A und EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure), das kann eine vollständige Palette von Proteasen hemmen.
- Zentrifugieren Sie die gelösten Lösungen für 10 Minuten bei 13.000 × g (4 ° C), und übertragen Sie die gelöscht Stände auf neue 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
- Quantifizieren Proteinkonzentration jeder Probe von Exosomen mit Bicinchoninsäure (BCA) oder Bradford - Test 16.
- Mischen Sie eine gleiche Menge an Proteinen (2 ug) von markierten und unmarkierten Proben und führen Sie die gleiche Mischung auf einem 4-20% SDS-PAGE-Gel bei 120 mA / 200 V für 30 min.
- Stain Gel mit Coomassie - Blau , gefolgt von 17 Entfärben.
- Mit einer Rasierklinge, schneiden Sie die Probenspur aus dem Gel. Dann schneiden Sie das Gel Spur in 10-15 gleich große Stücke. Legen Sie jedes Stück in ein frisches 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen für insgesamt 10-15 Rohre.
- Tauchen Sie Würfel in 25 mM NH 4 HCO 3 in 50% Acetonitril, Wirbel, und -Überstände verwerfen. Zweimal wiederholen. TrockenWürfel in einem Vakuum - Konzentrator 18, 19.
- Rehydrate Würfel mit 10 mM Dithiothreitol (DTT), Wirbel und Zentrifuge kurz. Inkubieren bei 56 ° C für 1 Stunde. Überstand verwerfen.
- Tauchen Gelwürfel in 55 mM Iodacetamid, Wirbel, und Spin. Inkubieren bei Raumtemperatur im Dunkeln für 45 min. Überstand verwerfen.
- Tauchen Sie Würfel in 25 mM NH 4 HCO 3, Wirbel, Spin und Überstand verwerfen.
- Tauchen Sie Würfel in 25 mM NH 4 HCO 3 in 50% Acetonitril, Wirbel, und Spin. Wiederholen 3.9 und 3.10.
- Trocknen Sie die Würfel in einem Vakuum-Konzentrator. In 25 ul Sequenziergrad modifizierte Trypsin in 25 mM NH 4 HCO 3, Inkubation bei 4 ° C für 30 min, und entsorgen Sie die überschüssige Lösung. Tauchen Sie Würfel in 25 mM NH 4 HCO 3 ohne Trypsin und Inkubation über Nacht bei 37 ° C.
- Spin Kurz Würfel nach unten und übertragen die resultierenden Peptid Extract in ein neues Röhrchen. In 30 ul 5% Ameisensäure in 50% Acetonitril zu den Kuben, Wirbel für 30 Minuten, und Spin. Kombinieren Sie den Überstand mit dem Extrakt. Trocknen Sie die Peptidextrakte mit einem Vakuumkonzentrator auf weniger als 5 & mgr; l.
- Senden Proben Massenspektrometrie Core Facility für die LC-MS / MS-Analyse. Die MS-Analysedaten, die von Open Source Software erzeugt werden kann, enthält typischerweise eine Zugangsnummer für jedes identifizierte Protein, gekennzeichnet / nicht-markiertem Verhältnisse und die Anzahl der einzelnen Peptide identifiziert.
4. Western Blotting Verification
HINWEIS: Western-Blot wird empfohlen Massenspektrometrie Ergebnisse zu überprüfen.
- Folgen Standard-Western-Blotting Protokollen und sicherzustellen, dass gleiche Mengen an Protein aus jeder Gruppe geladen werden. Verwenden Antikörper gegen Proteine von Interesse (zB Annexin A5, Laktat - Dehydrogenase - B - Kette) identifiziert durch MS. Western-Blot-Detektion, zusammen mit Densitometrie analysis, kann bestätigen, dass MS Protein Identifizierung und Quantifizierung korrekt sind.
5. Proteomik Datenanalyse
HINWEIS: Die Bewertung der Datenqualität, Datenvorbehandlung, Berechnung und Bestimmung der signifikanten Proteinkandidaten werden separat erfolgen für jede MS replizieren. Sobald obigen Analysen abgeschlossen sind, werden die analysierten Daten von Replikaten verglichen und 6 kombiniert, 20, 21.
- Bewerten Sie die Qualität der MS-Daten.
- Zunächst log2 die SILAC-MS in einem Tabellenkalkulationsprogramm markierten / nicht markierten Verhältnisse von quantifizierten Proteine verwandeln.
- In der wissenschaftlichen Grafiken und statistische Software, Gruppe die Verhältnisse in 40-100 Verhältnis Bins und zeichnen Sie die Anzahl der Verhältnisse pro Fach ein Histogramm zu erzeugen. Eine normale Verteilung von Histogramm zeigt eine gute Qualität der MS - Daten 6. Führen Sie diesen Schritt für alle MS repliziert.
- Um das Vertrauen und die Genauigkeit der MS Peptidverhältnisse erhöhen, sollten Proteine zu entfernen, die weniger als zwei quantifizierten Peptide haben.
- Um zu bestimmen , deutlich nach oben und nach unten reguliert Protein Kandidaten, verwenden Sie die folgenden Schritte zur Berechnung Bedeutung 22 Schwellen.
- In der wissenschaftlichen Grafiken und statistische Software erzeugen, die den Frequenzverteilungsdaten eine nichtlineare Regression oder Kurvenanpassung. Dieser Schritt ergibt Werte, die verwendet werden können, die Cutoff-Werte zu berechnen. Berechnen Sie die Cut-off-Werte als Median ± 1,96 σ für 95% Vertrauensgrenzen oder 2,56 σ für 99% Vertrauensgrenzen.
HINWEIS: Nähere Einzelheiten des Cutoffs Berechnung kann bei Emmott et al. 22. - Wählen Sie die Proteinkandidaten, deren Verhältnisse sind entweder größer als 1,96 (oder 2,56) Standardabweichungen über dem Mittelwert (signifikant überexprimiert) oder niedriger als 1,96 (oder 2,56) Standardabweichungen unter dem Mittelwert (deutlich unter ausgedrückt).
- In der wissenschaftlichen Grafiken und statistische Software erzeugen, die den Frequenzverteilungsdaten eine nichtlineare Regression oder Kurvenanpassung. Dieser Schritt ergibt Werte, die verwendet werden können, die Cutoff-Werte zu berechnen. Berechnen Sie die Cut-off-Werte als Median ± 1,96 σ für 95% Vertrauensgrenzen oder 2,56 σ für 99% Vertrauensgrenzen.
- Vergleichen die Replikate der oben identifizierten signifikanten Kandidaten Konsistenz zu erreichen. Stellen Sie sicher, dass sie die folgenden Kriterien erfüllen diese letzte Auswahlschritt weitergeben müssen: Kandidaten müssen konsequent in allen Replikaten identifiziert werden; und Replikate eines Kandidaten müssen in der Richtung der Regulierung im Einklang stehen (vorzugsweise mindestens 2 von 3 Wiederholungen eines Kandidaten sollte entweder hochreguliert oder herunterreguliert).
- Finalisieren Daten für die Kandidaten, die die oben genannten Kriterien durch ihre Replikate "Zusammenführen von Daten erfüllen.
6. Bioinformatics Verifikation und Charakterisierung
HINWEIS: Die bestehenden genomischen und bioinformatischen Informationen bietet eine Fülle von Informationen für fast jedes Protein. Data Mining und bioinformatische Analyse dieser Informationen können gewinnen viel Einblick in das Eigentum und die Funktionen der bedeutenden Kandidaten helfen. Diese process ist in der Regel notwendig, die richtige nachgeschalteten Nasslaborexperimenten zu entwerfen.
- Mit ihren GenBank Zugangsnummern oder UniProt IDs, die Kandidaten gegen aktuelle exosome Datenbanken zu suchen (Exocarta 23, Evpedia 24) , um zu überprüfen , dass die Kandidatenproteine zuvor in exosome gefunden wurden. Dieser Schritt fügt eine Schicht von Vertrauen, dass die Kandidaten sind in der Tat in Exosomen.
- Zugang http://www.exocarta.org/, klicken Sie auf "Abfrage" und geben Sie entweder das Gen oder Protein Name / Zugangsnummer. Eine Zusammenfassung Seite wird angezeigt und die Beweise in exosome wird gezeigt, zur Verfügung gestellt werden, wenn es irgendein.
- Suche die Kandidaten gegen die HIV-1 und dem Human Protein - Interaktion Datenbank 25. Alternativ können Sie die spezifischen Datenbanken, die Informationen über die Interaktion der Kandidatenproteine und die Testbedingungen zur Verfügung stellen kann.
- Zugriff auf die Datenbank bei www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/HIVWechselwirkungen. Auf dem Eintrag 'Protein Domain-Namen ", geben Sie die Namen der Kandidaten oder Zugangsnummern, und klicken Sie auf Suche. Die Suchergebnisse können Einblick in die Wechselwirkungen zwischen HIV-1 zur Verfügung stellen und die Protein-Kandidaten, und welche der Kandidaten vorschlagen könnte wirklich HIV-1 in Verbindung gebracht werden.
- Import GenBank Zugangsnummern oder UniProt IDs der Kandidaten in GO - Analyse - Software (wie FunRich, Functional Enrichment - Analyse - Tool 26) und die Software ausführen.
- Laden Sie die Software auf http://www.funrich.org/. Nach der Installation öffnen Sie die Software unter Anreicherung Analyse, klicken Sie auf "Add Data Set", und die Liste der Protein / Gene hochladen. Als nächstes wählen Sie den Diagrammtyp die GO-Analyse zu visualisieren.
HINWEIS: GO Analyseergebnisse werden in Form von Tortendiagrammen visualisiert werden. Dieser Schritt hilft uns, mit den Kandidaten in den Bereichen biologische Verfahren (BP), Cellular Komponente (C assoziiert globalen Einblick zu gewinnenC) und Molecular Funktion (MF).
- Laden Sie die Software auf http://www.funrich.org/. Nach der Installation öffnen Sie die Software unter Anreicherung Analyse, klicken Sie auf "Add Data Set", und die Liste der Protein / Gene hochladen. Als nächstes wählen Sie den Diagrammtyp die GO-Analyse zu visualisieren.
- Zugang DAVID bei http://david.ncifcrf.gov/ 27, klicken Sie auf das "Functional Annotation Tool" auf ihrer Website. Geben Sie die Kandidatenliste, wählen Sie die "Identifier" des Gens wie die "UniProt ID", wählen Sie "Gene List" und suchen. Die angereicherten GO Begriffe, p-Werte und weitere Parameter können durch Klicken auf die "Annotation Zusammenfassung Ergebnisse" unter der "Gene_Ontology" Kategorie zu finden.
- Um mögliche Wechselwirkungen der Kandidaten mit anderen Proteinen zu untersuchen, verwenden offen zugängliche STRING - Datenbank 28 potentielle Protein-Protein - Wechselwirkungen und mögliche biochemische Wege aufzuklären.
HINWEIS: GO Analysis and Functional Annotation (Abschnitt 6,3-6,4) können hier auch die neuesten STRING-Software durchgeführt werden.- Zugriff auf die Datenbank bei http://string-db.org/. Geben Sie die Protein-ID oder eine Sequenz in die vorgesehenen search Feld und wählen Sie die richtigen Spezies für die Analyse. Klicken Sie auf "Suchen". Die Ergebnisse werden Informationen zu den beiden direkten (physischen) geben und indirekte (funktionelle) Verbände. Die Top-Ten bekannte Spiele für die exosomalen Kandidat wird angezeigt und sollte für eine signifikante Kandidatenauswahl berücksichtigt werden.
ANMERKUNG: Eine große Menge an Informationen mit den Kandidaten im Zusammenhang analysiert werden können, die Schritte oben. Die wichtigsten Kandidaten zur weiteren nachgelagerten molekularen und biochemischen Analyse ausgewählt werden.
- Zugriff auf die Datenbank bei http://string-db.org/. Geben Sie die Protein-ID oder eine Sequenz in die vorgesehenen search Feld und wählen Sie die richtigen Spezies für die Analyse. Klicken Sie auf "Suchen". Die Ergebnisse werden Informationen zu den beiden direkten (physischen) geben und indirekte (funktionelle) Verbände. Die Top-Ten bekannte Spiele für die exosomalen Kandidat wird angezeigt und sollte für eine signifikante Kandidatenauswahl berücksichtigt werden.
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Representative Results
1A ist ein Flussdiagramm , umreißt das SILAC Markierungsverfahren 21. Um die Exosomen zu reinigen, müssen die Proben über Zentrifuge geschleudert werden. 1B zeigt die Schritte exosome Reinigung durch Ultrazentrifugation serielle 21. Nach der Reinigung sind die Exosomen unter experimentellen Proteomanalyse wie in dem Verfahren beschrieben.
2A ist ein Flussdiagramm zur Bestimmung signifikante Proteinkandidaten aus proteomic Daten 21. Die ausgewählten Kandidaten werden dann für nachgeschaltete Proteomik-Analyse verwendet. 2B ist ein Beispiel für SILAC Histogramms Anzeigen repräsentativer Verhältnisse von typischen Quantifizierungsergebnisse Protein (Diese Zahl kann von Li modifiziert wurde , et al. 6) und Tabelle 1 ist einen Beispiel für Cutoff - Werte für signifikante Kandidaten 6 aus diesen SILAC Verhältnis Histogramme zu bestimmen. Wenn Sie die in Abschnitt 6.3 beschriebenen Schritte wurden berechnet die Cutoff-Werte für deutlich nach oben oder nach unten reguliert Proteine zu bestimmen. In dieser repräsentativen Datensatz Proteine mit einem schweren / leichten (H / L) Verhältnis über dem oberen Grenzwert wurden als signifikant hochreguliert, während Proteine mit einem H / L-Verhältnis unter dem unteren Grenzwert betrachtet wurden als signifikant herunterreguliert betrachtet . Deutlich regulierte Kandidatenproteine würde zur weiteren Untersuchung unterzogen werden.
Abbildung 3 zeigt die Gesamt bioinformatische Analyse und Data - Mining - Verfahren für die ausgewählten bedeutenden Kandidaten. Tabelle 2 ist eine Data - Mining - Beispiel , das exosome und HIV-1 / Wirt - Interaktion Datenbanken 6 zu sammeln Informationen über die Kandidaten (Diese Registerkarte nutztle wurde von Li et al modifiziert. 6). Durch den Bergbau aktuellen exosome und HIV-1 / Wirt - Interaktion Datenbanken, dreizehn der vierzehn Kandidaten wurden gefunden mit Exosomen zu assoziieren. Fünf der vierzehn Kandidaten wurden auch mit HIV-1 zu interagieren, bekannt. Unter ihnen sind vier Kandidaten (HSPA4, Hitzeschock - 70 kDa - Protein 4; NUTF2, Kemtransport Faktor 2; PTGES3, Prostaglandin E Synthase 3; LDHB, L-Lactat - Dehydrogenase - B - Kette) gefunden , sowohl mit Exosomen und HIV-1 zu assoziieren. Unter HSPA4, NUTF2, PTGES3 und LDHB, war nur LDHB konsequent unterdrückten in der infizierten Fraktion (schwer markiert). Durch eine Reihe von Analysen, ausgewählt LDHB wir das signifikanteste Kandidat zu sein, was zu weiteren Untersuchung unterzogen werden konnte. Die nachgeschalteten Proteomik Analysen sind in Abbildung 4 dargestellt 4A zeigt kurze Schritte der Gen - Ontologie (GO) Analyse; 4B zeigt die Schritte der Durchführung DAVID-Analyse; 4C zeigt , wie Netzwerkanalyse mit STRING auszuführen. Die 5A, 5B und 5C sind DAVID Analyse eines Satzes von vierzehn Proteine in BP, CC und MF; 5D zeigt die Top - Ten - Partner von LDHB interagieren; 5E zeigt , dass die Mehrheit der Interaktionspartner von LDHB zugeordnet sind auch mit exosome und HIV-1. Initial DAVID Analyse Ergebnisse legten nahe, dass viele Kandidaten sind Apoptose-bezogenen und machen wahrscheinlich in Proteinbindung. Weitere STRING-Analyse bestätigte, dass LDHB Bindungspartner sind auch funktionell und örtlich zu exosome und HIV-1 zusammen. Alle diese Ergebnisse geben wertvolle Informationen für potenzielle nachgeschaltete Untersuchungen.
Abbildung 1: SILAC Kennzeichnung und exosome Reinigung unter Verwendung von Differential Ultrazentrifugation.(A) Zwei Gruppen von Zellen werden getrennt gezüchtet. Eine Gruppe wird in der Bezeichnung Medium für sechs Verdopplungen für eine vollständige Kennzeichnung gewachsen. Die andere Gruppe wird im normalen unmarkierten Medium für den gleichen Zeitraum gewachsen. Als nächstes werden die markierten Zellen mit HIV-1 infiziert, während unmarkierte Zellen nicht. Schließlich werden Exosomen aus beiden Gruppen parallel isoliert. (B) Die Proben (Überstand oder Pellets) in der Zentrifugation bei jedem Schritt verwendet werden , in den Teströhrchen angegeben. Fraktionen werden auf der rechten Seite von Reagenzgläsern verworfen vermerkt. Die Geschwindigkeit und die Länge jeder Zentrifugation werden auch gezeigt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Schritte zur Validierung von Proteom - Datensatz (n) und signifikante pro Bestimmungtein Kandidaten. (A) Flussdiagramm zur Bestimmung signifikante Proteinkandidaten von Proteom - Datensatz (n). Diese vier Schritte sorgen für eine sichere Auswahl von signifikanten Kandidaten. Zuerst wird ein Verhältnis SILAC Histogramms aufgetragen, um die Qualität der Daten zu bewerten. Als nächstes weniger idealen Kandidaten, die Genauigkeit verringern könnten, werden entfernt. Im dritten Schritt werden statistische Verfahren verwendet, um festgelegt Bedeutung Schwellenwerte für potentielle Proteinkandidaten. Schließlich werden die Wiederholungsdaten der signifikanten Kandidaten auf Konsistenz überprüft werden schließlich zusammengeführt. (B) Repräsentative Histogramm der SILAC Verhältnisse. Das Histogramm ergab symmetrische Verteilung entlang Verhältnis = 1 (log 2 = 0) Trendlinie. Die log2 transformierte Verhältnisse werden in Verhältnis Fächer unterteilt, und die y-Achse zeigt die relative Anzahl der erfassten Verhältnisse pro Fach. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Gesamt bioinformatische Analyse und Data - Mining - Verfahren für signifikante Kandidaten. Die Verfahren enthalten exosomalen und HIV-1 / Host Data Mining, Gene Ontology Charakterisierung, DAVID-Analyse und Netzwerk-Vorhersage. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Schritte zur Durchführung von Gen - Ontologie Charakterisierung, Anreicherung, und Pathway - Analysen. (A) Schritte zur Durchführung Gene Ontology (GO) Charakterisierung. Um einen Einblick über die Funktionen und subzellulärer Lokalisationen der bedeutenden Kandidaten, Schritte zur Durchführung GO Analyse Appropriate Software 26 veranschaulicht. (B) Die Schritte zur Durchführung Anreicherung Analyse GO Begriff. Zur Anreicherung Informationen der bedeutenden Kandidaten, kurze Schritte zur Durchführung DAVID Analyse gezeigt gewinnen. (C) Schritte zur Durchführung von Interaktion und Pfadanalyse. Um mögliche Wege aufzuklären und funktionelle Partner, Schritte zur Durchführung Interaktion oder Netzwerkanalyse durch STRING dargestellt finden. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: Repräsentative DAVID und STRING Analyseergebnisse. (A) BP Anreicherung Ergebnisse der vierzehn Kandidaten , die von DAVID - Analyse. Der Zelltod bezogenen Prozesse sind wesentlich bereichert. (B) CC enrichmen t Ergebnisse der vierzehn Kandidaten, die von DAVID-Analyse. Viele Proteine haben einen intrazellulären Ursprungs. (C) BP Anreicherung Ergebnisse der vierzehn Kandidaten , die von DAVID - Analyse. Die meisten der Kandidaten nehmen an Protein zu binden. (D) Top zehn Partner von LDHB von STRING identifiziert interagieren. (E) Die Mehrheit der LDHB Partner sind auch mit exosome und HIV-1, verbunden , die weiter die Rollen von LDHB in exosome / HIV-1 unterstützt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Tabelle 1: Repräsentative Berechnung der Cutoff - Werte für signifikante Protein Störung.
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Tabelle 2: Assoziationen zwischen SILAC Kandidaten und ihre exosomalen Lokalisierungen und Wechselwirkungen mit HIV-1.
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Discussion
In den in diesem Dokument beschrieben, haben wir gezeigt, die Anwendung der SILAC Technik, um die Wirkung von HIV-1-Infektion auf dem Host exosomalen Proteom zu untersuchen. Anfänglich nicht infizierten und HIV-1-infizierten Zellen sind unterschiedlich isotopenmarkierten. Die differentiell markierten Exosomen werden dann gereinigt, bevor die Proteinextraktion durchgeführt wird. Als nächstes wird die Massenspektrometrie-Flüssigchromatographie-Tandem eingesetzt, um die exosomalen Proteom zu analysieren. Schließlich werden die resultierenden Massenspektrometrie Daten und potenziellen Kandidatenproteine zu statistischen unterworfen und Bioinformatik-Analysen vor nachgelagerten biochemischen Dissektionen.
Kritische Schritte gesamten Protokoll zu erreichen, müssen optimierte Ergebnisse folgen. In der Anfangsphase des Protokolls SILAC Kennzeichnung könnte durch den Zelltyp und das Markierungsmedium berührt. Gesunde und hochproliferative Zellen sollten eine hohe Markierungseffizienz zu erhalten, verwendet werden. Entscheidend ist, dass die Kennzeichnung mITTEL frisch sein sollte mit dialysiertem fötalen Rinderserum (FBS) statt regulären FBS vorbereitet. Dialysiertes FBS erschöpft von Aminosäuren und Peptiden und ist daher weniger wahrscheinlich mit dem SILAC Kennzeichnung zu interferieren. Es sollte jedoch beachtet werden, dass dialysiertem Serum nicht für einige Zelllinien geeignet sein können, insbesondere primäre Zellen. Normales Wachstum in dem Medium mit dialysiertem FBS sollte vor dem Einsatz der Strategie SILAC bestätigt werden. Zusätzlich double "schweren" Isotopenmarkierung (13 C 6 L-Lysin und 13 C 6 15 N 4 L-Arginin) einzeln anstelle der Verwendung von 13 C 6 L-Lysin verwendet, kann die Anzahl der quantifizierten Peptide in der Massenspektrometrie erhöhen Analyse. Die minimale Anzahl von Zellen für eine erfolgreiche nachfolgende Proteomanalyse benötigt wird, hängt von vielen Faktoren ab, wie die Empfindlichkeit des Massenspektrometers, die Masse einer jeden Zelle und Proteom gezielte (ganze Proteom oder posttranslationale modifizierten Proteinen). Basierend auf unseren Erkenntnissen empfehlen wir, zehn Millionen Zellen als Ausgangsmenge in die entsprechende Anzahl von Zellen für die Massenspektrometrie erforderlich abzuschätzen.
Exosom Isolierung aus Zellkulturüberstand kann durch Zugabe eines Filtrationsschritt wie folgt verbessert werden. Für die Suspension von Zellen eine erste Zentrifugationsschritt bei 200 xg für 10 min erfolgt suspendierten Zellen in dem Überstand zu entfernen, gefolgt von Filtration durch einen 0,22 um - Filter 29, 30. Für adhärente Zellen, kann der Überstand in der gleichen Weise direkt aus der Kultur und filtriert gesammelt werden. Filtration ist ein kritischer Schritt für Exosomen von kontaminierenden Materialien, wie kleine Moleküle und Peptide zu trennen. Die Exosomen kann dann aus dem Überstand unter Verwendung der klassischen Ultrazentrifugation Methode oder unter Verwendung kommerziell erhältlicher Reagenzien exosome Isolation Kits isoliert werden. Die Reinheit des exosome kann durch nanoparti prüft werdencle - Tracking - Analyse oder Elektronenmikroskopie 31.
Da HIV-1-Virionen in Größe Exosomen typischerweise ähnlich sind, können sie Exosomen gereinigt aus HIV-1-infizierten Proben kontaminieren. In Proteom-Bildschirme können potentielle virale Verunreinigungen herausgefiltert werden, indem die Datenbanksuche nur für die menschliche Proteine zu begrenzen. Weitere Isolierungstechniken erprobte Methoden unter Verwendung von wie Iodixanol Dichtegradienten und Immunoaffinitäts - Isolierung kann auch HIV-1 - Virionen verwendet werden , von Exosomen 32 zu trennen, 33.
Als nächstes diskutieren wir einige Vorschläge zuverlässige Datenanalyse, um sicherzustellen, zu identifizieren potenziell signifikante Kandidaten einmal MS-Ergebnisse aus isolierten Exosomen erhalten werden. Im ersten Schritt der Analyse sollte das SILAC Verhältnis Histogramm einer Normalverteilung folgen. Wenn der Datenverteilung in einer bestimmten Richtung verdreht wird, würde der Leser benötigen th zu bestimmene verursachen, bevor mit der Analyse fortfahren. Zum Beispiel wurden die markierten und unmarkierten Proben können nicht in gleichen Anteilen gemischt. Außerdem können einige Peptide nicht schwer / leicht SILAC Verhältniswerte haben, und sollte von den potentiellen Protein Kandidaten eliminiert werden. Nach Kandidaten ausgewählt werden, Software und Datenbanken können exosome Anreicherung, Wechselwirkungen mit Testbedingungen zu überprüfen und mögliche Wege eingesetzt werden. Die Wechselwirkungen zwischen den Kandidatenproteine und Testbedingungen sollten durch spezielle Datenbanken vor bioinformatische Analyse abgebaut werden. Für Bioinformatik Charakterisierungen, Gen - Ontologie Anmerkungen können unter Verwendung verschiedener Software und Datenbanken identifiziert,
Die SILAC-Technik hier beschäftigt bietet einen systematischen und unkomplizierten Ansatz Host exosomalen Proteom zu analysieren. Die meisten biomedizinischen Laboratorien wäre in der Lage, die Verfahren mit minimaler zusätzlicher Ausrüstung und zusätzliche Kosten zu übernehmen. Die SILAC Technik wird jedoch in erster Linie deunter Verwendung von Zelllinien für Studien unterzeichnet. Als solche können andere Verfahren müssen zu studieren verschiedenen biologischen Proben eingesetzt werden. Zum Beispiel kann die markierungsfreie MRM (multiple reaction monitoring) Verfahren zur gezielten Quantifizierung von Proteinen und Peptiden in klinischen Proben 9, 34 verwendet werden. Während im Fall des Proteingehalts von mehreren Studien Bestimmung kann die SILAC Technik auch zu untersuchen, zwei oder mehreren Proben verwendet werden. Die chemische Markierungsverfahren iTRAQ (isobar Tags für relative und absolute Quantifizierung) oder TMT-basierte (Tandem-Massen-Tag) Methoden viel höhere Multiplex erlauben und wäre besser geeignet für mehrere Proben.
Das hier beschriebene Verfahren ist nicht auf proteomic Charakterisierung von Exosomen aus HIV-1 infizierten Zellen beschränkt. Mit Modifikationen kann es Exosomen unter einer Vielzahl von Test- und Belastungsbedingungen, wie beispielsweise bakterielle Infektionen, virale Infektionen zu analysieren angepasst und radiation. Es eignet sich auch für andere subzelluläre Kompartimente studieren.
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Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von einer ARRA Ergänzung zur Lebensdauer / Tufts / Brown CFAR, P30AI042853-13S1, NIH P20GM103421, P01AA019072, R01HD072693 und K24HD080539 BR unterstützt. Diese Arbeit wurde auch von Lifespan Pilot Research Fund (# 701- 5857), Rhode Island Foundation Medical Research Grant (# 20133969), und NIH COBRE URI / RIH Pilot Research Grant (P20GM104317) bis ML unterstützt. Wir danken James Myall und Vy Dang für die Hilfe bei der Handschrift und Figur Vorbereitung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| H9 cell line | ATCC | HTB-176 | |
| Trypan Blue | Thermo Fisher | 15250061 | |
| MTT assay kit | Thermo Fisher | V13154 | |
| Dialyzed fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher | 26400044 | |
| SILAC Protein Quantitation Kit – RPMI 1640 | Thermo Fisher | 89982 | DMEM version (89983) |
| L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 for SILAC | Thermo Fisher | 88434 | |
| L-Lysine-2HCl, 13C6 for SILAC | Thermo Fisher | 88431 | |
| HIV-1 NL4-3 | NIH AIDS Reagent Program | 2480 | |
| Alliance HIV-1 p24 Antigen ELISA kit | PerkinElmer | NEK050001KT | |
| Refrigerated super-speed centrifuge | Eppendorf | 22628045 | |
| Refrigerated ultracentrifuge | Beckman Coulter | 363118 | Should be able to reach 100,000 x g |
| 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher | 14-432-22 | |
| Ultracentrifuge Tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| SW 32 Ti Rotor | Beckman Coulter | 369694 | |
| RIPA buffer | Thermo Fisher | 89900 | |
| Protease Inhibitor Cocktails | Thermo Fisher | 78430 | |
| ThermoMixer | Eppendorf | 5384000020 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher | 23250 | |
| Spectrophotometer | Biorad | 1702525 | |
| SDS PAGE Gel apparatus | Thermo Fisher | EI0001 | |
| Novex 4-20% Tris-Glycine Mini Gels | Novex | XV04200PK20 | |
| Gel staining reagent | Sigma Aldrich | G1041 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
| SpeedVac Concentrator | Thermo Fisher | SPD131DDA | |
| Antibody to human annexin A5 | Abcam | ab14196 | |
| Antibody to human lactate dehydrogenase B chain | Abcam | ab53292 | |
| Graphing and Statistical Software | Systat | SigmaPlot | Or GraphPad Prism |
| Quantitative proteomics software suite | Max Planck Institue of Biochemistry | Maxquant | |
| Software and databases | Various vendors | Refer to main text for details |
References
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