Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

SILAC Based proteomik karakterisering av exosomes från HIV-1-infekterade celler

Published: March 3, 2017 doi: 10.3791/54799

Summary

Här beskriver vi en kvantitativ proteomik metod som använder tekniken med stabila isotopen märkning av aminosyror i cellkultur (SILAC) att analysera effekterna av HIV-1-infektion på värd exosomal proteom. Detta protokoll kan enkelt anpassas till celler under olika stress eller infektionsförhållanden.

Introduction

Många mänskliga sjukdomar, inklusive virusinfektioner, är ofta förknippade med distinkta cellulära processer som äger rum i och runt de drabbade cellerna. Proteiner, ofta i egenskap av den ultimata cellulära effektorer, medla dessa processer. Analys av proteinerna ofta kan ge ovärderlig information om den lokala miljön av påverkade celler och hjälpa oss att förstå den bakomliggande mekanismen för sjukdom patogenes. Bland olika proteinanalystekniker, har proteomik särskilt stort löfte. Som ett kraftfullt, storskaliga verktyg kan proteomik tillhandahålla en systemisk förståelse av cellulära processer, i synnerhet i området av funktionen och interaktionen av proteiner. Analysera specifika proteiner görs enklare genom utveckling av märkningstekniker, som tillåter forskare att övervaka uttrycket av cellulära komponenter, i synnerhet proteiner, i stället för undersökningen. Även om många proteomik analyser har gjorts på cellproteom skala, proteomik karakteriseringar på subcellulära fack har visat sig vara särskilt upplysande en. Detta exemplifieras väl i studier av HIV-1-infektion.

Exosomes, 30-100 nm membranvesiklar som utsöndras av ett brett spektrum av celltyper 2, 3, är kritiska komponenter i intercellulär kommunikation och molekylär transport. De tidigare upptäckt att spela viktiga roller i HIV-1 spirande process 4, 5. Genom att kombinera proteomik analys med funktionell dissekering, fann vi att exosomes frigörs från HIV-1-infekterade celler består av en unik och kvantitativt olika protein signatur och hamnen reglerande molekyler som påverkar cellulära egenskaper på angränsande receptiva celler, inklusive cellulär apoptos och proliferation 6. Metoderna beskrivs i detta protokoll,nämligen SILAC (stabil isotop märkning av aminosyror i cellkultur) 7 baserat proteomic karakterisering av exosomer från HIV-1-infekterade celler. Liknande tillvägagångssätt kan användas för att bättre förstå andra subcellulära fack under patogenes genom att justera experimentell spännings till den specifika avdelning eller del av intresse och göra nödvändiga ändringar av de beskrivna förfarandena.

Med tanke på den senaste utvecklingen av kvantitativa proteomik metoder, det finns många att välja mellan när du väljer den mest effektiva metoden för en viss experiment. Bland dessa är den kemiska-baserade iTRAQ (isobariska taggar för relativ och absolut kvantifiering) 8 och etiketten fria MRM (multipel övervakning reaktion) 9 tekniker. Båda metoderna är kraftfulla verktyg och är bra val för specifika inställningar. För en typisk laboratorie huvudsakligen arbeta med cellinjer, emellertid är dessa två metoder har relatively högre kostnader och är mer tidskrävande i jämförelse med den SILAC baserade metoden. SILAC är en metabolisk baserat märkningsteknik som innehåller icke-radioaktiva isotopiska former av aminosyror från odlingsmedierna i cellulära proteiner. Typiskt SILAC experiment börjar med två cellpopulationer, till exempel, infekterade och oinfekterade. Varje differentiellt märkt i sin specifika isotop miljö tills full märkning uppnås. De märkta exosomer av dessa celler utsätts sedan för proteinextraktion. När utvunnits, de märkta exosomal proteinerna analyseras med hjälp av vätskekromatografi tandem masspektroskopi 10. Slutligen masspektrometri resultat och kraftigt märkta proteiner utsattes för statistisk och bioinformatik analyser samt strikt biokemisk kontroll. Våra tidigare undersökande rapporter tyder på att SILAC / Exosome förfaranden är mer lämpade för cellinjer än primära celler, som cellinjer är vanligtvis i enaktiv prolifererande tillstånd för effektiv isotopmärkning,

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cell Culture och HIV-1-infektion

OBS: Innan experiment, är det rekommenderat att kontrollera cellernas livsduglighet genom Trypan blå färgning 11 och deras spridning genom en MTT-analys 12. Det är också viktigt att använda nyligen preparerat SILAC medium. Olika cellinjer kan användas, så länge som de är i en aktivt proliferativt stadium, och är mottagliga för HIV-1-infektion, eller testvillkoret av valet. I detta protokoll använder H9-cellinjen som exempel.

  1. Utsäde 2 x 10 6 H9-celler in i varje cellkulturkolv. Växa en grupp i 10 ml märkta RPMI 1640-medium innehållande 10% dialyserat fetalt bovint serum (FBS), 100 mg / L 13 C 6 L-lysin och 100 mg / L 13 C 6 15 N 4 L-arginin. Växer den andra gruppen i 10 ml omärkt RPMI 1640-medium, med 10% dialyserad FBS, 100 mg / L L-lysin och 100 mg / L L-arginin.
  2. Odla cellerna under sex fördubblingar vid vilken punkt de proteiner av cellerna i det märkta mediet är praktiskt taget fullständigt märkta (> 99%) med tunga aminosyror. Lägg till nytt medium eller ändra media regelbundet (var 1-3 dagar beroende på vilken typ av cell. För H9 cell ändrar medel var 3 dagar). Vid slutet av märkningen, öka odlingsvolym (t.ex. ~ 30 ml) för att rymma tillväxten av flera celler.
    OBS: Bestäm exakta cellfördubblingstiden vid början av experimentet via Trypan Blue-färgning och cellräkning.
  3. Infektera de märkta cellerna med HIV-1 NL4-3 användning av standard HIV-1-infektion-protokoll 13 för 48 timmar. Inkubera cellerna med lämpliga mängder av virus med en infektionsmultiplicitet (MOI) runt 0,3. Kontrollera HIV-1-infektion genom p24 kvantifiering av odlingssupernatanterna med användning av en HIV-1 p24-antigen ELISA-kit. Utför en immunofluorescensanalys 14 för att bekräfta framgångsrik infektion av celler. keep odla de omärkta cellerna i omärkt medium utan HIV-1-infektion.
  4. Skörda supernatanterna från båda grupperna vid slutet av infektionen (steg 2,1).

2. Exosome Isolering

OBS: Genom en serie av ultracentrifugeringssteg, är exosomal fraktioner från odlingssupernatanterna berikad 15. Utför alla följande steg vid 4 ° C, med en ultracentrifugrotor som kan nå en hastighet på minst 100 tusen x g.

  1. Samla in supernatanterna av kulturerna i 50 ml koniska rör, undvika celler. Centrifugera dem under 10 minuter vid 300 xg för att avlägsna kvarvarande celler.
  2. Samla in supernatanterna i nya 50 ml koniska rör och centrifugera dem under 10 min vid 2000 xg för att avlägsna döda celler. Överföring resulte supernatanter till kommersiella rotor-kompatibel rör som kan motstå ultracentrifugering.
  3. Var noga med att balansera ultracentrifugrör. Centrifugera rören under 30 minuter vid 10.000 xg för att avlägsnacelldebris.
  4. Samla supernatanterna i ultracentrifugrör och centrifugera för 70 minuter vid 100.000 x g. Kasta supernatanterna.
  5. Resuspendera Exosome rika pellets i 5 ml färsk PBS. Överföra lösningarna till färska ultracentrifugrör och centrifugera igen under 70 minuter vid 100.000 x g.
  6. Släng supernatanter. Att lagra exosomes långsiktigt resuspendera pellets i 50 pl PBS och förvara vid -80 ° C. Alternativt, gå direkt till proteinextraktion enligt nedan.

3. Protein Extraction och förberedelse

  1. Lös isolerade exosomal pellets i 100-200 ul RIPA lys och extraktionsbuffert med tillsats cocktails proteashämmare. Bufferten är sammansatt av 25 mM Tris-hydroklorid, 150 mM natriumklorid, 1% NP-40, 1% natriumdeoxikolat, och 0,1% SDS (natriumdodecylsulfat), vid pH 7,6. drinkar proteasinhibitom bör innehålla en mängd olika proteashämmare, såsom aprotinin, bestatin, leupeptin, pepstatin A och EDTA (etylendiamintetraättiksyra), som kan hämma ett komplett utbud av proteaser.
  2. Centrifugera de upplösta lösningarna för 10 min vid 13000 xg (4 ° C), och överför de röjda supernatanterna till nya 1,5 ml mikrocentrifugrör.
  3. Kvantifiera proteinkoncentration av varje prov av exosomer använder bicinkoninsyra (BCA) eller Bradford-analysen 16.
  4. Blanda en lika stor mängd av proteiner (2 | ig) från märkta och omärkta prover och kör lika stor blandning på en 4-20% SDS-PAGE-gel vid 120 mA / 200 V under 30 min.
  5. Stain gel med Coomassie Blue, följt av avfärgning 17.
  6. Med hjälp av ett rakblad, skär prov körfält från gelén. Skär sedan gelen körfält i 10-15 lika stora bitar. Lägg varje bit i en färsk 1,5 ml mikrocentrifugrör för totalt 10-15 rör.
  7. Doppa kuber i 25 mM NH 4 HCO 3 i 50% acetonitril, virvel, och kassera supernatanter. Upprepa två gånger. Torrkuber i en vakuumkoncentrator 18, 19.
  8. Rehydrera kuber med 10 mM ditiotreitol (DTT), virvel, och centrifugera kort. Inkubera vid 56 ° C under 1 timme. Släng supernatanten.
  9. Sänk gel kuber i 55 mM jodacetamid, virvel, och spinn. Inkubera vid rumstemperatur i mörker under 45 min. Släng supernatanten.
  10. Doppa kuber i 25 mM NH 4 HCO 3, virvel, snurra, och kassera supernatanten.
  11. Doppa kuber i 25 mM NH 4 HCO 3 i 50% acetonitril, virvel, och spinn. Upprepa 3,9 och 3,10.
  12. Torka kuber i en vakuumanrikningsverk. Tillsätt 25 pl sekvense grade modifierad trypsin i 25 mM NH4 HCO3, inkubera vid 4 ° C under 30 min, och kassera överskottslösningen. Fördjupa kuber i 25 mM NH4 HCO3 utan trypsin och inkubera över natten vid 37 ° C.
  13. snurra kort kuber ner och överföra den resulterande peptiden extraCT till ett nytt rör. Tillsätt 30 | il 5% myrsyra i 50% acetonitril för att kuberna, vortex under 30 minuter, och centrifugering. Kombinera supernatanten med extraktet. Torka de peptid extrakt med en vakuumkoncentrator till mindre än 5 | j, l.
  14. Överlämna prover till massa core facility spektrometri för LC-MS / MS-analys. MS analys av data, som kan genereras från öppen källkod, innefattar typiskt ett referensnummer för varje protein identifieras, märkta / omärkta nyckeltal och antalet unika peptider identifieras.

4. Western blotting Verification

OBS: Western blotting rekommenderas att kontrollera masspektrometri resultat.

  1. Följ vanliga western blotting-protokoll och se till att lika mängder protein från varje grupp laddas. Använd antikroppar mot proteiner av intresse (t.ex. Annexin A5, laktatdehydrogenas B-kedjan) som identifierats av MS. Western blotting upptäckt, tillsammans med densitometri analysis, kan bekräfta att MS proteinidentifiering och kvantifiering är korrekta.

5. proteomik Data Analysis

OBS: Bedömningen datakvalitet data förbehandling, beräkning och bestämning av signifikanta proteinkandidater görs separat för varje MS replikera. När ovanstående analyser är klara, de analyserade data från replikat jämfört och kombineras 6, 20, 21.

  1. Bedöma kvaliteten på MS-data.
    1. Först log2 omvandla SILAC-MS märkt / omärkta förhållanden av kvantifierade proteiner i ett kalkylprogram.
    2. I grafer och statistisk programvara, grupp förhållandena i 40-100 förhållandet korgar och rita antalet nyckeltal per bin för att generera ett histogram. En normal fördelning av histogrammet indikerar god kvalitet av MS-data 6. Gör detta steg för alla MS replikerar.
  2. För att öka förtroendet och noggrannheten hos MS-peptidförhållanden, överväga att ta bort proteiner som har mindre än två kvantifierade peptider.
  3. För att bestämma signifikant upp- och nedregleras protein kandidater, använd följande steg för att beräkna betydelse trösklar 22.
    1. I grafer och statistisk programvara, generera en icke-linjär regression eller kurvanpassning till uppgifterna frekvensfördelnings de. Detta steg ger värden som kan användas för att beräkna cutoff värden. Beräkna cut-off värden som median ± 1,96 σ för 95% konfidensintervall eller 2,56 σ för 99% konfidensintervall.
      OBS: Specifika detaljer för att beräkna de cutoffs kan hittas på Emmott et al. 22.
    2. Välj protein kandidater som förhållandena är antingen större än 1,96 (eller 2,56) standardavvikelser över medianen (kraftigt överuttryckt) eller lägre än 1,96 (eller 2,56) standardavvikelser under medianen (avsevärt under-uttryckt).
  4. Jämför replikat av de ovan identifierade betydande kandidater att uppnå enhetlighet. Se till att de uppfyller följande kriterier för att passera denna slutliga urvalet steg: kandidater måste konsekvent identifieras i samtliga replikat; och replikat av en kandidat måste vara konsekvent i sin riktning i förordning (företrädesvis åtminstone 2 av 3 kopior av en kandidat ska antingen vara uppreglerad eller nedreglerad).
  5. Slutföra uppgifter för sökande som uppfyller de ovan nämnda kriterierna genom att slå samman sina replikat data.

6. Bioinformatics Verifiering och karakterisering

OBS: Befintliga genomisk och bioinformatik uppgifter erbjuder en mängd information för nästan varje protein. Data mining och bioinformatik analys av denna information kan hjälpa till att få en hel del insikt i fastigheten och funktioner av de betydande kandidaterna. detta förfass är vanligtvis nödvändigt att utforma lämpliga nedströms våt-lab experiment.

  1. Att använda sig av GenBank åtkomstnummer eller UniProt ID, söka kandidater mot nuvarande Exosome databaser (Exocarta 23 Evpedia 24) för att kontrollera att kandidatproteiner har tidigare funnit i Exosome. Detta steg lägger ett lager av förtroende för att kandidaterna är verkligen i exosomes.
    1. Tillgång http://www.exocarta.org/, klicka på "Query" och mata antingen genen eller protein nummer beteckning / anslutningen. En sammanfattningssida visas och bevisen i Exosome visas, ges om det finns någon.
  2. Sök kandidaterna mot HIV-1 och Human Protein Interaction Database 25. Du kan också söka de specifika databaser som kan ge information om interaktionen mellan kandidatproteiner och testvillkoret.
    1. Tillgång till databasen på www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/HIVInteraktioner. På "protein domännamnet post, ange kandidaternas namn eller nummer anslutnings och klicka på sök. Sökresultaten kan ge insikt i samspelet mellan HIV-1 och protein kandidater, och föreslå vilka av kandidaterna skulle vara riktigt HIV-1 associerad.
  3. Import GenBank åtkomstnummer eller UniProt ID av kandidaterna till GO analysprogram (t.ex. FunRich, Functional Anrikning analysverktyg 26) och köra programmet.
    1. Ladda ner mjukvaran på http://www.funrich.org/. Efter installationen, öppna programvaran under anrikning analys, klicka på "Lägg Data Set", och ladda upp en lista över protein / gener. Därefter väljer diagramtyp att visualisera GO analys.
      NOT: GO analysresultat kommer att visualiseras i form av cirkeldiagram. Detta steg hjälper oss att få global insikt i samband med kandidaterna inom områdena biologisk process (BP), cellulär komponent (CC), och Molecular Function (MF).
  4. Tillgång DAVID på http://david.ncifcrf.gov/ 27, klicka på "Functional Tillägg verktyg" på sin webbplats. Ange kandidatlistan, välj "Identifier" av genen som "UniProt ID", välj "Gene List" och sökning. De anrikade GO termer, p-värden och andra parametrar kan hittas genom att klicka på "antecknings sammanfattning av resultaten" sida under kategorin "Gene_Ontology".
  5. För att undersöka potentiella interaktioner av kandidaterna med andra proteiner, använder öppet tillgängliga STRING databas 28 för att belysa potentiella protein-proteininteraktioner och eventuella biokemiska vägar.
    OBS: GO Analys och Funktionell Notering (avsnitt 6,3-6,4) kan även utföras med användning av den senaste STRING programvara.
    1. Tillgång till databasen på http://string-db.org/. Ingång protein ID eller sekvens i de utsedda sök rutan och välj rätt arter för analys. Klicka på "Sök". Resultaten kommer att ge information om både direkta (fysiska) och indirekta (funktionella) föreningar. De tio kända matcher för exosomal kandidaten kommer att visas och bör övervägas för betydande val kandidat.
      OBS: En hel del information i samband med kandidaterna kan analyseras med hjälp av stegen ovan. De mest betydande kandidaterna kan väljas för ytterligare nedströms molekylär och biokemisk analys.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1A är ett flödesschema som beskriver förfarandet 21 den SILAC märkning. För att rena exosomes måste proverna centrifugeras ned via centrifug. Figur 1B visar stegen Exosome rening genom serieultracentrifugering 21. När renad, de exosomes är föremål för experimentell proteomik analys som beskrivs i förfarandet.

Figur 2A är ett flödesschema för att bestämma signifikanta proteinkandidater från proteomik uppgifter 21. De utvalda kandidaterna används sedan för efterföljande proteomik analys. Figur 2B är ett exempel på SILAC histogram som visar representativa förhållanden av typiska protein kvantifiering resultat (Denna siffra har ändrats från Li et al. 6), och tabell 1 är enn exempel att bestämma Gränsvärdena för betydande kandidater 6 från dessa SILAC förhållande histogram. Genom att följa de steg som beskrivs i avsnitt 6.3, ades Gränsvärdena för bestämning signifikant upp- eller ned-reglerade proteiner beräknas. I detta representativa dataset, var proteiner med en tung / ljus (H / L) förhållande ovanför den övre gränsvärde anses avsevärt uppreglerat, medan proteiner med H / L-förhållandet under den undre gränsvärde ansågs vara betydligt nedregleras . Betydligt reglerade kandidatproteiner skulle utsättas för ytterligare utredning.

Figur 3 visar den totala bioinformatik analys och data mining förfaranden för de utvalda stora kandidater. Tabell 2 är en data mining exempel som utnyttjar Exosome och HIV-1 / värd interaktion databaser 6 för att samla information om kandidaterna (Denna flikle har ändrats från Li et al. 6). Genom att gruv nuvarande Exosome och HIV-1 / värd interaktion databaser, tretton av de fjorton kandidater befanns associera med exosomes. Fem ut den fjorton kandidater var också kända för att interagera med HIV-1. Bland dem, fyra kandidater (HSPA4, värmechock 70 kDa-protein 4, NUTF2, nukleär transportfaktor 2, PTGES3, prostaglandin E syntas 3, LDHB, L-laktatdehydrogenas B-kedja) konstaterades att associera med både Exosome och HIV-1. Bland HSPA4, NUTF2, PTGES3 och LDHB, endast LDHB var genomgående under uttryckas i den infekterade fraktionen (tung märkt). Genom en serie analyser, valde vi LDHB att vara den mest signifikanta kandidaten, som skulle kunna utsättas för ytterligare studier. De proteomik nedströms analyser visas i figur 4. Figur 4A visar korta stegen att genen ontologi (GO) analys; Figur 4B visar stegen att utföra DAVID-analys; Figur 4C visar hur man utför nätverksanalys med hjälp av STRING. Figurerna 5A, 5B och 5C är DAVID analys av en uppsättning av fjorton proteiner i BP, CC och MF; Figur 5D visar de tio samverkande partner LDHB; Figur 5E visar att majoriteten av samverkande partner LDHB är också förknippade med Exosome och HIV-1. Initiala DAVID analysresultaten tyder på att många kandidater är apoptos-relaterade och sannolikt delta i proteinbindning. Ytterligare STRING analys bekräftade att LDHB bindningspartners är också funktionellt och locationally relaterade till Exosome och HIV-1. Alla dessa resultat ger värdefull information för potentiella nedströms undersökningar.

Figur 1
Figur 1: SILAC märkning och Exosome rening med användning av differentiell ultracentrifugering.(A) Två grupper av celler odlas separat. En grupp odlas i märkt medium för sex fördubblingar för fullständig märkning. Den andra gruppen odlas i det normala omärkt medium för samma period. Därefter de märkta cellerna infekterades med HIV-1, medan omärkta celler inte är det. Slutligen är exosomer från båda grupperna isolerades parallellt. (B) prover (supernatanterna eller pellets) som används i centrifugering vid varje steg anges i provrören. Fraktioner som skall kasseras noteras på den högra sidan av provrören. Hastigheten och längden för varje centrifugering visas också. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2: Åtgärder för att validera proteomik dataset (s) och bestämning av den signifikanta proTein kandidater. (A) Flödesschema för bestämning signifikanta proteinkandidater från proteomic dataset (er). Dessa fyra steg säkerställa tillförlitlig urval av väsentliga kandidater. Först en SILAC förhållande histogram ritas för att bedöma kvaliteten på uppgifterna. Nästa, mindre idealiska kandidater som kan minska noggrannheten tas bort. I det tredje steget, är statistiska metoder används för att ställa signifikativa gränsvärden för potentiella proteinkandidater. Slutligen replikera data från de betydande kandidater analyserades med avseende konsekvens och slås samman så småningom. (B) Representativa histogram över SILAC förhållanden. Histogrammet avslöjade symmetrisk fördelning längs förhållande = 1 (log2 = 0) trendlinje. De log2 transformerade förhållandena är grupperade i förhållande fack, och y-axeln visar det relativa antalet upptäckta förhållanden per bin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3: Generellt bioinformatik analys och data mining rutiner för betydande kandidater. Procedurerna innehåller exosomal och HIV-1 / värd data mining, Gene Ontology karakterisering, DAVID analys och nätverk förutsägelse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4: Åtgärder för att utföra gen ontologi karakterisering, anrikning, och vägen analyser. (A) steg till att utföra gen ontologi (GO) karakterisering. För att få inblick i de funktioner och subcellulära lokaliseringar av de betydande kandidater, steg att utföra GO analys med hjälp av appenropriate programvara 26 illustreras. (B) steg att utföra GO Term anrikning analys. För att få anrikning information om de betydande kandidaterna är korta steg för att prestera DAVID analys visas. (C) Åtgärder för att utföra interaktion och väg analys. Att belysa möjliga vägar och hitta funktionella partners, steg för att prestera interaktion eller nätverksanalys av STRING visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 5
Figur 5: Representant DAVID och STRING analysresultat. (A) BP anrikning resultaten av de fjorton kandidaterna DAVID analys. Celldöd relaterade processer betydligt berikas. (B) CC enrichmen t resultaten av de fjorton kandidaterna DAVID analys. Många proteiner har en intracellulär ursprung. (C) BP anrikning resultaten av de fjorton kandidaterna DAVID analys. De flesta av de kandidater som deltar i proteinbindning. (D) Topp tio samverkande partner LDHB identifieras av STRING. (E) Majoriteten av LDHB partners är också förknippade med Exosome och HIV-1, vilket ytterligare stöder roller LDHB i Exosome / HIV-1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

bord 1
Tabell 1: Representativa beräkning av Gränsvärdena för betydande protein störning.

e2.jpg "/>
Tabell 2: Samband mellan SILAC kandidater och deras exosomal lokaliseringar och interaktioner med HIV-1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I de förfaranden som beskrivs i detta dokument visade vi tillämpningen av SILAC teknik för att undersöka effekten av HIV-1-infektion på värd exosomal proteom. Initialt, oinfekterade och HIV-1-infekterade celler är differentiellt isotopmärkt. De differentiellt märkta exosomes renas sedan innan du utför proteinextraktion. Därefter vätskekromatografi-tandem-masspektrometri användes för att analysera exosomal proteom. Slutligen, de resulterande masspektrometri data och potentiella kandidatproteiner utsattes för statistisk och bioinformatik analyser innan nedströms biokemiska dissektioner.

Kritiska steg i hela protokollet måste följas för att uppnå optimala resultat. I den inledande fasen av protokollet, kan SILAC märkningen påverkas av celltyp och märkningsmediet. Friska och mycket proliferativa celler bör användas för att erhålla en hög märkningseffektivitet. Kritiskt, märkningen medium bör vara nyberedd med användning av dialyserat fetalt bovint serum (FBS), snarare än vanlig FBS. Dialys FBS utarmat av aminosyror och peptider och är därför mindre benägna att störa SILAC märkningen. Det bör emellertid noteras att dialyserat serum inte kan vara lämpliga för vissa cellinjer, i synnerhet primärceller. Normal tillväxt på medellång med dialys FBS bör bekräftas innan anställa SILAC strategi. Dessutom, med användning av dubbel "tung" isotopmärkning (13 C 6 L-lysin och 13 C 6 15 N 4 L-arginin) i stället för att använda 13 C 6 L-lysin var för sig, kan öka antalet kvantifierade peptider i masspektrometri analys. Det minsta antalet celler som behövs för en lyckad efterföljande proteomanalys beror på många faktorer, till exempel känslighet masspektrometer, massan av varje cell, och proteom riktade (hela proteom eller posttranslationella modifierade proteiner). Baserat på våra resultat, rekommenderar vi tio miljoner celler som ett första belopp för att uppskatta det lämpliga antalet celler som krävs för masspektrometri.

Exosome isolering från cellkultursupernatanter kan förbättras genom tillsats av ett filtreringssteg enligt följande. För upphängning av celler, är ett initialt centrifugeringssteg vid 200 xg under 10 min görs för att avlägsna celler suspenderade i supematanten, följt av filtrering genom ett 0,22 pm filter 29, 30. För vidhäftande celler, kan supernatanten samlas direkt från kulturen och filtreras på samma sätt. Filtrering är ett kritiskt steg för att separera exosomes från kontaminerande material, såsom små molekyler och peptider. De exosomer kan sedan isoleras från supernatanten med användning av den klassiska ultracentrifugeringsmetod, eller genom att använda kommersiellt tillgängliga Exosome isolerings reagenser kit. Renheten hos den Exosome kan verifieras genom nanoparticle spårningsanalys eller elektronmikroskopi 31.

Eftersom HIV-1-virioner är typiskt ungefär lika stor som exosomes, kan de förorena exosomer renade från HIV-1-infekterade prover. I proteomik skärmar kan potentiella virala kontaminanter skall filtreras ut genom att begränsa databasen sökningen till endast humana proteiner. Ytterligare isoleringstekniker som använder etablerade metoder såsom iodixanol densitetsgradienter och immunaffinitetsisolering kan också användas för att separera HIV-1-virioner från exosomes 32, 33.

Därefter diskuterar vi några förslag för att säkerställa tillförlitlig analys av data för att identifiera potentiellt betydande kandidater när MS-resultat erhålls från isolerade exosomes. I det första steget av analysen bör SILAC förhållandet histogrammet följer en normalfördelning. Om datadistribution ligger snett i en särskild riktning, skulle läsaren behöva bestämma the orsaka innan du fortsätter med analys. Till exempel, kan de märkta och omärkta proverna inte har blandade i lika proportioner. Dessutom kan vissa peptider inte har tung / lätt SILAC förhållandevärden, och bör tas bort från de potentiella protein kandidater. Efter kandidater väljs, kan programvara och databaser användas för att verifiera Exosome anrikning, interaktioner med testförhållanden och möjliga vägar. Samspelet mellan kandidat proteiner och testvillkor bör brytas genom särskilda databaser före bioinformatik analys. För bioinformatik karakteriseringar kan genen Ontology kommentarer identifieras med hjälp av olika program och databaser,

Den SILAC teknik som användes här erbjuder en systematisk och enkel metod för att analysera värd exosomal proteom. De flesta biomedicinska laboratorier skulle kunna anta förfaranden med minimal ytterligare utrustning och extra kostnad. Den SILAC teknik är emellertid i första hand fråntecknats för studier med cellinjer. Som sådan, kan andra metoder måste användas för att studera olika biologiska prover. Till exempel kan metoden (multipel övervakning reaktion) label-free MRM användas för målinriktad kvantifiering av proteiner och peptider i kliniska prover 9, 34. Medan i fallet med bestämning proteininnehåll från olika studier, kan SILAC teknik också användas för att undersöka två eller flera prover. Den kemiska märkningsmetod iTRAQ (isobariska taggar för relativ och absolut kvantifiering) eller TMT-baserad (tandem mass tag) metoder tillåter mycket högre multiplexering och skulle vara bättre lämpade för flera prover.

Det förfarande som beskrivs här är inte begränsat till proteomic karakterisering av exosomer från HIV-1-infekterade celler. Med modifieringar, kan den anpassas för att analysera exosomes under ett brett spektrum av test- och stressbetingelser, såsom bakteriell infektion, viral infektion, och radiation. Det är också lämplig för att studera andra subcellulära fack.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av ett ARRA tillägg till Livslängd / Tufts / brun CFAR, P30AI042853-13S1, NIH P20GM103421, P01AA019072, R01HD072693 och K24HD080539 till BR. Detta arbete stöddes också av Lifespan Pilot Research Fund (# 701 5857), Rhode Island Foundation Medical Research Grant (# 20.133.969) och NIH COBRE URI / RIH Pilot bidrag (P20GM104317) till ML. Vi tackar James Myall och Vy Dang för hjälp med manuskriptet och figur förberedelse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
H9 cell line ATCC HTB-176
Trypan Blue Thermo Fisher 15250061
MTT assay kit Thermo Fisher V13154
Dialyzed fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher 26400044
SILAC Protein Quantitation Kit – RPMI 1640 Thermo Fisher 89982 DMEM version (89983)
L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 for SILAC Thermo Fisher 88434
L-Lysine-2HCl, 13C6 for SILAC Thermo Fisher 88431
HIV-1 NL4-3 NIH AIDS Reagent Program 2480
Alliance HIV-1 p24 Antigen ELISA kit PerkinElmer NEK050001KT
Refrigerated super-speed centrifuge Eppendorf 22628045
Refrigerated ultracentrifuge Beckman Coulter 363118 Should be able to reach 100,000 x g
50 mL Conical Centrifuge Tubes Thermo Fisher 14-432-22
Ultracentrifuge Tubes Beckman Coulter 326823
SW 32 Ti Rotor Beckman Coulter 369694
RIPA buffer Thermo Fisher 89900
Protease Inhibitor Cocktails Thermo Fisher  78430
ThermoMixer  Eppendorf 5384000020
BCA Protein Assay Kit  Thermo Fisher 23250
Spectrophotometer Biorad 1702525
SDS PAGE Gel apparatus Thermo Fisher EI0001
Novex 4-20% Tris-Glycine Mini Gels Novex XV04200PK20
Gel staining reagent Sigma Aldrich G1041
Sequencing Grade Modified Trypsin Promega V5111
SpeedVac Concentrator Thermo Fisher SPD131DDA
Antibody to human annexin A5 Abcam ab14196
Antibody to human lactate dehydrogenase B chain Abcam ab53292
Graphing and Statistical Software Systat  SigmaPlot  Or GraphPad Prism
Quantitative proteomics software suite Max Planck Institue of Biochemistry Maxquant 
Software and databases Various vendors Refer to main text for details

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), 968-977 (2016).
  2. Schorey, J. S., Bhatnagar, S. Exosome function: from tumor immunology to pathogen biology. Traffic. 9 (6), 871-881 (2008).
  3. Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
  4. Booth, A. M., et al. Exosomes and HIV Gag bud from endosome-like domains of the T cell plasma membrane. J Cell Biol. 172 (6), 923-935 (2006).
  5. Van Engelenburg, S. B., et al. Distribution of ESCRT machinery at HIV assembly sites reveals virus scaffolding of ESCRT subunits. Science. 343 (6171), 653-656 (2014).
  6. Li, M., et al. Quantitative proteomic analysis of exosomes from HIV-1-infected lymphocytic cells. Proteomics. 12 (13), 2203-2211 (2012).
  7. Ong, S. E., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
  8. Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
  9. Anderson, L., Hunter, C. L. Quantitative mass spectrometric multiple reaction monitoring assays for major plasma proteins. Mol Cell Proteomics. 5 (4), 573-588 (2006).
  10. Ong, S. E., Mann, M. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture for quantitative proteomics. Methods Mol Biol. 359, 37-52 (2007).
  11. Strober, W. Current Protocols in Immunology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  12. Verma, A., et al. Evaluation of the MTT lymphocyte proliferation assay for the diagnosis of neurocysticercosis. J Microbiol Meth. 81 (2), 175-178 (2010).
  13. Cepko, C., Pear, W. Retrovirus infection of cells in vitro and in vivo. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 9 Unit9.14 (2001).
  14. Lennette, E. T., Karpatkin, S., Levy, J. A. Indirect immunofluorescence assay for antibodies to human immunodeficiency virus. J Clin Microbiol. 25 (2), 199-202 (1987).
  15. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3 22 (2006).
  16. Olson, B. J. S. C., Markwell, J. Current Protocols in Protein Science. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  17. Gauci, V. J., Padula, M. P., Coorssen, J. R. Coomassie blue staining for high sensitivity gel-based proteomics. J Proteom. 90, 96-106 (2013).
  18. Soldi, M., Bonaldi, T. The ChroP approach combines ChIP and mass spectrometry to dissect locus-specific proteomic landscapes of chromatin. J Vis Exp. (86), (2014).
  19. Trompelt, K., Steinbeck, J., Terashima, M., Hippler, M. A new approach for the comparative analysis of multiprotein complexes based on 15N metabolic labeling and quantitative mass spectrometry. J Vis Exp. (85), (2014).
  20. Li, M., et al. Stem-loop binding protein is a multifaceted cellular regulator of HIV-1 replication. J Clin Invest. 126 (8), 3117-3129 (2016).
  21. Li, M., Ramratnam, B. Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1-Infected Cells. Methods Mol Biol. 1354, 311-326 (2016).
  22. Emmott, E., Goodfellow, I. Identification of protein interaction partners in mammalian cells using SILAC-immunoprecipitation quantitative proteomics. J Vis Exp. (89), (2014).
  23. Keerthikumar, S., et al. ExoCarta: A Web-Based Compendium of Exosomal Cargo. J Mol Biol. 428 (4), 688-692 (2016).
  24. Kim, D. K., et al. EVpedia: a community web portal for extracellular vesicles research. Bioinformatics. 31 (6), 933-939 (2015).
  25. Fu, W., et al. Human immunodeficiency virus type 1, human protein interaction database at NCBI. Nucleic Acids Res. 37, Database issue 417-422 (2009).
  26. Pathan, M., et al. FunRich: An open access standalone functional enrichment and interaction network analysis tool. Proteomics. 15 (15), 2597-2601 (2015).
  27. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).
  28. Szklarczyk, D., et al. The STRING database in 2011: functional interaction networks of proteins, globally integrated and scored. Nucleic Acids Res. 39, Database issue 561-568 (2011).
  29. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3.22 (2006).
  30. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).
  31. Webber, J., Clayton, A. How pure are your vesicles. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
  32. Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. Discrimination between exosomes and HIV-1: purification of both vesicles from cell-free supernatants. J Immunol Methods. 338 (1-2), 21-30 (2008).
  33. Chertova, E., et al. Proteomic and biochemical analysis of purified human immunodeficiency virus type 1 produced from infected monocyte-derived macrophages. J Virol. 80 (18), 9039-9052 (2006).
  34. Nikolov, M., Schmidt, C., Urlaub, H. Quantitative mass spectrometry-based proteomics: an overview. Methods Mol Biol. 893, 85-100 (2012).

Tags

Infektion exosomes extracellulära Fordon HIV-1 proteomik masspektrometri SILAC bioinformatik
SILAC Based proteomik karakterisering av exosomes från HIV-1-infekterade celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cheruiyot, C., Pataki, Z., Williams, More

Cheruiyot, C., Pataki, Z., Williams, R., Ramratnam, B., Li, M. SILAC Based Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1 Infected Cells. J. Vis. Exp. (121), e54799, doi:10.3791/54799 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter