Summary
Burada, ana exosomal proteomlarda HIV-1 enfeksiyonunun etkilerini analiz etmek için hücre kültürü (SILAC) amino asitler ile izotop etiketleme tekniği kullanılarak kantitatif proteomik bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol, kolayca farklı gerilme veya enfeksiyon koşullarda hücrelere uyarlanabilir.
Introduction
viral enfeksiyonlar da dahil olmak üzere bir çok insan hastalıkları, sık sık etkilenen hücrelerin etrafında yer alan farklı hücresel süreçleri ile ilişkilidir. Proteinler, genellikle bu süreçleri arabuluculuk, nihai hücresel efektör olarak hareket. Proteinlerin analizi sıklıkla etkilenen hücrelerin yerel çevreye kadar çok değerli bilgiler sağlar ve hastalık patogenezinde altta yatan mekanizma anlamak için bize yardımcı olabilir. Çeşitli protein analiz teknikleri arasında, proteomik özellikle büyük umut vaat ediyor. güçlü, geniş çaplı bir aracı olarak, proteomik, özellikle fonksiyon ve protein etkileşim alanında, hücresel süreçlerin bir tarihsel sağlayabilir. Belirli proteinlerin analiz İnceleme bölgesinde, araştırmacılar, hücresel bileşenler, özellikle de proteinlerinin ekspresyonunu izlemek için izin etiketleme teknikleri geliştirilmesi yoluyla basit yapılır. Birçok proteomik analizler hücresel gerçekleştirilen olmasına rağmenproteom ölçeği, hücre içi bölmeleri üzerinde proteomik karakterizasyonu 1 özellikle bilgilendirici olduğu kanıtlanmıştır. Bu HIV-1 enfeksiyonu ile ilgili çalışmalarda iyi örneklenmiştir.
Eksozomlar, hücre tipleri 2, 3, geniş bir yelpazede tarafından salgılanan 30-100 nm zar vezikülleri arası iletişim ve moleküler taşıma önemli bileşenleridir. Daha önce HIV-1 tomurcuklanma 4, 5 önemli roller oynamaya keşfedildi. Fonksiyonel diseksiyon ile proteomik analizi birleştirerek, HIV-1 ile enfekte hücrelerden salınan eksozomlar hücresel apoptoz ve çoğalması 6 olmak üzere alıcı hücreler, komşu hücresel özelliklerini etkileyecek eşsiz ve nicelik farklı protein imza ve liman düzenleyici moleküller oluşur bulundu. yöntemler bu protokolde tarif edilmiştir,yani SILAC HIV-1 enfekte hücreleri eksozom 7 göre proteomik karakterizasyonu (hücre kültürü içinde amino asitler ile izotop işaretleme). Benzer yaklaşımlar, daha özel bir bölme veya ilgi fraksiyonuna deneysel gerilme ayarlama ve tarif edilen prosedürlere, gerekli değişiklikler yaparak patojenez sırasında, diğer alt-hücresel bölümleri anlamak için uygulanabilir.
kantitatif proteomik yöntemlerin son gelişmeleri göz önüne alındığında, belirli bir deney için en etkili yöntem seçerken seçim için pek çok vardır. Bunlar arasında kimyasal bazlı iTRAQ (göreli ve mutlak ölçümü için izobarik etiketleri) 8 ve etiket içermeyen MRM (çoklu reaksiyon izleme) 9 teknikleridir. Her iki yöntem güçlü araçlardır ve özel ayarlar için iyi seçimlerdir. Tipik bir laboratuvar ağırlıklı hücre hatları ile çalışmak için, ancak, bu iki yöntem şansı göreceli vary yüksek maliyetler ve vardır daha zaman alıcı SILAC tabanlı yönteme göre. SILAC hücresel protein olarak kültür ortamından amino asit radyoaktif olmayan izotop formlarını içeren bir metabolik göre etiketleme tekniği. Tipik haliyle, SILAC deneyler, örneğin iki hücre popülasyonlarının, enfekte olan ve olmayan ile başlar. Tam etiketleme elde edilene kadar her diferansiyel kendine özgü izotopik ortamda etiketlenir. Bu hücrelerin etiketli eksozomlar sonra protein ekstre etmeye tabi tutulmaktadır. Bir kez etiketli exosomal proteinleri sıvı kromatografisi tandem kütle spektroskopisi 10 kullanılarak analiz edilmektedir, ayıklanır. Son olarak, kütle spektrometresi sonuçları ve önemli ölçüde etiketli proteinler istatistiksel tabi tutulur ve biyoinformatik titiz biyokimyasal doğrulama yanı sıra analiz eder. Bizim daha önceki soruşturma raporları hücre hatları bir genellikle olduğu gibi SILAC / eksozom prosedürleri, birincil hücrelerden daha hücre hatları için daha uygun olacağı kanısındayızverimli izotop etiketleme için aktif prolifere devlet,
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hücre Kültürü ve HIV-1 enfeksiyonu
NOT: deneyler başlamadan önce, bir MTT testi 12 ile Tripan Mavisi boyaması 11 ile hücrelerin canlılığı ve çoğalmasını kontrol edilmesi tavsiye edilir. Aynı zamanda yeni hazırlanan SILAC ortamını kullanmak için kritik öneme sahiptir. Çeşitli hücre çizgileri de aktif olarak çoğalma aşamasında olan ve HIV-1 enfeksiyonu, veya tercih test koşulu duyarlı olduğu sürece, kullanılabilir. Bu protokol, örnek olarak H9 hücre hattı kullanın.
- Her bir hücre kültür şişesi içine Tohum 2 x 10 6 H9 hücreleri. % 10 diyalize edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu (FBS), 100 mg / L '13C 6 L-lizin ve 100 mg / L 13 C 6 15 N4, L-arginin ihtiva eden RPMI 1640 ortamında etiketli 10 ml bir grup büyütün. FBS% 10 diyalizlenmiş, 100 mg / L L-Lizin ile 100 mg / L L-arginin ile, 10 ml işaretlenmemiş RPMI 1640 ortamı diğer grup büyütün.
- Ağır amino asitler ile etiketlenmiş ortam içinde hücrelerin proteinler, hemen hemen tamamen etiketlenir ve bu noktada altı katlanmaya (>% 99) hücreleri büyütün. taze medya ekleyin veya düzenli ortamı değiştirmek (her 1-3 gün hücre tipine bağlı olarak. H9 hücre için, orta her 3 günde değiştirme). Etiketleme sonunda, daha fazla hücre büyümeyi kültür hacmi (örneğin ~ 30 mi) artar.
Not: Tripan Blue lekelemesi ve hücre sayımı ile deneyin başlangıcında ikiye katlanma süresinde tam hücre belirler. - HIV-1 NL4-3 48 saat boyunca standart bir HIV-1 enfeksiyonu protokolü 13 ile etiketlenmiş hücreleri enfekte etmektedir. 0.3 civarında bir enfeksiyon çokluğu (MOI) virüs uygun miktarlarda hücreleri inkübe edin. Bir HIV-1 p24 antijen ELISA kiti kullanılarak kültür süpernatanlarının p24 miktarının HIV-1 enfeksiyonu kontrol edin. Hücrelerin başarılı enfeksiyonu teyit etmek için bir immünofloresan tahlil 14 gerçekleştirin. Keep, HIV-1 enfeksiyonu olmayan etiketlenmemiş ortam içinde etiketlenmemiş hücrelerin büyüyen.
- enfeksiyon sonunda (adım 2.1) de her iki grubun süpernatantlar hasat.
2. Exosome İzolasyon
Not: ultrasantrifügasyon bir dizi aşama ile, kültür süpernatanlarından exosomal kısımlar 15 zenginleştirilmiştir. En az 100,000 x g hızda ulaşabilir Ultrasantrifüj rotoru ile 4 ° C 'de, aşağıdaki adımları gerçekleştirir.
- Hücreleri kaçınarak, 50 ml konik tüplerde kültürlerin süpernatantlar toplayın. kalan hücrelerin çıkarılması için, 300 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj.
- Yeni 50 ml konik tüplerde süpernatantlar toplamak ve ölü hücreleri çıkarmak için 2,000 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj. Ultrasantrifügasyon dayanabildiğinden ticari rotor uyumlu tüplere süpernatantlar elde edilen transfer.
- ultrasantrifüjdeki tüpleri dengelemek için emin olun. çıkarmak için 10,000 x g'de 30 dakika boyunca santrifüj tüplerihücre enkazı.
- 100,000 x g'de 70 dakika süreyle ultrasantrifüj tüplerde süpernatantlar ve santrifüj toplayın. süpernatantlar atın.
- Taze PBS 5 ml eksozom zengin pelet yeniden süspanse edin. 100,000 x g'de 70 dakika boyunca tekrar taze ultrasantrifüj tüpleri ve santrifüj çözüm aktarın.
- Sil süpernatantlar. eksozomlar uzun vadeli saklamak için, -80 ° C de PBS ve mağaza 50 ul pelet tekrar süspansiyon. Aşağıda gösterildiği gibi, alternatif olarak, bir protein ekstre doğrudan devam edin.
3. Protein Ekstraksiyon ve Hazırlık
- katma proteaz inhibitörü kokteyl ile 100-200 ul RIPA lizis ve ekstraksiyon tamponu izole exosomal pelet çözülür. Tampon pH 7.6, 25 mM Tris-hidroklorür, 150 mM sodyum klorid,% 1 NP-40,% 1 sodyum deoksikolat ve% 0.1 SDS (sodyum dodesil sülfat) oluşmaktadır. proteaz inhibitörü kokteyl Aprotinin, bestatin, l gibi proteaz inhibitörleri, çeşitli içermelidireupeptin, A ve EDTA (etilendiamin tetraasetik asit) pepstatin, bu proteazların bir dizi inhibe edebilir.
- 13.000 xg (4 ° C) 'de 10 dakika boyunca eritildi çözüm santrifüj ve yeni bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüplerine temizlenir süpernatantlar aktarın.
- Bisinkoninik asit (BCA) ya da Bradford tahlili 16 kullanılarak eksozom Her numunenin protein konsantrasyonu ölçmek.
- etiketlenmiş ve etiketlenmemiş örneklerden protein eşit miktarda (2 ug) karıştırın ve 120 mA'da% 4-20 SDS-PAGE jel üzerinde eşit bir karışımı çalıştırmak / 200 V, 30 dakika.
- Coomassie Mavisi ile Leke jel 17 lekenin izledi.
- Bir jilet kullanarak, jel örnek şeritten kesti. Sonra 10-15 eşit parçaya jel şeritten kesti. 10-15 tüpler toplam taze bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içine her parçası koyun.
- % 50 asetonitril, girdap, 25 mM NH4 HCO3 küpleri daldırın ve süpernatantlar atın. İki kez tekrarlayın. KuruBir vakum konsantratör 18 19 küp.
- 10 mM ditiyotreitol (DTT), girdap ve santrifüj kısaca ile küpleri rehidrate. 1 saat boyunca 56 ° C'de inkübe edin. Süpernatantı atın.
- 55 mM iyodoasetamit, girdap ve spin jel küpleri daldırın. 45 dakika boyunca, karanlıkta, oda sıcaklığında inkübe edin. Süpernatantı atın.
- 25 mM NH 4 HCO 3, girdap, spin küpler daldırın ve supernatant atın.
- % 50 asetonitril, girdap ve spin 25 mM NH 4 HCO 3 küpler daldırın. 3.9 ve 3.10 tekrarlayın.
- bir vakum deriştirme aygıtı içinde, küpler kurutun. 25 mM NH4 HCO3 25 ul sıralaması derecesi modifiye tripsin ekleyin, 30 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe ve fazla solüsyonu atın. Tripsin olmayan 25 mM NH4 HCO3 küpleri bırakın ve gece boyunca 37 ° C enkübe edilir.
- Kısaca aşağı küpler spin ve ekstra ortaya çıkan peptid transferiyeni bir tüpe CT. 30 dakika ve dönüş için, küp% 50 asetonitril içinde bir girdap% 5 formik asit içinde 30 ul ekle. ekstraktı ile süpernatant birleştirin. en az 5 ul bir vakum konsantratör peptid kurutun.
- LC-MS / MS analizi için kütle spektrometresi çekirdek imkan numuneleri gönder. açık kaynak yazılım elde edilebilir MS analizi verileri, tipik bir katılım tanımlanan her protein için sayı, etiketli / etiketsiz oranları ve belirlenen eşsiz peptidler numarasını içerir.
4. Western Blot Doğrulama
Not: Western lekeleme kütle spektrometresi sonuçları doğrulamak için tavsiye edilir.
- Standart batı lekeleme protokolleri takip ve yüklenen her gruptan protein, eşit miktarda sağlamak. MS tarafından belirlenen faiz proteinlerine karşı antikorlar (örneğin anneksin A5, laktat dehidrogenaz B zinciri) kullanın. dansitometrisi analysi ile Western lekeleme algılamas, MS protein tanımlama ve miktar doğru olduğunu teyit edebilir.
5. Proteomik Veri Analizi
NOT: Her MS çoğaltmak için önemli bir protein adayların veri kalitesinin değerlendirilmesi, veri hazırlama, hesaplama ve kararlılık ayrı ayrı yapılır. Yukarıdaki analizler tamamlandığında, çoğaltır analiz verileri karşılaştırılmış ve 21 20, 6 birleştirdi.
- MS verilerin kalitesini değerlendirin.
- İlk olarak, SILAC-MS bir elektronik tablo programı / sayısal proteinlerin etiketsiz oranları etiketli dönüşümü log2.
- bilimsel grafik ve istatistiksel yazılım, grup içinde 40-100 oran bidonları içine oranları ve bir histogram oluşturmak için göz başına oranları sayısını arsa. Histogram bir normal dağılım MS verilerinin 6 kaliteli olduğunu gösterir. Tüm MS çoğaltır için bu adımı yapmak.
- MS peptid oranları güven ve doğruluğunu artırmak için, en az iki sayısallaştırılmış peptidler olan proteinlerin kaldırmayı düşünün.
- Önemli ölçüde yukarı ve aşağı düzenlenmiş protein adayları belirlemek için, önemi 22 eşikleri hesaplamak için aşağıdaki adımları kullanın.
- bilimsel grafik ve istatistik yazılımı olarak, frekans dağılım verilerine olmayan bir lineer regresyon veya eğri-fit oluşturmak. Bu adım, kesme değerlerini hesaplamak için kullanılabilir değerleri elde edilir. % 99 güven sınırları için 1.96,% 95 güven sınırları için σ veya 2.56 σ ± medyan olarak kesme değerlerini hesaplayın.
NOT: kesilecek hesaplanması spesifik ayrıntılar Emmott ark bulunabilir. 22. - ya medyan altında (belirgin aşırı ifade edilir) ortanca üzerinde fazla 1.96 (veya 2.56) standart sapmalar veya daha düşük 1.96 (veya 2.56) standart sapmalar (kimin oranları protein adayları seçmekönemli ölçüde altında ifade edilir).
- bilimsel grafik ve istatistik yazılımı olarak, frekans dağılım verilerine olmayan bir lineer regresyon veya eğri-fit oluşturmak. Bu adım, kesme değerlerini hesaplamak için kullanılabilir değerleri elde edilir. % 99 güven sınırları için 1.96,% 95 güven sınırları için σ veya 2.56 σ ± medyan olarak kesme değerlerini hesaplayın.
- tutarlılığı sağlamak için yukarıda tanımlanan önemli adayların çoğaltır karşılaştırın. Onlar bu son seçim adımı geçmesi için aşağıdaki kriterlere uygun olduğundan emin olun: Adayların sürekli tüm çoğaltır tespit edilmelidir; ve bir adayın çoğaltır düzenleme onların yönünde tutarlı olmalıdır (up-regüle veya aşağı-regüle tercihen bir adayın 3 çoğaltır üzerinden en az 2 ya da olmalıdır).
- onların çoğaltır 'verilerini birleştirerek yukarıda belirtilen ölçütleri karşılayan adaylar için veri tamamlayın.
6. Biyoinformatik Doğrulama ve Karakterizasyonu
NOT: Mevcut genomik ve biyoinformatik bilgiler hemen hemen her protein için bilgi hazinesi sunuyor. Bu bilgilere Veri madenciliği ve biyoinformatik analizi önemli adayların mülkiyet ve işlevleri içgörü büyük bir kazanma konusunda yardımcı olabilir. bu Process uygun aşağı ıslak laboratuvar deneyleri tasarlamak için genellikle gereklidir.
- Onların GenBank Erişim numaraları veya UniProt kimlikleri, mevcut eksozom veritabanlarının karşı aday arama (Exocarta 23, Evpedia 24) kullanarak aday proteinleri daha önce exosome bulunmuştur doğrulamak için. Bu adım adayları Eksozomlann gerçekten de olan güven bir katman daha ekler.
- Erişim http://www.exocarta.org/, "sorgu" ve giriş ya gen veya protein adı / erişim numarası tıklayın. Bir özet sayfası görünecek ve exosome deliller herhangi varsa sağlanan gösterilir.
- HIV-1 ve insan Protein Etkileşimi Veri 25 aleyhinde bulundu. Alternatif olarak, aday proteinlerin etkileşim ve deney durumu hakkında bilgi verebilir belirli veritabanlarında arama.
- www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/HIV de veritabanına erişmekEtkileşimler. 'Protein etki alanı adı' Girişte adayların adlarını veya katılım numaralarını girin ve arama tıklayın. Arama sonuçları HIV-1 ve protein adaylar arasındaki etkileşimlerin içgörü sağlamak ve gerçekten HIV-1 ile ilişkili olabilir adayların hangi önerebilirsiniz.
- İthalat GenBank numaraları ya da (örneğin FunRich, Fonksiyonel Zenginleştirme analiz aracı 26 gibi) GO analiz yazılımı içine adayların UniProt kimlikleri ve yazılımı çalıştırmak.
- http://www.funrich.org/ de yazılımını indirin. Yükleme tamamlandıktan sonra, zenginleştirme analizi altında, tıklayın "Veri Kümesi Ekle" Yazılımı açmak ve protein / genlerin listesini yükleyin. Sonraki GO analizi görselleştirmek için grafik türünü seçin.
NOT: GO analiz sonuçları pasta grafikler şeklinde görüntülenmiştir edilecektir. Bu adım (Biyolojik Süreci (BP), Hücresel Bileşeni alanlarında adayları ile ilişkili küresel fikir edinmek için C yardımcı olurC) ve moleküler işlev (MF).
- http://www.funrich.org/ de yazılımını indirin. Yükleme tamamlandıktan sonra, zenginleştirme analizi altında, tıklayın "Veri Kümesi Ekle" Yazılımı açmak ve protein / genlerin listesini yükleyin. Sonraki GO analizi görselleştirmek için grafik türünü seçin.
- Erişim DAVID http://david.ncifcrf.gov/ 27 de, kendi web sitesinde "Fonksiyonel Annotation Tool" tıklayın. Gibi "UniProt kimliği" olarak genin "Identifier" seçeneğini, aday listesine girin "Gen Listesi" ve arama seçin. zenginleştirilmiş GO şartları, p-değerleri ve diğer parametreler "Gene_Ontology" kategorisi altında "Annotation Özeti Sonuçları" sayfasını tıklayarak ulaşabilirsiniz.
- Diğer proteinler ile adayların potansiyel etkileşimleri araştırmak için, potansiyel protein-protein etkileşimleri ve olası biyokimyasal yollar aydınlatmak için açıkça erişilebilir STRING veritabanı 28 kullanın.
NOT: Analiz ve Fonksiyonel Açıklaması (Bölüm 6,3-6,4) GO da son STRING yazılımı kullanılarak yapılabilir.- http://string-db.org/ de veritabanına erişmek. belirlenen s girdi protein kimliği veya diziAraması kutu ve analiz için doğru tür seçin. "Ara" düğmesini tıklatın. Sonuçlar hem doğrudan (fiziksel) ve dolaylı (işlevsel) dernekler hakkında bilgi verecektir. exosomal aday için ilk on bilinen maçlar görüntülenir ve önemli aday seçiminde dikkate alınmalıdır.
NOT: Adayların ile ilişkili bilgilerin bir hayli yukarıdaki adımları kullanarak analiz edilebilir. en önemli adaylar, daha aşağıda moleküler ve biyokimyasal analiz için seçilebilir.
- http://string-db.org/ de veritabanına erişmek. belirlenen s girdi protein kimliği veya diziAraması kutu ve analiz için doğru tür seçin. "Ara" düğmesini tıklatın. Sonuçlar hem doğrudan (fiziksel) ve dolaylı (işlevsel) dernekler hakkında bilgi verecektir. exosomal aday için ilk on bilinen maçlar görüntülenir ve önemli aday seçiminde dikkate alınmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1A SILAC etiketleme prosedürü 21 gösteren bir akış şemasıdır. eksozomlar arındırmak için, numuneler santrifüj yoluyla döndürülür gerekir. Şekil 1B seri Ultrasantrifügasyon 21 exosome saflaştırma adımları göstermektedir. saflaştınldı sonra prosedür de tarif edilen, eksozomlar deney proteomik analize tabi tutulur.
Şekil 2A, proteomik veriler 21'den önemli protein adaylarının belirlenmesi için bir akış şemasıdır. Seçilen adaylar daha sonra aşağı proteomik analizi için kullanılmıştır. Şekil 2B, SILAC histogram örneği (Bu şekil, Li ve arkadaşları modifiye edilmiştir. 6) tipik bir protein ölçümü sonuçları Örnek oranlarını gösteren ve Tablo 1 a,Bu SILAC oranı histogramlar gelen önemli adaylar 6 kesim değerlerinin belirlenmesinde n örneği. Bölüm 6.3 açıklanan adımları takip ederek, önemli ölçüde yukarı veya aşağı regüle proteinleri belirlemek için kesim değerleri hesaplanmıştır. alt kesim değerinin altında bir H / L oranına sahip proteinler önemli ölçüde düzenlenmiş aşağı kabul edildi ise bu temsili veri kümesi, üst kesim değerinin üzerinde ağır / hafif (H / L) oranına sahip proteinler, önemli ölçüde up-regüle kabul edildi . Anlamlı düzenlenmiş aday proteinleri daha fazla soruşturmaya tabi olacaktır.
Şekil 3, seçilen önemli adaylar için genel biyoinformatik analizi ve veri madenciliği işlemleri. Tablo 2 Bu sekme adaylar hakkında bilgi (toplamak için 6 exosome ve HIV-1 / konak etkileşim veritabanları kullanan bir veri madenciliği örnektirLe Li ve arkadaşları modifiye edilmiştir. 6). Geçerli exosome ve HIV-1 / konak etkileşim veritabanları madencilik yoluyla, on dört aday arasından onüç Eksozomlann ile ilişkilendirmek bulundu. Beş on dört üzerinden adaylar da HIV-1 ile etkileşim için biliniyordu. Bunlar arasında, dört aday (HSPA4, ısı şoku 70 kDa proteini 4'tür; NUTF2 nükleer taşıma faktörü 2; PTGES3, prostaglandin E sintaz 3; LDHB, L-laktat dehidrogenaz B zinciri) eksozom ve HIV-1 hem de ilişkilendirmek bulunmuştur. HSPA4, NUTF2, PTGES3 ve LDHB arasında sadece LDHB (ağır etiketli) altında ifade enfekte fraksiyonunda sürekli oldu. bir dizi analiz ile, daha ayrıntılı bir şekilde çalışmaya tabi tutulabilir en önemli bir aday olmaya LDHB seçilir. Aşağı proteomik analizler Şekil görüntülenen 4. Şekil 4A gen ontoloji (GO) analiz kısa aşamalarını göstermektedir vardır; Şekil 4B performans DAVI adımlarını listelerD analizi; Şekil 4C STRING kullanarak ağ analizi gerçekleştirmek için nasıl gösterir. Şekiller 5A, 5B ve 5C BP, CC ve MF on dört proteinlerin bir dizi DAVID analizi vardır; Şekil 5D LDHB ilk on etkileşim ortakları göstermektedir; Şekil 5E LDHB ve etkileşim ortaklarının çoğunluğu da exosome ve HIV-1 ile ilişkili olduğunu göstermektedir. İlk DAVID analiz sonuçları birçok aday apoptoz ile ilgili ve muhtemelen protein bağlayıcı katılmak önerdi. Bundan başka dizesi çözümlemesi LDHB ortakları, işlevsel ve locationally eksozom ve HIV-1 ile ilgili bağlanma doğruladı. Tüm bu sonuçlar, potansiyel aşağı soruşturma için değerli bilgiler verir.
Şekil 1: SILAC etiketleme ve diferansiyel Ultrasantrifügasyon kullanarak exosome arıtma.(A) hücrelerin iki grup ayrı ayrı yetiştirilmektedir. Bir grup tam etiketleme için altı çiftlenmeler etiketlenmiş ortamda yetiştirilir. diğer grup, aynı süre için normal bir etiketlenmemiş bir ortam içinde büyütülür. etiketlenmemiş hücreler değil ise Sonra, etiketli hücreler, HIV-1 ile enfekte edilir. Son olarak, her iki grup arasında eksozomlar paralel izole edilir. Her adımda santrifüj kullanılan (B) numuneleri (süpernatanları ya da peletler) deney tüpleri içinde gösterilir. Fraksiyonlar test tüpleri sağ tarafında belirtilmiştir atılmalıdır. Hızlı ve her bir santrifüj uzunluğu da gösterilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: proteomik veri kümesi (ler) doğrulayarak ve önemli pro belirlenmesi için Adımlartein adaylar. Proteomik veri kümesi (ler) den önemli protein adaylarının belirlenmesi (A) Akış Şeması. Bu dört adım önemli adayların güvenilir bir seçim sağlamak. İlk olarak, bir SILAC oranı histogram verilerin kalitesini değerlendirmek için çizilir. doğruluğu azaltabilir Sonraki az ideal adaylardır kaldırılır. Üçüncü aşamada, istatistiki yöntemler potansiyel protein adaylar için anlam eşik ayarlamak için kullanılır. Son olarak, önemli adayların çoğaltmak veri tutarlılığı için analiz edilir ve sonunda birleştirilir. (B) SILAC oranları Temsilcisi histogram. Histogram oranı = 1 (log2 = 0) eğilim çizgisi boyunca simetrik dağılımı saptandı. log2 dönüştürülmüş oranlar oranı bidonları içine gruplandırılmış ve y ekseni bin başına tespit edilen oranların nispi sayısını gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: önemli adaylar için Genel biyoinformatik analizi ve veri madenciliği işlemleri. prosedürler exosomal ve HIV-1 / konak veri madenciliği, Gen Ontoloji karakterizasyonu, DAVID analizi ve ağ tahminini içerir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: Gen ontoloji karakterizasyonu, zenginleştirme gerçekleştirmeden Adımlar ve yolu analiz eder. (A) geni ontoloji (GO) karakterizasyonu gerçekleştirmek Adımlar. uygulamasını kullanarak GO analiz yapmak için fonksiyonlar ve önemli adayların hücre içi lokalizasyonu, adımlar hakkında fikir edinmek içinropriate yazılımı 26 gösterilmiştir. (B) GO Dönem zenginleştirme analizinin yapılması için adımlar. önemli adayların zenginleştirme bilgi edinmek için, DAVID analizi gerçekleştirmeden kısa adımlar gösterilmektedir. (C) etkileşim ve yolu analizinin yapılması için adımlar. olası yolları aydınlatmak ve gösterilen STRING etkileşimi veya ağ analizinin yapılması için fonksiyonel ortakları adımları bulmak için. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5: Temsilcisi DAVID ve STRING analiz sonuçları. DAVID analizi ile ondört aday (A) BP zenginleştirme sonuçları. Hücre ölümü ile ilgili işlemler önemli ölçüde zenginleştirilmiş. (B) CC enrichmen David analizi ile on dört aday t sonuçlanır. Çoğu protein hücre içi bir kökene sahiptir. David analizi ile on dört aday (C) BP zenginleştirme sonuçlanır. aday en bağlayıcı protein katılır. (D) ilk on STRING tarafından tanımlanan LDHB ortakları etkileşim. (E) LDHB ortaklarının çoğunluğu da daha eksozom / HIV-1 LDHB rollerini destekler eksozom ve HIV-1 ile ilişkilidir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Tablo 1: önemli protein pertürbasyon sınır değerler Temsilcisi hesaplanması.
e2.jpg "/>
Tablo 2: HIV-1 ile SILAC adaylar ve onların exosomal lokalizasyonu ve etkileşimleri arasındaki ilişkiler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yazıda tarif edilen prosedürlere olarak, ana exosomal proteomu HIV-1 enfeksiyonunun etkisini araştırmak için SILAC tekniğin uygulanmasını göstermektedir. Başlangıçta, enfekte edilmemiş ve HIV-1 ile enfekte edilmiş hücreleri, farklı olarak, izotopla işaretli bulunmaktadır. farklı şekilde etiketlenmiş eksozomlar sonra protein çıkarma yapmadan önce saflaştırılır. Daha sonra, sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometrisi exosomal Proteomun analiz için kullanılır. Son olarak, elde edilen kütle spektrometresi veri ve potansiyel aday proteinleri istatistik ve biyoinformatik maruz aşağı biyokimyasal disseksiyonlar önce analiz eder.
protokol boyunca kritik adımlar optimize sonuçlara ulaşmak için takip edilmesi gerekir. protokol ilk aşamalarında, SILAC markalama hücre tipine ve markalama ortam ile etkilenebilir. Sağlıklı ve yüksek proliferatif hücrelerin yüksek etiketleme verimliliği elde etmek için kullanılmalıdır. Kritik, etiketleme medium taze diyaliz edilmiş cenin sığır serumu (FBS) yerine normal FBS ile hazırlanmalıdır. Diyaliz edilen FBS amino asitler ve peptidler tüketilmiş ve SILAC etiketleme girişimine bu nedenle daha az muhtemeldir. Ancak, diyalize serum bazı hücre hatları, özellikle, birincil hücreler için uygun olmayabilir unutulmamalıdır. diyaliz FBS ile orta normal büyüme SILAC stratejiyi uygulayan önce teyit edilmelidir. Buna ek olarak, (13 C6 L-lisin, 13 C 6 15 N 4 L-arginin) kullanılarak tek tek 13C 6 L-lisin kullanılarak, çift "ağır" izotop işaretleme ile, kütle spektrometrisi nicemlenerek peptidlerin sayısını artırabilir analiz. Başarılı bir sonraki proteom analizi için gerekli hücre az sayıda, kütle spektrometresi, her bir hücre kütlesi ve proteomun gibi duyarlılığı (tüm proteom veya post-translasyonel olarak değişikliğe uğratılmış proteinler, hedeflenen bir çok faktöre bağlıdır). Bizim bulgularımıza dayanarak, kütle spektrometresi için gerekli hücrelerin uygun sayıda tahmin bir başlangıç tutarı olarak on milyon hücre öneriyoruz.
Hücre kültürü süpernatanları eksozom izolasyonu aşağıdaki şekilde bir filtre etme adımı eklenmesi ile geliştirilebilir. Hücre süspansiyonu için, 10 dakika boyunca 200 x g'de bir ilk santrifüj aşaması bir 0.22 mikron filtre 29, 30 boyunca, süzme, ardından süpernatan içinde süspansiyon haline getirilmiş hücreler kaldırmak için yapılır. Yapışkan hücreler için, yüzer kültüründen doğrudan toplanabilir ve aynı şekilde süzüldü. Filtrasyon gibi küçük moleküller ve peptitler gibi kirletici malzemelerden ekzozomlar ayırmak için kritik bir adımdır. eksozomlar daha sonra, klasik ultrasantrifügasyon yöntemi kullanılarak, ya da ticari olarak temin edilebilir eksozom yalıtım reaktifler kitleri kullanılarak süpernatandan izole edilebilir. exosome saflığı nanoparti doğrulanabilircle izleme analizi veya elektron mikroskobu 31.
HIV-1 virionlar eksozom boyut olarak tipik olarak benzer olduğu için, HIV-1 ile enfekte örneklerde saflaştırılan eksozomlar kirletebilir. proteomik ekranlar, olası viral kirleticiler sadece insan proteinlerine veritabanı arama sınırlayarak filtre edilebilir. Bu iyodiksanol yoğunluğu gradyanlar ve immün izolasyon olarak kurulan yöntemler kullanılarak daha fazla izolasyon teknikleri, aynı zamanda 33, eksozomlar 32 HIV-1 virionlar ayırmak için kullanılabilir.
Sonra, MS sonuçları izole Eksozomlann elde edilen kez potansiyel olarak önemli adayları belirlemek için güvenilir veri analizi sağlamak için bazı önerilerde tartışmak. Analizin ilk aşamasında, SILAC oran histogramı normal bir dağılım izlemelidir. veri dağıtım belirli bir yönde çarpık ise, okuyucu th belirlemek gerekire analizi ile devam etmeden önce neden olmaktadır. Örneğin, işaretlenmiş ve işaretlenmemiş örnekleri eşit oranlarda karıştırılmış olabilir. Ayrıca, bazı peptidler ağır / hafif SILAC oranı değerlerine sahip olmayabilir, ve potansiyel protein adaylardan elimine edilmelidir. Adaylar seçildikten sonra, yazılım ve veri tabanları test koşulları ve olası yollar ile exosome zenginleştirme, etkileşimlerini doğrulamak için kullanılabilir. Aday proteinleri ve test koşulu arasındaki etkileşimler biyoinformatik analizinden önce belirli veritabanları ile mayınlı edilmelidir. Biyoinformatik karakterizasyonu için, gen ontoloji açıklamalar çeşitli yazılım ve veri tabanları kullanılarak tespit edilebilir,
Burada kullanılan SILAC tekniği konak exosomal Proteomun analiz için sistematik ve anlaşılır bir yaklaşım sunuyor. Çoğu biyomedikal laboratuarlar minimum ek donanım ve ekstra maliyet prosedürleri kabul etmek mümkün olacaktır. SILAC teknik, ancak esas olarak kesilirhücre hatları kullanan çalışmaları için imzaladı. Bu şekilde, diğer yöntemler farklı biyolojik numunelerin çalışma için kullanılabilir gerekebilir. Örneğin, etiket bilgilerini MRM (çoklu reaksiyon takip işlemi) yöntemi, klinik örneklerde 9, 34 protein ve peptid hedef ölçümü için kullanılabilir. Birden çalışmalardan protein içeriği belirlenmesi halinde iken, SILAC teknik, iki veya daha fazla örnekleri incelemek için kullanılabilir. Kimyasal etiketleme yöntemi iTRAQ yöntemleri çok daha yüksek çoklama izin ve çoklu numuneler için daha iyi uygun olurdu ya da TMT tabanlı (tandem kütle etiketi) (göreli ve mutlak ölçümü için izobarik etiketleri).
Burada tarif edilen prosedür, HIV-1 ile enfekte hücrelerden eksozom proteomik karakterizasyonu ile sınırlı değildir. modifikasyonlar ile, bakteriyel enfeksiyon, viral enfeksiyon ve rad test ve gerilme koşulları geniş bir yelpazede altında eksozomlar analiz etmek için adapte edilebiliriation. Aynı zamanda, diğer alt-hücresel bölümleri çalışmak için uygundur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu çalışma BR ömrü / Tufts / Kahverengi SYAO, P30AI042853-13S1, NIH P20GM103421, P01AA019072, R01HD072693 ve K24HD080539 bir arra ek tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma aynı zamanda ömrü Pilot Araştırma Fonu (# 701- 5857), Rhode Island Vakfı Tıbbi Araştırma Grant (# 20133969), ve ML NIH COBRE URI / RİH Pilot Araştırma Grant (P20GM104317) tarafından desteklenmiştir. Biz el yazması ve şekil hazırlanması ile ilgili yardım için, James Myall ve Vy Dang teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| H9 cell line | ATCC | HTB-176 | |
| Trypan Blue | Thermo Fisher | 15250061 | |
| MTT assay kit | Thermo Fisher | V13154 | |
| Dialyzed fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher | 26400044 | |
| SILAC Protein Quantitation Kit – RPMI 1640 | Thermo Fisher | 89982 | DMEM version (89983) |
| L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 for SILAC | Thermo Fisher | 88434 | |
| L-Lysine-2HCl, 13C6 for SILAC | Thermo Fisher | 88431 | |
| HIV-1 NL4-3 | NIH AIDS Reagent Program | 2480 | |
| Alliance HIV-1 p24 Antigen ELISA kit | PerkinElmer | NEK050001KT | |
| Refrigerated super-speed centrifuge | Eppendorf | 22628045 | |
| Refrigerated ultracentrifuge | Beckman Coulter | 363118 | Should be able to reach 100,000 x g |
| 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher | 14-432-22 | |
| Ultracentrifuge Tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| SW 32 Ti Rotor | Beckman Coulter | 369694 | |
| RIPA buffer | Thermo Fisher | 89900 | |
| Protease Inhibitor Cocktails | Thermo Fisher | 78430 | |
| ThermoMixer | Eppendorf | 5384000020 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher | 23250 | |
| Spectrophotometer | Biorad | 1702525 | |
| SDS PAGE Gel apparatus | Thermo Fisher | EI0001 | |
| Novex 4-20% Tris-Glycine Mini Gels | Novex | XV04200PK20 | |
| Gel staining reagent | Sigma Aldrich | G1041 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
| SpeedVac Concentrator | Thermo Fisher | SPD131DDA | |
| Antibody to human annexin A5 | Abcam | ab14196 | |
| Antibody to human lactate dehydrogenase B chain | Abcam | ab53292 | |
| Graphing and Statistical Software | Systat | SigmaPlot | Or GraphPad Prism |
| Quantitative proteomics software suite | Max Planck Institue of Biochemistry | Maxquant | |
| Software and databases | Various vendors | Refer to main text for details |
References
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), 968-977 (2016).
- Schorey, J. S., Bhatnagar, S. Exosome function: from tumor immunology to pathogen biology. Traffic. 9 (6), 871-881 (2008).
- Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
- Booth, A. M., et al. Exosomes and HIV Gag bud from endosome-like domains of the T cell plasma membrane. J Cell Biol. 172 (6), 923-935 (2006).
- Van Engelenburg, S. B., et al. Distribution of ESCRT machinery at HIV assembly sites reveals virus scaffolding of ESCRT subunits. Science. 343 (6171), 653-656 (2014).
- Li, M., et al. Quantitative proteomic analysis of exosomes from HIV-1-infected lymphocytic cells. Proteomics. 12 (13), 2203-2211 (2012).
- Ong, S. E., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
- Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
- Anderson, L., Hunter, C. L. Quantitative mass spectrometric multiple reaction monitoring assays for major plasma proteins. Mol Cell Proteomics. 5 (4), 573-588 (2006).
- Ong, S. E., Mann, M. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture for quantitative proteomics. Methods Mol Biol. 359, 37-52 (2007).
- Strober, W. Current Protocols in Immunology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Verma, A., et al. Evaluation of the MTT lymphocyte proliferation assay for the diagnosis of neurocysticercosis. J Microbiol Meth. 81 (2), 175-178 (2010).
- Cepko, C., Pear, W. Retrovirus infection of cells in vitro and in vivo. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 9 Unit9.14 (2001).
- Lennette, E. T., Karpatkin, S., Levy, J. A. Indirect immunofluorescence assay for antibodies to human immunodeficiency virus. J Clin Microbiol. 25 (2), 199-202 (1987).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3 22 (2006).
- Olson, B. J. S. C., Markwell, J. Current Protocols in Protein Science. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Gauci, V. J., Padula, M. P., Coorssen, J. R. Coomassie blue staining for high sensitivity gel-based proteomics. J Proteom. 90, 96-106 (2013).
- Soldi, M., Bonaldi, T. The ChroP approach combines ChIP and mass spectrometry to dissect locus-specific proteomic landscapes of chromatin. J Vis Exp. (86), (2014).
- Trompelt, K., Steinbeck, J., Terashima, M., Hippler, M. A new approach for the comparative analysis of multiprotein complexes based on 15N metabolic labeling and quantitative mass spectrometry. J Vis Exp. (85), (2014).
- Li, M., et al. Stem-loop binding protein is a multifaceted cellular regulator of HIV-1 replication. J Clin Invest. 126 (8), 3117-3129 (2016).
- Li, M., Ramratnam, B. Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1-Infected Cells. Methods Mol Biol. 1354, 311-326 (2016).
- Emmott, E., Goodfellow, I. Identification of protein interaction partners in mammalian cells using SILAC-immunoprecipitation quantitative proteomics. J Vis Exp. (89), (2014).
- Keerthikumar, S., et al. ExoCarta: A Web-Based Compendium of Exosomal Cargo. J Mol Biol. 428 (4), 688-692 (2016).
- Kim, D. K., et al. EVpedia: a community web portal for extracellular vesicles research. Bioinformatics. 31 (6), 933-939 (2015).
- Fu, W., et al. Human immunodeficiency virus type 1, human protein interaction database at NCBI. Nucleic Acids Res. 37, Database issue 417-422 (2009).
- Pathan, M., et al. FunRich: An open access standalone functional enrichment and interaction network analysis tool. Proteomics. 15 (15), 2597-2601 (2015).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).
- Szklarczyk, D., et al. The STRING database in 2011: functional interaction networks of proteins, globally integrated and scored. Nucleic Acids Res. 39, Database issue 561-568 (2011).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3.22 (2006).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).
- Webber, J., Clayton, A. How pure are your vesicles. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
- Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. Discrimination between exosomes and HIV-1: purification of both vesicles from cell-free supernatants. J Immunol Methods. 338 (1-2), 21-30 (2008).
- Chertova, E., et al. Proteomic and biochemical analysis of purified human immunodeficiency virus type 1 produced from infected monocyte-derived macrophages. J Virol. 80 (18), 9039-9052 (2006).
- Nikolov, M., Schmidt, C., Urlaub, H. Quantitative mass spectrometry-based proteomics: an overview. Methods Mol Biol. 893, 85-100 (2012).
