Summary
نقدم بروتوكول لتحليل الأوعية التاجية في كامل قلوب الفئران الجنينية حتى E15.5، وذلك باستخدام أساليب تلطيخ المناعية القياسية تليها إزالة البصرية ومتحد البؤر المجهري. هذه التقنية تمكن التصور الأوعية الدموية في جميع أنحاء القلب بأكمله دون الحاجة لتحليل تستغرق وقتا طويلا من أقسام التسلسلية.
Introduction
إنشاء شبكة التاجية تعمل المهم لعمل القلب والتطور الجنيني، وتحليل المسوخ الماوس الوراثية يمكن أن توفر معلومات قيمة حول الإشارات الجزيئية الكامنة وراء هذه العملية التنموية. القدرة على تصور الضفيرة التاجية الجنينية ككل، بدلا من عرضها في سلسلة من المقاطع النسيجية، أمر ضروري لتسهيل تحليل الزخرفة سفينة في المسوخ وراثية، ويتجنب الخسارة المحتملة للمعلومات التي يمكن أن تحدث نتيجة الميكانيكية تشريح الأنسجة. يتم ترجمة السفن المنكوبة لتشكيل الشرايين والشعيرات الدموية العميقة داخل أسوار كلا البطينين والشريان الأورطي 1-3. ومع ذلك، في حين وضع العلامات الفلورية الخلايا جنبا إلى جنب مع ليزر المسح المجهري متحد البؤر يمكن أن توفر صور عالية الدقة من سطحية الأوعية الوريدية / wholemount المسمى اللمفاوية 4،5، وعمق التصوير محدودة بسبب اختراق البصرية. عالية الدقة التصوير من قبعةلذا illaries والشرايين في جميع أنحاء عمق كاملة من قلب غير ممكن من دون شكل من أشكال المقاصة الأنسجة.
يحدث اختراق البصرية الفقراء تلاه مؤشر الانكسار عالية من العديد من الخلايا وخارج الخلية مكونات الأنسجة سميكة (على سبيل المثال، والكولاجين والألياف المرنة). هذا ينثر ضوء التصوير، مما تسبب في عدم وضوح وانخفاض التباين. وكلاء تطهير عادة تطابق معامل الانكسار عالية من هذه الأنسجة، وهذا يعني أن الضوء يمكن أن تنتقل من خلال عينة دون عائق وأعمق في اختراق الأنسجة. قبل المقاصة والأنسجة والمجففة عموما الماء له معامل الانكسار المنخفض نسبيا. وقد تم تطوير عدد كبير من وسائل تطهير جديدة في الآونة الأخيرة، ولكن اعتمادا على التقنية المستخدمة، فإن عملية المقاصة يمكن أن يستغرق أياما أو أسابيع وربما تتطلب الكواشف مكلفة 6-9. BABB (1: خليط 2 من الكحول البنزيل بنزوات البنزيل و) هي غير مكلفة، وتستخدم عادة كيل المقاصة، والتي لديهاالاستفادة من تطهير العينات بسرعة للغاية. وقد وصفت تقنيات المقاصة استنادا BABB والتصوير سابقا لعينات العصبية ومختلف أجهزة 10-13. نحن هنا وصف تقنية قوية ومباشرة لإزالة BABB العينات immunostained تليها المجهري متحد البؤر، مع إشارة خاصة إلى فحص الأوعية الدموية في قلوب الفئران من E (اليوم الجنينية) 11،5-15،5. لكن، وكما تمت أيضا ثبت، يمكن بالتساوي جيدا أن تطبق هذه التقنية لتحليل الأجنة كلها، فضلا عن أنواع أخرى من الخلايا، طالما هي الأجسام المضادة عالية وجودة لعلامات الفائدة المتاحة.
Protocol
وقد أجريت جميع البحوث الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية بموجب ترخيص من وزارة الداخلية في المملكة المتحدة.
1. تشريح والتثبيت من الجنينية قلوب
- الموت ببطء الماوس توقيت الحوامل في اليوم المطلوب باستخدام تقنية اعدام افق أخلاقيا، على سبيل المثال، CO 2 الخدر تليها خلع عنق الرحم، وإزالة الأكياس الجنينية 14، وضعها في طبق بتري 10 سم مملوءة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) .
- باستخدام مجهر تشريح وملقط، فتح بعناية الحويصلات الرحم وإزالة كل جنين، قطع الحبل السري وإزالة الكيس المحي.
- لأغراض التنميط الجيني، وإزالة الذيل الجنينية ومكان في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل لاستخراج تحلل / الحمض النووي في وقت لاحق.
- من أجل إزالة القلب ويعلقون كل جنين من على ظهرها في سيليكون المغلفة المطاط الصناعي 35 مم طبق بيتري شغل برنامج تلفزيوني، باستخدام دبابيس minutien الفولاذ المقاوم للصدأ. باستخدام ملقط غرامة، كاليفورنياrefully فتح صدره وقطع الأوعية كبيرة، الأمامي للقلب. ثم الوصول إلى وراء القلب مع ملقط، فهم السفن وراء القلب وسحب بلطف لإزالة القلب؛ قد يأتي الرئتين أيضا بعيدا في نفس الوقت.
- نقل القلب إلى أدنى 35 مم طبق بتري تحتوي على برنامج تلفزيوني واستخدام ملقط غرامة لتقليم بعيدا أنسجة الرئة، إذا لزم الأمر. ثم نقل القلب إلى بئر من لوحة 48-جيدا مليئة برنامج تلفزيوني الباردة.
- بعد جمع كل القلوب في لوحة 48-جيدا، نضح في برنامج تلفزيوني مع البلاستيك ماصة باستير يميل غرامة واستبدالها مع 0.5 مل 4٪ بارافورمالدهيد (PFA).
تنبيه: PFA هو من المعروف أن حساسية، مسببة للسرطان، وسمية.- E11.5 الإصلاح - 12.5 قلوب لمدة 15 دقيقة، قلوب E13.5 لمدة 20 دقيقة وE14.5 - 15.5 قلوب لمدة 30 دقيقة، في 4٪ PFA في درجة حرارة الغرفة.
- نضح PFA مع البلاستيك ماصة باستير يميل غرامة وشطف قلوب 2X في برنامج تلفزيوني الباردة.
CAUTION: PFA غير خطرة ويجب التخلص منها وفقا للأنظمة المؤسسية. - إذا لم تكن تستخدم مباشرة لجبل بأكمله المناعية (انظر القسم 2)، يذوى قلوب من خلال تنفيذ المتعاقبة يغسل 5 دقائق في الحلول التالية: 25٪ الميثانول / 75٪ PBS، 50٪ الميثانول / 50٪ PBS، 75٪ الميثانول / 25 ٪ في برنامج تلفزيوني.
تنبيه: الميثانول السامة، وارتداء القفازات. تخزين قلوب في -20 درجة مئوية في الميثانول بنسبة 100٪.
2. الجامع جبل المناعية من الجنينية قلوب مع مكافحة PECAM1 الجسم المضاد
ملاحظة: الأجسام المضادة لمكافحة PECAM1 تعمل بشكل جيد لتلطيخ الأوعية التاجية (راجع الخطوة 2.4) ولكن أي علامة عموم البطانية التي تعطي إشارة قوية ستكون مناسبة.
- في حالة استخدام القلوب التي تم تخزينها في الميثانول بنسبة 100٪، ونقل إلى 1.5 مل أنابيب microcentrifuge وترطيب من خلال تنفيذ المتعاقبة يغسل 5 دقائق في الحلول التالية: 75٪ الميثانول / 25٪ PBS، 50٪ الميثانول / 50٪ PBS و 25٪ الميثانول / 75٪ PBS. Permeabilize قلوب من خلال تنفيذ 3 × 10 يغسل دقيقة في 0،5-1،0 مل PBST (PBS / 0.1٪ توين-20)، وتناوب في درجة حرارة الغرفة.
- منع قلوب من خلال تناوب لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في 1.0 مل مصل الماعز 10٪ في PBST.
- إزالة عازلة تمنع مع البلاستيك ماصة باستير يميل غرامة أو 1000 ميكرولتر ماصة واستبدالها مع 400-500 ميكرولتر كتلة الطازجة التي تحتوي على الأجسام المضادة الأولية معاداة PECAM1 المخفف 01:50. تدوير الأنابيب بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- في اليوم التالي، نضح كتلة / الأجسام المضادة الأولية مع البلاستيك ماصة باستير يميل غرامة أو 1000 ميكرولتر طرف ماصة وتنفيذ ما لا يقل عن 6X 1 يغسل ساعة في 1.0 مل PBST، الدورية للأنابيب في درجة حرارة الغرفة.
- استبدال غسل الماضي مع عازلة تمنع الطازجة التي تحتوي على الأجسام المضادة الثانوية-fluorophore مترافق المخفف 1: 500، واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية، مع دوران. حماية من الضوء من خلال التفاف الأنابيب في احباط.
- في اليوم التالي، ونضح كتلة / ثانيةالأجسام المضادة ondary مع البلاستيك ماصة باستير يميل غرامة وتنفيذ ما لا يقل عن 6X 1 يغسل ساعة في 1.0 مل PBST، الدورية للأنابيب في درجة حرارة الغرفة.
- تخزين قلوب في 4 درجات مئوية (محمية من الضوء) لحين الحاجة إليها.
3. إعداد حلول المقاصة وأطباق المجهر
ملاحظة: عند التصوير في قلوب BABB فمن الأهمية بمكان أن أيا من حل BABB يأتي في اتصال مع مكونات المجهر. لهذا الغرض بروتوكول التالية تحتوي على تعليمات لإعداد أطباق سيليكون مختومة المطاط الصناعي مناسبة للفحص المجهري مضان، والتي يمكن أن تكون على استعداد في وقت مبكر. يوفر المطاط الصناعي السيليكون حاجزا لاحتواء BABB ومنعها من المحتمل أن تتسرب بين أسفل الزجاج والجانبين البولي الطبق.
- لإعداد أطباق سيليكون المغلفة المطاط الصناعي، واتخاذ أطباق ثقافة القاع الزجاجية الضوئية ووضع سقف من 4 مل المسمار أعلى القارورة (حوالي 1.5 سم وقطرها) في وسط كل طبق.
ملاحظة: هذا تشكيل جيدا للعينة عند تطبيق المطاط الصناعي إلى الطبق. - ملء الأطباق مع المطاط الصناعي سيليكون على عمق حوالي 0.5 سم، وذلك باستخدام خرطوشة قضيب إلى مزيج من العنصرين كما يتم تطبيقها، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. ترك لعلاج لمدة لا تقل عن 24 ساعة، والتأكد من أن غطاء قارورة يبقى في وسط كل طبق.
ملاحظة: استخدام نظارات السلامة لتجنب الاتصال العرضي من المطاط الصناعي السيليكون مع العينين. - بعد الشفاء من المطاط الصناعي، وإزالة الغطاء قارورة من كل طبق، وهذا سيترك بئر المركزي حيث العينة إلى أن تصوير يمكن وضعها في اتصال مباشر مع أسفل الزجاج الطبق.
ملاحظة: عندما يكون علاجه يجب أن يكون المطاط الصناعي حازما وجافة لمسة. - إعداد الحل BABB (جزء 1 البنزيل الكحول إلى أجزاء 2 بنزوات البنزيل). يجب أن يتم تخزين هذا في زجاجة ومحمية من الضوء.
تنبيه: BABB هو السامة، والحل للتآكل. التعامل في خزانة الدخان بينما يرتدي الملابس الواقية المناسبة. - مزيج BABB والميثانول لجعل الحل 50:50 (1-5 مل) في قارورة زجاجية. يحفظ بعيدا عن الضوء، على سبيل المثال، عن طريق لف القارورة في احباط.
4. الجفاف والمقاصة وتركيب القلوب للمتحد البؤر المجهري
ملاحظة: أكبر العينات يمكن أن يتم مسح في 4 قوارير مل الزجاج، ولكن لعينات صغيرة (على سبيل المثال، قلوب تصل إلى E13.5) أنه من الأفضل لتنفيذ عملية المقاصة مباشرة في الطبق المجهري. هذا يساعد على منع "فقدان" العينات كما أصبحت قلوب شفافة جدا مرة واحدة مسح. هذه عينات صغيرة المقاصة سريع جدا، والتي تحدث في غضون دقائق قليلة.
ملاحظة: حماية العينات من الضوء خلال كل الخطوات التالية التي التفاف / تغطية الأنابيب والأطباق مع احباط.
- قبل تطهير، يذوى-قلوب immunostained من خلال سلسلة الميثانول عن طريق تناوب قلوب في تيمبي الغرفةrature في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل في التغييرات المتعاقبة من الحلول التالية: 25٪ الميثانول / 75٪ PBS، 50٪ الميثانول / 50٪ PBS و 75٪ الميثانول / 25٪ PBS (5 دقائق في كل منهما). وأخيرا، وتناوب لمدة 3 × 5 دقائق في الميثانول بنسبة 100٪.
- للقلوب حتى E13.5، مكان في وسط الطبق المجهري. تحت المجهر ضمان الموجه القلب مع العلوي الجانب الظهري. إزالة أي الميثانول من حول القلب مع ماصة باستير البلاستيك يميل غرامة.
- باستخدام نظيفة ذات الرؤوس غرامة البلاستيك ماصة باستور، إضافة BABB: الميثانول 50:50 الحل في حجم كاف لتزج القلب (حوالي 300-400 ميكرولتر). كما قلوب يمكن أن الوجه أحيانا في أكثر من حل، والتحقق من التوجه مرة أخرى في حين أن قلوب لا تزال مبهمة. ترك في حل لمدة 5 دقائق.
- إزالة الحل 50:50 إلى زجاجة النفايات الزجاجية في غطاء الدخان واستبدالها مع BABB، مرة أخرى باستخدام باستور البلاستيك ماصة ذات الرؤوس غرامة.
ملاحظة: ليس مطلوبا الحجم الكبير. إضافة الإكتفاءicient بحيث يجلس قلبية في غضون قطرة من حل. القلب يجب اضحة في غضون 5 دقائق. - للقلوب أكبر، مسح العينات في قوارير زجاجية.
ملاحظة: إن القلب E15.5 واضح وينبغي في غضون 30 دقيقة، 1 ساعة ولكن يمكن ترك بين عشية وضحاها إذا لزم الأمر. - بعد عينة واضحة، وإزالة حل واستبدالها مع حجم الحد الأدنى من BABB. اختياريا، وتغطي عينة مع زلة غطاء، للمساعدة على إبقائه في مكانه، ولكن هذا ليس ضروريا على الاطلاق. استخدام القلب للتصوير.
5. التصوير مسح القلوب التي كتبها متحد البؤر المجهري
وتم التقاط الصور على مجهر متحد البؤر مقلوب باستخدام 10X أو 20X أهداف الجافة: ملاحظة. على الرغم من أنه من الممكن استخدام الأطباق على مبائر تستقيم، ويجب اتخاذ الحذر لتجنب الاتصال من الهدف مع الحل BABB.
- جمع ض فحص القلب 15. اعتمادا على حجم القلب، قد تكون هناك حاجة إلى مسح البلاط لصورة القلب كله 16.
تنبيه: BABB هو الحل للتآكل، وارتداء قفازات نظيفة وضمان خارج الطبق المجهري خالية من BABB. التعامل مع الطبق بعناية والحفاظ على غطاء على طبق للحد من خطر تسرب عرضي على المجهر. - إذا سمحت المسافة العمل موضوعية، استخدام التكبير العالي لتحقيق صور ذات دقة أعلى من المناطق المثيرة للاهتمام.
6. تحليل البيانات باستخدام البرامج فيجي
- فتح ض كومة من الصور في فيجي 17.
- لجعل العرض من الألف إلى الياء المكدس كله أو جزء منه، انقر على الصورة واختر ستاك، تليها Z المشروع. أدخل البدء والتوقف عن أرقام شريحة، وحدد نوع ض الإسقاط، على سبيل المثال، متوسط الكثافة، كثافة كحد أقصى.
- لتسليط الضوء على السفن الفردية داخل كومة من شرائح صورة استخدام أداة ضربة (من القائمة الإضافات حدد الإنقسام، ثم ضربة / أداة لاسو) وانقر على مناطق من الصورة المراد شغلها في عصامشريحة CH. استخدام الأمر التعبئة (انقر فوق تحرير، ثم حدد التعبئة) لملء المناطق المختارة مع لون المقدمة واختيار (انقر فوق تحرير، ثم حدد خيارات، تليها الألوان والمقدمة).
- Z المشروع صورة كومة كما كان من قبل.
7. 3D حجم سطح التقديم من الشرايين التاجية تم إنشاؤها باستخدام Imaris
- انقر على أيقونة عرض تفوق في الجزء العلوي من الشاشة، وسحب وإسقاط ملف الصورة في إطار البيانات. انقر على أيقونة عرض 3D في الجزء العلوي من الشاشة.
- حدد رمز السطوح (رمز الأزرق) ثم انقر فوق علامة التبويب إنشاء. انقر على مربع الحوار "تخطي إنشاء التلقائي، يدويا تحرير" وانقر على أيقونة رسم (رقيقة رمز قلم رصاص).
- حدد علامة التبويب كفاف، وفوق علامة التبويب الوضع. في الوضع، اضغط على عصا سحرية أو الرموز isoline. اختر وضع المؤشر في اختيار مؤشر على الجانب الأيمن من الشاشة عن طريق النقر بجوار "اختر"، ثم انقر على "رسم9؛ مربع (في أسفل الزاوية اليسرى من الشاشة).
- استخدام isoline أو أداة العصا السحرية لتحديد الخطوط العريضة للشرايين في شرائح متتالية. التنقل من شريحة إلى شريحة باستخدام شريط التمرير شريحة الوظيفة.
- عندما تم اختيارها كل معالم، انقر على مربع خلق السطح. يمكن جعل حجم المحيطة غير مرئية، أو جعلها أكثر أو أقل مبهمة باستخدام مزيج الوضع. انقر على حجم لتسليط الضوء عليه ثم حدد علامة التبويب إعدادات، تليها علامة التبويب الوضع. اختيار مزيج واستخدام شريط التمرير لتغيير التعتيم.
- التقاط الصور باستخدام وظيفة لقطة.
Representative Results
ومع تطور القلب، وغزت عضلة القلب البطيني من قبل الخلايا البطانية (ECS) من مصادر مختلفة، ويتم تشكيل الضفيرة الوعائية. والسفن التي تتطور داخل عضلة القلب البطيني على المضي قدما لتشكيل شبكات الشعرية والشرايين تقديم الدم المؤكسج إلى أنسجة القلب 18. في نفس الوقت (حوالي E11.5) ينبع التاجي نبدأ في وضع مستقل عن شبكة الشعرية منفصلة (المعروفة باسم الضفيرة peritruncal) التي تحيط تجويف الشريان الأورطي 14،19،20. الضفيرة Peritruncal ECS تشكل في البداية عدة اتصالات مع تجويف الشريان الأورطي على مستوى الجيوب صمام، ولكن في نهاية المطاف إلا سوف سفينة واحدة لا تزال قائمة على كل جانب من الشريان الأورطي، والذهاب إلى تشكل جذور اليسار واليمين الشرايين التاجية 21. من جميع أنحاء E13.5 وperitruncal والبطين الأوعية القلبية تنضم لتشكل شبكة مترابطة، مما يتيح تدفق الدم من لأورتا في الأوعية التاجية 14،22. تلطيخ ECS مع مكافحة PECAM-1 الضد، جنبا إلى جنب مع إزالة BABB من قلوب سليمة، ويسمح تحليل الشبكات التاجية تطوير من المراحل الممكنة. في مراحل النمو اللاحقة الزخرفة الشرايين التاجية النضج ويمكن أيضا أن تدرس. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة لوصمة عار على الأوعية الدموية للأجنة كاملة (إلى E11.5 على الأقل)، ومع الأجسام المضادة المختلفة، على سبيل المثال، ومكافحة ألفا العضلات الملساء الأكتين (Sm22α) وEndomucin.
ويبين الشكل 1 الحد الأقصى لكثافة ض التوقعات من قلب E11.5 تم إنشاؤها باستخدام برنامج فيجي. تم استخدام وظيفة بلاط لجمع صور متعددة جزئية من القلب وغرزة معا في صورة كاملة؛ وهذا مفيد لإعطاء لمحة عامة عن تلطيخ في العينة كلها. في هذه الأجسام المضادة مرحلة PECAM1 البقع أساسا بطانة شغافية القلب وتدفق الخامسessels، ولكن عدد قليل من ECS يمكن أيضا ملاحظة في جدار البطين الأيسر (المنطقة محاصر في الشكل 1A، كما هو موضح الموسع في 1A). وبالإضافة إلى ذلك، الضفيرة peritruncal يمكن ملاحظتها بوضوح في جدار القناة تدفق (OT) (المنطقة محاصر في الشكل 1B). في الحالة الأخيرة، مما يقلل من عدد من شرائح في ض المكدس استخدامها لتوليد إسقاط تحسين وضوح الصورة، والسماح للاتصالات مع تجويف الشريان الأورطي إلى أن تصور بوضوح أكثر (الشكل 1B). في الشكل 2، وزيادة القريبة الأوعية الدموية في الشريان الأورطي ويمكن ملاحظة في قلب E12.5. ويبين الشكل 3 الضفيرة peritruncal في قلب E12.5. ض إسقاط 12 شريحة في الشكل 3A يظهر الضفيرة كاملة، ولكن كما يتم ترجمة بعض السفن البطني إلى تجويف الشريان الأبهر (والذي هو أيضا ملطخة بشكل كبير من قبل مكافحة PECAM1 الضد)، تقسيم ض المكدس طn لعدد من أكوام الفرعية تقدم (الشكل 3B-D) مزيد من المعلومات البصرية. على سبيل المثال، المكدس الفرعي المتوقعة في الشكل 3B يظهر سفينة peritruncal الاتصال السطح البطني من تجويف الشريان الأبهر، وهي ليست واضحة في الإسقاط الكامل. ويبين الشكل 4 جزء من القلب E15.5. الشرايين التاجية هي واضحة للعيان في هذه المرحلة (الشكل 4A، 30 شريحة الإسقاط). في توقعات ض 5-شريحة هو مبين في الأرقام 4B و C يمكن أيضا تصور الصمامات الأورطي والرئوي من قبل PECAM1 تلطيخ. الفروع والترابط في شبكة الشعيرات الدموية التاجية هي أيضا أكثر وضوحا في هذه التوقعات أصغر كومة الفرعية. وقد استخدمت تقنيات تجزئة اليدوية لتسليط الضوء على الشرايين التاجية باستخدام فيجي (الشكل 4D) أو Imaris (الشكل 4D و E). وجعل حجم سطح 3D الشرايين التاجية / تجويف الشريان الأبهر ولدت شالغناء Imaris يمكن عرضها مع أو بدون الأوعية الدموية المحيطة بها (الشكل 4E وF).
الأوعية الدموية من الأجنة كلها يمكن أيضا فحص باستخدام PECAM1 تلطيخ التخليص / BABB. الشكل 4A و A '، تظهر التوقعات ض الناتجة عن المداخن الفرعية من الجانب الأيمن (شرائح ض 11-65) والجانب الأيسر (شرائح ض 66-110) من جنين على التوالي. المقارنة بين الصورتين يدل على أن شدة إشارة الفلورسنت لم تخفض بشكل كبير مع اختراق أعمق في الأنسجة. في الشكل 4B، PECAM1 (إشارة حمراء) وEndomucin (إشارة خضراء) تم الجمع بين الأضداد لتسمية الشرايين intersomitic (المعايير الدولية للمراجعة) والأوردة على التوالي، من جنين E11.5. ويبين الشكل 4C SM22α (إشارة حمراء) وPECAM1 تلطيخ (إشارة خضراء) من المعايير الدولية للمراجعة في الجنين E11.5. في الشكل (6)، أجنة E11.5ملطخة PECAM 1 تم تصويرها مباشرة بعد إزالة BABB الشكل (4A)، أو بعد انقطاع دام شهرين تقريبا (الشكل 4B). لا تزال إشارة الفلورسنت قوية بما فيه الكفاية لصورة بنجاح بعد التخزين لفترات طويلة من العينة في BABB.
الشكل 1. المناعية من القلب E11.5 مع مكافحة PECAM1 الأجسام المضادة (الكشف مع لمكافحة الفئران مفتش مترافق لاليكسا 594). (A، B) وقد تم جمع صورة 2 × 2 المغطى باستخدام الهدف 10X مجهر متحد البؤر مقلوب. PECAM1 البقع الأجسام المضادة على حد سواء الشغاف والأوعية الدموية ECS. وقد ولدت التوقعات (الحد الأقصى لكثافة) من 22 (A) أو 5 (ب) ض شرائح كل من سماكة 4 ميكرون، وذلك باستخدام البرمجيات فيجي. A 'و B' هم enlargemenالخبر من المناطق محاصر في A و B على التوالي. السهام في A 'تشير إلى الأوعية الدموية في جدار البطين. في B '، يشير إلى قوس الضفيرة peritruncal. OT، تدفق الجهاز. LV، البطين الأيسر، RV البطين الأيمن. جميع الصور هي إطلالة أمامية. الحانات النطاق في A و B = 200 ميكرون. الحانات النطاق في A 'و B' = 100 ميكرون. تم تكييفها لوحة 1B "من ايفينز وآخرون، 2015 (19). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. المناعية من القلب E12.5 مع مكافحة PECAM1 الأجسام المضادة. لوحة ويظهر من الألف إلى الياء الإسقاط (الحد الأقصى لكثافة) من مسح 2X2 القرميد. وأظهرت هذه المنطقة محاصر في وenlargإد في A '. وتشير السهام الأوعية الدموية متعددة الأقرب إلى الشريان الأبهر (آو). LV، البطين الأيسر، RV البطين الأيمن. جميع الصور هي إطلالة أمامية. شريط النطاق في A = 200 ميكرون. شريط النطاق في A '= 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. التصوير من Peritruncal الضفيرة في القلب E12.5. وقد تم جمع الصور مبائر من الشريان الأورطي E12.5 (آو) ملطخة الأضداد المضادة للPECAM1 باستخدام الهدف 10X. تم إنشاؤها ض الإسقاط (الحد الأقصى لكثافة) في الفترة من 12 شرائح ض (4 ميكرون سمك)؛ وتشير السهام الأوعية الضفيرة peritruncal. تم تقسيم دينار بحريني 12 شريحة ض إلى ثلاث مداخن الفرعية كما هو مبين واستخدامها لتوليد projecti منفصلةالإضافات. النصال تشير الاتصالات التي شكلتها الضفيرة peritruncal إلى تجويف الشريان الأورطي. سفن Peritruncal المحلية البطني إلى تجويف الشريان الأورطي واضحة في B و C. جميع الصور هي إطلالة أمامية. شريط النطاق = 50 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. الشرايين التاجية وشعري الضفيرة في القلب E15.5. وقد تم جمع الصور مبائر من قلب E15.5 ملطخة الأضداد المضادة للPECAM1 باستخدام الهدف 10X. لوحة ويظهر أقصى كثافة ض الإسقاط ولدت من 30 شرائح ض (4 ميكرون سمك)؛ وتشير السهام الشرايين التاجية اليسار واليمين (LCA وRCA) وهو ما يمكن ملاحظته ربط الشريان الأورطي (آو). باستخدام مختلفا5 ر ض شريحة دون مداخن صمامات الأبهر والرئوي (AOV وPV) يمكن أن ينظر في B و C على التوالي (بين قوسين الزرقاء). الشعرية الضفيرة البطين هي أيضا أكثر وضوحا في هذه التوقعات أصغر كومة من الباطن؛ وتظهر الأوعية الدموية القريبة للصمام الرئوي (مربع صغير) الموسع في أسفل يمين لوحة C (المربع الكبير). وقد استخدم فيجي لتسليط الضوء على الأوعية الدموية الفردية، على سبيل المثال، لوحة D تم استخدام ضربة / أداة لاسو لملء الشرايين التاجية مع اللون الأحمر يدويا في كل ض شريحة قبل الإسقاط. تم استخدام برامج Imaris لخلق صور 3D الشرايين (الحمراء)، وتجويف الشريان الأبهر (الأخضر) في E و F. مرة أخرى تم ذلك يدويا، وذلك باستخدام أداة العصا السحرية لخلق ملامح وجوه في كل ض شريحة. غموض حجم المحيطة يمكن تغييرها في وضع مزيج، كما هو الحال في البريد. بدلا من ذلك، صورة 3D يمكن استخراجه، كما هو مبين في F البطين. جميع الصور هي إطلالة أمامية. شريط النطاق في A = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5. تصوير الأوعية الدموية الجنينية. لوحات A و A 'تظهر الصور مبائر من E10.5 البرية نوع الجنين ملطخة مكافحة PECAM1 الأجسام المضادة، التي تم جمعها باستخدام الهدف 10X (تجانب المسح الضوئي). تم إنشاؤها متوسط كثافة التوقعات ض من شرائح ض 11-65 (أ) و 66-110 (A ') من مسح شريحة 120 ض (4 ميكرون شرائح سميكة)، والتي تبين فقط خسارة طفيفة من كثافة مضان عبر سمك الجنين . يظهر اللوحة ب الأوعية intersomitic للجنين E11.5 ملطخة antibod المنشأ ضد PECAM1 (إشارة الحمراء من الأجسام المضادة الثانوية 594 مترافق) وEndomucin (EMCN، إشارة خضراء من الأجسام المضادة الثانوية 488 مترافق)، التي وصمة عار على الشرايين intersomitic (السهم) والأوردة (رأس السهم) على التوالي (متوسط كثافة ض الإسقاط من القرميد مسح). لوحة C يظهر الشرايين intersomitic (المعايير الدولية للمراجعة) من E11.5 البرية نوع الجنين ملطخة الأجسام المضادة ضد PECAM1 (إشارة خضراء من الأجسام المضادة الثانوية 488 مترافق) وSM22α (إشارة الحمراء من الأجسام المضادة الثانوية 594 مترافق). وقد تم جمع الصور متحد البؤر باستخدام الهدف الجاف 20X واستخدامها لتوليد أقصى قدر التوقعات كثافة ض. جميع الصور هي وجهات النظر السهمي. الحانات النطاق في A و B = 250 ميكرون، شريط النطاق في C = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
د / 54800 / 54800fig6.jpg "/>
الشكل 6. عينات Immunostained مسح في BABB يحتفظ نيون الإشارة لمدة شهرين على الاقل. كانت ملطخة أجنة E11.5 مع PECAM1 الأجسام المضادة وتطهيرها مع BABB. تم تصوير الأجنة من نفس الدفعة فورا أو بعد انقطاع دام شهرين. لوحة ويظهر الشرايين intersomitic الجنين تصويرها على الفور ولوحة B يظهر الجنين تصوير بعد ذلك بشهرين. وقد تم جمع الصور متحد البؤر باستخدام الهدف الجاف 10X واستخدامها لتوليد أقصى قدر التوقعات كثافة ض. داو، الشريان الأبهر الظهري. صور تظهر وجهات النظر السهمي. الحانات النطاق في A و B = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
تم تصوير الأوعية التاجية في القلب الجنينية بأكملها المناعية wholemount مع الأجسام المضادة لمكافحة PECAM1 تليها إزالة البصرية ومتحد البؤر المجهري. طريقة واضحة وصفها هنا، لتطهير القلوب الماوس الجنينية مع BABB، ويزيد من تغلغل البصرية وتمكن من التقاط صور عالية الدقة للأوعية الدموية الموضعية في الشريان الأورطي والبطين الجدران. كما استخدمت القائم على الجلسرين الكواشف التجميع. مثل Vectashield (معامل الانكسار 1.45) لتصوير الأوعية الدموية التاجية 22 إلا أن مؤشر الانكسار أعلى من BABB (1.56) يقلل من تشتت الضوء أكثر فأكثر، مما أعمق اختراق الأنسجة. إزالة الأنسجة يغني عن الحاجة لأكثر تعقيدا، أشكال مكلفة المجهري مثل multiphoton وخفيفة المجهر ورقة والتي قد تكون أقل متناول الباحثين. عملية المقاصة سريعا للغاية بالمقارنة مع الطرق الأخرى 6-9 ولعينات صغيرة يمكن أن يكون كاليفورنياrried من استخدام كميات صغيرة من الكواشف مباشرة على طبق المجهر. مطلوب تلطيخ قوية من الأوعية الدموية من أجل تحقيق صور ذات جودة عالية؛ تم اختيار مكافحة PECAM1 الأجسام المضادة لانه يمثل جميع أنواع التاجي ECS وعدد من الأجسام المضادة التجارية وجدت لتقديم مستويات عالية بشكل مناسب من تلطيخ. وبالإضافة إلى ذلك، وتلطيخ الفلورسنت يبدو أن مستقرة للغاية في BABB. العينات المخزنة في درجة حرارة الغرفة في BABB (محمية من الضوء) احتفظت إشارة الفلورسنت لعدة أشهر. حقيقة أن PECAM1 الأجسام المضادة تسميات بكفاءة البطانة التاجية وكذلك كان الأوعية الدموية إشكالية في بعض الأحيان، خصوصا عند التقاط الصور من الضفيرة peritruncal. أدى تلطيخ أقوى من تجويف الشريان الأبهر مقارنة ECS peritruncal في خطر الإفراط في التشبع في بعض المناطق من الصور، وهذا يعني أن تعديل دقيق للمعلمات التصوير كان مطلوبا. من الناحية المثالية، وتلوين الأجسام المضادة فقط الأوعية الدموية ECS ستستخدم. في التمرين،ومع ذلك، وإيجاد الأجسام المضادة المناسبة التي تحقق المستوى المطلوب من تلطيخ wholemount يمكن أن يكون صعبا. في الآونة الأخيرة، وقد تبين الأحماض الدهنية بروتين ملزمة 4 (FABP4) ليكون علامة من التاجي الأوعية الدموية ECS 23، وبالتالي يمكن أن تمثل بديلا للPECAM1.
من أجل الحفاظ على التشكل 3D من الشريان الأورطي والقلب غرف كانت العينات يست مسطحة مثبتة، ولكن بدلا من ذلك تم تصويرها في أطباق ذات قاع زجاجي. عمق العينات المراد تصويرها يمنع استخدام الأهداف التكبير عالية، نظرا لمسافات عمل قصيرة بهم. لا تزال مع ذلك صور عالية الدقة للتحقيق باستخدام الهدف 10X عن طريق زيادة الوقت بكسل يسكن واستخدام حجم البكسل مجموعة من 1024 س 1024 على الأقل لالتقاط الصور. وكان هذا كافيا لتحليل هيكل وتوزيع الأوعية التاجية، ولكن تحليل أكثر دقة للهيكل الخلوي قد تتطلب تصاعد-شقة من العينات. تشريح الأجزاء الفردية من القلب للتركيب،على سبيل المثال، جدران البطين، أو الشريان الأورطي، قد يكون من الضروري أيضا. بدلا من ذلك، والإفراط في أخذ العينات من صورة تليها deconvolution يمكن القيام بها من أجل زيادة دقة وحساسية. ولكن هذا يتطلب وقتا أطول الأوقات المسح، ويخلق صورة صورة كبيرة للغاية التي تتطلب الكثير من القدرة الحاسوبية لمعالجة.
قلوب تصل إلى E15.5 تم تصوير بنجاح باستخدام هذه الطريقة، وأنه من الممكن أيضا لتحليل الأوعية الدموية للأجنة كاملة (إلى E11.5 على الأقل) باستخدام نفس البروتوكول. كما تم تصوير أنواع الخلايا الأخرى، على سبيل المثال، خلايا العضلات الملساء في مختبرنا باستخدام هذه التقنية. لأنسجة سمكا، على سبيل المثال، قلوب كبار السن من E15.5، يمكن اختراق الأجسام المضادة يكون عاملا مقيدا. قد تكون هناك حاجة حضانات أطول و / أو زيادة المنظفات. وبالإضافة إلى ذلك، عندما جمع ض كومة كبيرة من الصور قوة الإشارة يمكن أن تخفض مثل الليزر تخترق أبعد أجزاء من الأنسجة. ولكن أسيوطيمكن تعديل إعدادات OCAL لزيادة قوة الليزر مع زيادة المسافة ض.
يسهل هذا أسلوب التحليل المجهري متحد البؤر كل المراحل الأولى من تكوين الأوعية التاجية والزخرفة من الشرايين التاجية في مراحل النمو اللاحقة. يمكن الحصول على معلومات مفصلة حول توزيع، المتفرعة وهيكل الأوعية الدموية في وقت قصير، مما يجعل هذه أداة قيمة لدراسة المسوخ الماوس الوراثية مع عيوب معينة في مسارات الأوعية الدموية.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل القلب Foundation'and البريطاني بدعم من المعهد الوطني للمركز البحوث الطبية الحيوية بحوث الصحية في مستشفى جريت أورموند ستريت للأطفال مؤسسة سالفورد وجامعة كوليدج في لندن.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Life Technologies | 14190-094 | |
| Forceps | FST | 11251-30 | |
| 10 cm Petri dishes | Falcon | 351029 | |
| 35 mm Petri dishes | Sigma | P5112 | |
| Stainless steel minutien pins 0.2 mm diameter | FST | 26002-20 | |
| Fine tip pastettes | Alpha Laboratories | LW4061 | |
| 1,000 ml pipette tips | Sorenson | 34000 | |
| 48-well plate | Falcon | 353078 | |
| Kwik-Gard | World Precision Instrument | KWIKGARD | Silicone elastomer Sylgard184 packaged in a cartridge for mixing and dispensing |
| Kwik-Gard refill | World Precision Instrument | KWIKGLUE | Refill cartridges and dispensing tips |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Make up in PBS and store at -20 °C |
| 100% methanol | VWR | 20847307 | |
| Tween®20 | Sigma | P1379 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Anti-PECAM1 antibody, rat anti-mouse | BD Pharmingen | 553370 | Primary antibody, dilute 1 in 50 |
| Anti-CD31 polyclonal, rabbit polyclonal | Abcam | ab28364 | Primary antibody, dilute 1 in 50 |
| Anti-CD31/PECAM1 clone 2H8, armenian hamster monoclonal | Thermo Fisher Scientific | MA3105 | Primary antibody, dilute 1 in 400 |
| Endomucin antibody (V.7C7), rat monoclonal | Santa Cruz Biotechnology | sc-65495 | Primary antibody, dilute 1 in 50 |
| Anti-SM22 alpha antibody, rabbit polyclonal | Abcam | ab14106 | Primary antibody, dilute 1 in 250 |
| Goat anti-rat IgG (H+L)Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A11007 | Secondary antibody, dilute 1 in 500 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L)Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | Secondary antibody, dilute 1 in 500 | |
| Goat anti-Armenian Hamster IgG (H+L)Alexa Fluor 488 | Abcam | ab173003 | |
| Goat anti-rat IgG (H+L)Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21208 | Secondary antibody, dilute 1 in 500 |
| Phenolic screw cap | Wheaton | 240408 | |
| Benzyl alcohol | Sigma | 402834 | |
| Benzyl benzoate | Sigma | B6630 | |
| Imaris | Bitplane Imaging | image analysis software | |
| ImageJ software | NIH | Freeware |
References
- Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).
- Tian, X., et al. Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries. Cell Res. 23 (9), 1075-1090 (2013).
- Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).
- Klotz, L., et al. Cardiac lymphatics are heterogeneous in origin and respond to injury. Nature. 522 (7554), 62-67 (2015).
- Nam, J., et al. Coronary veins determine the pattern of sympathetic innervation in the developing heart. Development. 140 (7), 1475-1485 (2013).
- Zhu, D., Larin, K. V., Luo, Q., Tuchin, V. V. Recent progress in tissue optical clearing. Laser Photon. Rev. 7 (5), 732-757 (2013).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat. Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat. Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat. Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Zucker, R. M., Hunter, E. S., Rogers, J. M. Confocal laser scanning microscopy of morphology and apoptosis in organogenesis-stage mouse embryos. Methods Mol. Biol. 135, 191-202 (2000).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat. Protoc. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Erturk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. J. Vis.Exp : JoVE. (89), (2014).
- Dyer, L. A., Wu, Y., Patterson, C. Protein isolation from the developing embryonic mouse heart valve region. J. Vis.Exp s : JoVE. (91), e51911 (2014).
- Wilsbacher, L. D., Coughlin, S. R. Analysis of cardiomyocyte development using immunofluorescence in embryonic mouse heart. J. Vis.Exp : JoVE. (97), (2015).
- StitchArt Guide for Zen 2010. , Zeiss. Available from: http://www.google.co.uk/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&ved=0ahUKEwjC6OPVnO7NAhVD7RQKHQzqALkQFggcMAA&url=ftp%3A%2F%2Fftp.sonic.net%2Fpub%2Fusers%2Flhund%2FMMP%2FBlurWin2012%2FHelpful Docs%2FTiling_and_Stitching in Zen.pdf&usg=AFQjCNH4C6dv8bdmKC651sp_CFz4C1Rq3g (2010).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Tian, X., Pu, W. T., Zhou, B. Cellular origin and developmental program of coronary angiogenesis. Circ. Res. 116 (3), 515-530 (2015).
- Ivins, S., et al. The CXCL12/CXCR4 Axis Plays a Critical Role in Coronary Artery Development. Dev. Cell. 33 (4), 455-468 (2015).
- Theveniau-Ruissy, M., et al. Coronary stem development in wild-type and Tbx1 null mouse hearts. Dev. Dyn : an official publication of the American Association of Anatomists. 245 (4), 445-459 (2016).
- Tomanek, R. J. Formation of the coronary vasculature during development. Angiogenesis. 8 (3), 273-284 (2005).
- Chen, H. I., et al. VEGF-C and aortic cardiomyocytes guide coronary artery stem development. J. Clin.Iinvest. 124 (11), 4899-4914 (2014).
- Tian, X., et al. Vessel formation. De novo formation of a distinct coronary vascular population in neonatal heart. Science. 345 (6192), 90-94 (2014).
