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Developmental Biology

साफ भ्रूण दिल में कोरोनरी वाहिकाओं का विश्लेषण

Published: December 7, 2016 doi: 10.3791/54800
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Developmental Biology of Birth Defects, UCL Institute of Child Health, 2MRC Centre for Regenerative Medicine, SCRM Building, University of Edinburgh

Summary

हम E15.5 करने के लिए पूरे भ्रूण murine दिलों में कोरोनरी वाहिकाओं के विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत, मानक प्रतिरक्षात्मक धुंधला ऑप्टिकल निकासी और confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा पीछा किया तरीकों का उपयोग कर। इस तकनीक को धारावाहिक वर्गों के लिए समय लेने वाली विश्लेषण के लिए आवश्यकता के बिना पूरे दिल में रक्त वाहिकाओं के दृश्य के लिए सक्षम बनाता है।

Introduction

एक कार्य कोरोनरी नेटवर्क की स्थापना इस विकास की प्रक्रिया अंतर्निहित आणविक संकेतों में बहुमूल्य अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं दिल समारोह और भ्रूण विकास, और आनुवंशिक माउस म्यूटेंट के विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है। एक पूरे के रूप में भ्रूण कोरोनरी जाल कल्पना करने की क्षमता है, बल्कि histological वर्गों की एक श्रृंखला में प्रस्तुत की तुलना में, आनुवंशिक म्यूटेंट में पोत patterning के विश्लेषण की सुविधा के लिए आवश्यक है, और है कि यांत्रिक का एक परिणाम के रूप में हो सकता है जानकारी के संभावित नुकसान से बचा जाता है ऊतक के टुकड़ा करने की क्रिया। धमनियों के लिए फार्म नसीब वेसल्स और केशिकाओं दोनों निलय और महाधमनी 1-3 की दीवारों के भीतर गहरे स्थानीय कर रहे हैं। हालांकि, जबकि लेजर स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोपी के साथ संयुक्त wholemount लेबल सतही शिरापरक / लसीका वाहिकाओं 4,5 के उच्च संकल्प छवियों प्रदान कर सकते हैं कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट लेबलिंग, इमेजिंग की गहराई ऑप्टिकल प्रवेश द्वारा सीमित है। टोपी के उच्च संकल्प इमेजिंगillaries और धमनियों दिल की पूरी गहराई भर इसलिए ऊतक समाशोधन के कुछ फार्म के बिना संभव नहीं है।

गरीब ऑप्टिकल पैठ कई सेलुलर और बाह्य (जैसे, कोलेजन और लोचदार फाइबर) मोटी ऊतकों के घटकों के उच्च अपवर्तनांक के कारण होता है। इस इमेजिंग प्रकाश scatters, धुंधला के कारण और इसके विपरीत कम किया है। क्लियरिंग एजेंट आमतौर पर इस तरह के ऊतकों के उच्च अपवर्तनांक मैच, जिसका अर्थ है कि प्रकाश नमूना अबाधित के माध्यम से यात्रा और ऊतकों में गहरी पैठ कर सकते हैं। साफ़ करने से पहले, ऊतकों आम तौर पर सूखे चूर्ण पानी के रूप में एक अपेक्षाकृत कम अपवर्तनांक हो गया है। नई समाशोधन ढेर सारे तरीकों के हाल ही में विकसित किया गया है, लेकिन इस्तेमाल किया, समाशोधन प्रक्रिया दिनों या हफ्तों ले जा सकते हैं और महंगा अभिकर्मकों 6-9 की आवश्यकता हो सकती तकनीक पर निर्भर करता है। BABB (एक 1: बेंजाइल अल्कोहल और लोबान बेंजोएट के 2 मिश्रण) एक सस्ती, आमतौर पर इस्तेमाल समाशोधन एजेंट, जो हैबहुत जल्दी नमूने समाशोधन का लाभ। BABB आधारित समाशोधन और इमेजिंग तकनीक तंत्रिका विज्ञान के नमूने और विभिन्न अंगों 10-13 के लिए पहले से वर्णित किया गया है। 15.5 - यहाँ हम ई (भ्रूण दिन) 11.5 से murine दिल में रक्त वाहिकाओं की परीक्षा के लिए विशेष संदर्भ के साथ confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा पीछा किया immunostained नमूनों की BABB मंजूरी के लिए एक मजबूत और सरल तकनीक का वर्णन है,। हालांकि, के रूप में भी प्रदर्शित किया गया है, इस तकनीक को समान रूप से अच्छी तरह से पूरे भ्रूण के विश्लेषण, साथ ही अन्य प्रकार की कोशिकाओं के लिए लागू किया जा सकता है, जब तक ब्याज की मार्कर के रूप में उच्च गुणवत्ता वाले एंटीबॉडी उपलब्ध हैं।

Protocol

सभी पशु अनुसंधान ब्रिटेन के गृह मंत्रालय से लाइसेंस के तहत संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार किया गया था।

1. विच्छेदन और भ्रूण दिल का निर्धारण

  1. एक नैतिकता की दृष्टि से मंजूरी दे दी मुर्गियों को मारने तकनीक, जैसे, सीओ 2 narcosis ग्रीवा अव्यवस्था के बाद का उपयोग आवश्यक दिन पर एक समय गर्भवती माउस euthanize, और, भ्रूण थैलियों 14 को हटाने के लिए उन्हें फॉस्फेट बफर खारा से भरा एक 10 सेमी पेट्री डिश में रखकर (पीबीएस) ।
  2. एक विदारक माइक्रोस्कोप और संदंश का प्रयोग, ध्यान से प्रत्येक भ्रूण गर्भाशय की थैलियों को खोलने और हटाने, गर्भनाल विच्छेद और जर्दी थैली को हटाने।
  3. जीनोटाइपिंग प्रयोजनों के लिए, सेल / डीएनए निष्कर्षण के लिए बाद में एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में भ्रूण पूंछ और जगह को हटा दें।
  4. दिल, प्रत्येक भ्रूण, एक पीबीएस भरा सिलिकॉन elastomer लेपित 35 मिमी पेट्री डिश में अपनी पीठ पर बाहर हटाने स्टेनलेस स्टील minutien पिन का उपयोग पिन करने के लिए आदेश में। ठीक संदंश का प्रयोग, सीएrefully छाती खोलने के लिए और महान जहाजों को तोड़ने, दिल के लिए पूर्वकाल। फिर संदंश के साथ दिल के पीछे तक पहुंच गया, दिल के पीछे वाहिकाओं समझ और धीरे से खींच दिल को दूर करने के लिए; फेफड़े भी एक ही समय में दूर आ सकता है।
  5. पीबीएस युक्त एक ताजा 35 मिमी पेट्री डिश के लिए दिल स्थानांतरण और, फेफड़े के ऊतकों दूर ट्रिम करने के लिए यदि आवश्यक हो तो ठीक संदंश का उपयोग करें। तब एक 48 अच्छी तरह से थाली ठंड पीबीएस के साथ भरा एक अच्छी तरह से करने के लिए दिल हस्तांतरण।
  6. 48 अच्छी तरह से थाली में सब के दिल इकट्ठा करने के बाद, एक ठीक इत्तला दे दी प्लास्टिक पाश्चर विंदुक के साथ पीबीएस aspirate और 0.5 मिलीलीटर 4% paraformaldehyde (पीएफए) के साथ बदलें।
    चेतावनी: पीएफए, allergenic कैंसर, और विषाक्त हो जाना जाता है एक है।
    1. फिक्स E11.5 - 15 मिनट के लिए 12.5 दिल, 20 मिनट और E14.5 के लिए E13.5 दिल - कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 15.5 दिल, 4% पीएफए ​​में।
  7. एक ठीक इत्तला दे दी प्लास्टिक पाश्चर विंदुक के साथ पीएफए ​​Aspirate और दिल 2x ठंड पीबीएस में कुल्ला।
    Cautआयन: पीएफए खतरनाक है और संस्थागत नियमों के अनुसार निपटाया जाना चाहिए।
  8. अगर पूरे माउंट immunostaining के लिए तुरंत का उपयोग नहीं (धारा 2 देखें), निम्न समाधानों में लगातार 5 मिनट washes के बाहर ले जाने से दिल निर्जलीकरण: 25% मेथनॉल / 75% पीबीएस, 50% मेथनॉल / 50% पीबीएस, 75% मेथनॉल / 25 % पीबीएस।
    चेतावनी: मेथनॉल विषैला होता है, दस्ताने पहनते हैं। 100% मेथनॉल में -20 डिग्री सेल्सियस पर दिल स्टोर।

एंटी PECAM1 एंटीबॉडी के साथ भ्रूण दिल की 2. पूरा पर्वत Immunostaining

नोट: विरोधी PECAM1 एंटीबॉडी कोरोनरी वाहिकाओं धुंधला करने के लिए अच्छी तरह से काम करते हैं, लेकिन किसी भी अखिल endothelial मार्कर है कि एक मजबूत संकेत देता उपयुक्त होगा (2.4 कदम देखें)।

  1. दिल है कि 100% मेथनॉल में संग्रहित किया गया है का उपयोग करते हैं, तो 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों को हस्तांतरण और निम्न समाधानों में लगातार 5 मिनट washes के बाहर ले जाने से rehydrate: मेथनॉल / 25% पीबीएस, 50% मेथनॉल / 50% पीबीएस और 25% से 75% मेथनॉल / 75% पीबीएस। 1.0 मिलीलीटर PBST (पीबीएस / 0.1% बीच 20), कमरे के तापमान पर घूर्णन - 0.5 में 3 एक्स 10 मिनट washes के बाहर ले जाने से दिल Permeabilize।
  2. PBST में 1.0 मिलीलीटर 10% बकरी सीरम में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए घूर्णन द्वारा दिलों ब्लॉक।
  3. एक ठीक इत्तला दे दी प्लास्टिक पाश्चर विंदुक या 1,000 μl विंदुक टिप के साथ अवरुद्ध बफर निकालें और 400 के साथ की जगह - 500 μl ताजा विरोधी PECAM1 प्राथमिक एंटीबॉडी 01:50 पतला युक्त ब्लॉक। 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर नलियों घुमाएँ।
  4. अगले दिन, एक ठीक इत्तला दे दी प्लास्टिक पाश्चर विंदुक या 1,000 μl विंदुक टिप के साथ ब्लॉक / प्राथमिक एंटीबॉडी aspirate और 1.0 मिलीलीटर PBST में कम से कम 1 घंटा 6x washes के लिए बाहर ले जाने, कमरे के तापमान पर नलियों घूर्णन।
  5. ताजा अवरुद्ध fluorophore संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी 1 पतला युक्त बफर के साथ पिछले धोने बदलें: 500, और 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं, रोटेशन के साथ। पन्नी में लपेटकर द्वारा नलियों प्रकाश से सुरक्षित रखें।
  6. अगले दिन, aspirate ब्लॉक / सेकएक ठीक इत्तला दे दी प्लास्टिक पाश्चर विंदुक के साथ ondary एंटीबॉडी और 1.0 मिलीलीटर PBST में कम से कम 1 घंटा 6x washes के लिए बाहर ले जाने, कमरे के तापमान पर नलियों घूर्णन।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस (प्रकाश से सुरक्षित) की जरूरत है जब तक दिल में स्टोर।

3. समाशोधन समाधान और माइक्रोस्कोपी व्यंजन की तैयारी

नोट: BABB में दिल जब इमेजिंग यह महत्वपूर्ण है कि BABB समाधान में से कोई भी माइक्रोस्कोप के घटकों के साथ संपर्क में आता है। इस प्रयोजन के लिए निम्नलिखित प्रोटोकॉल सिलिकॉन elastomer सील प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए उपयुक्त व्यंजन है, जो पहले अच्छी तरह से तैयार किया जा सकता की तैयारी के लिए निर्देश शामिल हैं। सिलिकॉन elastomer BABB होते हैं और यह संभवतः गिलास नीचे और डिश के पॉली कार्बोनेट पक्षों के बीच रिसाव से रोकने के लिए एक बाधा प्रदान करता है।

  1. सिलिकॉन elastomer लेपित व्यंजन तैयार करने के लिए, ऑप्टिकल ग्लास तली संस्कृति व्यंजन पेंच शीर्ष शीशी ले और एक 4 मिलीलीटर से एक टोपी जगह (लगभग 1.5 सेमी व्यास में) प्रत्येक डिश के केंद्र में है।
    नोट: इस नमूने के लिए एक अच्छी तरह से बनेगी जब इलास्टोमेर डिश के लिए लागू किया जाता है।
  2. निर्माताओं के निर्देशों के अनुसार, लगभग 0.5 सेमी की गहराई तक सिलिकॉन elastomer के साथ बर्तन भरें, के रूप में वे लागू कर रहे हैं दो घटकों का मिश्रण करने के लिए एक applicator कारतूस के प्रयोग से। कम से कम 24 घंटे के लिए इलाज करने के लिए, सुनिश्चित करें कि शीशी टोपी हर डिश के केंद्र में रहता है बनाने छोड़ दें।
    नोट: आंखों के साथ सिलिकॉन elastomer के आकस्मिक संपर्क से बचने के लिए सुरक्षा चश्मे का प्रयोग करें।
  3. इलास्टोमेर इलाज करने के बाद, प्रत्येक पकवान से शीशी टोपी को हटा दें, यह एक अच्छी तरह से केंद्रीय जहां नमूना imaged किया जा पकवान की गिलास नीचे के साथ सीधे संपर्क में रखा जा सकता छोड़ देंगे।
    नोट: जब ठीक हो इलास्टोमेर फर्म और स्पर्श करने के लिए सूखा होना चाहिए।
  4. BABB समाधान (2 भागों लोबान बेंजोएट के लिए 1 भाग बेंजाइल अल्कोहल) तैयार करें। यह एक कांच की बोतल में संग्रहीत और प्रकाश से संरक्षित किया जाना चाहिए।
    चेतावनी: BABबी एक जहरीले, संक्षारक समाधान है। उपयुक्त सुरक्षात्मक कपड़े पहने whilst एक धूआं अलमारी में संभाल लेना।
  5. एक कांच की शीशी में - (5 मिलीलीटर 1) मिक्स BABB और मेथनॉल 50:50 समाधान बनाने के लिए। प्रकाश, जैसे से सुरक्षित रखें, पन्नी में लपेटकर द्वारा शीशी।

4. निर्जलीकरण, क्लियरिंग और confocal माइक्रोस्कोपी के लिए दिल के बढ़ते

नोट: बड़े नमूनों, 4 मिलीलीटर कांच की शीशियों में मंजूरी दी जा सकती लेकिन छोटे नमूने के लिए (जैसे, E13.5 करने के लिए दिल) यह माइक्रोस्कोपी डिश में सीधे समाशोधन प्रक्रिया से बाहर ले जाने के लिए बेहतर है। इस रोकने में मदद करता 'खोने' नमूने के रूप में दिल बहुत पारदर्शी हो एक बार मंजूरी दे दी। इन छोटे नमूने के लिए समाशोधन, बहुत तेजी से होता है कुछ ही मिनटों के भीतर होने वाली।
नोट: लपेटकर / पन्नी के साथ ट्यूब और बर्तन को कवर द्वारा सभी निम्न चरणों के दौरान प्रकाश से नमूनों को सुरक्षित रखें।

  1. साफ़ करने से पहले, कमरे न्यू यॉर्क में दिल घूर्णन द्वारा एक मेथनॉल श्रृंखला के माध्यम से immunostained-दिल निर्जलीकरणनिम्न समाधानों की लगातार परिवर्तन में एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में rature: 25% मेथनॉल / 75% पीबीएस, 50% मेथनॉल / 50% पीबीएस और 75% मेथनॉल / 25% पीबीएस (5 प्रत्येक में न्यूनतम)। अंत में, 100% मेथनॉल में 3 एक्स 5 मिनट के लिए बारी बारी से।
  2. अप E13.5, माइक्रोस्कोपी डिश के केंद्र में जगह करने के लिए दिल के लिए; माइक्रोस्कोप के तहत यह सुनिश्चित दिल अपनी पृष्ठीय पक्ष ऊपरवाला के साथ केंद्रित है। एक ठीक इत्तला दे दी प्लास्टिक पाश्चर विंदुक के साथ दिल के आसपास से किसी भी मेथनॉल निकालें।
  3. (- 400 μl लगभग 300) पर्याप्त मात्रा दिल को विसर्जित करने में 50:50 समाधान मेथनॉल: एक साफ ठीक इत्तला दे दी प्लास्टिक पाश्चर विंदुक का प्रयोग, BABB जोड़ें। जैसा कि दिल कभी कभी समाधान में फ्लिप कर सकते हैं, फिर उन्मुखीकरण जाँच whilst दिल अभी भी अपारदर्शी हैं। 5 मिनट के लिए समाधान में छोड़ दें।
  4. धूआं हुड में एक कांच की बोतल के लिए बेकार 50:50 समाधान निकालें और BABB के साथ की जगह है, फिर एक ठीक इत्तला दे दी प्लास्टिक पाश्चर विंदुक का उपयोग।
    नोट: एक बड़ी मात्रा की आवश्यकता नहीं है; suff जोड़नेicient तो यह है कि दिल समाधान की एक बूंद के भीतर बैठता है। दिल 5 मिनट के भीतर स्पष्ट करना चाहिए।
  5. बड़े दिल के लिए, कांच की शीशियों में नमूने साफ़ करें।
    नोट: एक E15.5 दिल 30 मिनट -1 घंटा के भीतर स्पष्ट करना चाहिए लेकिन यदि आवश्यक हो तो रात भर के लिए छोड़ दिया जा सकता है।
  6. बाद नमूना स्पष्ट है, समाधान निकालने और BABB की एक न्यूनतम मात्रा के साथ बदलें। वैकल्पिक रूप से, एक कवर पर्ची के साथ नमूना कवर, यह जगह में रखने में मदद करने के लिए, लेकिन यह बिल्कुल जरूरी नहीं है। इमेजिंग के लिए दिल का प्रयोग करें।

5. इमेजिंग मंजूरी दे दी confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा दिल

नोट: छवियाँ 10X 20X या सूखी उद्देश्यों का उपयोग एक औंधा confocal खुर्दबीन पर कब्जा कर लिया गया। हालांकि यह एक ईमानदार confocal पर व्यंजन का उपयोग करना संभव है, अतिरिक्त देखभाल BABB समाधान के साथ उद्देश्य के संपर्क से बचने के लिए लिया जाना चाहिए।

  1. दिल 15 के एक Z-स्कैन लीजिए। दिल के आकार पर निर्भर करता है, एक टाइल स्कैन छवि पूरे दिल से 16 की आवश्यकता हो सकती है।
    चेतावनी: BABB एक संक्षारक समाधान है, साफ दस्ताने पहनते हैं और यह सुनिश्चित माइक्रोस्कोपी डिश के बाहर BABB से मुक्त है। डिश सावधानी से संभालना और माइक्रोस्कोप पर आकस्मिक spillage के जोखिम को कम करने के लिए पकवान पर ढक्कन रखने के लिए।
  2. उद्देश्य काम दूरी की अनुमति देता है, तो ब्याज के क्षेत्रों के उच्च संकल्प चित्रों को प्राप्त करने के लिए एक उच्च बढ़ाई उपयोग करें।

6. डेटा विश्लेषण फिजी सॉफ्टवेयर का उपयोग

  1. फिजी 17 में छवियों के Z ढेर खोलें।
  2. पूरी हो चुकी है या इसे का हिस्सा के AZ प्रक्षेपण बनाने के लिए, छवि पर क्लिक करें और ढेर, जेड परियोजना द्वारा पीछा चयन करें। प्रारंभ दर्ज करें और टुकड़ा संख्या बंद करो, और z प्रक्षेपण, जैसे, औसत तीव्रता, अधिकतम तीव्रता के प्रकार का चयन करें।
  3. छवि स्लाइस उड़ा उपकरण का उपयोग का एक ढेर के भीतर अलग-अलग जहाजों को उजागर करने के लिए (प्लगइन्स मीनू विभाजन से, और फिर उड़ा / कमंद उपकरण) और छवि के क्षेत्रों पर क्लिक करें ईए में भरे जानेचर्चा टुकड़ा। (संपादित करें पर क्लिक करें, फिर विकल्प, रंग और अग्रभूमि के द्वारा पीछा चयन) को भरने के आदेश का उपयोग करें (संपादित करें पर क्लिक करें, फिर भरें चुनें) पसंद का अग्रभूमि रंग के साथ चयनित क्षेत्रों को भरने के लिए।
  4. जेड परियोजना छवि के रूप में पहले हो चुकी है।

7. 3 डी कोरोनरी धमनियों की सतह मात्रा प्रतिपादन Imaris का उपयोग कर उत्पन्न

  1. स्क्रीन के शीर्ष पर पार दृश्य आइकन पर क्लिक करें और खींचें और डेटा विंडो में छवि फ़ाइल ड्रॉप। स्क्रीन के शीर्ष पर 3 डी दृश्य आइकन पर क्लिक करें।
  2. सतहों आइकन (नीले चिह्न) का चयन करें और फिर बनाएँ टैब पर क्लिक करें। 'स्वत: निर्माण जाएं, मैन्युअल रूप से संपादित' संवाद बॉक्स पर क्लिक करें और ड्रा आइकन (पतली पेंसिल आइकन) पर क्लिक करें।
  3. कंटूर टैब, और फिर मोड टैब का चयन करें। मोड में, जादू की छड़ी या isoline आइकन पर क्लिक करें। 'चुनें' के बगल में क्लिक करके स्क्रीन के दाहिने हाथ की ओर सूचक चयन में सूचक मोड का चयन, और फिर 'ड्रा पर क्लिक करें9; बॉक्स (स्क्रीन के नीचे बाएँ हाथ के कोने में)।
  4. लगातार स्लाइस में धमनियों की आकृति का चयन करने के isoline या जादू की छड़ी उपकरण का प्रयोग करें। टुकड़ा से नेविगेट स्लाइस स्थिति स्लाइडर का उपयोग कर टुकड़ा करने के लिए।
  5. जब सभी आकृति चुना गया है, सतह बनाने के बॉक्स पर क्लिक करें। आसपास मात्रा अदृश्य बनाया जा सकता है, या मिश्रण मोड का उपयोग कम या ज्यादा अपारदर्शी प्रदान की गई है; इसे उजागर करने के लिए और फिर सेटिंग टैब, मोड टैब के द्वारा पीछा चयन खंड पर क्लिक करें। मिश्रण का चयन करें और स्लाइडर का उपयोग अस्पष्टता बदलने के लिए।
  6. स्नैपशॉट समारोह का उपयोग कर छवियों पर कब्जा।

Representative Results

दिल के रूप में विकसित, निलय मायोकार्डियम विभिन्न स्रोतों से endothelial कोशिकाओं (ईसीएस) द्वारा हमला किया जाता है, और एक नाड़ी जाल का गठन किया है। वाहिकाओं है कि निलय मायोकार्डियम के भीतर विकसित हृदय के ऊतकों से 18 ऑक्सीजन युक्त रक्त पहुंचाने केशिका और धमनी नेटवर्क बनाने के लिए पर जाना होगा। एक ही समय (E11.5 के आसपास) कोरोनरी उपजी एक अलग केशिका नेटवर्क (peritruncal जाल के रूप में जाना जाता है) से स्वतंत्र रूप से विकसित करने के लिए शुरू कि महाधमनी 14,19,20 के लुमेन चारों ओर से घेरे पर। Peritruncal जाल ईसीएस शुरू में वाल्व साइनस के स्तर पर महाधमनी के लुमेन के साथ कई कनेक्शन फार्म, हालांकि अंत में केवल एक पोत महाधमनी के प्रत्येक पक्ष पर जारी रहती है, छोड़ दिया और सही कोरोनरी धमनियों 21 की जड़ों के लिए फार्म पर चल रहा है। से peritruncal E13.5 और वेंट्रिकुलर आसपास दौरे जहाजों में शामिल होने के एक परस्पर नेटवर्क के रूप में, एक से रक्त प्रवाह की अनुमतिकोरोनरी वाहिकाओं 14,22 में Orta। विरोधी PECAM-1 एंटीबॉडी, अक्षत दिल की BABB मंजूरी के साथ संयुक्त ईसीएस के धुंधला, जल्द से जल्द संभव चरणों से विकासशील कोरोनरी नेटवर्क का विश्लेषण परमिट। बाद में विकास के चरणों में परिपक्व कोरोनरी धमनियों की patterning भी जांच की जा सकती है। इस विधि को भी पूरे भ्रूण की वाहिका दाग के लिए उपयोग किया जा सकता है (ऊपर E11.5 करने के लिए कम से कम), और विभिन्न एंटीबॉडी, जैसे के साथ, विरोधी अल्फा चिकनी पेशी actin (Sm22α) और Endomucin।

चित्रा 1 फिजी सॉफ्टवेयर का उपयोग कर उत्पन्न एक E11.5 दिल की अधिकतम तीव्रता जेड के अनुमानों से पता चलता है। टाइल समारोह दिल के कई आंशिक छवियों को इकट्ठा करने और एक पूर्ण छवि में उन्हें एक साथ सिलाई के लिए इस्तेमाल किया गया था; इस पूरे नमूना में धुंधला की एक सिंहावलोकन दे करने के लिए उपयोगी है। इस चरण PECAM1 एंटीबॉडी पर मुख्य रूप से दिल और बहिर्वाह वी के endocardial अस्तर दागessels, हालांकि कुछ ईसीएस भी बाएं निलय दीवार में मनाया जा सकता है (चित्रा 1 ए में बॉक्सिंग क्षेत्र से पता चला 1 ए में बढ़े हुए ')। इसके अलावा, peritruncal जाल स्पष्ट रूप से बहिर्वाह पथ (ओटी) (चित्रा 1 बी में बॉक्सिंग क्षेत्र) की दीवार में मनाया जा सकता है। उत्तरार्द्ध मामले में, जेड ढेर प्रक्षेपण उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल में स्लाइस की संख्या को कम करने छवि की स्पष्टता में सुधार, और अधिक स्पष्ट देखे जा करने के लिए (चित्रा 1 बी ') महाधमनी के लुमेन के साथ कनेक्शन की अनुमति है। चित्रा 2 में, महाधमनी के लिए बढ़ा वाहिका समीपस्थ एक E12.5 दिल में मनाया जा सकता है। चित्रा 3 एक E12.5 दिल में peritruncal जाल से पता चलता है। चित्रा 3 ए में 12-टुकड़ा Z प्रक्षेपण पूरे जाल से पता चलता है, तथापि के रूप में कुछ जहाजों महाधमनी (जो भी भारी विरोधी PECAM1 एंटीबॉडी से सना हुआ है) के लुमेन के लिए पेट के बल स्थानीय कर रहे हैं, बंटवारे Z ढेर मैंउप ढेर के एक नंबर Nto (चित्रा 3 बी-डी) और अधिक दृश्य जानकारी प्रदान करता है। उदाहरण के लिए, उप ढेर चित्रा 3 बी में अनुमानित महाधमनी लुमेन के उदर सतह है, जो पूर्ण प्रक्षेपण में दिखाई नहीं है को जोड़ने के लिए एक peritruncal पोत से पता चलता है। चित्रा 4 एक E15.5 दिल का हिस्सा पता चलता है; कोरोनरी धमनियों इस स्तर (चित्रा -4 ए, 30-टुकड़ा प्रक्षेपण) में स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं। 5-टुकड़ा Z आंकड़े 4 बी में दिखाया गया अनुमानों और सी में महाधमनी और फेफड़े के वाल्व भी PECAM1 धुंधला द्वारा देखे जा सकते हैं; शाखाओं और कोरोनरी केशिका नेटवर्क के अंतर सम्बन्ध भी इन छोटे उप ढेर अनुमानों में स्पष्ट कर रहे हैं। मैनुअल विभाजन तकनीक फिजी (चित्रा 4D) या Imaris (चित्रा 4 डी और ई) का उपयोग कोरोनरी धमनियों को उजागर करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। कोरोनरी धमनियों के 3 डी सतह मात्रा प्रतिपादन / महाधमनी लुमेन यू उत्पन्नगाओ Imaris साथ या आसपास के वाहिका (चित्रा 4E और एफ) के बिना देखा जा सकता है।

पूरे भ्रूण की वाहिका भी PECAM1 धुंधला / BABB क्लीयरेंस का उपयोग कर जांच की जा सकती है। क्रमश: भ्रूण के और बाईं ओर (z स्लाइस 66-110) - चित्रा -4 ए और ए ', दाईं ओर से उप ढेर से उत्पन्न Z अनुमानों (65 जेड स्लाइस 11) दिखा। दो छवियों की तुलना से पता चलता है कि फ्लोरोसेंट संकेत की तीव्रता काफी ऊतक में गहरी पैठ के साथ कम नहीं था। चित्रा 4 बी, PECAM1 (रेड सिग्नल) और Endomucin (हरी झंडी) में एंटीबॉडी क्रमश intersomitic धमनियों (ISAS) और नसों लेबल करने के लिए एक E11.5 भ्रूण के, संयुक्त थे। चित्रा 4C SM22α (रेड सिग्नल) और एक E11.5 भ्रूण में ISAs की PECAM1 धुंधला (हरी झंडी) से पता चलता। चित्रा 6 में, E11.5 भ्रूणPECAM 1 के साथ दाग BABB निकासी (चित्रा -4 ए) के तुरंत बाद imaged थे, या लगभग दो महीने (चित्रा 4 बी) के अंतराल के बाद। फ्लोरोसेंट संकेत अभी भी सफलतापूर्वक BABB में नमूने के लंबे समय तक भंडारण के बाद छवि के लिए काफी मजबूत था।

आकृति 1
चित्रा 1. विरोधी PECAM1 एंटीबॉडी के साथ एक E11.5 दिल की Immunostaining (एलेक्सा 594 करने के लिए विरोधी चूहा आईजीजी संयुग्मित के साथ पाया)। (ए, बी) एक 2 x 2 टाइल छवि एक औंधा confocal खुर्दबीन के 10x उद्देश्य का उपयोग कर एकत्र किया गया था। PECAM1 एंटीबॉडी दाग ​​दोनों endocardial और नाड़ी ईसीएस। अनुमानों (अधिकतम तीव्रता), 22 (ए) या 5 (बी) जेड स्लाइस 4 माइक्रोन मोटाई में से प्रत्येक से उत्पन्न किया गया, फिजी सॉफ्टवेयर का उपयोग कर। ए 'और' बी 'enlargemen हैंक्रमश: ए और बी में बॉक्सिंग क्षेत्रों के टीएस। ए में 'तीर वेंट्रिकल की दीवार में रक्त वाहिकाओं से संकेत मिलता है; बी 'में, ब्रैकेट peritruncal जाल इंगित करता है। ओटी, बहिर्वाह पथ; एल.वी., बाएं वेंट्रिकल, आर.वी. सही वेंट्रिकल। सभी छवियों ललाट विचार कर रहे हैं। एक में स्केल सलाखों और बी = 200 माइक्रोन; ए 'और' बी '= 100 माइक्रोन में बड़े पैमाने सलाखों के। पैनल 1 बी 'Ivins एट अल।, 2015 19 से अनुकूलित किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. विरोधी PECAM1 एंटीबॉडी के साथ एक E12.5 दिल की Immunostaining। पैनल एक 2x2 टाइलों स्कैन की AZ प्रक्षेपण (अधिकतम तीव्रता) से पता चलता है। एक में बॉक्सिंग क्षेत्र enlarg दिखाया गया हैएक एड में '; तीर समीपस्थ महाधमनी (एओ) करने के लिए कई रक्त वाहिकाओं का संकेत मिलता है। एल.वी., बाएं वेंट्रिकल, आर.वी. सही वेंट्रिकल। सभी छवियों ललाट विचार कर रहे हैं। एक में स्केल बार = 200 माइक्रोन; ए '= 100 माइक्रोन में पैमाने पर पट्टी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
एक E12.5 दिल में 3. Peritruncal जाल की इमेजिंग चित्रा। एक E12.5 महाधमनी (एओ) विरोधी PECAM1 एंटीबॉडी के साथ दाग की Confocal छवियों 10X उद्देश्य का उपयोग कर एकत्र किए गए थे। Z प्रक्षेपण (अधिकतम तीव्रता) ए में 12 जेड स्लाइस (4 माइक्रोन मोटाई) से उत्पन्न किया गया था; तीर peritruncal जाल जहाजों से संकेत मिलता है। संकेत के रूप में और अलग projecti उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया बी.डी. 12 जेड स्लाइस तीन उप ढेर में विभाजित किया गयाons; तीर महाधमनी के लुमेन के लिए peritruncal जाल द्वारा गठित कनेक्शन संकेत मिलता है। Peritruncal महाधमनी के लुमेन के लिए पेट के बल स्थानीय वाहिकाओं बी और सी में दिखाई दे रहे हैं। सभी छवियों ललाट विचार कर रहे हैं। स्केल बार 50 माइक्रोन =। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
एक E15.5 दिल में चित्रा 4. कोरोनरी धमनियों और केशिका जाल। एक E15.5 दिल विरोधी PECAM1 एंटीबॉडी के साथ दाग की Confocal छवियों 10X उद्देश्य का उपयोग कर एकत्र किए गए थे। पैनल अधिकतम तीव्रता जेड 30 जेड स्लाइस (4 माइक्रोन मोटाई) से उत्पन्न प्रक्षेपण पता चलता है; तीर छोड़ दिया और सही कोरोनरी धमनियों (एलसीए और आरसीए) जो महाधमनी (ए ओ) को जोड़ने के देखा जा सकता है संकेत मिलता है। एडवेंचर्स का प्रयोगT 5 Z टुकड़ा उप ढेर महाधमनी और फेफड़े के वाल्व (AOV और पीवी) क्रमश: (नीले कोष्ठक) बी और सी में देखा जा सकता है। वेंट्रिकुलर केशिका जाल भी इन छोटे उप ढेर अनुमानों में स्पष्ट है; फेफड़े के वाल्व (छोटे से बॉक्स) के समीपस्थ रक्त वाहिकाओं पैनल सी (बड़े बॉक्स) के नीचे सही में बढ़े हुए दिखाया गया है। फिजी उड़ा / कमंद उपकरण प्रक्षेपण से पहले प्रत्येक Z टुकड़ा में मैन्युअल लाल रंग के साथ कोरोनरी धमनियों को भरने के लिए इस्तेमाल किया गया था, अलग-अलग रक्त वाहिकाओं, जैसे उजागर करने के लिए इस्तेमाल किया गया था पैनल डी के लिए। Imaris सॉफ्टवेयर धमनियों (लाल) और ई और एफ में महाधमनी लुमेन (हरा) के 3 डी चित्र बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया था; फिर से इस मैन्युअल रूप से किया गया था, प्रत्येक Z टुकड़ा में वस्तु की आकृति बनाने के लिए जादू की छड़ी उपकरण का उपयोग। आसपास के मात्रा की अस्पष्टता ई के रूप में, मिश्रण मोड में बदला जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, 3 डी छवि, निकाला जा सकता है के रूप में एफ में दिखाया गया है है। सभी छवियों ललाट विचार कर रहे हैं। एक = 100 माइक्रोन में स्केल बार। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. भ्रूण vasculature की इमेजिंग। पैनलों ए और ए 'शो एक E10.5 जंगली प्रकार भ्रूण विरोधी PECAM1 एंटीबॉडी के साथ दाग, 10X उद्देश्य (टाइलों स्कैन) का उपयोग कर एकत्र की confocal छवियों। औसत तीव्रता Z अनुमानों Z स्लाइस 11-65 120 जेड टुकड़ा स्कैन (4 माइक्रोन मोटी स्लाइस) (ए) और 66-110 (ए '), भ्रूण की मोटाई भर में प्रतिदीप्ति तीव्रता का केवल एक मामूली नुकसान दिखाने से उत्पन्न किया गया । पैनल बी एक E11.5 भ्रूण के intersomitic वाहिकाओं antibod के साथ दाग से पता चलता है PECAM1 (594 संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी से लाल सिग्नल) और Endomucin (EMCN, 488 संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी से हरी झंडी), के खिलाफ एँ जो intersomitic धमनियों (तीर) और नसों (नोक) क्रमश: एक टाइलों से (औसत तीव्रता Z प्रक्षेपण दाग स्कैन)। पैनल सी PECAM1 के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ दाग एक E11.5 जंगली प्रकार भ्रूण से intersomitic धमनियों (ISAS) (488 संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी से हरी झंडी) और SM22α (594 संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी से लाल सिग्नल) से पता चलता। Confocal छवियों 20X सूखी उद्देश्य का उपयोग कर एकत्र की है और अधिकतम तीव्रता Z अनुमानों उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया। सभी छवियों बाण विचार कर रहे हैं। ए और बी में स्केल सलाखों = 250 माइक्रोन, सी = 100 माइक्रोन में पैमाने पर पट्टी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 6 immunostained नमूने BABB में मंजूरी दे दी कम से कम दो महीने के लिए फ्लोरोसेंट संकेत को बनाये रखें। E11.5 भ्रूण PECAM1 एंटीबॉडी के साथ दाग और BABB के साथ मंजूरी दे दी थी; एक ही बैच से भ्रूण तुरंत या दो महीने के अंतराल के बाद imaged थे। पैनल एक भ्रूण के intersomitic धमनियों तुरंत imaged पता चलता है और पैनल बी भ्रूण दो महीने बाद imaged पता चलता है। Confocal छवियों 10X सूखी उद्देश्य का उपयोग कर एकत्र की है और अधिकतम तीव्रता Z अनुमानों उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया। डीएओ, पृष्ठीय महाधमनी। छवियाँ बाण के विचारों को दिखाने के। एक में स्केल सलाखों और बी = 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

पूरे भ्रूण दिलों में कोरोनरी वाहिकाओं विरोधी PECAM1 एंटीबॉडी ऑप्टिकल निकासी और confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा पीछा के साथ wholemount immunostaining द्वारा imaged थे। सरल विधि यहाँ BABB साथ भ्रूण माउस दिल की निकासी के लिए वर्णित है, ऑप्टिकल पैठ बढ़ जाती है और रक्त वाहिकाओं महाधमनी और वेंट्रिकुलर दीवारों में अनुवादित की उच्च संकल्प छवियों का कब्जा सक्षम बनाता है। ऐसे Vectashield (अपवर्तनांक 1.45) के रूप में ग्लिसरॉल आधारित बढ़ते अभिकर्मकों भी कोरोनरी वाहिका 22 तथापि BABB के उच्च अपवर्तनांक (1.56) अभी भी आगे प्रकाश बिखरने कम कर देता है, गहरी ऊतक प्रवेश को सक्षम करने की इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया गया है। ऊतक निकासी के इस तरह के multiphoton और प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी जो कम आसानी से शोधकर्ताओं के लिए उपलब्ध हो सकता है के रूप में माइक्रोस्कोपी के और अधिक जटिल, महंगी रूपों के लिए जरूरत obviates। समाशोधन प्रक्रिया अन्य तरीकों 6-9 करने के लिए और छोटे नमूने CA हो सकता है की तुलना में बहुत तेजी से हैसीधे माइक्रोस्कोपी पकवान पर अभिकर्मकों की छोटी मात्रा का उपयोग कर बाहर rried। वाहिका की मजबूत धुंधला आदेश उच्च गुणवत्ता के चित्र प्राप्त करने के लिए आवश्यक है; विरोधी PECAM1 एंटीबॉडी चयनित किया गया था के रूप में यह कोरोनरी ईसीएस और वाणिज्यिक एंटीबॉडी के एक नंबर के सभी प्रकार के निशान धुंधला की उपयुक्त उच्च स्तर देने के लिए पाए गए। इसके अलावा, फ्लोरोसेंट धुंधला BABB में अत्यंत स्थिर होने के लिए प्रकट होता है; BABB में कमरे के तापमान पर संग्रहित नमूने (प्रकाश से सुरक्षित) कई महीनों के लिए अपने फ्लोरोसेंट संकेत बनाए रखा। तथ्य यह है कि PECAM1 एंटीबॉडी कुशलता, साथ ही वाहिका कभी कभी समस्याग्रस्त था कोरोनरी अंतर्हृदकला लेबल खासकर जब peritruncal जाल की छवियों पर कब्जा। peritruncal ईसीएस की तुलना में महाधमनी लुमेन की मजबूत धुंधला छवियों के कुछ क्षेत्रों में अधिक संतृप्ति के एक जोखिम में हुई है, जिसका अर्थ है कि इमेजिंग मापदंडों के सावधान समायोजन आवश्यक था। आदर्श रूप में, एक एंटीबॉडी धुंधला केवल संवहनी ईसीएस इस्तेमाल किया जा सकता है; प्रयोग में,हालांकि, उपयुक्त एंटीबॉडी कि wholemount धुंधला की अपेक्षित स्तर उपज पाने के लिए मुश्किल हो सकता है। हाल ही में, फैटी एसिड बाध्यकारी प्रोटीन 4 (FABP4) कोरोनरी संवहनी ईसीएस 23 के एक मार्कर होना दिखाया गया है और इसलिए PECAM1 के लिए एक विकल्प का प्रतिनिधित्व कर सकते।

आदेश महाधमनी और दिल कक्षों नमूने फ्लैट पर चढ़कर नहीं थे की 3 डी आकृति विज्ञान बनाए रखने के लिए, लेकिन बजाय गिलास तली व्यंजन में imaged थे। नमूनों की गहराई imaged किया जा करने के लिए अपने छोटे से काम दूरी की वजह से, उच्च बढ़ाई उद्देश्यों के उपयोग रोका। हालांकि उच्च संकल्प छवियों अभी भी पिक्सेल ध्यान केन्द्रित करना समय बढ़ रही है और छवि पर कब्जा करने के लिए कम से कम 1024 x 1024 के एक पिक्सेल सरणी के आकार का उपयोग करके एक 10x उद्देश्य का उपयोग प्राप्त थे। इस संरचना और कोरोनरी वाहिकाओं के वितरण के विश्लेषण के लिए पर्याप्त था, लेकिन सेलुलर संरचना के महीन विश्लेषण नमूनों की फ्लैट बढ़ते आवश्यकता हो सकती है। बढ़ते के लिए दिल के अलग अलग हिस्सों के विच्छेदन,उदाहरण के लिए, निलय दीवारों, या महाधमनी, यह भी आवश्यक हो सकता है। वैकल्पिक रूप से, अधिक नमूना छवि deconvolution के द्वारा पीछा के आदेश संकल्प और संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिए किया जा सकता है; हालांकि यह काफी लंबे समय तक बार स्कैनिंग की आवश्यकता है और बहुत बड़ी छवि फ़ाइलों कि कंप्यूटिंग पर कार्रवाई करने के लिए बिजली की बहुत आवश्यकता है बनाता है।

E15.5 करने के लिए दिल को सफलतापूर्वक इस पद्धति का उपयोग imaged किया गया है, और यह भी पूरे भ्रूण की वाहिका (कम से कम E11.5 तक) का विश्लेषण करने के लिए एक ही प्रोटोकॉल का उपयोग संभव है। अन्य प्रकार की कोशिकाओं, जैसे, चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं को भी इस तकनीक का उपयोग हमारी प्रयोगशाला में imaged किया गया है। मोटा ऊतकों, जैसे, दिल E15.5 से अधिक पुराने के लिए, एंटीबॉडी पैठ एक सीमित कारक हो सकता है; अब incubations और / या बढ़ा डिटर्जेंट की आवश्यकता हो सकती है। इसके अलावा, जब छवियों की एक बड़ी Z ढेर इकट्ठा करने के संकेत के रूप लेज़रों ऊतक के दूर भागों घुसना ताकत को कम किया जा सकता है; हालांकि confOcal सेटिंग्स बढ़ती Z दूरी के साथ लेजर शक्ति बढ़ाने के लिए समायोजित किया जा सकता है।

इस विधि दोनों कोरोनरी वाहिनियों के गठन के शुरुआती दौर और बाद में विकास के चरणों में कोरोनरी धमनियों की patterning के confocal सूक्ष्म विश्लेषण की सुविधा। वितरण, शाखाओं में बंटी है और रक्त वाहिकाओं की संरचना के बारे में विस्तृत जानकारी कम समय में प्राप्त किया जा सकता है, इस angiogenesis रास्ते में विशिष्ट दोष के साथ आनुवंशिक माउस म्यूटेंट के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण बना रही है।

Acknowledgments

काम ब्रिटिश हार्ट Foundation'and राष्ट्रीय बाल एनएचएस फाउंडेशन ट्रस्ट और यूनिवर्सिटी कॉलेज लंदन के लिए ग्रेट ऑरमंड स्ट्रीट हॉस्पिटल में स्वास्थ्य अनुसंधान बायोमेडिकल रिसर्च सेंटर के लिए संस्थान द्वारा समर्थित द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS Life Technologies 14190-094
Forceps FST 11251-30
10 cm Petri dishes Falcon 351029
35 mm Petri dishes Sigma P5112
Stainless steel minutien pins 0.2 mm diameter FST 26002-20
Fine tip pastettes  Alpha Laboratories LW4061
1,000 ml pipette tips Sorenson 34000
48-well plate Falcon 353078
Kwik-Gard World Precision Instrument KWIKGARD Silicone elastomer Sylgard184 packaged in a cartridge for mixing and dispensing
Kwik-Gard refill World Precision Instrument KWIKGLUE Refill cartridges and dispensing tips
Paraformaldehyde Sigma P6148 Make up in PBS and store at -20 °C
100% methanol VWR 20847307
Tween®20 Sigma P1379
Goat serum Sigma G9023
Anti-PECAM1 antibody, rat anti-mouse BD Pharmingen 553370 Primary antibody, dilute 1 in 50
Anti-CD31 polyclonal, rabbit polyclonal Abcam ab28364 Primary antibody, dilute 1 in 50
Anti-CD31/PECAM1 clone 2H8, armenian hamster monoclonal Thermo Fisher Scientific MA3105 Primary antibody, dilute 1 in 400
Endomucin antibody (V.7C7), rat monoclonal Santa Cruz Biotechnology sc-65495 Primary antibody, dilute 1 in 50
Anti-SM22 alpha antibody, rabbit polyclonal Abcam ab14106 Primary antibody, dilute 1 in 250
Goat anti-rat IgG (H+L)Alexa Fluor 594 Thermo Fisher Scientific A11007 Secondary antibody, dilute 1 in 500
Goat anti-rabbit IgG (H+L)Alexa Fluor 594 Thermo Fisher Scientific Secondary antibody, dilute 1 in 500
Goat anti-Armenian Hamster IgG (H+L)Alexa Fluor 488 Abcam ab173003
Goat anti-rat IgG (H+L)Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A21208 Secondary antibody, dilute 1 in 500
Phenolic screw cap Wheaton 240408
Benzyl alcohol Sigma 402834
Benzyl benzoate Sigma B6630
Imaris Bitplane Imaging image analysis software
ImageJ software NIH Freeware

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक 118 कोरोनरी वाहिकाओं BABB PECAM1 भ्रूण दिल wholemount immunofluorescence ऑप्टिकल समाशोधन confocal माइक्रोस्कोपी
साफ भ्रूण दिल में कोरोनरी वाहिकाओं का विश्लेषण
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Ivins, S., Roberts, C., Vernay, B., Scambler, P. J. Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts. J. Vis. Exp. (118), e54800, doi:10.3791/54800 (2016).

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