Summary
Мы представляем протокол для анализа коронарных сосудов в целом эмбриональных мышиных сердец до E15.5, с использованием стандартных иммунологических методов окрашивания с последующим оптическим клиренса и конфокальной микроскопии. Этот метод позволяет визуализировать кровеносные сосуды на протяжении всего сердца, без необходимости трудоемкого анализа серийных срезах.
Introduction
Создание функционирующей коронарной сети имеет решающее значение для функции сердца и эмбрионального развития, а также анализ генетических мутантов мыши может дать ценную информацию о молекулярных сигналов, лежащих в основе этого процесса развития. Способность визуализировать эмбриональные коронарных сплетение в целом, а не представлены в серии гистологических срезов, имеет важное значение для облегчения анализа кучность сосудов в генетических мутантов, и позволяет избежать возможной потери информации, которая может возникнуть в результате механического разрезание ткани. Суда суждено сформировать артерии и капилляры локализованы глубоко внутри стенок обоих желудочков и аорты 1-3. Тем не менее, в то время как флуоресцентного мечения клеток в сочетании с лазерной сканирующей конфокальной микроскопии может обеспечить изображений с высоким разрешением Wholemount меченных поверхностных вен / лимфатическими сосудами 4,5, глубина изображения ограничена оптическим проникновением. Высокое разрешение изображения колпачкаПоэтому illaries и артерии на протяжении всей глубины сердца невозможно без какой-либо форме очистки ткани.
Плохое оптическое проникновение обусловлено высоким показателем преломления и множественной клеточной внеклеточного (например, коллагена и эластичных волокон) компонентов толстых тканей. Это рассеивает свет изображения, вызывая размытие и снижение контрастности. Клиринговые агенты, как правило, соответствуют высоким показателем преломления таких тканей, а это означает, что свет может проходить через образец беспрепятственное и проникают глубже в ткани. Перед очисткой, ткани, как правило, обезвоженной, как вода имеет относительно низкий показатель преломления. Множество новых методов клиринговых были разработаны в последнее время , тем не менее в зависимости от используемого метода, процесс удаления может занять несколько дней или недель , и может потребовать дорогостоящих реагентов 6-9. Бэбб (смесь 1: 2 бензилового спирта и бензилбензоата) является недорогим, обычно используемый осветлитель, который имеетПреимущество очистки образцов очень быстро. Бэбб на основе клиринга и обработки изображений методы были описаны ранее для неврологических образцов и различных органов 10-13. Здесь мы опишем надежный и простой метод для Бабб оформления иммуноокрашиванию образцов с последующим конфокальной микроскопии, с конкретной ссылкой на обследования кровеносных сосудов в мышиных сердцах из Е (эмбриональный день) 11,5 - 15,5. Однако, как также было продемонстрировано, методика может одинаково хорошо применяться для анализа целых эмбрионов, а также другие типы клеток, до тех пор, как высокие антитела качества к маркерам интерес доступны.
Protocol
Все исследования на животных было проведено в соответствии с ведомственным руководящим принципам по лицензии внутренних дел Великобритании.
1. Вскрытие и фиксирование эмбриональных сердец
- Эвтаназии задержанное беременной мыши на нужный день с помощью этически одобренного отбрасывания невидимых граней технику, например, CO 2 наркоза с последующим смещением шейных позвонков, и удалить эмбриональные мешочки 14, помещая их в 10 см чашке Петри заполнены фосфатным буферным раствором (PBS) ,
- Использование рассекает микроскопом и пинцетом, осторожно откройте мешочки матки и удаление каждого эмбриона, перерезав пуповину и удаление желтка.
- Для целей генотипирования, удалите эмбриональных хвост и место в 1,5 мл микроцентрифужных трубки для экстракции лизиса / ДНК позже.
- Для того, чтобы удалить сердце, гнездовым каждого эмбриона на его спине в PBS, заполненный силиконовым эластомером покрытием 35 мм чашки Петри, с использованием нержавеющей стали minutien штифтов. Использование тонких щипцов, CArefully открыть сундук и отделят большие сосуды, впереди сердца. Затем идущие позади сердца с пинцетом, возьмитесь сосуды позади сердца и потяните осторожно, чтобы удалить сердце; легкие могут уходить в то же время.
- Перенести сердце свежий 35 мм чашки Петри, содержащей PBS и использовать тонкий пинцет, чтобы обрезать ткань легкого, если это необходимо. Затем передать сердце в лунку 48-луночного планшета, заполненную холодным PBS.
- После сбора все сердца в 48-луночного планшета, аспирация PBS с остроконечного пластиковой пипетки Пастера и заменить 0,5 мл 4% параформальдегида (PFA).
ВНИМАНИЕ: PFA является известным аллергенными, канцерогенными и токсичны.- Fix E11.5 - 12.5 сердца в течение 15 мин, E13.5 сердца в течение 20 мин и E14.5 - 15.5 сердца в течение 30 мин в 4% PFA при комнатной температуре.
- Аспирируйте PFA с остроконечного пластиковой пипетки Пастера и полоскать сердца 2x в холодной PBS.
ПредостережениеION: PFA является опасным и должны быть утилизированы в соответствии с институциональными нормами. - Если сразу не используется для всей монтирования иммунное окрашивание (см раздел 2), обезвоживают сердца путем проведения последовательных 5 мин промывок в следующих растворах: 25% метанол / 75% PBS, 50% метанол / 50% PBS, 75% метанол / 25 % PBS.
ВНИМАНИЕ: Метанол является токсичным, носить перчатки. Храните сердца при -20 ° С в 100% метанола.
2. Всего горе Иммунологическое эмбриональных сердец с анти-PECAM1 антитела
Примечание: Анти-PECAM1 антитела работают хорошо для окрашивания коронарных сосудов (см шаг 2.4), но и любой пан-эндотелиальной маркер, который дает надежный сигнал будет лучшим выбором.
- При использовании сердца, которые были сохранены в 100% метаноле, передают в 1,5 мл микропробирок и регидратации путем проведения последовательных 5 мин промывок в следующих растворах: 75% метанол / 25% PBS, 50% метанол / 50% PBS и 25% метанол / 75% PBS. Проницаемыми сердца путем проведения 3 х 10 мин промывок в 0,5 - 1,0 мл PBST (PBS / 0,1% твин-20), вращая при комнатной температуре.
- Блок сердца путем вращения в течение 1 ч при комнатной температуре в 1,0 мл 10% сыворотки козьего в PBST.
- Удалите блокирующий буфер с помощью остроконечного пластиковой пипетки Пастера или 1000 мкл кончика пипетки и заменить 400 - 500 мкл свежей блок, содержащий первичное антитело анти-PECAM1 разбавленный 1:50. Поворот пробирки в течение ночи при температуре 4 ° С.
- На следующий день, аспирация блок / первичное антитело с помощью остроконечного пластиковой пипетки Пастера или 1000 мкл кончика пипетки и проводить по крайней мере 6 раз 1 час промывок в 1,0 мл PBST, вращая пробирки при комнатной температуре.
- Заменить последний промывочный свежей блокирующем буфере, содержащем Флуорофор-конъюгированные вторичные антитела, разбавленного 1: 500, и инкубировать в течение ночи при 4 ° С, при вращении. Защита от света, обернув пробирки в фольгу.
- На следующий день, аспирация блок / секричных антител с помощью остроконечного пластиковой пипетки Пастера и проводить по крайней мере 6 раз 1 час промывок в 1,0 мл PBST, вращая пробирки при комнатной температуре.
- Хранить сердца при температуре 4 ° С (защищенном от света месте), пока это необходимо.
3. Подготовка Очистка растворов и микроскопии Посуда
Примечание: при визуализации сердца в Бэбб жизненно важно, чтобы ни один из раствора Бэбб не входит в контакт с компонентами микроскопа. Для этого следующий протокол содержит инструкции для приготовления силиконового эластомера запечатанных посуду, пригодные для флуоресцентной микроскопии, которые могут быть подготовлены заранее. Силиконового эластомера обеспечивает барьер, чтобы он содержал Бэбб и предотвратить его потенциально просачивается между стеклянным дном и поликарбонатных сторонах тарелки.
- Для получения силиконового эластомера покрытием блюда, принимают оптические стеклянным дном блюда культуры и поместите колпачок с 4 мл флакон с завинчивающейся крышкой (приблизительно 1,5 см в диаметре) В центре каждого блюда.
Примечание: Это сформирует скважину для образца, когда эластомер наносят на блюдо. - Наполните посуду с силиконового эластомера на глубину приблизительно 0,5 см, с помощью аппликатора картриджа, чтобы смешать два компонента, как они применяются, в соответствии с инструкциями производителя. Оставьте, чтобы вылечить в течение по крайней мере 24 часов, убедившись в том, что флакон крышкой остается в центре каждого блюда.
Примечание: Используйте защитные очки, чтобы избежать случайного контакта силиконового эластомера с глазами. - После отверждения эластомера, удалите флакон крышкой из каждой тарелки, то это оставит центральную скважину, где образец будет изображенную могут быть размещены в непосредственном контакте со стеклянным дном тарелки.
Примечание: после отверждения эластомер должен быть твердым и сухим на ощупь. - Приготовьте раствор Бабб (1 часть бензилового спирта на 2 части бензилбензоата). Это следует хранить в стеклянной бутылке и защищенном от света месте.
ВНИМАНИЕ: BABB является токсичным, коррозионные раствор. Обращаться в вытяжном шкафу в то время как носить соответствующую защитную одежду. - Смешайте Бэбб и метанол, чтобы сделать 50:50 раствор (1 - 5 мл) в стеклянный флакон. Защита от света, например, путем обертывания флакон в фольгу.
4. Обезвоживание, Клиринг и Монтажное червей для конфокальной микроскопией
Примечание: Большие образцы могут быть очищены в 4 мл стеклянные флаконы, однако для небольших образцов (например, сердца до E13.5) лучше проводить процесс удаления непосредственно в микроскопии блюдо. Это помогает предотвратить "потерять" образцы как сердца становятся очень прозрачным, как только очищается. Для этих небольших образцов очистка происходит очень быстро, происходит в течение нескольких минут.
Примечание: Защитите образцы от света во всех следующих шагов обертывания / покрытия труб и посуду фольгой.
- Перед очисткой, дегидратировани иммуноокрашиванию-сердца через ряд метанола путем вращения сердца при комнатной Температура в 1,5 мл микроцентрифужных трубки в последовательных изменений из следующих растворов: 25% метанол / 75% PBS, 50% метанол / 50% PBS и 75% метанола / 25% PBS (5 мин в каждом). И, наконец, поворот на 3 х 5 мин в 100% метанола.
- Для сердца до E13.5, место в центре микроскопии блюдо; под микроскопом обеспечить сердце ориентируют его спинной стороной вверх. Удалите из метанола вокруг сердца с помощью остроконечного пластиковые пипетки Пастера.
- Используя чистую остроконечный пластиковую пипетку Пастера, добавьте Бабб: метанол 50:50 раствор в достаточном объеме, чтобы погрузить сердце (приблизительно 300 - 400 мкл). Как сердца иногда может перевернуться в растворе, проверьте ориентацию снова в то время как сердца все еще непрозрачны. Оставьте в растворе в течение 5 мин.
- Удалите 50:50 раствор в бутылке из стекла отходов в вытяжном шкафу и заменить Бабб, снова используя остроконечный пластиковые пипетки Пастера.
Примечание: Большой объем не требуется; добавить Suffциент так, что сердце сидит в капле раствора. Сердце должно очистить в течение 5 мин. - Для больших сердец, очистить образцы в стеклянных флаконах.
Примечание: E15.5 сердце должно очистить в течение 30 мин-1 час, но может быть оставлена на ночь при необходимости. - После того как образец ясно, удалить раствор и заменить с минимальным объемом Бабб. Необязательно, крышка образца с покровным, чтобы помочь сохранить его на месте, однако это не является абсолютно необходимым. Используйте сердце для работы с изображениями.
5. Очищенные визуализации сердца конфокальной микроскопией
Примечание: Изображения были захвачены на перевернутой конфокальной микроскопии с использованием 10X или 20X сухих целей. Несмотря на то, что можно использовать посуду на вертикальном конфокальной, особую осторожность следует соблюдать осторожность во избежание контакта с целью решения Бабб.
- Сбор Z-сканирование сердца 15. В зависимости от размера сердца, кафеля сканирования может потребоваться изображение , все сердце 16.
ВНИМАНИЕ: Бабб является коррозионное раствор, носить чистые перчатки и убедитесь , что за пределами микроскопии блюдо свободна от Бабб. Соблюдайте осторожность при обращении блюдо и держать крышку на блюдо, чтобы свести к минимуму риск случайной утечки на микроскоп. - Если цель рабочее расстояние позволяет, использовать большее увеличение для достижения фотографий регионов, представляющих интерес более высокого разрешения.
6. Анализ данных с помощью программного обеспечения Фиджи
- Откройте стек г изображений на Фиджи 17.
- Для того, чтобы аз проекцию всего стека или его части, нажмите на изображение и выберите стек, а затем Z проекта. Введите запуска и остановки номера ломтик, и выбрать тип проекции г, например, средней интенсивности, максимальной интенсивности.
- Для выделения отдельных судов в пределах стека срезов изображения используйте инструмент Blow (из меню плагинов выберите Сегментация, а затем Blow / Лассо) и нажмите на участках изображения для заполнения еач срез. С помощью команды Fill (нажмите на Edit, затем выберите Fill), чтобы заполнить выбранные области с цветом переднего плана выбора (нажмите на Edit, затем выберите Функции, а затем с помощью цвета переднего и заднего плана).
- Z проект изображение стека, как и раньше.
7. 3D Surface Volume Rendering коронарных артерий, генерируемой с использованием Imaris
- Нажмите на иконку превзойдет просмотра в верхней части экрана и перетащить файл изображения в окне данных. Нажмите на иконку View 3D в верхней части экрана.
- Выберите значок поверхности (синий значок), а затем нажмите на вкладку Create. Нажмите в диалоговом окне "Пропустить автоматическое создание, редактирование вручную" и нажмите на иконку Draw (тонкий значок карандаша).
- Выберите вкладку контур, а затем вкладку Режим. В режиме, нажмите на палочку волшебную или изолиний иконки. Выберите режим указателя при выборе указателя на правой стороне экрана, нажав рядом с "Выбрать", а затем нажмите на кнопку 'Draw9; коробка (в левом нижнем углу экрана).
- Используйте изолинии или волшебной палочки инструмент для выбора контуров артерий в последовательных срезах. Переход от среза нарезать с помощью ползунка Кусочек Position.
- Когда выбраны все контуры, нажмите на поле Создать поверхность. Окружающий объем можно сделать невидимыми, или сделать более или менее непрозрачным, используя режим наложения; нажмите на томе, чтобы выделить его, а затем выберите вкладку Параметры, а затем на вкладке Mode. Выберите Blend, и использовать ползунок, чтобы изменить непрозрачность.
- Захват изображений с помощью функции Snapshot.
Representative Results
По мере развития сердца, желудочковый миокард захвачена эндотелиальных клеток (ЭКС) из различных источников, и сосудистых сплетений образуется. Сосуды , которые развиваются в миокарде будет продолжаться , чтобы сформировать капиллярные и артериальные сети , доставляющие кислородом крови к сердечной ткани 18. В то же время (около E11.5) коронарный вытекающей начинают развиваться независимо друг от друга из отдельной капиллярной сети (известный как peritruncal сплетение) , который окружает просвет аорты 14,19,20. Peritruncal сплетение КЭ первоначально образуют несколько соединений с просветом аорты на уровне синусов клапанов, однако в конечном счете , только одно судно будет сохраняться на каждой стороне аорты, происходит с образованием корней левой и правой коронарной артерии 21. Из около E13.5 peritruncal и желудочков миокарда сосудов присоединиться к образуют взаимосвязанную сеть, позволяя приток крови от аорта в коронарных сосудах 14,22. Окрашивание КЭ с анти-РЕСАМ-1 антитела, в сочетании с Бабб клиренса неповрежденных сердца, позволяет анализировать развивающихся коронарных сетей с самых ранних этапах. На более поздних стадиях развития структурирование назревающих коронарных артерий также могут быть рассмотрены. Этот метод также может быть использован для окрашивания сосудистую сеть целых эмбрионов (до E11.5 , по крайней мере), а также с различными антителами, например, анти-альфа - актин гладких мышц (Sm22α) и Endomucin.
На рисунке 1 показана максимальная интенсивность Z-проекции с E11.5 сердца , генерируемого с использованием программного обеспечения Фиджи. Функция Плитка использовалась для сбора нескольких частичных изображений сердца и сшить их вместе в целостный образ; это полезно, чтобы дать общее представление о окрашивания во всем образце. На этом этапе PECAM1 антитела преимущественно окрашивает эндокарда оболочки сердца и оттока Vessels, однако некоторые из них КЭ могут также наблюдаться в стенки левого желудочка (коробочного область на рисунке 1А, показан в увеличенном в 1А '). Кроме того, peritruncal сплетение можно ясно наблюдать в стенке сливного тракта (OT) ( в штучной упаковке область на рисунке 1В). В последнем случае, сокращение числа срезов в Z-стек , используемый для создания проекции улучшена четкость изображения, что позволяет соединения с просветом аорты визуализироваться более отчетливо (рис 1В '). На рисунке 2, повышенная сосудистая сеть проксимально по отношению к аорте можно наблюдать в E12.5 сердце. На рисунке 3 показана peritruncal сплетение в качестве E12.5 сердца. 12-срезовый г проекция на фигуре 3А показывает весь сплетение, однако , как некоторые суда локализованы вентрально в просвет аорты (который также сильно загрязнена анти-PECAM1 антитела), расщепление Z-стек яNto ряд вспомогательных стеки (фигура 3В-D) , обеспечивает более визуальную информацию. Например, к югу от стека проецируется на фигуре 3В показан peritruncal сосуд , который соединяется с вентральной просвет аорты, которая не видна в полной проекции. На рисунке 4 показана часть E15.5 сердца; коронарные артерии четко видны на этой стадии (рис 4A, выступ 30-срез). В г проекций 5-срезов , показанных на рисунках 4В и С аортальный и легочные клапаны также могут быть визуализированы с помощью PECAM1 окрашивания; ветви и взаимосвязи коронарного капиллярной сети также яснее в этих небольших выступов суб-стека. Ручные методы сегментации были использованы для выделения коронарных артерий с помощью Фиджи (рис 4D) или Imaris (рис 4D и E). 3D объем поверхности визуализации коронарных артерий / Просвет аорты генерируется USing Imaris можно рассматривать с или без окружающей сосудистую систему (рис 4E и F).
Сосудистая целых эмбрионов также можно исследовать с помощью PECAM1 окрашивания / Бабб зазор. Рисунок 4A и А ', показывают Z проекции , полученные от суб-стеков с правой стороны (г срезы 11 - 65) и левую сторону (г ломтиков 66-110) эмбриона соответственно. Сравнение двух изображений показывает, что интенсивность флуоресцентного сигнала существенно не снижается с более глубокого проникновения в ткань. На рисунке 4В, PECAM1 (красный сигнал) и Endomucin (зеленый сигнал) антитела были объединены для обозначения intersomitic артерии (МСА) и вены , соответственно, из E11.5 эмбриона. Рисунок 4C показывает SM22α (красный сигнал) и PECAM1 окрашивания (зеленый сигнал) ИСАС в качестве E11.5 эмбриона. На рисунке 6, E11.5 эмбрионовокрашивали PECAM 1 были обследованы сразу после того, как Бабб зазор (рис 4А), или после перерыва продолжительностью около двух месяцев (рис 4б). Флуоресцентный сигнал был все еще достаточно сильна, чтобы успешно изображению после длительного хранения образца в Бэбб.
Рисунок 1. Иммунологическое из E11.5 Сердце с Anti-PECAM1 антитела (Обнаружен с анти-крысиным IgG , конъюгированного с Alexa 594). (A, B) размером 2 х 2 плиточный изображение было собрано с использованием цели 10X перевернутой конфокальной микроскопии. пятна антител PECAM1 как эндокардиальные и сосудистая. Écs Проекции (максимальная интенсивность) генерировали из 22 (а) и 5 (В) г ломтиков каждый толщиной 4 мкм, с помощью программного обеспечения Фиджи. А 'и В' enlargemenTS боксового областей в А и В соответственно. Стрелки в 'указывают на кровеносные сосуды в стенке желудочка сердца; в B ', скобка указывает на peritruncal сплетение. OT, пути оттока; LV, левый желудочек, правый желудочек RV. Все изображения являются фронтальным видом. Шкала баров в А и В = 200 мкм; масштабные линейки в A 'и B' = 100 мкм. Группа 1В 'была заимствована из Айвинс и др., 2015 19. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Иммунологическое из E12.5 Сердце с анти-PECAM1 антитела. Группа показывает проекцию аз (максимальная интенсивность) 2х2 плиточный сканирования. Коробочная области в показан enlargред в A '; Стрелки указывают несколько кровеносных сосудов проксимальнее аорты (Ао). LV, левый желудочек, правый желудочек RV. Все изображения являются фронтальным видом. Шкала бар A = 200 мкм; Шкалы в А '= 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Визуализация Peritruncal сплетении в E12.5 сердце. были собраны конфокальной образы в E12.5 аорты (Ао) окрашивали анти-PECAM1 антител с использованием цели 10X. Г проекция (максимальная интенсивность) в A был сформирован из 12 г ломтиков (толщиной 4 мкм); Стрелки указывают peritruncal сплетение сосудов. BD 12 г ломтиков были разделены на три подгруппы стеки как указано , и используется для создания отдельного projectiдополнения; Наконечники указывают на связи, сформированные peritruncal сплетение в просвет аорты. Peritruncal сосуды локализованы вентрально в просвет аорты видны в В и С. Все изображения являются фронтальным видом. Шкала бар = 50 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. коронарными артериями и капиллярного сплетения в E15.5 сердце. были собраны конфокальной образы в E15.5 сердце окрашивали анти-PECAM1 антител с использованием цели 10X. Панель А показывает максимальную проекцию интенсивности г генерируемый от 30 г ломтиков (толщиной 4 мкм); Стрелки указывают на левую и правую коронарные артерии (LCA и RCA), которые можно увидеть подключения к аорте (Ао). Использование дифферет 5 г ломтик суб-стеки аортальный и легочные клапаны (АОВ и PV) можно видеть в В и С соответственно (синие скобки). Желудочков капиллярное сплетение также яснее в этих небольших выступов суб-стека; кровеносные сосуды проксимальнее клапана легочной артерии (небольшой коробке) показаны увеличены в правом нижнем углу панели С (большая коробка). Фиджи использовали для выделения отдельных кровеносных сосудов, например, для панели D Удар / лассо был использован для заполнения коронарных артерий с красным цветом вручную в каждом срезе г до проекции. Программное обеспечение Imaris было использовано для создания 3D изображения артерий (красный) и просвет аорты (зеленый) в Е и F; опять же это было сделано вручную, с помощью волшебной палочки инструмент для создания объекта контуры в каждом срезе г. Непрозрачность окружающего объема может быть изменен в режиме смешивания, как и в Е. В качестве альтернативы, 3D - изображение может быть извлечен, как показано на F желудочек. Все изображения являются фронтальным видом. Шкала бар A = 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. Визуализация Эмбриональные васкулатура. Панели А и показывают конфокальной изображения А 'с E10.5 дикого типа эмбрионов , окрашенных с анти-PECAM1 антитела, собранные с использованием цели 10X (плиточный сканирования). Средняя интенсивность г проекции были получены от г ломтиков 11-65 (А) и 66-110 (А ') ломтиком сканирования 120 г (4 мкм срезы толщиной), показывая лишь незначительную потерю интенсивности флуоресценции по толщине зародыша , Панель В показывает intersomitic сосуды с E11.5 эмбрионов , окрашенных antibod х годов против PECAM1 (красный сигнал с 594-конъюгированного вторичного антитела) и Endomucin (EMCN, зеленый сигнал с 488-конъюгированного вторичного антитела), которые пачкают intersomitic артерии (стрелка) и вены (стрелочка) соответственно (средняя проекция интенсивности г из кафельной сканирование). Панель C показывает intersomitic артерии (МСА) из E11.5 дикого типа эмбриона , окрашенном антителами против PECAM1 (зеленый сигнал с 488-конъюгированного вторичного антитела) и SM22α (красный сигнал с 594-конъюгированного вторичного антитела). Конфокальные изображения были собраны с использованием 20X сухой цели и используется для создания максимальной проекции интенсивности Z. Все изображения сагиттальной просмотров. Шкала баров в А и В = 250 мкм, масштаб бар в C = 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
d / 54800 / 54800fig6.jpg "/>
Рисунок 6. иммуноокрашиванию Образцы Очищенные в Бабб Сохранил флуоресцентный сигнал в течение не менее двух месяцев. E11.5 эмбрионы окрашивали антителами PECAM1 и очистил с Бабб; Эмбрионы из той же партии были обследованы сразу или после перерыва два месяца. Панель А показывает intersomitic артерии эмбриона вошедшие в образ сразу и панель В показывает эмбрион отображены через два месяца. Конфокальные изображения были собраны с использованием 10X сухой цели и используется для создания максимальной проекции интенсивности Z. DAO, спинная аорта. Изображения показывают сагиттальные взгляды. Шкала баров в А и В = 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Discussion
Коронарные сосуды в целом эмбрионального сердца были обследованы с помощью Wholemount иммунным окрашиванием с анти-PECAM1 антителом с последующим оптическим клиренса и конфокальной микроскопии. Простой метод, описанный здесь, для оформления эмбриональных сердца мыши с Бабб, увеличивает оптическое проникновение и обеспечивает захват изображений с высоким разрешением кровеносных сосудов, локализованных в аорте и желудочковой стенки. Глицерин на основе монтажа реагенты , такие как Vectashield (показатель преломления 1,45) также были использованы для визуализации коронарных сосудов 22 , однако, чем выше показатель преломления Бэбб (1,56) уменьшает рассеивание света еще дальше, позволяя проникновение более глубокие ткани. Тканевая оформление устраняет необходимость в более сложных, дорогостоящих форм микроскопии, таких как многофотонной и световой микроскопии листа, который может быть менее доступными для исследователей. Процесс клиринга очень быстро по сравнению с другими методами 6-9 и для малых выборок может быть чаrried с использованием небольших объемов реагентов непосредственно на микроскопии блюдо. Прочные окрашивание сосудистую требуется для того, чтобы достичь высокого качества изображения; анти-PECAM1 антитело было выбрано, как это отмечает все виды коронарного КЧС и ряда коммерческих антител были найдены, чтобы дать соответствующим образом высокие уровни окрашивания. Кроме того, флуоресцентный окрашивание по-видимому, чрезвычайно устойчивым в Бэбб; Образцы хранили при комнатной температуре в Бабб (защищенном от света месте) сохранили свой флуоресцентный сигнал в течение нескольких месяцев. Тот факт, что PECAM1 антитело эффективно маркирует коронарную эндокарда, а также сосудистую сеть от времени проблематично, особенно при съемке изображений peritruncal сплетении. Сильнее окрашивание просвет аорты по сравнению с peritruncal КЧС привело к риску чрезмерного насыщения в некоторых областях изображений, а это означает, что требуется тщательной корректировки параметров изображения. В идеале, окрашивание антитела сосудистая будет использоваться только КЭ; на практике,однако, поиск подходящих антител, которые дают необходимый уровень Wholemount окрашивания может быть затруднено. В последнее время , жирные кислоты , белок , связывающий 4 (FABP4) было показано, является маркером коронарного сосудистого КЭ 23 и , следовательно , может представлять собой альтернативу PECAM1.
Для того, чтобы сохранить 3D морфологии аорты и камер сердца образцы не были плоскими монтажа, но вместо этого были отображены в стеклянном дном посуды. Глубина образцов быть отображены не позволяют использовать высокие цели увеличения, из-за своих коротких рабочих расстояниях. Однако изображения с высоким разрешением по-прежнему достижимы с использованием объектива 10х за счет увеличения времени задержки пикселя и используя размер массива пикселей по меньшей мере 1,024 х 1,024 для захвата изображения. Этого было достаточно для анализа структуры и распределения коронарных сосудов, однако тоньше анализ клеточной структуры может потребовать плоским монтаж образцов. Вскрытие отдельных частей сердца для монтажа,например, стенок желудочков, или аорта, также могут быть необходимы. В качестве альтернативы, передискретизации изображения с последующим деконволюции может быть осуществлено с целью увеличения разрешения и чувствительности; это, однако, значительно больше требует времени сканирования и создает очень большие файлы изображений, которые требуют много вычислительной мощности для обработки.
Сердца до E15.5 были успешно визуализируют с помощью этого метода, а также можно анализировать сосудистую целых эмбрионов (по крайней мере до E11.5), используя тот же протокол. Другие типы клеток, например, клетки гладких мышц также были отображены в нашей лаборатории , используя эту технику. Для более толстых тканей, например, сердца старше E15.5, проникновение антител может быть ограничивающим фактором; больше инкубацию и / или увеличение моющего средства может потребоваться. Кроме того, при сборе большого г стопка изображений сила сигнала может быть уменьшена, поскольку лазеры проникают дальние участки ткани; однако конфÖçal параметры могут быть скорректированы, чтобы увеличить мощность лазера с увеличением расстояния г.
Этот метод облегчает конфокальной микроскопический анализ как на ранних стадиях формирования коронарных сосудов и кучность коронарных артерий на более поздних стадиях развития. Более подробная информация о распределении, разветвленности и структуры кровеносных сосудов могут быть приобретены в течение короткого времени, что делает это ценным инструментом для изучения генетических мутантов мышей с определенными дефектами ангиогенеза путей.
Acknowledgments
Работа выполнена при финансовой поддержке British Heart Foundation'and при поддержке Национального института по исследованиям в области здравоохранения научно-исследовательского центра биомедицинской в Большом госпитале Ормонд-стрит для детей NHS Foundation Trust и Университетского колледжа Лондона.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Life Technologies | 14190-094 | |
| Forceps | FST | 11251-30 | |
| 10 cm Petri dishes | Falcon | 351029 | |
| 35 mm Petri dishes | Sigma | P5112 | |
| Stainless steel minutien pins 0.2 mm diameter | FST | 26002-20 | |
| Fine tip pastettes | Alpha Laboratories | LW4061 | |
| 1,000 ml pipette tips | Sorenson | 34000 | |
| 48-well plate | Falcon | 353078 | |
| Kwik-Gard | World Precision Instrument | KWIKGARD | Silicone elastomer Sylgard184 packaged in a cartridge for mixing and dispensing |
| Kwik-Gard refill | World Precision Instrument | KWIKGLUE | Refill cartridges and dispensing tips |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Make up in PBS and store at -20 °C |
| 100% methanol | VWR | 20847307 | |
| Tween®20 | Sigma | P1379 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Anti-PECAM1 antibody, rat anti-mouse | BD Pharmingen | 553370 | Primary antibody, dilute 1 in 50 |
| Anti-CD31 polyclonal, rabbit polyclonal | Abcam | ab28364 | Primary antibody, dilute 1 in 50 |
| Anti-CD31/PECAM1 clone 2H8, armenian hamster monoclonal | Thermo Fisher Scientific | MA3105 | Primary antibody, dilute 1 in 400 |
| Endomucin antibody (V.7C7), rat monoclonal | Santa Cruz Biotechnology | sc-65495 | Primary antibody, dilute 1 in 50 |
| Anti-SM22 alpha antibody, rabbit polyclonal | Abcam | ab14106 | Primary antibody, dilute 1 in 250 |
| Goat anti-rat IgG (H+L)Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A11007 | Secondary antibody, dilute 1 in 500 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L)Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | Secondary antibody, dilute 1 in 500 | |
| Goat anti-Armenian Hamster IgG (H+L)Alexa Fluor 488 | Abcam | ab173003 | |
| Goat anti-rat IgG (H+L)Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21208 | Secondary antibody, dilute 1 in 500 |
| Phenolic screw cap | Wheaton | 240408 | |
| Benzyl alcohol | Sigma | 402834 | |
| Benzyl benzoate | Sigma | B6630 | |
| Imaris | Bitplane Imaging | image analysis software | |
| ImageJ software | NIH | Freeware |
References
- Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).
- Tian, X., et al. Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries. Cell Res. 23 (9), 1075-1090 (2013).
- Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).
- Klotz, L., et al. Cardiac lymphatics are heterogeneous in origin and respond to injury. Nature. 522 (7554), 62-67 (2015).
- Nam, J., et al. Coronary veins determine the pattern of sympathetic innervation in the developing heart. Development. 140 (7), 1475-1485 (2013).
- Zhu, D., Larin, K. V., Luo, Q., Tuchin, V. V. Recent progress in tissue optical clearing. Laser Photon. Rev. 7 (5), 732-757 (2013).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat. Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat. Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat. Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Zucker, R. M., Hunter, E. S., Rogers, J. M. Confocal laser scanning microscopy of morphology and apoptosis in organogenesis-stage mouse embryos. Methods Mol. Biol. 135, 191-202 (2000).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat. Protoc. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Erturk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. J. Vis.Exp : JoVE. (89), (2014).
- Dyer, L. A., Wu, Y., Patterson, C. Protein isolation from the developing embryonic mouse heart valve region. J. Vis.Exp s : JoVE. (91), e51911 (2014).
- Wilsbacher, L. D., Coughlin, S. R. Analysis of cardiomyocyte development using immunofluorescence in embryonic mouse heart. J. Vis.Exp : JoVE. (97), (2015).
- StitchArt Guide for Zen 2010. , Zeiss. Available from: http://www.google.co.uk/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&ved=0ahUKEwjC6OPVnO7NAhVD7RQKHQzqALkQFggcMAA&url=ftp%3A%2F%2Fftp.sonic.net%2Fpub%2Fusers%2Flhund%2FMMP%2FBlurWin2012%2FHelpful Docs%2FTiling_and_Stitching in Zen.pdf&usg=AFQjCNH4C6dv8bdmKC651sp_CFz4C1Rq3g (2010).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Tian, X., Pu, W. T., Zhou, B. Cellular origin and developmental program of coronary angiogenesis. Circ. Res. 116 (3), 515-530 (2015).
- Ivins, S., et al. The CXCL12/CXCR4 Axis Plays a Critical Role in Coronary Artery Development. Dev. Cell. 33 (4), 455-468 (2015).
- Theveniau-Ruissy, M., et al. Coronary stem development in wild-type and Tbx1 null mouse hearts. Dev. Dyn : an official publication of the American Association of Anatomists. 245 (4), 445-459 (2016).
- Tomanek, R. J. Formation of the coronary vasculature during development. Angiogenesis. 8 (3), 273-284 (2005).
- Chen, H. I., et al. VEGF-C and aortic cardiomyocytes guide coronary artery stem development. J. Clin.Iinvest. 124 (11), 4899-4914 (2014).
- Tian, X., et al. Vessel formation. De novo formation of a distinct coronary vascular population in neonatal heart. Science. 345 (6192), 90-94 (2014).
