Summary
我々は、光のクリアランス、共焦点顕微鏡に続く標準的な免疫学的染色法を用いて、E15.5までの全胚マウス心臓における冠血管の分析のためのプロトコルを提示します。この技術は、連続切片の時間のかかる分析を必要とすることなく、心臓全体にわたって血管の可視化を可能にします。
Introduction
機能冠状動脈のネットワークを確立することは、心機能および胚発生に重要である、と遺伝的マウス変異体の分析は、この発達過程の根底にある分子信号に貴重な洞察を提供することができます。組織切片のシリーズで提示するのではなく、全体としての胚性冠状動脈神経叢を視覚化する能力は、遺伝的変異体では、血管パターニングの分析を容易にするために不可欠であり、機械の結果として発生する可能性があり、情報の潜在的な損失を回避組織のスライス。動脈と毛細血管を形成するために運命船舶は、心室と大動脈1-3の両方の壁内の深い局在しています。しかし、ホールマウント標識表在静脈/リンパ管4,5の高解像度画像を提供することができるレーザ走査型共焦点顕微鏡検査と組み合わせた細胞の蛍光標識一方、撮像の深さは、光の浸透によって制限されます。キャップの高分解能イメージング心の全体の深さを通してillariesと動脈は組織のクリアリングのいくつかのフォームなしではできませんので。
悪いの光の浸透は、複数の細胞および細胞外（ 例えば、コラーゲンと弾性繊維）の高屈折率の厚さの組織の構成要素によって引き起こされます。これにより、撮像光を散乱ぶれせ、コントラストを減少させました。クリア剤は、典型的には、光が遮られていないサンプルを通過し、組織内に深く浸透することができることを意味し、そのような組織の高い屈折率を一致させます。水は比較的低い屈折率を有するようにクリアする前に、組織は、一般的に脱水されます。新しい決済方法の過多は、しかし、使用される技術に応じて、最近開発された、クリア処理は、数日または数週間を取ることができ、高価な試薬6-9を必要とするかもしれません。 BABB（1：ベンジルアルコールおよび安息香酸ベンジルの2混合物）を持っている安価な、一般的に使用されるクリアリング剤であります非常に迅速にサンプルをクリアすることの利点。 BABBベースの清算およびイメージング技術は、神経学的サンプルと様々な器官10-13のために以前に記載されています。 15.5 - ここでは、E（日胚）11.5からネズミの心臓の血管の検査を特に参照して、共焦点顕微鏡に続いて免疫染色したサンプルのBABBクリアランスのための堅牢かつ簡単な方法を説明します。また実証されているようしかし、この技術は、等しく良好であれば、目的のマーカーのような高品質の抗体が利用可能であり、全体の胚の分析、ならびに他の細胞型に適用することができます。
Protocol
すべての動物実験は、英国内務省からのライセンスの下で施設のガイドラインに準じて行きました。
1.解剖および胚ハーツの固定
- 倫理的に承認されたカリング技術、頸椎脱臼に続いて、例えば、CO 2ナルコーシス、およびリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で満たされた10センチメートルペトリ皿に置く、胚嚢14を削除を使用して、必要な日に時限妊娠マウスを安楽死させます。
- 解剖顕微鏡や鉗子を使用して、慎重に臍帯を切断し、卵黄嚢の除去、子宮嚢を開き、各胚を削除します。
- ジェノタイピングのために、後に溶解/ DNA抽出1.5 mlのマイクロ遠心チューブに胚の尾と場所を削除します。
- ステンレス鋼minutienピンを使用して、PBSで満たされたシリコーンエラストマーでコーティングされた35ミリメートルペトリ皿中のその背中に各胚を、心を取り除く固定するためです。 、CAの細かい鉗子を使用してrefully胸を開き、大血管を切断、心に前方。その後、ピンセットで心臓の後ろに達し、心臓の背後にある血管を把握し、心を取り除くためにそっと引き出します。肺も同時に離れて来るかもしれません。
- PBSを含む新鮮な35ミリメートルのペトリ皿に心を移し、必要に応じて、肺組織を切り取るために細かい鉗子を使用しています。その後、冷PBSで満たされた48ウェルプレートのウェルに心を移します。
- 48ウェルプレート内のすべての心を収集した後、先の細いプラスチックパスツールピペットでPBSを吸引し、0.5ミリリットルの4％パラホルムアルデヒド（PFA）と交換してください。
注意：PFAは、アレルギー性の発癌性、および毒性があることが知られています。- 修正E11.5 - 室温で4％PFAで30分間15.5心、 - 20分とE14.5 12.5 15分間の心、E13.5の心。
- 先の細いプラスチック製パスツールピペットでPFAを吸引し、心の2倍の冷PBSでリンス。
CAUTION：PFAが危険であると制度の規制に従って、廃棄する必要があります。 - 25％メタノール/ 75％PBS、50％メタノール/ 50％PBS、75％メタノール/ 25：全体のマウント免疫染色のために直ちに使用しない場合は、以下の溶液に連続した5分間の洗浄を行うことで心を脱水、（セクション2を参照） ％PBS。
注意：メタノールは毒性があり、手袋を着用してください。 100％メタノール中で-20℃で心を保管してください。
抗PECAM1抗体による胚ハーツの2ホールマウント免疫染色
注：抗PECAM1抗体は冠状血管を染色するために働くが、適切であろう強いシグナルを与える任意の汎内皮マーカー（ステップ2.4を参照してください）。
- 100％メタノールに記憶されている心を使用している場合は、1.5ミリリットルのマイクロチューブに移し、以下のソリューションでの連続した5分間の洗浄を行うことにより再水和：75パーセントをメタノール/ 25％PBS、50％メタノール/ 50％PBSおよび25％メタノール/ 75％PBS。 室温で回転し、1.0ミリリットルPBST（PBS / 0.1％のTween-20） - 0.5で3×10分間の洗浄を行うことで心を透過性。
- PBSTで1.0ミリリットルの10％ヤギ血清で、室温で1時間回転させることによって、心をブロックします。
- 先の細いプラスチックパスツールピペットまたは千μlのピペットチップでブロッキング緩衝液を除去し、400と交換 - 1時50希釈した抗PECAM1の一次抗体を含有する500μlの新鮮なブロック。 4℃で一晩チューブを回転させます。
- 次の日は、室温でチューブを回転させ、先の細いプラスチック製パスツールピペットまたは千μlのピペットチップでブロック/一次抗体を吸引し、1.0ミリリットルPBST中で少なくとも6×1時間の洗浄を行います。
- 1希釈したフルオロフォア結合二次抗体を含有する新鮮なブロッキングバッファーで最後の洗浄に置き換え：500を、回転して、4℃で一晩インキュベートします。ホイルでチューブを包むことにより、光から保護します。
- 翌日、ブロック/秒を吸引先の細いプラスチック製パスツールピペットで次側抗体とは、室温でチューブを回転させ、1.0ミリリットルPBST中で少なくとも6×1時間の洗浄を行います。
- 必要になるまで4°C（光から保護）に心を保管してください。
クリアソリューションおよび顕微鏡料理の調製
注：BABBで心を撮影するとき、BABBソリューションのいずれも、顕微鏡の部品と接触しないことが重要です。この目的のために、以下のプロトコルは、事前に調製することができる蛍光顕微鏡に適したシリコーンエラストマー封止型料理を、調製するための命令が含まれています。シリコーンエラストマーは、BABBを含み、潜在的にガラス底皿のポリカーボネート側の間浸入を防止するための障壁を提供します。
- 直径シリコーンエラストマーでコーティングされた料理を準備するには、スクリュートップバイアルを4ミリリットルからキャップを光学ガラス底の培養皿を取り、置く（約1.5センチメートル）各皿の中心インチ
注：エラストマーを皿に適用した場合、このサンプルのために十分に形成します。 - 製造者の指示に従って、それらが適用されるように、2つの成分を混合するために、アプリケータカートリッジを使用して、約0.5センチメートルの深さまでシリコーンエラストマーと料理を記入してください。バイアルキャップは、各皿の中央に残っていることを確認して、少なくとも24時間硬化させるために残します。
注：目でシリコーンエラストマーの偶発的な接触を避けるために、安全メガネを使用してください。 - エラストマーを硬化させた後、各ディッシュからバイアルキャップを取り外し、これは試料皿のガラス底部に直接接触して配置することができる撮像される中央のウェルを残します。
注：硬化したときエラストマーは、タッチにしっかりと乾燥しているべきです。 - （2部の安息香酸ベンジルに1部のベンジルアルコール）BABB溶液を調製します。これは、ガラス瓶に保存され、光から保護されるべきです。
注意：BABBは、毒性、腐食性溶液です。適切な防護服を着用しながら、ドラフトチャンバー内で処理します。 - ガラスバイアル中 - （5ミリリットル1）50:50溶液を作製するためにBABBとメタノールを混ぜます。ホイルでバイアルをラップすることによって、 例えば 、光から保護します。
4.脱水、クリアと共焦点顕微鏡のためのハートの取り付け
注：より大きなサンプルは、しかし、小さなサンプルのため、4ミリリットルのガラスバイアルにクリアすることができる（ 例えば、E13.5まで心）、顕微鏡皿に直接クリア処理を実行することをお勧めします。これがクリアされると心が非常に透明になるサンプルとして「負け」防止に役立ちます。これらの少量のサンプルをクリアするため、数分以内に起こる、非常に迅速です。
注：ホイルでチューブや食器をカバー/ラップすることにより、以下のすべてのステップの間に光から試料を保護します。
- クリアする前に、部屋テンペで心を回転させることにより、メタノールの一連の免疫染色-心を脱水25％メタノール/ 75％PBS、50％メタノール/ 50％PBSおよび75％メタノール/ 25％PBS（各5分）：次の溶液の連続変化1.5 mlマイクロチューブでrature。最後に、100％メタノール中で3×5分間回転させます。
- E13.5までの心のために、顕微鏡の皿の中央にある場所。顕微鏡下で心臓がその背側の最上部に配向していることを確認します。先の細いプラスチックパスツールピペットで心臓の周囲から任意のメタノールを除去。
- きれいな先の細いプラスチック製パスツールピペットを使用して、BABBを追加：メタノール50:50ソリューションを心没頭するのに十分な量で（約300から400μl）を。心は時々溶液中で裏返しにすることができますように心はまだ不透明である一方で、再び向きを確認してください。 5分間溶液中に残します。
- ドラフト内でガラス廃棄ボトルへ50:50溶液を除去し、再び先の細いプラスチック製パスツールピペットを使用して、BABBと交換してください。
注：大容量を必要としません。 suffを追加icient心は溶液の液滴内に位置するように。心臓は5分以内にクリアする必要があります。 - 大きい方の心のために、ガラスバイアル内のサンプルをオフにします。
注：E15.5の心臓は、30分〜1時間以内にクリアする必要がありますが、必要に応じて一晩放置することができます。 - サンプルがクリアされている後、溶液を除去し、BABBの最小容積と交換してください。必要に応じて、所定の位置にそれを維持するのに役立つように、カバースリップでサンプルをカバーし、しかし、これは絶対に必要というわけではありません。イメージングのために心を使用してください。
5.イメージングは、共焦点顕微鏡によって心をクリア
注：画像は、10倍または20倍のドライ対物レンズを使用して、倒立型共焦点顕微鏡で撮影しました。それは直立共焦点に食器を使用することも可能ですが、余分なケアはBABB溶液と対物レンズの接触を避けるようにしなければなりません。
- 心臓15のzスキャンを収集します。心臓の大きさに応じて、タイルのスキャンは、全体の心臓16の画像を必要とすることができます。
注意：BABBは、腐食性溶液で清潔な手袋を着用し、顕微鏡皿の外側はBABBから自由であることを確認してください。慎重に皿を処理し、顕微鏡上に漏出事故の危険性を最小限にするために皿に蓋を保ちます。 - 客観的な作動距離が許せば、関心領域の高解像度画像を得るために高倍率を使用しています。
フィジーソフトウェアの使用6.データ解析
- フィジー17内の画像のzスタックを開きます。
- それのスタック全体または一部のAZ投影を行うには、画像をクリックして、スタックを選択し、Zプロジェクトが続きます。開始と停止スライス番号を入力し、zの投影の種類を選択し、 例えば、平均強度、最大強度。
- （プラグインのメニュー選択セグメンテーションから、次に/なげなわツールをブロー）フェラ・ツールを使用して画像スライスのスタック内の個々の容器をハイライト表示し、EAに充填される画像の領域をクリックしますchのスライス。 （色と前景色が続き、[オプション]を選択し、[編集]をクリックします）選択の前景色で選択領域を埋めるために（そして、塗りつぶしを選択し、[編集]をクリックします）塗りつぶしコマンドを使用します。
- 画像は以前のようにスタックZプロジェクト。
IMARISを使用して生成された冠動脈の7. 3D表面ボリュームレンダリング
- 画面上部のサーパスビューアイコンをクリックし、ドラッグして、データウィンドウに画像ファイルをドロップします。画面の上部にある3Dビューのアイコンをクリックしてください。
- 表面アイコン（青いアイコン）を選択し、[作成]タブをクリックします。 「自動作成をスキップし、手動で編集」ダイアログ・ボックスをクリックして、描画アイコン（薄い鉛筆のアイコン）をクリックしてください。
- 等高線]タブを選択し、[モード]タブ。モードでは、魔法の杖や孤立線のアイコンをクリックしてください。 [選択]の横のをクリックして、画面の右側にポインタ選択のポインタモードを選択し、「描画をクリックしてください9; （画面の左下にある）ボックス。
- 連続したスライスにおける動脈の輪郭を選択するために、孤立線や魔法の杖ツールを使用してください。スライス位置のスライダーを使用してスライスするスライスから移動します。
- すべての輪郭が選択された場合には、サーフェスの作成ボックスをクリックしてください。周囲のボリュームが非表示になり、またはブレンドモードを使用して、多かれ少なかれ不透明にすることができます。モード]タブに続いて、それを強調表示し、[設定]タブを選択するために、ボリュームをクリックしてください。ブレンドを選択し、不透明度を変更するには、スライダを使用しています。
- スナップショット機能を使用して画像をキャプチャします。
Representative Results
心臓が発達するように、心室心筋は、種々の供給源からの内皮細胞（EC）によって侵入され、かつ血管叢が形成されています。心室筋以内に発症する船舶は、心臓組織18に酸素を豊富に含んだ血液を提供毛細血管および動脈ネットワークを形成するために行くだろう。 （E11.5付近）同時に冠動脈、大動脈14,19,20の内腔を囲む（peritruncal叢として知られている）別々の毛細血管網から独立して開発を始める茎。 Peritruncal叢のECは当初しかし、最終的に一つだけの容器は、左と右冠状動脈21の根を形成するために起こっている、大動脈の各側に持続します、バルブ洞のレベルで大動脈の内腔と複数の接続を形成します。 E13.5周りからperitruncalおよび心筋血管を心室がAからの血流を可能にする、相互接続されたネットワークを形成するまでに参加しますオルタ冠状血管14,22へ。無傷の心のBABBクリアランスと組み合わせた抗PECAM-1抗体を用いたECの染色は、できるだけ早い段階から開発冠動脈ネットワークの分析を可能にします。後で発達段階で成熟冠動脈のパターニングも調べることができます。この方法は、（少なくとも、E11.5まで）全体の胚の血管系を染色するために利用することができ、異なる抗体と、 例えば、抗α平滑筋アクチン（SM22α）とエンドムチン。
図1は、フィジーのソフトウェアを使用して生成されたE11.5心臓の最大強度のz-投影を示しています。タイル機能は、心臓の複数の部分画像を収集し、完全な画像にそれらを一緒にステッチするために使用されました。これは、試料全体に染色の概要を提供することが有用です。この段階でPECAM1抗体は、主に心臓や流出、vの心内膜ライニングを染色しますessels、しかしいくつかのECは、（ '1（a）に拡大して示す、 図 1Aの四角で囲んだ領域）左心室壁で観察することができます。また、peritruncal叢は明らか流出路（OT）（ 図1Bに箱入りの領域）の壁に観察することができます。後者の場合には、突起を生成するために使用されるzスタック内のスライスの数を減少させること（ 図1B '）より明確に視覚化される大動脈の内腔との接続を可能にする、画像の透明度を向上させます。 図2では、大動脈に増加した血管系の近位は、E12.5の心で観察することができます。 図3は、E12.5心臓におけるperitruncal叢を示しています。 図3Aの12スライスzの投影が、いくつかの血管がiがzスタックを分割し、（も重く抗PECAM1抗体により染色された）大動脈の内腔に腹側に局在しているしかしとして、全体の神経叢を示していますサブスタック数NTO（ 図3B-D）は、より視覚的な情報を提供します。例えば、 図3（b）に投影されたサブスタックは全投影で表示されていない大動脈内腔の腹側表面に接続するperitruncal容器を示しています。 図4は、E15.5心臓の一部を示しています。冠状動脈は、この段階（ 図4A、30スライスの投影）ではっきりと見えます。 図4Bに示す5スライスZ突起及びC大動脈及び肺動脈弁はまた、PECAM1染色によって可視化することができます。枝や冠状動脈毛細血管網の相互接続は、これらのより小さなサブスタックの投影でも鮮明です。手動セグメンテーション技術は、フィジー（ 図4D）またはIMARIS（ 図4DおよびE）を使用して冠状動脈を強調するために使用されています。冠状動脈の3次元表面ボリュームレンダリング/大動脈内腔は、Uを生成しました歌うIMARISは、周囲の脈管構造（ 図4EおよびF）の有無にかかわらず表示することができます。
全体の胚の血管系はまた、PECAM1染色/ BABBクリアランスを使用して検査することができます。それぞれ胚の左側（Zスライス66から110） - 図 4AおよびA 'は 、右側からサブスタックから生成されたzの突出部（65のzスライス11）を示します。 2つの画像の比較は、蛍光シグナルの強度が著しく組織に深く浸透して減少しなかったことを示しています。 図4B、PECAM1（赤信号）とエンドムチン（緑信号）において、抗体は、E11.5胚の、それぞれ節間動脈（のISA）と静脈を標識するために組み合わせました。 図4Cは、SM22α（赤信号）およびE11.5胚でのISAのPECAM1染色（緑色の信号）を示しています。 図6では、E11.5胚PECAM 1で染色されたが、すぐにBABBクリアランス（ 図 4A）の後、または約2ヶ月（ 図4B）の間隔後に画像化しました。蛍光シグナルは、成功しBABBのサンプルの長期間貯蔵した後に静止画に十分な強さでした。
（アレクサ594に抗ラットIgGコンジュゲートを用いて検出）抗PECAM1抗体によるE11.5心臓の図1.免疫染色。 （A、B）2×2のタイル状の画像が倒立共焦点顕微鏡の10×対物レンズを用いて収集しました。 PECAM1抗体汚れ心内膜と血管のECの両方。突起（最大強度）フィジーのソフトウェアを使用して、図22（A）または図5（B）Zスライス4ミクロンの厚さのそれぞれから生成されました。 A 'およびB'は enlargemenありますそれぞれAとBで箱入りの領域のTS。 'Aの矢印は、心室壁の血管を示しています。 B 'で、ブラケットはperitruncal叢を示しています。 OT、流出路。 LV、左心室、右心室、右心室。すべての画像は正面図です。 AとB = 200μm単位のスケールバー; A 'およびB' = 100μm単位のスケールバー。パネル1Bは、「アイビンスら 、2015年19から適応されました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
抗PECAM1抗体によるE12.5ハートの図2.免疫染色。パネルAは 、2x2のタイル張りのスキャンのAZ投影（最大強度）を示しています。 Aで箱入りの領域は部拡大表示されますA 'に編。矢印は、近位大動脈（AO）に複数の血管を示しています。 LV、左心室、右心室、右心室。すべての画像は正面図です。 Aにおけるスケールバー=200μmの。 '= 100μm単位のスケールバー。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
E12.5心にPeritruncal神経叢の3イメージング図。抗PECAM1抗体で染色されたE12.5大動脈（AO）の共焦点画像は、10倍の対物レンズを用いて収集しました。 Aにおけるz投影（最大強度）は12のzスライス（厚さ4μm）から生成されました。矢印はperitruncal叢の血管を示しています。 BDザ12 Zスライスを示すように、3つのサブスタックに分割し、別々のprojectiを生成するために使用されましたアドオン。矢じりは、大動脈の内腔にperitruncal叢によって形成された接続を示しています。大動脈の内腔に腹側に局在しPeritruncal船は、BとCに表示されます。すべての画像は正面図です。 =50μmのスケールバー。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
E15.5ハートで4冠動脈と毛細血管叢図。抗PECAM1抗体で染色されたE15.5心臓の共焦点画像は、10倍の対物レンズを用いて収集しました。パネルAは、30 Z切片（4μmの厚さ）から生成された最大強度Z投影を示す図です。矢印は、大動脈（AO）への接続見ることができ、左右の冠状動脈（LCAおよびRCA）を示しています。 differen使い方トン5のzスライス大動脈と肺動脈弁（AOVとPV）を、サブスタックは（青括弧）をそれぞれBとCで見ることができます。心室毛細血管叢は、これらのより小さなサブスタックの投影でも鮮明です。肺動脈弁（小箱）への近位血管がパネルC（大箱）の右下に拡大して示されています。フィジーは、パネルDのためのブロー/投げ縄ツールは、従来の投影に各zスライスに手動で赤色で冠状動脈を埋めるために使用された、 例えば 、個々の血管を強調するために使用されました。 IMARISソフトウェアは、動脈（赤）とEとFにおける大動脈内腔（緑）の3D画像を作成するために使用されました。再びこれは各zスライス内のオブジェクトの輪郭を作成するために、魔法の杖のツールを使用して、手動で行われました。周囲ボリュームの不透明度は、Eのように、ブレンドモードに変更することができます。 Fに示されるように代わりに、3D画像を抽出することができます。すべての画像は正面図です。 A = 100μm単位のスケールバー。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
胚血管系の5イメージング図。パネルAおよび抗PECAM1抗体で染色されたE10.5の野生型胚のA '示す共焦点画像は、10倍の対物レンズ（タイルスキャン）を使用して収集しました。平均強度zの突起は、胚の厚さにわたって蛍光強度のわずかな損失を示し、zのスライスから11-65（A）と120のzスライススキャン（4μmの厚さにスライス）の66から110（A '）を生成しました。パネルBは 、不格好なやつで染色したE11.5胚の間血管を示していますタイル張りから（平均強度のz投影それぞれ節間動脈（矢印）および静脈（矢印）を染色PECAM1（594結合二次抗体からの赤色信号）とエンドムチン（EMCN、488結合二次抗体からの緑色信号）に対する居住スキャン）。パネルCは 、PECAM1（488結合二次抗体からの緑信号）とSM22α（594結合二次抗体からの赤色信号）に対する抗体で染色したE11.5の野生型胚から節間動脈（のISA）を示しています。共焦点画像は、20倍のドライ対物レンズを使用して収集し、最大強度Z投影を生成するために使用しました。すべての画像は矢状図です。 AとBにおけるスケールバー= 250μmで、C = 100μm単位のスケールバー。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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BABBでクリア図6.免疫染色されたサンプルは、少なくとも2ヶ月間の蛍光シグナルを保持します。 E11.5胚は、PECAM1抗体で染色し、BABBでクリアしました。同じバッチからの胚は、直ちにまたは2ヶ月の間隔の後に画像化しました。パネルAは 、すぐに撮像された胚の体節間動脈を示し、パネルBは、胚は2ヶ月後に結像示しています。共焦点画像は、10倍のドライ対物レンズを使用して収集し、最大強度Z投影を生成するために使用しました。 DAO、背側大動脈。画像は矢状図を示しています。 AとB = 100μm単位のスケールバー。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Discussion
全体の胚心の中に冠動脈血管が光学クリアランスおよび共焦点顕微鏡に続く抗PECAM1抗体を用いたホールマウント免疫染色によって画像化しました。ここで説明する簡単な方法は、BABBとマウス胎児心のクリアランスのために、光の浸透を増加させ、大動脈および心室壁に局在血管の高解像度画像の取り込みを可能にします。 BABB（1.56）の高い屈折率より深い組織浸透を可能にする、さらに別の光散乱を減少させるが、このようなベクタシールド（屈折率1.45）などのグリセロールに基づく実装の試薬はまた、冠状血管系22の結像に使用されてきました。組織クリアランスは、このような多者や研究者にはあまり容易に利用可能であり、シート光顕微鏡などの顕微鏡のより複雑な、高価なフォームを不要にします。清算プロセスは、他の方法6-9と小さなサンプルがCAであることができるために比べて非常に迅速です顕微鏡皿の上に直接試薬の小さなボリュームを使用してrried。血管系のロバストな染色は、高品質の画像を達成するために必要とされます。抗PECAM1抗体は、染色の適切に高いレベルを与えることが見出された冠状動脈ECおよび市販の抗体の数のすべてのタイプをマークとして選択しました。また、蛍光染色はBABB中で非常に安定であるように見えます。 （光から保護）BABB中、室温で保存したサンプルは、数ヶ月のために彼らの蛍光信号を保持していました。 peritruncal叢の画像を撮影する場合は特にPECAM1抗体を効率的に、冠状動脈性心内膜だけでなく、血管系が時折問題があったラベルを付けているという事実。 peritruncalのECに比べ大動脈内腔の強い染色は、撮像パラメータの慎重な調整が必要とされたことを意味し、画像の一部の地域で過飽和の危険性が生じました。理想的には、抗体染色は、血管のECは、使用されます。実際には、しかし、ホールマウント染色の必要なレベルをもたらす適切な抗体を見つけることが困難な場合があります。最近、脂肪酸結合タンパク質4（FABP4）は、冠血管のEC 23のマーカーであることが示されており、したがって、PECAM1の代替を表すことができます。
大動脈および心臓の室の3次元形態を保持するために、サンプルは、フラットマウントされなかったが、代わりに、ガラス底の皿に画像化しました。撮像されるべき試料の深さは、その短い作動距離に、高倍率の対物レンズを使用することを妨げ。しかし、高解像度画像は、画素の滞留時間を増加させると、画像キャプチャのために、少なくとも1,024×1,024ピクセルのアレイサイズを使用して、10倍の対物レンズを使用して、依然として達成可能でした。しかしながら、これは、細胞構造の細かい分析はサンプルのフラットマウントが必要な場合があり、構造及び冠状血管の分布の分析に十分でした。装着するための心の個々の部分の解剖、例えば、心室の壁、または大動脈、必要な場合もあります。代替的に、オーバーサンプリングデコンボリューションに続く画像の解像度と感度を高めるために行うことができます。これは、しかし、かなり長いスキャン時間を必要とし、処理するためのコンピューティングパワーを多く必要とする非常に大きな画像ファイルを作成します。
E15.5まで心臓を正常にこの方法を使用して画像化され、同じプロトコルを使用して（少なくともE11.5まで）全体の胚の脈管構造を分析することも可能であるしました。他の細胞型、 例えば、平滑筋細胞は、この技術を用いて我々の研究室で撮像されています。厚い組織、 例えば、心E15.5よりも古いために、抗体の浸透が制限要因となる可能性があります。長いインキュベーションおよび/または増加した界面活性剤が必要になることがあります。また、画像の大Zスタックを収集する際には、レーザーは、組織の遠い部分を貫通するように強度を低減することができる信号。しかし、confにOCAL設定が増加Z距離でレーザパワーを増大させるように調整することができます。
この方法は、冠動脈血管形成の初期段階以降の発達段階での冠状動脈のパターニングの両方の共焦点顕微鏡分析を容易にします。配布の詳細については、分岐血管の構造はこれに血管新生経路における特定の欠陥を有する遺伝子のマウス突然変異体の研究のための貴重なツールを作り、短時間で取得することができます。
Acknowledgments
仕事は子供NHS財団トラストとロンドン大学のためのグレートオーモンド・ストリート病院のヘルスリサーチ生物医学研究センター研究所でサポートされている英国心臓Foundation'andによって賄われていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Life Technologies | 14190-094 | |
| Forceps | FST | 11251-30 | |
| 10 cm Petri dishes | Falcon | 351029 | |
| 35 mm Petri dishes | Sigma | P5112 | |
| Stainless steel minutien pins 0.2 mm diameter | FST | 26002-20 | |
| Fine tip pastettes | Alpha Laboratories | LW4061 | |
| 1,000 ml pipette tips | Sorenson | 34000 | |
| 48-well plate | Falcon | 353078 | |
| Kwik-Gard | World Precision Instrument | KWIKGARD | Silicone elastomer Sylgard184 packaged in a cartridge for mixing and dispensing |
| Kwik-Gard refill | World Precision Instrument | KWIKGLUE | Refill cartridges and dispensing tips |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Make up in PBS and store at -20 °C |
| 100% methanol | VWR | 20847307 | |
| Tween®20 | Sigma | P1379 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Anti-PECAM1 antibody, rat anti-mouse | BD Pharmingen | 553370 | Primary antibody, dilute 1 in 50 |
| Anti-CD31 polyclonal, rabbit polyclonal | Abcam | ab28364 | Primary antibody, dilute 1 in 50 |
| Anti-CD31/PECAM1 clone 2H8, armenian hamster monoclonal | Thermo Fisher Scientific | MA3105 | Primary antibody, dilute 1 in 400 |
| Endomucin antibody (V.7C7), rat monoclonal | Santa Cruz Biotechnology | sc-65495 | Primary antibody, dilute 1 in 50 |
| Anti-SM22 alpha antibody, rabbit polyclonal | Abcam | ab14106 | Primary antibody, dilute 1 in 250 |
| Goat anti-rat IgG (H+L)Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A11007 | Secondary antibody, dilute 1 in 500 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L)Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | Secondary antibody, dilute 1 in 500 | |
| Goat anti-Armenian Hamster IgG (H+L)Alexa Fluor 488 | Abcam | ab173003 | |
| Goat anti-rat IgG (H+L)Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21208 | Secondary antibody, dilute 1 in 500 |
| Phenolic screw cap | Wheaton | 240408 | |
| Benzyl alcohol | Sigma | 402834 | |
| Benzyl benzoate | Sigma | B6630 | |
| Imaris | Bitplane Imaging | image analysis software | |
| ImageJ software | NIH | Freeware |
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