Summary
Vi presentiamo un protocollo per l'analisi dei vasi coronarici, in tutto cuori murini embrionali fino a E15.5, usando metodi di colorazione immunologici standard, seguiti da gioco ottica e la microscopia confocale. Questa tecnica permette la visualizzazione dei vasi sanguigni durante tutto cuore senza la necessità di analizzare tempo di sezioni seriali.
Introduction
Creazione di una rete coronarica funzionante è fondamentale per la funzione del cuore e lo sviluppo embrionale, e l'analisi di mutanti genetici del mouse in grado di fornire informazioni preziose in segnali molecolari alla base di questo processo di sviluppo. La capacità di visualizzare plesso coronarie embrionali nel suo complesso, piuttosto che presentato in una serie di sezioni istologiche, è essenziale per facilitare l'analisi di patterning nave in mutanti genetici, ed evita la perdita potenziale di informazioni che possono verificarsi a seguito di meccanico affettatura del tessuto. Vasi destinata a formare le arterie e capillari sono localizzati in profondità all'interno delle mura di entrambi i ventricoli e l'aorta 1-3. Tuttavia, mentre marcatura fluorescente di cellule in combinazione con scansione laser confocale in grado di fornire immagini ad alta risoluzione di navi wholemount marcato superficiali venose / linfatici 4,5, la profondità delle immagini è limitata dalla penetrazione ottica. immagini ad alta risoluzione di tappoillaries e arterie in tutto il tutta la profondità del cuore non è quindi possibile senza una qualche forma di compensazione dei tessuti.
Penetrazione ottica scadente è causato dalla alto indice di rifrazione del multiplo cellulare e extracellulare (per esempio, collagene e fibre elastiche) componenti di tessuti spessi. Questo disperde la luce di imaging, causando la sfocatura e una diminuzione del contrasto. gli agenti di compensazione genere corrispondono l'elevato indice di rifrazione di tali tessuti, il che significa che la luce può viaggiare attraverso il campione senza ostacoli e penetrare in profondità nel tessuto. Prima di compensazione, i tessuti sono generalmente disidratati come l'acqua ha un indice di rifrazione relativamente basso. Una pletora di nuovi metodi di compensazione sono stati sviluppati di recente, tuttavia a seconda della tecnica utilizzata, il processo di compensazione può richiedere giorni o settimane e può richiedere costosi reagenti 6-9. BABB (una miscela 1: 2 di alcool benzilico e benzil benzoato) è un agente di compensazione comunemente usato poco costoso, che ha lavantaggio di compensazione campioni in modo estremamente rapido. Tecniche di compensazione BABB-based e di imaging sono stati descritti in precedenza per i campioni neurologici e vari organi 10-13. Qui si descrive una tecnica solida e lineare per la liquidazione BABB di campioni immunostained seguita da microscopia confocale, con specifico riferimento all'esame dei vasi sanguigni nei cuori murini da E (giorno embrionale) 11,5-15,5. Tuttavia, come è stato anche dimostrato, la tecnica può essere ugualmente applicata ad analisi di embrioni interi, così come altri tipi di cellule, purché anticorpi alta qualità ai marcatori di interesse sono disponibili.
Protocol
Tutte le ricerche degli animali è stata effettuata in conformità con le linee guida istituzionali sotto licenza dal Regno Unito Home Office.
1. dissezione e la fissazione di cuori embrionali
- Euthanize un mouse scaduta incinta sul giorno desiderato utilizzando una tecnica di abbattimento etico approvato, ad esempio, di CO 2 narcosi seguita da dislocazione cervicale, e rimuovere le sacche embrionali 14, ponendole in una capsula di Petri 10 centimetri riempito con tampone fosfato salino (PBS) .
- Utilizzando un microscopio da dissezione e pinze, aprire con cautela le sacche uterine e rimuovere ogni embrione, recidere il cordone ombelicale e la rimozione del sacco vitellino.
- Ai fini di genotipizzazione, rimuovere la coda embrionale e posto in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga per l'estrazione di lisi / DNA in seguito.
- Per rimuovere cuore, pin ogni embrione sul dorso in un elastomero siliconico rivestito 35 millimetri Petri PBS-riempite, utilizzando perni minutien acciaio inossidabile. Utilizzando una pinza sottile, carefully aprire il torace e tagliare i grossi vasi, anteriore al cuore. Poi raggiungendo dietro il cuore con le pinze, afferrare i vasi dietro il cuore e tirare delicatamente per rimuovere il cuore; polmoni può anche venire via allo stesso tempo.
- Trasferire il cuore ad un fresco 35 millimetri Petri contenenti PBS e utilizzare una pinza sottile per tagliare via il tessuto polmonare, se necessario. Poi il trasferimento cuore in un pozzetto di una piastra a 48 pozzetti riempiti con PBS freddo.
- Dopo aver raccolto tutti i cuori nella piastra 48 pozzetti, aspirare il PBS con una punta fine pipetta Pasteur di plastica e sostituirlo con 0,5 ml 4% paraformaldeide (PFA).
ATTENZIONE: PFA è un noto per essere allergenico, cancerogeno e tossico.- Fix E11.5 - 12,5 cuori per 15 min, cuori E13.5 per 20 min e E14.5 - 15.5 cuori per 30 minuti, a 4% PFA a temperatura ambiente.
- Aspirare il PFA con una punta fine pipetta Pasteur di plastica e sciacquare i cuori 2x in PBS freddo.
CAUTION: PFA sono pericolosi e devono essere smaltiti secondo le norme istituzionali. - Se non si utilizza immediatamente per tutto il monte immunostaining (vedere la sezione 2), disidratano i cuori mediante la realizzazione di successivi 5 min lavaggi nelle seguenti soluzioni: 25% di metanolo / 75% PBS, il 50% di metanolo / 50% PBS, il 75% di metanolo / 25 % PBS.
ATTENZIONE: Il metanolo è tossico, indossare guanti. Conservare i cuori a -20 ° C in 100% metanolo.
2. monte intero Immunocolorazione di embrionali cuori con Anti-PECAM1 anticorpo
NOTA: Gli anticorpi anti-PECAM1 funzionano bene per la colorazione dei vasi coronarici (vedi punto 2.4), ma qualsiasi marcatore pan-endoteliale, che dà un segnale robusto sarebbe adatto.
- Se si utilizza cuori che sono stati conservati in 100% metanolo, trasferire 1,5 ml provette da microcentrifuga e reidratare effettuando successivi 5 min lavaggi nelle seguenti soluzioni: 75% metanolo / 25% PBS, 50% metanolo / 50% PBS e 25% metanolo / 75% PBS. Permeabilize i cuori effettuando 3 x 10 min lavaggi in 0,5 - 1,0 ml PBST (PBS / 0.1% Tween-20), rotante a temperatura ambiente.
- Bloccare i cuori ruotando per 1 ora a temperatura ambiente in 1,0 ml di 10% siero di capra in PBST.
- Rimuovere tampone bloccante con una plastica pipetta Pasteur a punta fine o 1.000 ml puntale e sostituirlo con 400 - 500 ml di blocco fresco contenente l'anticorpo primario anti-PECAM1 diluito 1:50. Ruotare i tubi notte a 4 ° C.
- Il giorno successivo, aspirare l'anticorpo blocco / primaria con una pipetta Pasteur di plastica a punta fine o 1.000 ml puntale ed eseguire almeno 6x 1 ora lavaggi in 1,0 ml di PBST, ruotando i tubi a temperatura ambiente.
- Sostituire l'ultimo lavaggio con tampone di bloccaggio fresco contenente l'anticorpo secondario fluoroforo coniugato diluito 1: 500, e incubare una notte a 4 ° C, con rotazione. Proteggere dalla luce avvolgendo i tubi in carta stagnola.
- Il giorno seguente, aspirare il blocco / secanticorpo daria con una punta fine pipetta Pasteur di plastica e di effettuare almeno 6x 1 ora lavaggi in 1,0 ml di PBST, ruotando i tubi a temperatura ambiente.
- Conservare i cuori a 4 ° C (protetto dalla luce) fino a quando necessario.
3. preparazione di soluzioni di compensazione e piatti Microscopia
NOTA: Quando l'imaging cuori BABB è vitale che nessuna soluzione BABB entra in contatto con i componenti del microscopio. A tal fine il seguente protocollo contiene le istruzioni per la preparazione di piatti di elastomeri di silicone sigillato adatti per microscopia a fluorescenza, che possono essere preparate in anticipo. L'elastomero siliconico fornisce una barriera per contenere la BABB e impedire che potenzialmente infiltrazioni tra il fondo di vetro ed i lati policarbonato del piatto.
- Per preparare i piatti elastomero di silicone, prendere piatti ottici con fondo trasparente della cultura e mettere un tappo da un 4 ml con tappo a vite flaconcino (circa 1,5 cm di diametro) Al centro di ogni piatto.
NOTA: Questo sarà un bene per il campione quando l'elastomero viene applicata al piatto. - Riempire i piatti con elastomero siliconico ad una profondità di circa 0,5 cm usando una cartuccia applicatore di mescolare i due componenti sono applicati, in base alle istruzioni del fabbricante. Lasciare curare per almeno 24 ore, facendo attenzione che il tappo del flacone rimane al centro di ogni piatto.
NOTA: Usare occhiali di sicurezza per evitare il contatto accidentale del elastomero di silicone con gli occhi. - Dopo la polimerizzazione l'elastomero, rimuovere il cappuccio della fiala da ogni piatto, Questo lascerà un pozzo centrale dove il campione da acquisire può essere posto a diretto contatto con il fondo di vetro del piatto.
NOTA: quando curato l'elastomero deve essere robusto e asciutta al tatto. - Preparare la soluzione BABB (1 parte di alcool benzilico a 2 parti benzilico benzoato). Questo deve essere conservato in una bottiglia di vetro al riparo dalla luce.
ATTENZIONE: BABB è una soluzione tossici, corrosivi. Maneggiare sotto cappa mentre indossa abbigliamento protettivo adeguato. - Mix BABB e metanolo per ottenere una soluzione 50:50 (1 - 5 ml) in un flacone di vetro. Proteggere dalla luce, ad esempio, avvolgendo la fiala in un foglio.
4. La disidratazione, di compensazione e di montaggio di Cuori per Microscopia confocale
NOTA: ingrandita campioni possono essere cancellati in 4 ml fiale di vetro, tuttavia per piccoli campioni (per esempio, cuori fino a E13.5) è meglio effettuare il processo di compensazione direttamente nel piatto microscopia. Questo aiuta a prevenire 'perdere' i campioni come i cuori diventano molto trasparente una volta eliminato. Per questi piccoli campioni di compensazione è molto rapida, che si verifica entro pochi minuti.
NOTA: Proteggere i campioni dalla luce durante tutte le seguenti fasi di confezionamento / rivestimento tubi e piatti con un foglio.
- Prima di cancellare, disidratano i-cuori immunostained attraverso una serie di metanolo facendo ruotare i cuori a camera Temperatura in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga a modifiche successive delle seguenti soluzioni: 25% metanolo / 75% PBS, 50% metanolo / 50% PBS e 75% metanolo / 25% PBS (5 min in ciascuna). Infine, ruotare per 3 x 5 min a 100% di metanolo.
- Per i cuori fino a E13.5, posto al centro del piatto microscopio; al microscopio garantire cuore è orientato con il suo alto lato dorsale. Rimuovere eventuali metanolo da tutto il cuore con una punta fine pipetta di plastica Pasteur.
- Utilizzando un pulito a punta fine di plastica pipetta Pasteur, aggiungere BABB: metanolo 50:50 soluzione in un volume sufficiente per immergere il cuore (circa 300-400 ml). Come il cuore a volte può capovolgere nella soluzione, prova di nuovo l'orientamento mentre i cuori sono ancora opachi. Lasciare nella soluzione per 5 min.
- Rimuovere la soluzione 50:50 a una bottiglia di rifiuti di vetro in cappa e sostituirlo con BABB, ancora una volta con un a punta fine di plastica pipetta Pasteur.
NOTA: Un grande volume non è necessaria; aggiungi sufficient modo che il cuore si trova all'interno di una goccia di soluzione. Il cuore deve cancellare entro 5 minuti. - Per i cuori più grandi, cancellare i campioni in fiale di vetro.
NOTA: Un cuore E15.5 dovrebbe risolversi entro 30 minuti-1 ora, ma può essere lasciata durante la notte se necessario. - Dopo che il campione è chiaro, rimuovere la soluzione e sostituirlo con un volume minimo di BABB. Facoltativamente, coprire il campione con un vetrino, per aiutare a mantenere in posizione, tuttavia questo non è assolutamente necessario. Utilizzare il cuore per l'imaging.
5. Imaging Azzerato Cuori da Microscopia confocale
NOTA: Le immagini sono state catturate su un microscopio confocale invertito utilizzando 10X o 20X obiettivi a secco. Sebbene sia possibile utilizzare i piatti su un confocale verticale, particolare attenzione deve essere presa per evitare il contatto dell'obiettivo con la soluzione BABB.
- Raccogliere un z-scan del cuore 15. A seconda delle dimensioni del cuore, una scansione tegola può essere richiesto di immagine tutto il cuore 16.
ATTENZIONE: BABB è una soluzione corrosiva, indossare guanti puliti e garantire la parte esterna del piatto di microscopia è esente da BABB. Maneggiare il piatto con attenzione e tenere il coperchio sul piatto per minimizzare il rischio di contatto accidentale con il microscopio. - Se la distanza di lavoro obiettivo permette, utilizzare un ingrandimento maggiore per ottenere immagini ad alta risoluzione di regioni di interesse.
6. Analisi dei dati mediante Fiji Software
- Aprire la z pila di immagini in Fiji 17.
- Per rendere la proiezione az di tutta la pila o parte di esso, clicca sull'immagine e selezionate Pila, seguito dal progetto Z. Inserisci Start e Stop numeri delle sezioni, e selezionare il tipo di z di proiezione, ad esempio, l'intensità media, intensità max.
- Per evidenziare i singoli vasi all'interno di una pila di fette di immagine utilizzano lo strumento Blow (dal menu di selezione Plugin segmentazione, e poi soffiare / strumento Lazo) e cliccare sulle aree dell'immagine da compilare e bisfetta ch. Utilizzare il comando Fill (fare clic su Modifica, quindi selezionare Fill) per riempire le aree selezionate con il colore di primo piano della scelta (fare clic su Modifica, quindi selezionare Opzioni, seguito da colori e primo piano).
- Progetto Z l'immagine pila come prima.
7. 3D Surface Volume Rendering delle arterie coronarie generato utilizzando Imaris
- Fare clic sulla vista icona di sorpassare nella parte superiore dello schermo e trascinare il file immagine nella finestra dei dati. Fare clic sulla icona Vista 3D nella parte superiore dello schermo.
- Selezionare l'icona superfici (icona blu) e quindi fare clic sulla scheda Crea. Fare clic nella finestra di dialogo 'Skip creazione automatica, modificare manualmente' e cliccare sull'icona Draw (sottile icona della matita).
- Selezionare la scheda Contour, e poi la scheda Modalità. In modalità, cliccare sulla bacchetta magica o le icone ISOLINE. Scegliere la modalità puntatore nella selezione puntatore sul lato destro dello schermo facendo clic su accanto a 'Seleziona', e quindi fare clic su 'Draw9; scatola (in basso a sinistra dello schermo).
- Utilizzare lo ISOLINE o strumento bacchetta magica per selezionare i contorni delle arterie a fette successive. Passare dalla fetta di tagliare con il cursore Slice posizione.
- Quando tutti i contorni sono stati selezionati, fare clic sulla casella Crea superficie. Il volume circostante può essere reso invisibile, o resa più o meno opaca utilizzando la modalità di fusione; cliccare sul volume per evidenziarlo e quindi selezionare la scheda Impostazioni, quindi la scheda Modalità. Selezionare Miscela e utilizzare il cursore per modificare l'opacità.
- Cattura immagini utilizzando la funzione Snapshot.
Representative Results
Come il cuore si sviluppa, il miocardio ventricolare è invaso da cellule endoteliali (EC) da varie fonti, e si forma un plesso vascolare. Le navi che si sviluppano all'interno del miocardio ventricolare andranno a formare le reti capillari e arterie che forniscono sangue ossigenato al cuore del tessuto 18. Allo stesso tempo (circa E11.5) coronaria steli cominciare a sviluppare indipendentemente da una rete capillare separata (noto come plesso peritruncal) che circonda il lume dell'aorta 14,19,20. Peritruncal plesso EC inizialmente forma più connessioni con il lume dell'aorta a livello dei seni valvolari, tuttavia definitiva solo vaso persisterà su ciascun lato della aorta, andando a formare le radici delle arterie coronarie destra e sinistra 21. Dalla intorno E13.5 il peritruncal e ventricolare vasi del miocardio si uniscono per formare una rete interconnessa, permettendo il flusso di sangue dal unorta nei vasi coronarici 14,22. La colorazione di EC con anti-PECAM-1 anticorpi, combinato con BABB liquidazione dei cuori intatti, permette l'analisi delle reti coronariche in via di sviluppo dalle prime fasi possibili. Nelle fasi di sviluppo successive alla patterning delle arterie coronarie in scadenza può anche essere esaminato. Questo metodo può anche essere utilizzato per colorare la vascolarizzazione di embrioni interi (fino a E11.5 almeno), e con differenti anticorpi, per esempio, anti-alfa del muscolo liscio actina (Sm22α) e Endomucin.
La figura 1 mostra il massimo di intensità z-proiezioni di un cuore E11.5 generata utilizzando il software Fiji. La funzione Tile stato usato per raccogliere più immagini parziali del cuore ed unirle in un'immagine completa; questo è utile per fornire un quadro della colorazione nell'intero campione. A questo anticorpo fase PECAM1 macchie principalmente il rivestimento endocardica del cuore e deflusso vessels, tuttavia alcuni EC può anche essere osservato nella parete ventricolare sinistra (regione scatola in figura 1A, mostrata ingrandita in 1A '). Inoltre, il plesso peritruncal possono essere osservati chiaramente nella parete del tratto di efflusso (OT) (regione scatola nella Figura 1B). In quest'ultimo caso, la riduzione del numero di fette nel z-stack utilizzato per generare la proiezione migliorata la chiarezza dell'immagine, consentendo i collegamenti con il lume dell'aorta da visualizzare più distintamente (Figura 1B '). In figura 2, l'aumentata vascolarizzazione prossimale all'aorta può essere osservato in un cuore E12.5. La Figura 3 mostra il plesso peritruncal in un cuore E12.5. La z sporgenza 12-fetta in figura 3A mostra l'intero plesso, tuttavia, come alcuni vasi sono localizzate ventralmente al lume dell'aorta (che è anche fortemente colorate con anticorpo anti-PECAM1), dividendo la z-stack into una serie di sotto-cataste (Figura 3B-D) fornisce ulteriori informazioni visive. Per esempio, la sotto-mazzetta proiettata nella Figura 3B mostra una nave peritruncal collegamento alla superficie ventrale del lume aortico, che non è visibile nella piena proiezione. La figura 4 mostra una parte di un cuore E15.5; le arterie coronarie sono chiaramente visibili in questa fase (Figura 4A, proiezione 30-slice). Nei 5 slice z proiezioni mostrate nelle figure 4B e C le valvole aortica e polmonare possono anche essere visualizzati da PECAM1 colorazione; i rami e le interconnessioni della rete capillare coronarica sono anche più chiaro in queste proiezioni sub-stack più piccoli. Tecniche di segmentazione manuale sono state utilizzate per evidenziare le arterie coronarie utilizzando Fiji (Figura 4D) o Imaris (Figura 4D ed E). Il volume rendering 3D della superficie delle arterie coronarie / lume aortico u generaticantare Imaris può essere visualizzato con o senza il sistema vascolare circostante (Figura 4E e F).
La vascolarizzazione degli embrioni interi può anche essere esaminata usando PECAM1 colorazione / BABB spazio. Figura 4A e A ', mostrano z proiezioni generati dal sotto-cataste dal lato destro (z fette 11 - 65) e sinistra (z fette 66-110) dell'embrione, rispettivamente. Il confronto delle due immagini mostra che l'intensità del segnale fluorescente non diminuiva significativamente con maggiore penetrazione nel tessuto. Nella Figura 4B, PECAM1 (segnale rosso) e Endomucin (segnale verde) anticorpi sono stati combinati per etichettare le arterie intersomitic (ISA) e le vene, rispettivamente, di un embrione E11.5. La figura 4C mostra SM22α (segnale rosso) e PECAM1 colorazione (segnale verde) di ISA in un embrione E11.5. In figura 6, embrioni E11.5macchiato con PECAM 1 sono stati ripresi subito dopo BABB gioco (Figura 4A), oppure dopo un intervallo di circa due mesi (Figura 4B). Il segnale fluorescente era ancora abbastanza forte da un'immagine con successo dopo conservazione prolungata del campione in BABB.
Figura 1. Immunocolorazione di un cuore E11.5 con Anti-PECAM1 anticorpo (rilevato con anti-topo IgG coniugato Alexa 594). (A, B) un'immagine di 2 x 2 piastrellato stati raccolti usando l'obiettivo 10X di un microscopio confocale invertito. anticorpo colora PECAM1 sia endocardici ed ECS vascolare. Le proiezioni (intensità massima) sono stati generati da 22 (A) o 5 (B) z fette ciascuno di 4 micron di spessore, utilizzando il software Fiji. A 'e B' sono enlargements delle aree in scatola, rispettivamente A e B. Frecce in A 'indicano i vasi sanguigni nella parete del ventricolo; in B ', la staffa indica il plesso peritruncal. OT, tratto di efflusso; LV, ventricolo sinistro, RV ventricolo destro. Tutte le immagini sono viste frontali. Barre di scala in A e B = 200 micron; barre di scala in A 'e B' = 100 micron. Pannello 1B 'è stato adattato da Ivins et al. 2015 19. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Immunocolorazione di un cuore E12.5 con Anti-PECAM1 anticorpo. Pannello A mostra la proiezione az (massima intensità) di una scansione 2x2 piastrelle. La regione in scatola in A è mostrato AMPLIAEd in A '; frecce indicano multipli vasi sanguigni prossimale all'aorta (Ao). LV, ventricolo sinistro, RV ventricolo destro. Tutte le immagini sono viste frontali. Barra di scala in A = 200 micron; barra della scala in A '= 100 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Imaging del plesso Peritruncal in un cuore E12.5. immagini confocale di un dell'aorta E12.5 (Ao) colorati con anticorpo anti-PECAM1 sono stati raccolti utilizzando l'obiettivo 10X. La proiezione z (intensità massima) in A è stata generata da 12 fette z (4 micron di spessore); frecce indicano i vasi del plesso peritruncal. BD Il 12 z fette sono stati divisi in tre sotto-cataste come indicato e usato per generare projecti separataons; frecce indicano connessioni formate dal plesso peritruncal al lume dell'aorta. Vasi Peritruncal localizzate ventralmente al lume dell'aorta sono visibili in B e C. Tutte le immagini sono viste frontali. Barra di scala = 50 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. arterie coronarie e capillare plesso in un cuore E15.5. immagini confocale di un cuore E15.5 macchiato con anticorpi anti-PECAM1 sono stati raccolti utilizzando l'obiettivo 10X. Pannello A mostra una proiezione massima intensità z generato da 30 fette z (4 micron di spessore); frecce indicano le arterie coronarie destra e sinistra (LCA e RCA) che si possono vedere il collegamento con l'aorta (Ao). utilizzando different 5 z fetta sub-impila le valvole aortica e polmonare (AOV e PV) possono essere visti rispettivamente (parentesi blu) in B e C. Il capillare del plesso ventricolare è anche più chiaro in queste proiezioni sub-stack più piccoli; vasi sanguigni prossimali alla valvola polmonare (piccola scatola) sono mostrati allargato in basso a destra del pannello C (grande scatola). Fiji è stato utilizzato per evidenziare i vasi sanguigni individuali, ad esempio, per il pannello D il / strumento lazo colpo è stato utilizzato per riempire le arterie coronarie con il colore rosso manualmente in ogni z fetta prima di proiezione. Software Imaris è stato utilizzato per creare immagini in 3D delle arterie (rosso) e lume aortico (verde) in E e F; ancora una volta questo è stato fatto manualmente, utilizzando lo strumento bacchetta magica per creare contorni degli oggetti in ogni z fetta. L'opacità del volume circostante può essere modificata nel modalità di fusione, come in E. In alternativa, l'immagine 3D può essere estratto, come illustrato in F sinistro. Tutte le immagini sono viste frontali. Barra di scala in A = 100 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Imaging di embrionali Vasculature. Pannelli A e A 'mostrare immagini confocale di un E10.5 embrione wild type macchiato con anticorpi anti-PECAM1, raccolti con l'obiettivo 10X (scansione piastrelle). Intensità media z proiezioni sono stati generati da z fette 11-65 (A) e 66-110 (A ') di una scansione fetta 120 z (4 micron fette spesse), mostrando solo una leggera perdita di intensità di fluorescenza attraverso lo spessore dell'embrione . Pannello B mostra i vasi intersomitic di un embrione E11.5 colorati con gli anticorpi i contro PECAM1 (segnale rosso da anticorpo secondario 594-coniugato) e Endomucin (EMCN, segnale verde da anticorpo secondario 488-coniugato), che macchiano le arterie intersomitic (freccia) e vene (punta di freccia), rispettivamente (media intensità z proiezione da un piastrellato scansione). Pannello C mostra arterie intersomitic (ISA) da un E11.5 embrione wild type macchiato con anticorpi contro PECAM1 (segnale verde da anticorpo secondario 488-coniugato) e SM22α (segnale rosso da anticorpo secondario 594-coniugato). immagini confocale sono stati raccolti utilizzando l'obiettivo a secco 20X e utilizzati per generare il massimo proiezioni intensità z. Tutte le immagini sono viste sagittali. Barre di scala in A e B = 250 micron, bar scala C = 100 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 6. I campioni immunostained sgomberati a Babb Conservare segnale fluorescente per almeno due mesi. embrioni E11.5 sono state colorate con l'anticorpo PECAM1 e liquidati con BABB; embrioni dello stesso lotto sono stati ripresi immediatamente o dopo un intervallo di due mesi. Pannello A mostra le arterie intersomitic dell'embrione imaged immediatamente e il pannello B mostra l'embrione ripreso due mesi più tardi. immagini confocale sono stati raccolti utilizzando l'obiettivo a secco 10X e utilizzati per generare il massimo proiezioni intensità z. dAO, aorta dorsale. Immagini mostrano viste sagittali. Barre di scala in A e B = 100 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Discussion
vasi coronarici in interi cuori embrionali sono stati ripresi da immunostaining wholemount con anticorpi anti-PECAM1 seguito da gioco ottica e la microscopia confocale. Il metodo semplice qui descritto, per la liquidazione dei cuori embrionali di topo con BABB, aumenta la penetrazione ottica e consente la cattura di immagini ad alta risoluzione dei vasi sanguigni localizzati nelle pareti dell'aorta e ventricolari. Glicerolo a base di reagenti di montaggio, come Vectashield (indice di rifrazione 1,45) sono stati utilizzati anche per l'imaging del sistema vascolare coronarico 22 invece l'indice di rifrazione più elevato di Babb (1,56) riduce la dispersione della luce ancora di più, consentendo la penetrazione nei tessuti più profondi. passaggio Tissue elimina la necessità di più complesse, costose forme di microscopia come multifotonica e microscopia foglio leggero che può essere meno prontamente disponibile per i ricercatori. Il processo di compensazione è estremamente rapido rispetto ad altri metodi 6-9 e per piccoli campioni possono essere caRRied utilizzando piccoli volumi di reagenti direttamente sul piatto microscopia. colorazione robusta della vascolarizzazione è necessaria al fine di ottenere immagini di alta qualità; anti-PECAM1 anticorpo è stato selezionato come segna tutti i tipi di coronarica EC e una serie di anticorpi commerciali sono stati trovati invia opportunamente elevati livelli di colorazione. Inoltre, la colorazione fluorescente appare estremamente stabile in BABB; campioni conservati a temperatura ambiente in BABB (protetti dalla luce) mantenuto la loro segnale fluorescente per diversi mesi. Il fatto che PECAM1 anticorpo marca efficacemente l'endocardio coronarica e vascolare era talvolta problematico, soprattutto durante la cattura immagini del plesso peritruncal. Forte colorazione del lume aortico rispetto al peritruncal EC determinato un rischio di sovra-saturazione in alcune zone delle immagini, il che significa che è stato richiesto un'attenta regolazione dei parametri di imaging. Idealmente, una colorazione anticorpi solo vascolare EC sarebbe stato utilizzato; in pratica,tuttavia, trovare gli anticorpi adatti che producono il livello di colorazione wholemount può essere difficile. Recentemente, acido grasso proteina legante 4 (FABP4) ha dimostrato di essere un indicatore della coronaria EC vascolare 23 e può quindi rappresentare un'alternativa alla PECAM1.
Al fine di mantenere la morfologia 3D delle camere aorta e cuore i campioni non erano piatto montato, ma sono stati invece ripreso in piatti con fondo trasparente. La profondità dei campioni da acquisire precluso l'uso di obiettivi ad alto ingrandimento, a causa delle loro brevi distanze di lavoro. Tuttavia immagini ad alta risoluzione erano ancora raggiungibili utilizzando un obiettivo 10X, aumentando il tempo di permanenza dei pixel e con una dimensione di matrice di pixel di almeno 1.024 x 1.024 per la cattura delle immagini. Questo era sufficiente per l'analisi della struttura e distribuzione dei vasi coronarici, tuttavia Un'analisi più accurata struttura cellulare può richiedere piatta montaggio dei campioni. La dissezione di singole parti del cuore per il montaggio,ad esempio, pareti ventricolo o aorta, può anche essere necessario. In alternativa, sovracampionamento dell'immagine seguita da deconvoluzione può essere effettuata al fine di aumentare la risoluzione e la sensibilità; questo però richiede molto più tempo i tempi di scansione e crea file di immagini molto grandi che richiedono molta potenza di calcolo per elaborare.
Cuori fino a E15.5 sono stati ripresi con successo utilizzando questo metodo, ed è anche possibile analizzare la vascolarizzazione di embrioni interi (almeno fino a E11.5) utilizzando lo stesso protocollo. Altri tipi di cellule, ad esempio, cellule muscolari lisce sono state anche ripreso nel nostro laboratorio utilizzando questa tecnica. Per i tessuti più spessi, per esempio, cuori di età superiore a E15.5, la penetrazione degli anticorpi può essere un fattore limitante; può essere richiesto incubazione più lunghi e / o un aumento di detergente. Inoltre, quando si raccolgono una grande z pila di immagini intensità del segnale può essere ridotto come i laser penetrano più lontane porzioni di tessuto; tuttavia il confimpostazioni ocal possono essere regolate per aumentare la potenza del laser con l'aumentare della distanza z.
Questo metodo facilita l'analisi al microscopio confocale di entrambe le prime fasi della formazione dei vasi coronarici e il patterning delle arterie coronarie in fasi di sviluppo successive. Informazioni dettagliate sulla distribuzione, ramificazione e la struttura dei vasi sanguigni può essere acquisita in breve tempo, rendendo questo un prezioso strumento per lo studio di mutanti genetici di topo con difetti specifici percorsi di angiogenesi.
Acknowledgments
Il lavoro è stato finanziato dal cuore Foundation'and britannico sostenuto dal National Institute for Biomedical Research Centre Health Research al Great Ormond Street Hospital for Children NHS Foundation Trust e University College di Londra.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Life Technologies | 14190-094 | |
| Forceps | FST | 11251-30 | |
| 10 cm Petri dishes | Falcon | 351029 | |
| 35 mm Petri dishes | Sigma | P5112 | |
| Stainless steel minutien pins 0.2 mm diameter | FST | 26002-20 | |
| Fine tip pastettes | Alpha Laboratories | LW4061 | |
| 1,000 ml pipette tips | Sorenson | 34000 | |
| 48-well plate | Falcon | 353078 | |
| Kwik-Gard | World Precision Instrument | KWIKGARD | Silicone elastomer Sylgard184 packaged in a cartridge for mixing and dispensing |
| Kwik-Gard refill | World Precision Instrument | KWIKGLUE | Refill cartridges and dispensing tips |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Make up in PBS and store at -20 °C |
| 100% methanol | VWR | 20847307 | |
| Tween®20 | Sigma | P1379 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Anti-PECAM1 antibody, rat anti-mouse | BD Pharmingen | 553370 | Primary antibody, dilute 1 in 50 |
| Anti-CD31 polyclonal, rabbit polyclonal | Abcam | ab28364 | Primary antibody, dilute 1 in 50 |
| Anti-CD31/PECAM1 clone 2H8, armenian hamster monoclonal | Thermo Fisher Scientific | MA3105 | Primary antibody, dilute 1 in 400 |
| Endomucin antibody (V.7C7), rat monoclonal | Santa Cruz Biotechnology | sc-65495 | Primary antibody, dilute 1 in 50 |
| Anti-SM22 alpha antibody, rabbit polyclonal | Abcam | ab14106 | Primary antibody, dilute 1 in 250 |
| Goat anti-rat IgG (H+L)Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A11007 | Secondary antibody, dilute 1 in 500 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L)Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | Secondary antibody, dilute 1 in 500 | |
| Goat anti-Armenian Hamster IgG (H+L)Alexa Fluor 488 | Abcam | ab173003 | |
| Goat anti-rat IgG (H+L)Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21208 | Secondary antibody, dilute 1 in 500 |
| Phenolic screw cap | Wheaton | 240408 | |
| Benzyl alcohol | Sigma | 402834 | |
| Benzyl benzoate | Sigma | B6630 | |
| Imaris | Bitplane Imaging | image analysis software | |
| ImageJ software | NIH | Freeware |
References
- Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).
- Tian, X., et al. Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries. Cell Res. 23 (9), 1075-1090 (2013).
- Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).
- Klotz, L., et al. Cardiac lymphatics are heterogeneous in origin and respond to injury. Nature. 522 (7554), 62-67 (2015).
- Nam, J., et al. Coronary veins determine the pattern of sympathetic innervation in the developing heart. Development. 140 (7), 1475-1485 (2013).
- Zhu, D., Larin, K. V., Luo, Q., Tuchin, V. V. Recent progress in tissue optical clearing. Laser Photon. Rev. 7 (5), 732-757 (2013).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat. Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat. Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat. Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Zucker, R. M., Hunter, E. S., Rogers, J. M. Confocal laser scanning microscopy of morphology and apoptosis in organogenesis-stage mouse embryos. Methods Mol. Biol. 135, 191-202 (2000).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat. Protoc. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Erturk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. J. Vis.Exp : JoVE. (89), (2014).
- Dyer, L. A., Wu, Y., Patterson, C. Protein isolation from the developing embryonic mouse heart valve region. J. Vis.Exp s : JoVE. (91), e51911 (2014).
- Wilsbacher, L. D., Coughlin, S. R. Analysis of cardiomyocyte development using immunofluorescence in embryonic mouse heart. J. Vis.Exp : JoVE. (97), (2015).
- StitchArt Guide for Zen 2010. , Zeiss. Available from: http://www.google.co.uk/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&ved=0ahUKEwjC6OPVnO7NAhVD7RQKHQzqALkQFggcMAA&url=ftp%3A%2F%2Fftp.sonic.net%2Fpub%2Fusers%2Flhund%2FMMP%2FBlurWin2012%2FHelpful Docs%2FTiling_and_Stitching in Zen.pdf&usg=AFQjCNH4C6dv8bdmKC651sp_CFz4C1Rq3g (2010).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Tian, X., Pu, W. T., Zhou, B. Cellular origin and developmental program of coronary angiogenesis. Circ. Res. 116 (3), 515-530 (2015).
- Ivins, S., et al. The CXCL12/CXCR4 Axis Plays a Critical Role in Coronary Artery Development. Dev. Cell. 33 (4), 455-468 (2015).
- Theveniau-Ruissy, M., et al. Coronary stem development in wild-type and Tbx1 null mouse hearts. Dev. Dyn : an official publication of the American Association of Anatomists. 245 (4), 445-459 (2016).
- Tomanek, R. J. Formation of the coronary vasculature during development. Angiogenesis. 8 (3), 273-284 (2005).
- Chen, H. I., et al. VEGF-C and aortic cardiomyocytes guide coronary artery stem development. J. Clin.Iinvest. 124 (11), 4899-4914 (2014).
- Tian, X., et al. Vessel formation. De novo formation of a distinct coronary vascular population in neonatal heart. Science. 345 (6192), 90-94 (2014).
