Summary
Vi præsenterer en protokol til analyse af koronarkar i hele embryonale murine hjerter op til E15.5, ved hjælp af standard immunologiske farvningsmetoder efterfulgt af optisk clearance og konfokal mikroskopi. Denne teknik muliggør visualisering af blodkar i hele hjertet uden behov for tidskrævende analyse af serielle sektioner.
Introduction
Etablering af en velfungerende koronar netværk er afgørende for hjertefunktionen og embryonale udvikling, og analyse af genetiske musen mutanter kan give værdifuld indsigt i de molekylære signaler underliggende denne udviklingsproces. Evnen til at visualisere embryonale koronar plexus som helhed, snarere end præsenteret i en række histologiske snit, er afgørende for at lette analysen af fartøjets mønster i genetiske mutanter, og undgår potentielle tab af oplysninger, der kan opstå som følge af mekanisk snitning af vævet. Fartøjer skæbnebestemt til at danne arterier og kapillærer er lokaliseret dybt inden for murene i både hjertekamrene og aorta 1-3. Men mens fluorescerende mærkning af celler kombineret med laser-scanning konfokal mikroskopi kan give billeder af wholemount-mærket overfladiske venøse / lymfekar 4,5 høj opløsning, er dybden af billeddannelse begrænset af optisk penetration. Høj opløsning billeddannelse af hætteillaries og arterier gennem hele dybden af hjertet er derfor ikke muligt uden en eller anden form for væv clearing.
Dårlig optisk penetration skyldes det høje brydningsindeks for det multiple cellulære og ekstracellulære (fx kollagen og elastiske fibre) komponenter af tykke væv. Dette spreder billeddannende lys, der forårsager sløring og nedsat kontrast. Afhjælpning midler typisk matche højt brydningsindeks af sådanne væv, hvilket betyder, at lyset kan rejse gennem prøven uhindret og trænge dybere ind i vævet. Før clearing, væv er generelt dehydratiseret som vand har et relativt lavt brydningsindeks. En overflod af nye clearing metoder er blevet udviklet for nylig, men afhængigt af den anvendte teknik kan clearingen tage dage eller uger, og kan kræve kostbare reagenser 6-9. Babb (en 1: 2 blanding af benzylalkohol og benzylbenzoat) er en billig, almindeligt anvendt klarende middel, som har denFordelen ved at rydde prøver ekstremt hurtigt. Babb-baserede clearing og billeddannelsesteknikker er tidligere blevet beskrevet for neurologiske prøver og forskellige organer 10-13. Her beskriver vi en robust og ligetil teknik til Babb clearance af immunofarvede prøver efterfulgt af konfokal mikroskopi, med særlig henvisning til en undersøgelse af blodkar i murine hjerter fra E (embryonale dag) 11,5-15,5. Men som det også blevet vist, at teknikken kan lige så godt anvendes til analyse af hele embryoner, såvel som andre celletyper, så længe høj kvalitet antistoffer mod markørerne af interesse er til rådighed.
Protocol
Alle dyr forskning blev udført i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer under licens fra det britiske indenrigsministerium.
1. Dissektion og Fiksering af Embryonale Hjerter
- Aflive en tidsindstillet gravid mus på den ønskede dag under anvendelse af et etisk godkendt udsætning teknik, f.eks CO 2 narkose efterfulgt af cervikal dislokation, og fjern de embryonale sacs 14, anbringe dem i en 10 cm petriskål fyldt med phosphatpufret saltvand (PBS) .
- Ved hjælp af et dissektionsmikroskop og pincet, forsigtigt åbne op for uterine sække og fjerne hvert embryo, overskæring af navlestrengen og fjerne blommesækken.
- Til genotypebestemmelse formål fjerne embryonale hale og sted i en 1,5 ml mikrocentrifugerør til lyse / DNA-ekstraktion senere.
- For at fjerne hjertet, pin embryonets ud på ryggen i en PBS-fyldt silikoneelastomer-coated 35 mm petriskål, anvendelse af rustfrit stål minutien stifter. Ved hjælp af fine pincet, carefully åbne kisten og skille de store kar, anterior til hjertet. Så nåede bag hjertet med pincet, tag fat skibene bag hjertet og træk forsigtigt at fjerne hjerte; lungerne kan også komme væk på samme tid.
- Overfør hjertet til et frisk 35 mm petriskål indeholdende PBS og bruge fine tænger til at trimme væk lungevævet, hvis det er nødvendigt. Derefter overføre hjertet til en brønd af en 48-brønds plade fyldt med kold PBS.
- Efter indsamling af alle hjerter i 48-brønds plade, aspireres PBS med en spids plastik Pasteur pipette og erstatte med 0,5 ml 4% paraformaldehyd (PFA).
ADVARSEL: PFA er et kendt for at være allergifremkaldende, kræftfremkaldende og giftige.- Fix E11.5 - 12,5 hjerter til 15 min, E13,5 hjerter i 20 min og E14.5 - 15,5 hjerter til 30 min, i 4% PFA ved stuetemperatur.
- Aspirer PFA med en spids plastik Pasteur pipette og skyl hjerterne 2x i kold PBS.
cautION: PFA er farligt og skal bortskaffes i overensstemmelse med de institutionelle regler. - Hvis du ikke bruger det samme for hele mount immunfarvning (se afsnit 2), dehydrere hjerter ved at udføre successive 5 minutters vaske i følgende løsninger: 25% methanol / 75% PBS, 50% methanol / 50% PBS, 75% methanol / 25 % PBS.
ADVARSEL: Methanol er giftigt, handsker. Opbevar hjerterne ved -20 ° C i 100% methanol.
2. Hele Mount immunfarvning af Embryonale Hjerter med Anti-PECAM1 antistof
BEMÆRK: Anti-PECAM1 antistoffer fungere godt for farvning af koronarkar (se trin 2.4), men enhver pan-endotel markør, der giver et robust signal ville være egnet.
- Hvis du bruger hjerter, der er blevet gemt i 100% methanol, overførsel til 1,5 ml mikrocentrifugerør og rehydrere ved at udføre successive 5 minutters vaske i følgende løsninger: 75% methanol / 25% PBS, 50% methanol / 50% PBS og 25% methanol / 75% PBS. Permeabilisere hjerter ved at udføre 3 x 10 minutters vaske i 0,5 - 1,0 ml PBST (PBS / 0,1% Tween-20), som roterer ved stuetemperatur.
- Blokere hjerter ved rotation i 1 time ved stuetemperatur i 1,0 ml 10% gedeserum i PBST.
- Fjern blokerende buffer med en spids plastik Pasteur pipette eller 1000 pi pipettespids og erstatte med 400 - 500 pi frisk blok indeholder anti-PECAM1 primære antistof fortyndet 1:50. Rotere rørene natten over ved 4 ° C.
- Den næste dag, aspireres blokken / primære antistof med en spids plast Pasteur pipette eller 1.000 pi pipettespids og udføre mindst 6x 1 time vaske i 1,0 ml PBST, rotation rørene ved stuetemperatur.
- Erstatte den sidste vask med frisk blokerende buffer indeholdende fluoroforen-konjugeret sekundært antistof fortyndet 1: 500, og inkuberes natten over ved 4 ° C, med rotation. Beskytte mod lys ved indpakning af rørene i folie.
- Den følgende dag, aspireres blokken / sekdært antistof med en spids plast Pasteur pipette og udføre mindst 6x 1 time vaske i 1,0 ml PBST, rotation rørene ved stuetemperatur.
- Opbevar hjerter ved 4 ° C (beskyttet mod lys) indtil brug.
3. Udarbejdelse af Clearing Solutions og Mikroskopi Dishes
BEMÆRK: Når billeddannelse hjerter i Babb er det afgørende, at ingen af Babb opløsningen kommer i kontakt med bestanddelene i mikroskopet. Til dette formål følgende protokol indeholder instruktioner til at forberede silikone elastomer-forseglede retter egnede til fluorescens mikroskopi, som kan fremstilles i god tid. Silicone-elastomeren tilvejebringer en barriere til at indeholde Babb og forhindre det potentielt siver mellem glasset bund og polycarbonat sider af skålen.
- For at forberede silikone beklædt med elastomer retter, tage optisk glas-bund kultur retter og placere en hætte fra en 4 ml skrue top hætteglas (ca. 1,5 cm i diameter) I midten af hver skål.
BEMÆRK: Dette vil danne en brønd for prøven, når elastomeren påføres fadet. - Fyld retter med siliconeelastomer til en dybde på ca. 0,5 cm, ved anvendelse af en applikator patron til at blande de to komponenter, som de anvendes ifølge producentens anvisninger. Efterlad hærde i mindst 24 timer og sikrer, at hætteglassets hætte forbliver i midten af hver skål.
BEMÆRK: Brug sikkerhedsbriller for at undgå utilsigtet kontakt med silicone elastomer med øjnene. - Efter hærdning af elastomeren, fjernes hætteglasset hætten fra hver skål, vil dette give en central brønd, hvor prøven, der skal afbildes kan placeres i direkte kontakt med glasset bunden af skålen.
BEMÆRK: når helbredt elastomeren skal være fast og tør at røre ved. - Forbered Babb opløsning (1 del benzylalkohol til 2 dele benzylbenzoat). Dette bør opbevares i en glasflaske og beskyttet mod lys.
ADVARSEL: BABB er et giftigt, ætsende opløsning. Håndtag i stinkskab mens iført passende beskyttelsestøj. - Mix Babb og methanol til at gøre en 50:50 opløsning (1 - 5 ml) i et hætteglas. Beskytte mod lys, fx ved at vikle hætteglasset i folie.
4. Dehydrering, Clearing og Montering af hjerter for konfokal mikroskopi
BEMÆRK: Større prøver kan blive ryddet i 4 ml hætteglas, men for små prøver (f.eks hjerter op til E13.5) er det bedre at udføre clearingen direkte i mikroskopi fad. Dette hjælper med at forhindre "miste" prøverne som hjerterne bliver meget transparent engang ryddet. For disse små prøver clearing er meget hurtig, forekommer inden for et par minutter.
BEMÆRK: Beskyt prøverne fra lys under alle følgende trin ved indpakning / dækker rør og retter med folie.
- Før clearing, dehydrere de immunofarvede-hjerter gennem en methanol-serie ved at dreje hjerter ved stue tempeperatur i et 1,5 ml mikrocentrifugerør i successive ændringer af følgende løsninger: 25% methanol / 75% PBS, 50% methanol / 50% PBS og 75% methanol / 25% PBS (5 min i hver). Endelig rotere i 3 x 5 min i 100% methanol.
- For hjerter op til E13.5, sted i midten af mikroskopi skålen; under mikroskopet sikre hjertet er orienteret med sin dorsale side øverst. Fjern methanol fra omkring hjertet med en spids plastik Pasteur pipette.
- Brug en ren spids plastik Pasteur pipette, tilføje Babb: methanol 50:50 opløsning i et tilstrækkeligt volumen til at fordybe hjertet (ca. 300-400 pi). Da hjerterne til tider kan vendes i løsningen, kontrollere retningen igen, mens hjerterne er stadig uigennemsigtige. Lad i opløsningen i 5 min.
- Fjern 50:50 løsning på et glasaffald flaske i stinkskab og erstatte med Babb, igen ved hjælp af en spids plastik Pasteur pipette.
BEMÆRK: En stor mængde er ikke påkrævet; tilføje sufficient så hjertet sidder i en dråbe opløsning. Hjertet skal rydde inden for 5 min. - For større hjerter, rydde prøverne i hætteglas.
BEMÆRK: Et E15.5 hjerte skal rydde inden 30 min-1 time, men kan stå natten over hvis det er nødvendigt. - Efter at prøven er klar, fjernes opløsningen og erstatte med en minimal mængde af Babb. Eventuelt dække prøven med et dækglas, at hjælpe med at holde det på plads, men dette er ikke absolut nødvendigt. Brug hjertet til billeddannelse.
5. Imaging Ryddet Hearts af konfokalmikroskopi
BEMÆRK: Billeder blev fanget på et omvendt konfokal mikroskopet med 10X eller 20X tørre mål. Selv om det er muligt at anvende de retter en opretstående konfokal, skal der udvises ekstra forsigtighed for at undgå kontakt af målsætningen med Babb opløsning.
- Saml en z-scanning af hjertet 15. Afhængig af størrelsen af hjertet, kan en flise scanning være nødvendigt at afbilde hele hjertet 16.
ADVARSEL: Babb er en ætsende løsning, slid rene handsker og sikre ydersiden af mikroskopi parabol er fri for Babb. Håndter fadet forsigtigt og holde låget på skålen for at minimere risikoen for spild af præparatet på mikroskopet. - Hvis målet arbejdsafstand tillader, bruge en højere forstørrelse for at opnå højere opløsning billeder af områder af interesse.
6. Dataanalyse Brug Fiji Software
- Åbn z stak billeder i Fiji 17.
- For at gøre az projektion af hele stakken eller en del heraf, skal du klikke på billede og vælg Stack, efterfulgt af Z-projektet. Indtast start og stop skive numre, og vælg den type z projektion, fx gennemsnitlig intensitet, max intensitet.
- For at fremhæve enkelte fartøjer inden for en stak af billedudsnit bruger Blow værktøj (fra Plugins menuen vælg segmentering, og derefter Blow / Lasso værktøj) og klikke på de områder af billedet, der skal fyldes i each skive. Brug kommandoen Fill (klik på Rediger, og vælg derefter Fill) for at fylde de udvalgte områder med forgrunden farve valg (klik på Rediger og derefter vælge Valg, efterfulgt af Farver og forgrund).
- Z-projektet billedet stable så før.
7. 3D Overflade Volume Rendering af kranspulsårerne Genereret Brug Imaris
- Klik på ikonet Overgå visning øverst på skærmen, og træk og slip billedfilen i data vinduet. Klik på View-ikonet 3D øverst på skærmen.
- Vælg ikonet overflader (blåt ikon) og derefter klikke på fanen Opret. Klik på "Skip automatisk oprettelse, redigere manuelt 'dialogboksen, og klik på ikonet Draw (tynd blyant ikon).
- Vælg fanen Contour, og derefter på fanen Mode. I tilstand, skal du klikke på tryllestaven eller isolinje ikoner. Vælg markøren tilstanden i udvælgelsen Pointer på højre side af skærmen ved at klikke ud for 'Vælg', og klik derefter på "Draw9; boks (i nederste venstre hjørne af skærmen).
- Brug isolinje eller tryllestaven til at markere konturerne af arterierne i successive skiver. Naviger fra skive til skive bruge skyderen Slice holdning.
- Når der er valgt alle de konturer, skal du klikke på Opret Surface kassen. Det omgivende volumen kan gøres usynlig, eller gjort mere eller mindre uigennemsigtig bruge Blend mode; klik på Lydstyrke for at fremhæve det, og vælg derefter fanen Indstillinger, efterfulgt af fanen Mode. Vælg Blend og bruge skyderen til at ændre opaciteten.
- Fang billeder ved hjælp af Snapshot-funktionen.
Representative Results
Som hjertet udvikler, er det ventrikulære myocardium invaderet af endotelceller (EC'er) fra forskellige kilder, og en vaskulær plexus dannes. Fartøjer, der udvikler inden den ventrikulære myocardium vil gå på at danne de kapillære og arterielle netværk leverer iltet blod til hjertet væv 18. Samtidig (omkring E11.5) den koronare stilke begynder at udvikle sig uafhængigt fra en separat kapillærnet (kendt som peritruncal plexus), der omgiver hulrummet i aorta 14,19,20. Peritruncal plexus EC'er oprindeligt danner flere forbindelser med hulrummet i aorta på niveauet af ventilen bihuler, men i sidste ende kun ét fartøj vil fortsætte på hver side af aorta, går på at danne rødder venstre og højre koronararterier 21. Fra omkring E13.5 den peritruncal og ventrikulær myokardie skibe slutte op til at danne et sammenhængende netværk, så blodgennemstrømningen fra enOrta i koronarkar 14,22. Farvning af EC'er med anti-PECAM-1 antistof, kombineret med Babb clearance af de intakte hjerter, kan analysen af udviklingslandene koronare netværk fra det tidligst mulige stadium. På senere udviklingsstadier kan også undersøges mønsterdannelse af modning kranspulsårerne. Denne metode kan også anvendes til farvning vaskulaturen af hele embryoner (op til E11.5 mindst), og med forskellige antistoffer, fx anti-alpha glatmuskelactin (Sm22α) og Endomucin.
Figur 1 viser maksimal intensitet z-projektioner af en E11.5 hjerte genereres ved hjælp af Fiji-software. Den Tile funktionen blev brugt til at indsamle flere partielle billeder af hjertet og sy dem sammen til et komplet billede; det er nyttigt at give et overblik over farvning i hele prøven. På dette stadium PECAM1 antistof hovedsagelig pletter den endokardiale hjertesækken og udstrømning vessels dog nogle få EC'er kan også iagttages i den venstre ventrikulære væg (boxed region i figur 1A, vist forstørret i 1A). Desuden kan de peritruncal plexus tydeligt ses i væggen af udstrømning tarmkanalen (OT) (boxed region i figur 1 B). I sidstnævnte tilfælde, at reducere antallet af skiver i z-stakken bruges til at generere fremspringet forbedret klarhed i billedet, gør det muligt for forbindelser med lumen af aorta, der skal visualiseres mere tydeligt (figur 1B). I figur 2 kan observeres øget vaskulatur proximalt til aorta i en E12.5 hjerte. Figur 3 viser peritruncal plexus i en E12.5 hjerte. Den 12-slice z projektion i Figur 3A viser hele plexus, men som nogle fartøjer er lokaliseret ventralt til lumen i aorta (som også stærkt plettet af anti-PECAM1 antistof), opdele z-stak into en række sub-stakke (figur 3B-D) giver mere visuel information. For eksempel er den sub-stack projiceret i Figur 3B viser en peritruncal fartøj tilslutning til den ventrale overflade af aorta lumen, som ikke er synlig i den fulde projektion. Figur 4 viser en del af en E15.5 hjerte; kranspulsårerne er klart synlige på dette stadium (figur 4A, 30-slice projektion). I de 5-slice z fremspring vist i fig 4B og C kan aorta og pulmonal ventiler også visualiseres ved PECAM1 farvning; grene og sammenkoblinger af koronar kapillære netværk er også klarere i disse mindre sub-stack fremskrivninger. Manuelle segmentering teknikker er blevet anvendt til at fremhæve koronararterierne vha Fiji (figur 4D) eller Imaris (figur 4D og E). 3D overflade volumen gengivelse af koronararterier / aortalumen genereret uSing Imaris kan ses med eller uden omgivende vaskulatur (Figur 4E og F).
Det kar af hele embryoner kan også undersøges ved hjælp PECAM1 farvning / Babb clearance. Figur 4A og A ', viser z fremskrivninger genereret fra sub-stakke fra højre side (z skiver 11 - 65) og venstre side (z skiver 66-110) af embryo hhv. Sammenligning af de to billeder viser, at intensiteten af det fluorescerende signal ikke signifikant nedsætter med dybere penetration i vævet. I figur 4B, PECAM1 (rød signal) og Endomucin (grønt signal) blev antistoffer kombineret for at mærke de intersomitic arterier (ISA) og vener henholdsvis en E11.5 embryo. Figur 4C viser SM22α (rød signal) og PECAM1 farvning (grøn signal) af ISA i et E11.5 embryo. I figur 6 E11.5 embryoerfarvet med PECAM 1 blev afbildet umiddelbart efter Babb clearance (Figur 4A), eller efter et interval på ca. to måneder (Figur 4B). Det fluorescerende signal var stadig stærk nok til at billedet med succes efter langvarig oplagring af prøven i Babb.
Figur 1. immunfarvning af en E11.5 Heart med Anti-PECAM1 Antibody (registreret med Anti-rotte IgG konjugeret til Alexa 594). (A, B) en 2 x 2 flisebelagte billede blev opsamlet under anvendelse af 10X objektiv af et inverteret konfokal mikroskop. PECAM1 antistof pletter både endokardiale og vaskulær ECS. Fremspring (maksimal intensitet) blev dannet fra 22 (A) eller 5 (B) z udsnit hver på 4 um tykkelse, ved hjælp Fiji software. A 'og B' er enlargements af de boxed områder i A og B henholdsvis. Pile i A 'angiver blodkar i ventriklen væggen; i B ', beslaget angiver peritruncal plexus. OT, udstrømning tarmkanalen; LV, venstre ventrikel, RV højre hjertekammer. Alle billeder er frontal udsigt. Scale barer i A og B = 200 um; skala barer i A 'og B' = 100 um. Panel 1B 'blev tilpasset fra Ivins et al., 2015 19. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. immunfarvning af en E12.5 Heart med Anti-PECAM1 Antibody. Panel A viser az projektion (maksimal intensitet) af en 2x2 flisebelagt scanning. Den indrammede område i A vises enlarged i A '; Pilene angiver flere blodkar proksimalt til aorta (Ao). LV, venstre ventrikel, RV højre hjertekammer. Alle billeder er frontal udsigt. Scale bar i A = 200 um; skala bar i A '= 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Imaging af Peritruncal Plexus i en E12.5 Heart. Konfokale billeder af en E12.5 aorta (Ao) farvet med anti-PECAM1 antistof blev opsamlet under anvendelse af 10X objektiv. Z projektion (maksimal intensitet) i A blev genereret fra 12 z skiver (4 um tykkelse); pilene angiver de peritruncal plexus fartøjer. BD 12 z skiver blev inddelt i tre undergrupper stakke som angivet og anvendt til at generere separat projections; pilespidser angiver forbindelser dannet ved peritruncal plexus til lumen i aorta. Peritruncal fartøjer lokaliseret ventralt til lumen af aorta er synlige i B og C. Alle billeder er frontal udsigt. Scale bar = 50 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. kranspulsårerne og Kapillær Plexus i en E15.5 Heart. Konfokale billeder af en E15.5 hjerte farvet med anti-PECAM1 antistof blev opsamlet under anvendelse af 10X objektiv. Panel A viser en maksimal intensitet z projektion genereret fra 30 z skiver (4 um tykkelse); pile angiver de venstre og højre kranspulsårer (LCA og RCA), som kan ses tilslutning til aorta (Ao). Brug different 5 z skive sub-stakke aorta og pulmonal ventiler (AOV og PV) kan ses i B og C (blå parentes). Den ventrikulære kapillære plexus er også klarere i disse mindre sub-stack fremskrivninger; blodkar proksimale til det pulmonale ventil (lille boks) er vist forstørret i nederste højre hjørne af felt C (stor kasse). Fiji blev anvendt til at fremhæve de enkelte blodkar, f.eks, for panel D Blow / lassoværktøjet blev anvendt til at fylde koronararterierne med rød farve manuelt i hvert Z skive forud for projektion. Imaris software blev brugt til at skabe 3D-billeder af arterierne (rød) og aorta lumen (grøn) i E og F; igen dette blev gjort manuelt, ved hjælp af tryllestaven til at oprette objekt konturer i hvert z skive. Den opacitet af det omgivende volumen kan ændres i Blend mode, som i E. Alternativt kan 3D-billedet ekstraheres, som vist i F ventrikel. Alle billeder er frontal udsigt. Scale bar i A = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Imaging af embryonale karrene. Paneler A og A 'viser konfokale billeder af en E10.5 vildtype embryo farvet med anti-PECAM1 antistof, opsamles under anvendelse af 10X objektiv (flisebelagte scanning). Gennemsnitlig intensitet z fremskrivninger blev genereret fra z skiver 11-65 (A) og 66-110 (A) i en 120 z skive scanning (4 um tykke skiver), viser kun et lille tab af fluorescens intensitet på tværs af tykkelsen af embryoet . Panel B viser intersomitic fartøjer med en E11.5 embryo farvet med Antibod erne mod PECAM1 (rød signal fra 594-konjugeret sekundært antistof) og Endomucin (EMCN, grønt signal fra 488-konjugeret sekundært antistof), der plette intersomitic arterier (pil) og vener (pilespids) henholdsvis (gennemsnitlig intensitet z projektion fra en flisebelagt Scan). Felt C viser intersomitic arterier (ISA) fra en E11.5 vildtype embryo farvet med antistoffer mod PECAM1 (grønne signal fra 488-konjugeret sekundært antistof) og SM22α (rødt signal fra 594-konjugeret sekundært antistof). Konfokal billeder blev indsamlet ved hjælp af 20X tørre mål og anvendes til at generere maksimal intensitet z fremskrivninger. Alle billeder er sagittale visninger. Scale barer i A og B = 250 um, skala bar i C = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
d / 54800 / 54800fig6.jpg "/>
Figur 6. immunfarvede Prøver ryddet i Babb Bevar Fluorescent Signal for mindst to måneder. E11.5 embryoer blev farvet med PECAM1 antistof og ryddet med Babb; embryoner fra samme parti blev afbildet med det samme eller efter et interval på to måneder. Panel A viser intersomitic arterierne i embryo afbildes umiddelbart og panel B viser embryonet afbildet to måneder senere. Konfokal billeder blev indsamlet ved hjælp af 10X tørre mål og anvendes til at generere maksimal intensitet z fremskrivninger. Dao, dorsale aorta. Billeder viser sagittale visninger. Scale barer i A og B = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Koronarkar i hele embryonale hjerter blev afbildet ved wholemount immunfarvning med anti-PECAM1 antistof efterfulgt af optisk clearance og konfokal mikroskopi. Den enkle metode beskrevet her, for afslutningen af embryonale mus hjerter med Babb, øger optisk penetration og muliggør indfangning af højopløselige billeder af blodkar lokaliseret i aorta og ventrikulære vægge. Glycerol-baserede monteringsmuligheder reagenser såsom Vectashield (brydningsindeks 1,45) er også blevet anvendt til billeddannelse af koronare vaskulatur 22 dog den højere brydningsindeks af Babb (1,56) reducerer lysspredning yderligere, muliggør dybere væv penetration. Tissue clearance overflødiggør behovet for mere komplekse, dyre former for mikroskopi såsom multifoton og lys ark mikroskopi som kan være mindre let tilgængelige for forskere. Den clearing proces er yderst hurtig i forhold til andre metoder 6-9, og for små prøver kan være carried under anvendelse små volumener af reagenser direkte på mikroskopi skålen. Robust farvning af vaskulaturen er påkrævet for at opnå billeder af høj kvalitet; anti-PECAM1 antistof blev valgt som det markerer alle typer koronar EC'er og en række kommercielle antistoffer viste sig at give passende høje niveauer af farvning. Derudover synes den fluorescerende farvning at være yderst stabil i Babb; prøver opbevaret ved stuetemperatur i Babb (beskyttet mod lys) bevarede deres fluorescerende signal i flere måneder. Det faktum, at PECAM1 antistof effektivt mærker koronar endokardium samt vaskulaturen var lejlighedsvis problematisk, især når du tager billeder af peritruncal plexus. Stærkere farvning af aorta lumen i forhold til peritruncal EC'er resulterede i en risiko for over-mætning i nogle områder af billederne, hvilket betyder, at omhyggelig justering af de billeddannende parametre var påkrævet. Ideelt, et antistof-farvning kun vaskulær EC'er ville blive brugt; i praksis,dog finde egnede antistoffer, der giver det krævede niveau af wholemount farvning kan være svært. For nylig er fedtsyrebindende protein 4 (FABP4) blevet vist at være en markør for koronar vaskulær EC'er 23 og kan derfor udgøre et alternativ til PECAM1.
For at fastholde 3D morfologi aorta og hjertekamre prøverne ikke var fast monteret, men blev i stedet afbildet i glas-bund retter. Dybden af de prøver, der skal afbildes udelukket anvendelsen af høje forstørrelsesobjektiver, på grund af deres korte arbejdstid afstande. Dog høj opløsning stadig var opnåelige ved hjælp af en 10X målsætning ved at øge pixel opholdstid og bruge en pixel array-størrelse på mindst 1024 x 1024 for billedoptagelse. Dette var tilstrækkeligt til analyse af strukturen og distribution af koronarkar, men finere analyse af cellestruktur kan kræve fladskærms-montering af prøver. Dissektion af individuelle dele af hjertet for montering,f.eks ventrikel vægge, eller aorta, kan også være nødvendig. Alternativt over-sampling af billedet efterfulgt af udfoldning kan udføres for at øge opløsning og følsomhed; dette kræver dog betydeligt længere scanning gange og skaber meget store billedfiler, der kræver en masse computerkraft til at behandle.
Hjerter op til E15.5 lykkedes afbildes ved hjælp af denne metode, og det er også muligt at analysere vaskulaturen af hele embryoner (op til mindst E11.5) under anvendelse af den samme protokol. Andre celletyper, f.eks, glatte muskelceller er også blevet afbildet i vores laboratorium under anvendelse af denne teknik. For tykkere væv, fx, hjerter ældre end E15.5, kan penetration antistof være en begrænsende faktor; kan kræves længere inkuberinger og / eller øget detergent. Hertil kommer, når indsamling af en stor z stabel af billeder signalstyrken kan blive reduceret som laserne trænger de fjerneste dele af væv; men confocal indstillinger kan justeres for at øge laserenergi med stigende z afstand.
Denne metode letter konfokal mikroskopisk analyse af både de tidligste stadier af koronarkar dannelse og mønster af kranspulsårerne på senere udviklingsstadier. Detaljerede oplysninger om distribution, forgrening og struktur af blodkar kan erhverves på kort tid, hvilket gør dette til et værdifuldt redskab for studiet af genetiske mus mutanter med specifikke defekter i angiogenese veje.
Acknowledgments
Arbejdet blev finansieret af British Heart Foundation'and støttet af National Institute for Health Research Biomedical Research Centre på Great Ormond Street Hospital for Children NHS Foundation Trust og University College London.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Life Technologies | 14190-094 | |
| Forceps | FST | 11251-30 | |
| 10 cm Petri dishes | Falcon | 351029 | |
| 35 mm Petri dishes | Sigma | P5112 | |
| Stainless steel minutien pins 0.2 mm diameter | FST | 26002-20 | |
| Fine tip pastettes | Alpha Laboratories | LW4061 | |
| 1,000 ml pipette tips | Sorenson | 34000 | |
| 48-well plate | Falcon | 353078 | |
| Kwik-Gard | World Precision Instrument | KWIKGARD | Silicone elastomer Sylgard184 packaged in a cartridge for mixing and dispensing |
| Kwik-Gard refill | World Precision Instrument | KWIKGLUE | Refill cartridges and dispensing tips |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Make up in PBS and store at -20 °C |
| 100% methanol | VWR | 20847307 | |
| Tween®20 | Sigma | P1379 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Anti-PECAM1 antibody, rat anti-mouse | BD Pharmingen | 553370 | Primary antibody, dilute 1 in 50 |
| Anti-CD31 polyclonal, rabbit polyclonal | Abcam | ab28364 | Primary antibody, dilute 1 in 50 |
| Anti-CD31/PECAM1 clone 2H8, armenian hamster monoclonal | Thermo Fisher Scientific | MA3105 | Primary antibody, dilute 1 in 400 |
| Endomucin antibody (V.7C7), rat monoclonal | Santa Cruz Biotechnology | sc-65495 | Primary antibody, dilute 1 in 50 |
| Anti-SM22 alpha antibody, rabbit polyclonal | Abcam | ab14106 | Primary antibody, dilute 1 in 250 |
| Goat anti-rat IgG (H+L)Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A11007 | Secondary antibody, dilute 1 in 500 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L)Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | Secondary antibody, dilute 1 in 500 | |
| Goat anti-Armenian Hamster IgG (H+L)Alexa Fluor 488 | Abcam | ab173003 | |
| Goat anti-rat IgG (H+L)Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21208 | Secondary antibody, dilute 1 in 500 |
| Phenolic screw cap | Wheaton | 240408 | |
| Benzyl alcohol | Sigma | 402834 | |
| Benzyl benzoate | Sigma | B6630 | |
| Imaris | Bitplane Imaging | image analysis software | |
| ImageJ software | NIH | Freeware |
References
- Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).
- Tian, X., et al. Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries. Cell Res. 23 (9), 1075-1090 (2013).
- Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).
- Klotz, L., et al. Cardiac lymphatics are heterogeneous in origin and respond to injury. Nature. 522 (7554), 62-67 (2015).
- Nam, J., et al. Coronary veins determine the pattern of sympathetic innervation in the developing heart. Development. 140 (7), 1475-1485 (2013).
- Zhu, D., Larin, K. V., Luo, Q., Tuchin, V. V. Recent progress in tissue optical clearing. Laser Photon. Rev. 7 (5), 732-757 (2013).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat. Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat. Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat. Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Zucker, R. M., Hunter, E. S., Rogers, J. M. Confocal laser scanning microscopy of morphology and apoptosis in organogenesis-stage mouse embryos. Methods Mol. Biol. 135, 191-202 (2000).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat. Protoc. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Erturk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. J. Vis.Exp : JoVE. (89), (2014).
- Dyer, L. A., Wu, Y., Patterson, C. Protein isolation from the developing embryonic mouse heart valve region. J. Vis.Exp s : JoVE. (91), e51911 (2014).
- Wilsbacher, L. D., Coughlin, S. R. Analysis of cardiomyocyte development using immunofluorescence in embryonic mouse heart. J. Vis.Exp : JoVE. (97), (2015).
- StitchArt Guide for Zen 2010. , Zeiss. Available from: http://www.google.co.uk/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&ved=0ahUKEwjC6OPVnO7NAhVD7RQKHQzqALkQFggcMAA&url=ftp%3A%2F%2Fftp.sonic.net%2Fpub%2Fusers%2Flhund%2FMMP%2FBlurWin2012%2FHelpful Docs%2FTiling_and_Stitching in Zen.pdf&usg=AFQjCNH4C6dv8bdmKC651sp_CFz4C1Rq3g (2010).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Tian, X., Pu, W. T., Zhou, B. Cellular origin and developmental program of coronary angiogenesis. Circ. Res. 116 (3), 515-530 (2015).
- Ivins, S., et al. The CXCL12/CXCR4 Axis Plays a Critical Role in Coronary Artery Development. Dev. Cell. 33 (4), 455-468 (2015).
- Theveniau-Ruissy, M., et al. Coronary stem development in wild-type and Tbx1 null mouse hearts. Dev. Dyn : an official publication of the American Association of Anatomists. 245 (4), 445-459 (2016).
- Tomanek, R. J. Formation of the coronary vasculature during development. Angiogenesis. 8 (3), 273-284 (2005).
- Chen, H. I., et al. VEGF-C and aortic cardiomyocytes guide coronary artery stem development. J. Clin.Iinvest. 124 (11), 4899-4914 (2014).
- Tian, X., et al. Vessel formation. De novo formation of a distinct coronary vascular population in neonatal heart. Science. 345 (6192), 90-94 (2014).
