Summary
Apresenta-se um protocolo para a análise dos vasos coronários em corações inteiros de murino embrionárias até E15.5, utilizando métodos de coloração imunológicas convencionais seguido pela depuração da óptica e microscopia confocal. Esta técnica permite a visualização dos vasos sanguíneos ao longo de todo o coração, sem a necessidade de uma análise demorada de secções seriadas.
Introduction
Estabelecer uma rede coronária funcionamento é crucial para a função cardíaca e desenvolvimento embrionário, e análise de mutantes genéticos do rato podem fornecer informações valiosas sobre os sinais moleculares subjacentes a este processo de desenvolvimento. A capacidade de visualizar o plexo coronárias embrionárias como um todo, em vez de apresentado de uma série de cortes histológicos, é essencial para facilitar a análise de padrões navio em mutantes genéticos, e evita a perda potencial de informação que pode ocorrer como resultado de mecânica o corte do tecido. Vasos fadado para formar artérias e capilares são localizados no fundo das paredes de ambos os ventrículos e aorta 1-3. No entanto, ao mesmo tempo marcação fluorescente de células combinadas com microscopia laser confocal de varrimento pode fornecer imagens de alta resolução dos vasos venosos superficiais wholemount marcado linfáticos / 4,5, a profundidade da imagem é limitada pela penetração óptico. imagens de alta resolução da tampaillaries artérias e ao longo de toda a profundidade do coração não é, portanto, possível, sem alguma forma de compensação de tecido.
Óptico penetração pobre é causado pela alta índice de refracção do múltiplo celular e extracelular (por exemplo, o colagénio e as fibras elásticas) componentes de tecidos espessos. Isto espalha a luz de imagem, causando ofuscamento e diminuiu contraste. agentes de compensação tipicamente coincide com o índice de refracção elevado de tais tecidos, o que significa que a luz pode viajar através da amostra desobstruída e penetrar mais fundo no tecido. Antes de compensação, os tecidos são geralmente desidratado como a água tem um índice de refracção relativamente baixo. Uma pletora de novos métodos de compensação foram desenvolvidos recentemente, no entanto, dependendo da técnica utilizada, o processo de limpeza pode levar dias ou semanas e pode necessitar de reagentes dispendiosos 6-9. BABB (uma mistura 1: 2 de álcool benzílico e benzoato de benzilo) é, um agente de compensação utilizada de baixo custo, que tem ovantagem de limpar as amostras de forma extremamente rápida. Técnicas de limpeza e formação de imagens baseada-BABB foram descritos anteriormente para as amostras neurológicas e vários órgãos 10-13. Aqui nós descrevemos uma técnica robusta e direta para o apuramento BABB de amostras imunomarcadas seguido por microscopia confocal, com referência específica ao exame dos vasos sanguíneos no coração murino de E (dia embrionário) 11,5-15,5. No entanto, como também já foi demonstrado, a técnica pode ser igualmente bem aplicado para a análise de embriões inteiros, bem como outros tipos celulares, contanto anticorpos como de alta qualidade para os marcadores de interesse estão disponíveis.
Protocol
Toda a pesquisa animal foi realizada em conformidade com as diretrizes institucionais sob licença do UK Home Office.
1. Dissecção e Fixação de Embrionárias Corações
- Euthanize um rato cronometrado-grávida no dia desejado usando uma técnica de abate eticamente aprovado, por exemplo, o CO 2 narcose seguido por deslocamento cervical, e remover os sacos embrionários 14, colocando-os em uma placa de Petri 10 centímetros preenchido com tampão fosfato salino (PBS) .
- Usando um microscópio de dissecção e uma pinça, abrir-se cuidadosamente os sacos uterinos e remover cada embrião, cortando o cordão umbilical e a remoção do saco vitelino.
- Para fins de genotipagem, remova a cauda embrionária e coloque em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para a extração de lise / DNA mais tarde.
- A fim de remover o coração, o pino cada embrião para fora sobre as suas costas num silicone 35 milímetros de Petri revestidas de elastómero PBS-cheia, utilizando pinos de aço inoxidável minutien. Usando uma pinça fina, carefully abrir o peito e cortar os grandes vasos, anterior ao coração. Então chegando atrás do coração com a pinça, segure os vasos por trás do coração e puxe para remover o coração; os pulmões pode também vir de distância ao mesmo tempo.
- Transferir o coração para uma placa de Petri 35 milímetros fresco contendo PBS e utilizar uma pinça fina para aparar o tecido pulmonar, se necessário. Em seguida, transferir o coração a um poço de uma placa de 48 poços com PBS frio.
- Depois de recolher todos os corações na placa de 48 poços, aspirar o PBS com uma pipeta de Pasteur de plástico de ponta fina e substituir com 0,5 ml de paraformaldeído a 4% (PFA).
CUIDADO: PFA é um conhecido por ser alergénicos, cancerígenos e tóxicos.- Fix E11.5 - 12,5 corações durante 15 minutos, os corações E13.5 durante 20 min e E14.5 - 15,5 corações durante 30 min, em PFA a 4%, à temperatura ambiente.
- Aspirar o PFA com uma pipeta de Pasteur de plástico de ponta fina e enxaguar os corações 2x em PBS frio.
CAUTION: PFA é perigoso e deve ser eliminado de acordo com as normas institucionais. - Se não utilizar imediatamente para toda a imunocoloração de montagem (ver secção 2), desidratar os corações através da realização de sucessivas 5 min lavagens nas seguintes soluções: 25% de metanol / 75% PBS, 50% de metanol / 50% PBS, 75% de metanol / 25 % PBS.
CUIDADO: O metanol é tóxico, usar luvas. Armazenar os corações a -20 ° C em metanol a 100%.
2. Whole Mount imunocoramento embrionárias corações com Anti-PECAM1 Antibody
NOTA: Os anticorpos anti-PECAM1 funcionar bem para a coloração dos vasos coronários (ver passo 2.4), mas qualquer marcador pan-endotelial, que dá um sinal robusto seria adequado.
- Se usando corações que foram armazenados em 100% de metanol, a transferência para tubos de 1,5 ml de microcentrífuga e hidratar efectuando sucessivos 5 min lavagens com as seguintes soluções: 75% de metanol / 25% de PBS, 50% de metanol / 50% de PBS e 25% metanol / 75% PBS. Permeabilizar o coração através da realização de 3 x 10 min lavagens em 0,5-1,0 mL de PBST (PBS / 0,1% de Tween-20), em rotação à temperatura ambiente.
- Bloquear os corações por rotação durante 1 hora à temperatura ambiente em soro de cabra a 1,0 ml de 10% em PBST.
- Remover tampão de bloqueio com um plástico Pasteur pipeta de ponta fina ou 1.000 ul ponta da pipeta e substituir com 400 - 500 ul bloco fresco contendo o anticorpo primário anti-PECAM1 diluída 1:50. Rodar os tubos durante a noite a 4 ° C.
- No dia seguinte, aspirar o anticorpo bloco / primária com uma pipeta de Pasteur de plástico de ponta fina ou 1.000 ponteira ul e realizar pelo menos 6x 1 lavagens h em 1,0 ml de PBST, girando os tubos à temperatura ambiente.
- Substituir a última lavagem com tampão de bloqueio fresco contendo o anticorpo secundário conjugado com fluoróforo-diluído a 1: 500, e incubar durante a noite a 4 ° C, com rotação. Proteger da luz envolvendo os tubos em alumínio.
- No dia seguinte, aspirar o bloco / seganticorpo secundá- com uma pipeta de Pasteur de plástico de ponta fina e realizar pelo menos 6x 1 lavagens h em 1,0 ml de PBST, girando os tubos à temperatura ambiente.
- Armazenar os corações a 4 ° C (protegido da luz) até ser necessário.
3. Preparação de Soluções de Compensação e pratos Microscopia
NOTA: Quando imagiologia de corações em BABB é vital que nenhuma das Babb a solução entra em contacto com os componentes do microscópio. Para este efeito, o protocolo seguinte contém instruções para a preparação de pratos de silicone selado-de elastómeros adequados para a microscopia de fluorescência, que podem ser preparados com antecedência. O elastómero de silicone proporciona uma barreira para conter o BABB e impedi-la de escorrer potencialmente entre o fundo de vidro e os lados de policarbonato do prato.
- Para preparar o silicone pratos revestidos de elastómero, tomam ópticos pratos de cultura de vidro de fundo e colocar uma tampa de um frasco de 4 ml parafuso superior (cerca de 1,5 cm de diâmetro) No centro de cada prato.
NOTA: Este vai formar um poço para a amostra quando o elastómero é aplicada ao prato. - Encher os pratos com elastómero de silicone a uma profundidade de aproximadamente 0,5 cm, utilizando um cartucho aplicador para misturar os dois componentes à medida que são aplicados, de acordo com as instruções dos fabricantes. Deixar a curar durante pelo menos 24 horas, certificando-se de que a tampa do frasco permanece no centro de cada prato.
NOTA: Use óculos de segurança para evitar o contacto acidental do elastômero de silicone com os olhos. - Depois da cura do elastómero, remover a tampa do frasco de cada prato, isto irá deixar uma cavidade central em que a amostra a ser trabalhada pode ser colocada em contacto directo com o fundo de vidro do prato.
NOTA: quando o elastómero curado deve ser firme e seca ao toque. - Preparar a solução de BABB (álcool benzílico de 1 parte a 2 partes de benzoato de benzilo). Isto deve ser armazenado num frasco de vidro e protegido da luz.
CUIDADO: BABB é uma solução tóxico, corrosivo. Manusear de um exaustor enquanto vestindo vestuário de protecção adequado. - Mistura BABB e metanol para fazer uma solução 50/50 (1 - 5 ml) num frasco de vidro. Proteger da luz, por exemplo, envolvendo o frasco em folha.
4. Desidratação, Compensação e montagem dos corações para microscopia confocal
NOTA: As amostras maior pode ser limpo em frascos de 4 ml de vidro, no entanto, para pequenas amostras (por exemplo, coração até E13.5) é melhor levar a cabo o processo de compensação directamente no prato microscopia. Isso ajuda a evitar "perder" as amostras como os corações se tornam muito transparente, uma vez apagada. Por essas pequenas amostras de compensação é muito rápido, ocorrendo em poucos minutos.
NOTA: Proteja as amostras da luz Durante a todas as seguintes etapas envolvendo / cobrindo tubos e pratos com papel alumínio.
- Antes de limpar, desidratar os-corações imunomarcadas através de uma série de metanol girando os corações na tempe quartotura num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml em alterações sucessivas dos seguintes soluções: 25% de metanol / 75% de PBS, 50% de metanol / 50% de PBS e 75% de metanol / 25% de PBS (5 min cada). Finalmente, rodar para 3 x 5 min em 100% de metanol.
- Para corações até E13.5, coloque no centro do prato de microscopia; sob o microscópio assegurar o coração está orientada com o seu lado mais superior dorsal. Remova qualquer metanol de todo o coração com uma pipeta de plástico Pasteur de ponta fina.
- Usando um Pasteur de plástico pipeta de ponta fina e limpa, adicione BABB: metanol 50:50 solução num volume suficiente para mergulhar o coração (aproximadamente 300-400 mL). Como o coração às vezes pode virar na solução, verifique a orientação novamente, enquanto os corações ainda são opacos. Deixar na solução durante 5 minutos.
- Remover a solução de 50:50 a um frasco de resíduos de vidro no exaustor e substituir com BABB, novamente usando uma pipeta de plástico Pasteur de ponta fina.
NOTA: Um grande volume não é necessário; adicionar sufficient modo que o coração fica dentro de uma gota de solução. O coração deve limpar dentro de 5 min. - Para corações maiores, limpar as amostras em frascos de vidro.
NOTA: Um coração E15.5 deve limpar dentro de 30 min-1 hr, mas pode ser deixado durante a noite, se necessário. - Depois da amostra é clara, remover a solução e substituir por um volume mínimo de BABB. Opcionalmente, cobrir a amostra com uma lamela, para ajudar a mantê-lo no lugar, no entanto, este não é absolutamente necessário. Use o coração para a imagem latente.
5. de imagem Cleared corações por microscopia confocal
NOTA: As imagens foram capturadas em um microscópio confocal invertido usando 10X ou 20X objectivos secos. Embora seja possível utilizar os pratos num confocal na posição vertical, um cuidado especial deve ser tomado para evitar o contacto do objectivo com a solução BABB.
- Colete um z-scan do coração 15. Dependendo do tamanho do coração, uma varredura azulejo pode ser necessária para a imagem inteira do coração 16.
ATENÇÃO: BABB é uma solução corrosiva, usar luvas limpas e garantir o exterior do prato de microscopia é livre de BABB. Lidar com o prato com cuidado e manter a tampa no prato para minimizar o risco de derrame acidental sobre o microscópio. - Se a distância de trabalho objectivo permitir, usar uma ampliação maior para atingir imagens de alta resolução de regiões de interesse.
6. Análise de Dados Usando Fiji Software
- Abra a pilha z de imagens em Fiji 17.
- Para fazer projeção az de toda a pilha ou parte dele, clique na imagem e selecione Stack, seguido pelo projeto Z. Digite o início e parar números fatia e selecione o tipo de z projeção, por exemplo, intensidade média, a intensidade máxima.
- Para realçar os vasos individuais dentro de uma pilha de fatias de imagem usam a ferramenta de sopro (da selecione Segmentação do menu Plugins, e depois Funda / ferramenta Lasso) e clique nas áreas da imagem a ser preenchido eafatia ch. Use o comando Fill (clique em Editar, em seguida, selecione Fill) para preencher as áreas selecionadas com a cor de primeiro plano de escolha (clique em Editar, em seguida, selecione Opções, seguido de Cores e Primeiro Plano).
- projeto de Z a imagem empilhar como antes.
7. renderização em 3D da superfície Volume de Artérias Coronárias gerado usando Imaris
- Clique no ícone Ultrapasse vista no topo da tela e arrastar e soltar o arquivo de imagem para a janela de dados. Clique no ícone 3D View, na parte superior da tela.
- Selecione o ícone de superfícies (ícone azul) e, em seguida, clique na guia criar. Clique na caixa de diálogo 'Ir criação automática, editar manualmente "e clique no ícone Draw (ícone de lápis fina).
- Selecione a guia Contorno, e então na aba Modo. Em Modo, clique na varinha mágica ou ícones de isolinhas. Escolha o modo de ponteiro na seleção do ponteiro no lado direito da tela, clicando ao lado de "Select", em seguida, clique no botão "Desenhar9; box (no canto inferior esquerdo da tela).
- Use o isolinha ou ferramenta varinha mágica para selecionar os contornos das artérias em fatias sucessivas. Navegar de fatia a fatia usando o controle deslizante Fatia posição.
- Quando todos os contornos foram selecionados, clique na caixa Criar Superfície. O volume circundante pode ser tornada invisível, ou tornado mais ou menos opaca usando o modo de mistura; clique no Volume para destacá-lo e, em seguida, selecione a guia Configurações, seguido pelo separador Mode. Selecione Mistura e use o controle deslizante para alterar a opacidade.
- Capturar imagens usando a função Snapshot.
Representative Results
À medida que o coração se desenvolve, o miocárdio ventricular é invadido por células endoteliais (ECs) a partir de várias fontes, e um plexo vascular é formado. As embarcações que se desenvolvem dentro do miocárdio ventricular vai continuar a formar as redes capilares arteriais e entregando o sangue oxigenado para o tecido cardíaco 18. Ao mesmo tempo (cerca de E11.5) a coronária hastes começam a desenvolver-se independentemente de uma rede capilar separado (conhecido como o plexo peritruncal) que rodeia o lúmen da aorta 14,19,20. Plexo Peritruncal ECs inicialmente formar múltiplas ligações com o lúmen da aorta ao nível dos seios da válvula, porém, finalmente, apenas um vaso persistirá em cada lado da aorta, indo para formar as raízes das artérias coronárias esquerda e direita 21. De todo E13.5 o peritruncal e ventriculares vasos do miocárdio juntar-se para formar uma rede interligada, permitindo o fluxo de sangue a partir da umaorta nos vasos coronários 14,22. A coloração das células endoteliais com anti-PECAM-1 de anticorpos, associado ao esvaziamento das Babb o coração intactos, permite a análise das redes coronárias em desenvolvimento desde as primeiras fases possíveis. Nas fases posteriores de desenvolvimento, também pode ser examinada a padronização das artérias coronárias em maturação. Este método também pode ser utilizado para corar a vasculatura de embriões inteiros (E11.5 até pelo menos), e com anticorpos diferentes, por exemplo, anti-alfa actina de músculo liso (Sm22α) e Endomucin.
A Figura 1 mostra o máximo de intensidade z-projeções de um coração E11.5 gerados usando software Fiji. A função Tile foi utilizado para coletar várias imagens parciais do coração e uni-las em uma imagem completa; isto é útil para dar uma visão geral de coloração em toda a amostra. Neste anticorpo estágio PECAM1 manchas principalmente o forro do endocárdio do coração e saída vessels, no entanto algumas células endoteliais pode também ser observado na parede do ventrículo esquerdo (região em caixa da Figura 1A, mostrado ampliado em 1A '). Além disso, o plexo peritruncal pode ser claramente observada na parede da via de saída (OT) (região em caixa da Figura 1B). Neste último caso, a redução do número de fatias na Z-pilha utilizada para gerar a projecção melhorada a clareza da imagem, permitindo que as ligações com o lúmen da aorta para ser visualizado mais distintamente (Figura 1B '). Na Figura 2, o aumento da vasculatura proximal da aorta pode ser observada em E12.5 um coração. A Figura 3 mostra o plexo peritruncal num coração E12.5. A projecção 12 Z-fatia na Figura 3A mostra todo o plexo, no entanto, como alguns vasos estão localizados ventral para o lúmen da aorta (que também é fortemente coradas por anticorpo anti-PECAM1), dividindo a pilha de Z-inpara um número de sub-pilhas (Figura 3B-D) fornece mais informação visual. Por exemplo, o sub-pilha projectada na Figura 3B mostra um navio peritruncal ligar à superfície ventral do lúmen da aorta, o que não é visível na projecção completa. A Figura 4 mostra parte de um coração E15.5; as artérias coronárias são claramente visíveis nesta fase (Figura 4A, a projecção 30 fatias). Nas projecções z 5-fatia mostrados nas Figuras 4B e C, as válvulas aórtica e pulmonar também pode ser visualizada por coloração com PECAM1; os ramos e interconexões da rede capilar coronária também são mais clara nessas projeções sub-stack menores. Técnicas de segmentação manuais foram usados para destacar as artérias coronárias utilizando Fiji (Figura 4D) ou Imaris (Figura 4D e E). A renderização de volume 3D superfície das artérias coronárias / luz aórtica gerado uImaris cante podem ser vistos com ou sem a vasculatura circundante (Figura 4E e F).
A vasculatura de embriões inteiros também pode ser corado pelo PECAM1 / BABB apuramento. A Figura 4A e A ', mostram projecções z gerados a partir de sub-pilhas a partir do lado direito (z fatias 11 - 65) e do lado esquerdo (z fatias 66-110) do embrião, respectivamente. A comparação das duas imagens mostra que a intensidade do sinal fluorescente não diminuiu de forma significativa com a penetração mais profunda do tecido. Na Figura 4B, PECAM1 (sinal vermelho) e Endomucin (sinal verde) anticorpos foram combinados para identificar as artérias intersomitic (ISA) e veias, respectivamente, de um embrião E11.5. A Figura 4C mostra SM22α (sinal vermelho) e coloração PECAM1 (sinal verde) das ISA em um embrião E11.5. Na Figura 6 embriões E11.5coradas com PECAM 1 foram fotografadas imediatamente após depuração BABB (Figura 4A), ou após um intervalo de cerca de dois meses (Figura 4B). O sinal fluorescente ainda era forte o suficiente para a imagem com êxito após um armazenamento prolongado da amostra em BABB.
Figura 1. A imunocoloração de um coração E11.5 com Anti-PECAM1 Antibody (detectado com anti-IgG de rato conjugado com Alexa 594). (A, B) uma imagem de 2 x 2 de azulejos foram obtidos utilizando o objetivo 10X de um microscópio confocal invertido. PECAM1 manchas de anticorpos tanto endocárdio ea ECS vascular. As projecções (intensidade máxima) foram gerados a partir de 22 (A) ou 5 (B) z fatias cada um de espessura 4 mm, utilizando o software Fiji. A 'e B' são ALARGAMENTTS das áreas encaixotados em A e B, respectivamente. Setas em A 'indicam vasos sanguíneos na parede do ventrículo; em B ', o suporte indica o plexo peritruncal. OT, via de saída; VE, do ventrículo esquerdo, RV ventrículo direito. Todas as imagens são vistas frontais. As barras de escala em A e B = 200 um; barras de escala em A 'e B' = 100 uM. Painel 1B 'foi adaptado de Ivins et al., 2015 19. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. A imunocoloração de um coração E12.5 com Anti-PECAM1 anticorpo. O painel A mostra projeção az (intensidade máxima) de uma varredura 2x2 azulejos. A região encaixotado A é mostrado enlarged em A '; setas indicam múltiplos vasos sanguíneos proximal à aorta (Ao). VE, do ventrículo esquerdo, RV ventrículo direito. Todas as imagens são vistas frontais. barra de escala em A = 200 mm; barra de escala em A '= 100 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Imagem da Peritruncal Plexus em um coração E12.5. imagens confocal de uma aorta E12.5 (Ao) coradas com anticorpo anti-PECAM1 foram recolhidos usando a objetiva de 10X. A projecção z (intensidade máxima) em A foi gerado a partir de 12 fatias z (4 mm de espessura); setas indicam os vasos do plexo peritruncal. O BD 12 fatias z foram divididos em três sub-pilhas tal como indicado e usado para gerar projecti separadaons; As setas indicam ligações formadas pelo plexo peritruncal para o lúmen da aorta. Peritruncal vasos localizados ventral para o lúmen da aorta são visíveis em B e C. Todas as imagens são vistas frontais. Barra de escala = 50 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. artérias coronárias e Capilar Plexus em um coração E15.5. imagens confocal de um coração E15.5 coradas com anticorpo anti-PECAM1 foram recolhidos usando a objetiva de 10X. O painel A mostra uma projecção de intensidade máxima z gerado a partir de 30 fatias z (4 mm de espessura); setas indicam as artérias coronárias esquerda e direita (LCA e RCA) que pode ser visto de ligação à aorta (Ao). usando different 5 z fatia sub-empilha as valvas aórtica e pulmonar (AOV e PV) pode ser visto na B e C, respectivamente (suportes azuis). O plexo capilar ventricular também é mais clara nessas projeções sub-stack menores; vasos sanguíneos proximais a válvula pulmonar (pequena caixa) o são mostrados ampliada no canto inferior direito do painel C (caixa grande). Fiji foi usada para realçar os vasos sanguíneos individuais, por exemplo, para o painel D a ferramenta Sopro / lasso foi usado para preencher as artérias coronárias com vermelho manualmente em cada z fatia antes da projeção. Software Imaris foi usada para criar imagens em 3D das artérias (vermelho) e luz aórtica (verde) em E e F; novamente este foi feito manualmente, utilizando a ferramenta varinha mágica para criar contornos de objetos em cada fatia z. A opacidade do volume envolvente pode ser alterada em modo de mistura, como em E. Alternativamente, a imagem 3D pode ser extraído, como mostrado na F esquerdo. Todas as imagens são vistas frontais. barra de escala em A = 100 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Imagem de Embryonic Vasculature. Painéis A e mostram imagens confocais de um E10.5 tipo selvagem embrião coradas com anticorpo anti-PECAM1, recolhidos utilizando o objetivo de 10X (varredura de azulejos) A '. Projecções z intensidade média foram gerados a partir de fatias z 11-65 (A) e 66-110 (A ') de uma fatia de digitalização 120 Z (4 uM fatias de espessura), que mostram apenas uma ligeira perda de intensidade de fluorescência em toda a espessura do embrião . O painel B mostra os vasos intersomitic de um embrião E11.5 corados com Antibod s contra PECAM1 (sinal vermelho do anticorpo secundário 594 conjugado) e Endomucin (EMCN, sinal verde do anticorpo secundário 488 conjugado), que mancham as artérias intersomitic (seta) e veias (seta), respectivamente (média de projecção intensidade z de uma telhada digitalizar). O painel C mostra artérias intersomitic (ISA) de um E11.5 tipo selvagem embrião coradas com anticorpos contra PECAM1 (sinal verde do anticorpo secundário 488 conjugado) e SM22α (sinal vermelho do anticorpo secundário 594 conjugado). imagens confocais foram coletadas usando o objetivo seca 20X e usado para gerar projeções de intensidade máxima z. Todas as imagens são vistas sagital. As barras de escala em A e B = 250 um, barra de escala em C = 100 uM. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 6. As amostras imunocoradas apuradas em BABB Reter fluorescente sinal durante pelo menos dois meses. embriões E11.5 foram coradas com anticorpo PECAM1 e limpou com BABB; embriões a partir do mesmo lote foram fotografadas imediatamente ou após um intervalo de dois meses. O painel A mostra as artérias intersomitic do embrião fotografada imediatamente e o painel B mostra o embrião fotografada dois meses mais tarde. imagens confocais foram coletadas usando o objetivo seca 10X e usado para gerar projeções de intensidade máxima z. Dão, aorta dorsal. Imagens mostram vistas sagital. As barras de escala em A e B = 100 uM. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
vasos coronários em corações embrionárias inteiras foram fotografadas pela imunocoloração wholemount com o anticorpo anti-PECAM1 seguido de apuramento óptica e microscopia confocal. O método simples descrito aqui, para o apuramento dos corações embrionárias de rato com BABB, aumenta a penetração óptica e permite a captura de imagens de alta resolução dos vasos sanguíneos localizados nas paredes da aorta e ventriculares. Reagentes de montagem à base de glicerol, tais como Vectashield (índice de refracção 1,45), também têm sido utilizados para imagiologia da vasculatura coronária 22, no entanto, o índice de refracção mais elevado de BABB (1,56) reduz a dispersão de luz ainda mais, permitindo uma penetração mais profunda do tecido. apuramento tecido evita a necessidade de formas mais complexas, caras de microscopia como multiphoton e microscopia folha de luz que pode ser menos prontamente disponíveis para os pesquisadores. O processo de limpeza é extremamente rápida em comparação com outros métodos de 6-9 e para pequenas amostras pode ser carried utilizando pequenos volumes de reagentes directamente sobre o prato de microscopia. robusta coloração da vascularização é necessária, a fim de obter imagens de alta qualidade; anticorpo anti-PECAM1 foi seleccionado, uma vez que todos os tipos de marca ECs coronária e um número de anticorpos comerciais foram encontrados para dar adequadamente elevados níveis de coloração. Além disso, a coloração fluorescente parece ser extremamente estáveis em BABB; As amostras armazenadas à temperatura ambiente em BABB (protegida da luz) mantiveram o seu sinal de fluorescência durante vários meses. O facto de o anticorpo PECAM1 eficientemente rotula o endocárdio coronária, bem como a vasculatura foi ocasionalmente problemático, especialmente quando a captura de imagens do plexo peritruncal. coloração mais forte da luz aórtica em comparação com o ECs peritruncal resultou em um risco de excesso de saturação em algumas áreas das imagens, o que significa que foi necessário um ajuste cuidadoso dos parâmetros de imagem. Idealmente, uma única coloração com anticorpo vascular ECs seria usado; na prática,no entanto, encontrar anticorpos adequados que produzam o nível requerido de coloração wholemount pode ser difícil. Recentemente, a proteína de ligação de ácido gordo 4 (FABP4) foi demonstrado ser um marcador de células endoteliais vasculares coronárias e 23 podem, portanto, representar uma alternativa para PECAM1.
A fim de manter a morfologia 3D das câmaras aorta e coração as amostras não eram flat-montados, mas em vez disso foram fotografadas em pratos com fundo de vidro. A profundidade das amostras a ser trabalhada impediu o uso de objetivos de alta ampliação, devido às suas distâncias de trabalho curtas. imagens no entanto de alta resolução ainda eram realizáveis usando uma objetiva de 10X, aumentando o tempo de permanência de pixels e utilizando um tamanho de matriz de pixels de pelo menos 1.024 x 1.024 para captura de imagem. Este foi suficiente para a análise da estrutura e a distribuição dos vasos coronários, no entanto a análise fina de estrutura celular pode exigir-montagem fixa de amostras. A dissecção das peças individuais do coração para a montagem,por exemplo, paredes ventriculares, ou na aorta, também pode ser necessário. Alternativamente, a sobre-amostragem da imagem seguido pela desconvolução pode ser levada a cabo, a fim de aumentar a resolução e sensibilidade; Este, porém, requer consideravelmente mais tempo de análise e cria arquivos de imagem muito grandes que exigem uma grande quantidade de energia para processar computação.
Corações até E15.5 foram fotografadas com sucesso usando este método, e é também possível analisar a vasculatura de embriões inteiros (até pelo menos E11.5) utilizando o mesmo protocolo. Outros tipos de células, por exemplo, células do músculo liso também foram visualizados no nosso laboratório usando esta técnica. Para tecidos mais grossos, por exemplo, corações mais de E15.5, a penetração do anticorpo pode ser um fator limitante; incubações mais longas e / ou aumento do detergente pode ser necessária. Além disso, quando a recolha de uma grande pilha de imagens z da intensidade do sinal pode ser reduzida como os lasers de penetrar nas porções mais distantes do tecido; No entanto, o confocal configurações podem ser ajustados para aumentar a potência do laser, com o aumento da distância Z.
Este método facilita a análise microscópica confocal de ambas as primeiras fases da formação de vasos coronários e padronização das artérias coronárias em fases posteriores de desenvolvimento. Informações pormenorizadas sobre a distribuição, estrutura e ramificação de vasos sanguíneos podem ser adquiridas num curto período de tempo, tornando esta uma ferramenta valiosa para o estudo de mutantes genéticos específicos do rato com defeitos nas vias de angiogénese.
Acknowledgments
O trabalho foi financiado pela British Heart Foundation'and apoiado pelo Instituto Nacional de Pesquisa em Saúde Centro de Investigação Biomédica no Great Ormond Street Hospital for Children NHS Foundation Trust e da University College London.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Life Technologies | 14190-094 | |
| Forceps | FST | 11251-30 | |
| 10 cm Petri dishes | Falcon | 351029 | |
| 35 mm Petri dishes | Sigma | P5112 | |
| Stainless steel minutien pins 0.2 mm diameter | FST | 26002-20 | |
| Fine tip pastettes | Alpha Laboratories | LW4061 | |
| 1,000 ml pipette tips | Sorenson | 34000 | |
| 48-well plate | Falcon | 353078 | |
| Kwik-Gard | World Precision Instrument | KWIKGARD | Silicone elastomer Sylgard184 packaged in a cartridge for mixing and dispensing |
| Kwik-Gard refill | World Precision Instrument | KWIKGLUE | Refill cartridges and dispensing tips |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Make up in PBS and store at -20 °C |
| 100% methanol | VWR | 20847307 | |
| Tween®20 | Sigma | P1379 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Anti-PECAM1 antibody, rat anti-mouse | BD Pharmingen | 553370 | Primary antibody, dilute 1 in 50 |
| Anti-CD31 polyclonal, rabbit polyclonal | Abcam | ab28364 | Primary antibody, dilute 1 in 50 |
| Anti-CD31/PECAM1 clone 2H8, armenian hamster monoclonal | Thermo Fisher Scientific | MA3105 | Primary antibody, dilute 1 in 400 |
| Endomucin antibody (V.7C7), rat monoclonal | Santa Cruz Biotechnology | sc-65495 | Primary antibody, dilute 1 in 50 |
| Anti-SM22 alpha antibody, rabbit polyclonal | Abcam | ab14106 | Primary antibody, dilute 1 in 250 |
| Goat anti-rat IgG (H+L)Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A11007 | Secondary antibody, dilute 1 in 500 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L)Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | Secondary antibody, dilute 1 in 500 | |
| Goat anti-Armenian Hamster IgG (H+L)Alexa Fluor 488 | Abcam | ab173003 | |
| Goat anti-rat IgG (H+L)Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21208 | Secondary antibody, dilute 1 in 500 |
| Phenolic screw cap | Wheaton | 240408 | |
| Benzyl alcohol | Sigma | 402834 | |
| Benzyl benzoate | Sigma | B6630 | |
| Imaris | Bitplane Imaging | image analysis software | |
| ImageJ software | NIH | Freeware |
References
- Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).
- Tian, X., et al. Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries. Cell Res. 23 (9), 1075-1090 (2013).
- Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).
- Klotz, L., et al. Cardiac lymphatics are heterogeneous in origin and respond to injury. Nature. 522 (7554), 62-67 (2015).
- Nam, J., et al. Coronary veins determine the pattern of sympathetic innervation in the developing heart. Development. 140 (7), 1475-1485 (2013).
- Zhu, D., Larin, K. V., Luo, Q., Tuchin, V. V. Recent progress in tissue optical clearing. Laser Photon. Rev. 7 (5), 732-757 (2013).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat. Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat. Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat. Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Zucker, R. M., Hunter, E. S., Rogers, J. M. Confocal laser scanning microscopy of morphology and apoptosis in organogenesis-stage mouse embryos. Methods Mol. Biol. 135, 191-202 (2000).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat. Protoc. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Erturk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. J. Vis.Exp : JoVE. (89), (2014).
- Dyer, L. A., Wu, Y., Patterson, C. Protein isolation from the developing embryonic mouse heart valve region. J. Vis.Exp s : JoVE. (91), e51911 (2014).
- Wilsbacher, L. D., Coughlin, S. R. Analysis of cardiomyocyte development using immunofluorescence in embryonic mouse heart. J. Vis.Exp : JoVE. (97), (2015).
- StitchArt Guide for Zen 2010. , Zeiss. Available from: http://www.google.co.uk/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&ved=0ahUKEwjC6OPVnO7NAhVD7RQKHQzqALkQFggcMAA&url=ftp%3A%2F%2Fftp.sonic.net%2Fpub%2Fusers%2Flhund%2FMMP%2FBlurWin2012%2FHelpful Docs%2FTiling_and_Stitching in Zen.pdf&usg=AFQjCNH4C6dv8bdmKC651sp_CFz4C1Rq3g (2010).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Tian, X., Pu, W. T., Zhou, B. Cellular origin and developmental program of coronary angiogenesis. Circ. Res. 116 (3), 515-530 (2015).
- Ivins, S., et al. The CXCL12/CXCR4 Axis Plays a Critical Role in Coronary Artery Development. Dev. Cell. 33 (4), 455-468 (2015).
- Theveniau-Ruissy, M., et al. Coronary stem development in wild-type and Tbx1 null mouse hearts. Dev. Dyn : an official publication of the American Association of Anatomists. 245 (4), 445-459 (2016).
- Tomanek, R. J. Formation of the coronary vasculature during development. Angiogenesis. 8 (3), 273-284 (2005).
- Chen, H. I., et al. VEGF-C and aortic cardiomyocytes guide coronary artery stem development. J. Clin.Iinvest. 124 (11), 4899-4914 (2014).
- Tian, X., et al. Vessel formation. De novo formation of a distinct coronary vascular population in neonatal heart. Science. 345 (6192), 90-94 (2014).
