Summary
Biz optik açıklık ve konfokal mikroskobu ile takip standart immünolojik boyama yöntemleri kullanarak, E15.5 kadar bütün embriyonik fare kalplerinde koroner damarların analizi için bir protokol mevcut. Bu teknik, dizi bölgelerinin zaman alıcı analizi için gerek kalmadan tüm kalp boyunca kan damarlarının görselleştirme sağlar.
Introduction
İşleyen bir koroner ağının kurulması, bu gelişim sürecini altında yatan moleküler sinyalleri içine değerli bilgiler sağlayabilir kalp fonksiyonu ve embriyonik gelişim ve genetik fare mutantlar analizi için çok önemlidir. Bir bütün olarak, embriyonik koroner pleksusu görselleştirmek için yeteneği, çok histolojik kesitlerin bir dizi sunulmuştur daha genetik mutantlar damar desen analizini kolaylaştırmak için gereklidir, ve mekanik bir sonucu olarak meydana gelebilir bilginin potansiyel kaybını önler doku dilimleme. Arterleri oluşturmak için kaderde gemiler ve kılcal derin ventriküller ve aort 1-3 hem de duvarları içinde lokalizedir. Ancak, Wholemount etiketli yüzeysel venöz / lenfatik damarların 4,5 yüksek çözünürlüklü görüntülerini sağlayabilir lazer tarama konfokal mikroskobu ile birlikte hücrelerin floresan etiketleme ederken, görüntüleme derinliği optik nüfuz ile sınırlıdır. kapağın yüksek çözünürlüklü görüntülemeKalbin tüm derinliği boyunca illaries ve arterler doku temizleme çeşit olmadan mümkün değildir.
Kötü bir optik penetrasyon çoklu hücresel ve hücre dışı (örneğin, kollajen ve elastik liflerin) kalınlığındaki doku bileşenlerinin yüksek kırılma endeksi ile kaynaklanır. Bu, görüntüleme ışığı dağıtır bulanıklık neden ve kontrast azalmıştır. Yıkama maddesi tipik olarak, ışık engelsiz numune boyunca seyahat ve doku içine daha derine nüfuz edebilir, yani bu dokuların yüksek refraksiyon endeksi eşleşmesi. Su, nispeten düşük bir kırılma indisine sahip olduğu temizlemeden önce dokular genellikle suyu alınır. Yeni takas yöntemleri bir bolluk, ancak takas işlemi günler ya da haftalar sürebilir ve pahalı reaktifler 6-9 gerektirebilir kullanılan tekniğe bağlı olarak, son zamanlarda geliştirilmiştir. BABB (1: benzil alkol ve benzil benzoat: 2 karışımı) olan bir ucuz, yaygın olarak kullanılan temizleme maddesi, birSon derece hızlı bir şekilde örnekleri takas avantajı. BABB bazlı temizleme ve görüntüleme teknikleri nörolojik örnekleri ve çeşitli organlarda 10-13 daha önce tarif edilmiştir. 15.5 - Burada E (embriyonik gün) 11.5 den sıçangil kalplerinde kan damarlarının incelenmesi özel referansla, konfokal mikroskobu ile takip immunohistokimyasal örneklerin BABB temizlenmesi için sağlam ve basit bir teknik açıklanmaktadır. Ayrıca gösterilmiştir Bununla birlikte, teknik, aynı zamanda uzun bir ilgi belirteçleri olarak, yüksek kaliteli antikorlar kullanılabilir, tüm embriyo analizi, hem de diğer hücre tipleri de uygulanabilir.
Protocol
Tüm hayvan araştırmaları UK Home Office lisansı altında kurumsal kurallarına uygun olarak yürütülmüştür.
1. Diseksiyon ve Embriyonik Kalpler Fixation
- Etik açıdan onaylanmıştır itlaf teknik, sonra servikal dislokasyon yapılmıştır, örneğin CO2 narkozu ile istenen günde bir zamanlı gebe fare öldürülür ve fosfat tamponlu tuzlu su ile dolu bir 10 santimetrelik bir petri tabağına yerleştirilerek embriyonik keseleri 14 kaldırma (PBS) .
- göbek bağını kesilmesinin ve yolk sac çıkarmadan, dikkatle her embriyo rahim keseler açmak ve kaldırmak, bir mikroskop ve forseps kullanma.
- genotiplendirme amaçlı, daha sonra lizis / DNA ekstraksiyonu için 1.5 ml mikrosantrifüj tüp embriyonik kuyruk ve yer çıkarın.
- Paslanmaz çelik minutien işaretçilerine kullanarak, bir PBS dolu silikon elastomer kaplı 35 mm Petri kabındaki sırtında her bir embriyo dışarı, kalp kaldırmak pin için. Ince forseps ca kullanarakrefully göğüs açık ve büyük damarları sever, kalp ön. Sonra kalp arkasında damarları kavramak ve kalp kaldırmak için hafifçe çekin, forseps ile kalp arkasında ulaşan; Akciğerler aynı anda uzak gelebilir.
- PBS içeren taze bir 35 mm Petri kabı kalbi aktarın ve gerekirse, akciğer dokusunun uzak trim ince forseps kullanabilir. Daha sonra, soğuk PBS ile dolu bir 48-çukurlu plaka iyi kalp aktarın.
- 48-çukurlu plaka içindeki tüm kalpleri topladıktan sonra, ince uçlu bir plastik pastör pipeti ile PBS aspire ve 0.5 ml% 4 paraformaldehit (PFA) ile değiştirin.
UYARI: PFA, alerjik, kanserojen ve zehirli olduğu bilinen bir olduğunu.- Düzeltme E11.5 - oda sıcaklığında% 4 PFA içinde 30 dakika süreyle 15.5 kalpler, - 20 dakika karıştırıldı ve E14.5 12.5, 15 dakika boyunca kalpler, E 13.5 kalpler.
- ince uçlu plastik Pasteur pipeti ile PFA aspirat ve kalpleri 2x soğuk PBS ile durulayın.
cautION: PFA tehlikelidir ve kurumsal düzenlemelere uygun olarak bertaraf edilmelidir. - % 25 metanol /% 75 PBS,% 50 metanol /% 50 PBS,% 75 metanol / 25: tüm montaj immün için hemen kullanmaya değilse aşağıdaki çözümleri ardışık 5 dk yıkar yaparak kalpleri kurutmak, (bakınız bölüm 2) % PBS ile yıkandı.
DİKKAT: Metanol zehirlidir, eldiven giymek. % 100 metanol içinde -20 ° C'de kalpleri saklayın.
Anti-PECAM1 Antikor ile Embriyonik Hearts 2. Tüm Dağı immün
NOT: Anti-PECAM1 antikorları koroner damarları boyama için iyi çalışır, ancak uygun olacağını güçlü bir sinyal veren herhangi bir pan-endotelyal işaretleyici (adım 2.4).
- % 100 metanol saklanan kalpleri kullanılıyorsa, bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüplerine transfer aşağıdaki Çözeltilerin art arda 5 dakika yıkama yaparak rehidrate:% 75 metanol /% 25 PBS ve% 50 metanol /% 50 PBS ve% 25 metanol /% 75 PBS ile yıkandı. Oda sıcaklığında döner, 1.0 mi PBST (PBS /% 0.1 Tween-20) - 0.5, 3 x 10 dakika yıkama yaparak kalpleri geçirgenliği.
- PBST içinde 1.0 ml% 10 keçi serumu, oda sıcaklığında 1 saat süre ile döndürülmesi ile kalpleri bloke eder.
- ince uçlu plastik Pasteur pipeti veya 1000 ul pipet ile engelleme tamponu çıkarın ve 400 ile değiştirin - 01:50 seyreltilmiş anti-PECAM1 birincil antikor içeren 500 ul taze blok. 4 ° C'de bir gece tüpler döndürün.
- Ertesi gün, oda sıcaklığında tüpleri dönen, bir ince uçlu plastik Pasteur pipeti veya 1000 ul pipet ile blok / birincil antikor aspire ve 1.0 ml PBST en az 6x 1 saat yıkar yürütmek.
- 1 seyreltilmiş florofor-konjuge sekonder antikor içeren taze bloke tamponu ile son yıkama yerine: 500 ve rotasyon ile, 4 ° C'de gece boyunca inkübe edilir. folyo tüpler sararak ışıktan koruyunuz.
- Ertesi gün, blok / sn aspireince uçlu bir plastik pastör pipeti ile sekonder antikor, ve oda sıcaklığında tüpleri döner, 1.0 mi PBST içinde en az 1 saat 6x yıkama yapın.
- 4 ° (ışıktan korumalı) C kadar gerekli de kalpleri saklayın.
Takas Çözümleri ve Mikroskopi Yemekleri 3. hazırlanması
NOT: Babb kalpleri görüntüleme yaparken BABB çözümün hiçbiri mikroskop bileşenleri ile temas o hayati önem taşımaktadır. Bu amaç için, aşağıdaki protokolü de önceden hazırlanabilir floresan mikroskobu için uygun silikon elastomer sızdırmaz yemekler hazırlamak için talimatları içerir. silikon elastomer Babb içerir ve potansiyel olarak cam alt ve yemeğin polikarbonat tarafı arasında sızmasını önlemek için bir engel oluşturur.
- çapında silikon elastomer kaplı yemekler hazırlamak için, vida üst şişe, 4 ml bir kap optik cam tabanlı kültür kaplarına alıp koyun (yaklaşık 1.5 cm) Tabakların her merkezinde.
NOT: Elastomer çanak uygulandığında, bu örnek için bir kuyu oluşturacaktır. - üreticinin talimatlarına uygun olarak, uygulandıkları gibi iki bileşeni karıştırmak için bir uygulama kartuşu kullanılarak, yaklaşık olarak 0.5 cm derinliğe kadar silikon elastomer yemekler doldurun. Şişe kapağı her yemeğin ortasında kalır emin, en az 24 saat boyunca tedavi etmek için bırakın.
NOT: Göz ile silikon elastomer yanlışlıkla temasını önlemek için koruyucu gözlük kullanın. - elastomer sertleştikten sonra, her bir tabaktan şişe kapağı çıkarın Bu örnek çanak, cam alt ile doğrudan temas halinde yerleştirilebilir yansıması için merkezi bir kuyu bırakacaktır.
NOT: tedavi sırasında elastomer dokunulduğunda sert ve kuru olmalıdır. - (2 parça benzil benzoat 1 kısım benzil alkol) BABB çözeltisi hazırlayın. Bu, bir cam şişe içinde saklanan ve ışıktan korunmalıdır.
DİKKAT: BABB toksik, korozif bir çözümdür. Uygun koruyucu giysiler giyen ederken bir çeker ocak içinde taşıyınız. - bir cam şişede - (5 mi 1) karışımı BABB ve metanol 50:50 çözelti yapmak için. Folyo şişeyi sararak, örneğin ışık koruyun.
4. Dehidrasyon, Takas ve Konfokal Mikroskopi için Hearts montajı
NOT: Büyük örnekler ancak küçük örnekler için, 4 ml'lik cam şişelerde silinebilir (örneğin, E13.5 kadar kupa) o mikroskobu çanak doğrudan takas işlemini yürütmek için daha iyidir. Bu önlemeye yardımcı olur kalpleri bir kez temizlenmiş çok şeffaf olmak gibi örnekleri 'kaybetme'. Bu küçük örnekler için takas birkaç dakika içinde ortaya çıkan, çok hızlıdır.
NOT: / sarma folyo ile tüpler ve yemekleri kapsayan tüm aşağıdaki adımları sırasında ışıktan örnekleri koruyun.
- temizlemeden önce, oda tempe de kalpleri döndürerek bir metanol dizi immunohistokimyasal-kalpleri kurutmakAşağıdaki çözümlerden art arda değişikliklerin bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde rature: metanol /% 75 PBS ve% 50 metanol /% 50 PBS ve% 75 metanol /% 25 PBS (her biri 5 dakika),% 25. Son olarak, 100% metanol 3 x 5 dakika boyunca döner.
- yukarı mikroskopi çanak merkezinde E13.5, yere kalpleri için; mikroskop altında kalp dorsal yan en üstte şekilde yönlendirilir emin olun. ince uçlu plastik Pasteur pipeti ile kalbin etrafında herhangi metanol çıkarın.
- Temiz ince uçlu bir plastik pastör pipeti kullanılarak, Babb ekleyin: metanol, 50:50 solüsyonu kalp sokmak için yeterli bir hacimde (yaklaşık 300-400 ul). kalpler bazen çözeltide çevirmek gibi kalpleri hala opak iken, yine yönünü kontrol edin. 5 dakika boyunca çözelti içinde bırakın.
- davlumbaz cam atık şişesine 50:50 çözüm çıkarın ve tekrar ince uçlu bir plastik Pasteur pipeti kullanarak, Babb ile değiştirin.
NOT: Bir büyük hacimli gerekli değildir; SUFF eklemekicient böylece kalp çözeltisinin bir damlası içinde oturur. kalp 5 dakika içinde temizlemek gerekir. - Daha büyük kalpleri için, cam şişe numuneleri temizleyin.
NOT: Bir E15.5 kalp 30 dakika-1 saat içinde temizlemek gerekir ancak gerekirse bir gecede bırakılabilir. - Örnek açıktır sonra çözelti, kaldırıp Babb en az bir hacim ile değiştirin. İsteğe bağlı olarak, ancak bu mutlaka gerekli değildir, yerinde tutmak için yardımcı olmak için bir kayar kapak ile birlikte örnek kapsamaktadır. görüntüleme için kalbi kullanın.
Konfokal Mikroskopi 5. Görüntüleme Temizlendi Kalpler
NOT: Görüntüler 10X veya 20X kuru hedefleri kullanarak ters bir konfokal mikroskop ele geçirildi. bir dik konfokal yemekler kullanmak mümkün olsa da, ekstra bakım BABB çözeltisi ile objektif temasından kaçınmak için dikkat edilmelidir.
- Kalp 15 z-tarama toplayın. Kalbin boyutuna bağlı olarak, bir döşeme tarama görüntü tüm kalp 16 gerekebilir.
DİKKAT: BABB bir aşındırıcı bir çözümdür, temiz eldiven giymek ve mikroskopi çanak dışında Babb ücretsiz olduğundan emin olun. dikkatli çanak Kulp ve mikroskop üzerine kazara dökülme riskini en aza indirmek için çanak kapağı tutmak. - objektif çalışma mesafesi izin veriyorsa, ilgi alanlarının daha yüksek çözünürlüklü fotoğraf elde etmek için daha yüksek bir büyütme kullanmak.
Fiji Yazılım Kullanma 6. Veri Analizi
- Fiji 17 görüntülerin z yığınını açın.
- Bütün yığının veya bir kısmının az projeksiyonunu yapmak için, Görüntü tıklayın ve Z projesi takip Stack seçin. Başlat girin ve dilim numaraları durdurun ve z projeksiyon, örneğin, ortalama yoğunluk, maksimum yoğunluk türünü seçin.
- Şişirme aracı kullanmak görüntü dilimlerinin bir yığın içinde tek tek damarları vurgulamak (Eklentiler menüsünden seçin segmentasyonu gelen ve daha sonra Kement aracı / Darbe) ve görüntü alanlarına tıklayın ea doldurulacakch dilim. seçim ön plan rengiyle seçili alanları doldurmak için (o Dolgu seçin Düzenle üzerine tıklayın) Dolgu komutunu kullanın (Renkler ve Önalan tarafından takip Seçenekler, seçin, Düzenle üzerine tıklayın).
- görüntü olarak daha önce yığını Z projesi.
Koroner Arter 7. 3D Yüzey Volume Rendering Imaris kullanma Oluşturulan
- Ekranın üst kısmındaki Aşan görünümü simgesini tıklayın ve sürükle ve veri penceresine görüntü dosya açılır. Ekranın üst kısmındaki 3D Görünüm simgesini tıklayın.
- yüzeyler simgesine (mavi simge) seçin ve ardından Oluştur sekmesine tıklayın. 'Elle düzenlemek, otomatik oluşturmayı atla' iletişim kutusunda tıklayın ve Beraberlik simgesi (ince kalem simgesi) tıklayın.
- Kontur sekmesini ve ardından Mod sekmesini seçin. Modunda, sihirli değnek veya Isoline simgeleri tıklayın. 'Seç' yanındaki tıklayarak ekranın sağ taraftaki Pointer seçiminde ibre modunu seçin ve ardından 'Beraberlik tıklayın9; (Ekranın sol alt köşesinde) kutusu.
- ardışık dilimleri arterlerin hatlarını seçmek için Isoline veya sihirli değnek aracını kullanın. Dilim Pozisyonu kaydırıcısını kullanarak dilim dilim gidin.
- Tüm konturlar seçilmiştir olduğunda, Surface Oluştur kutusuna tıklayın. Çevredeki hacim görünmez hale veya Blend modunu kullanarak daha fazla veya daha az opak kılınabilir; vurgulayın ve ardından Mod sekmesine ardından Ayarlar sekmesini seçmek için Volume tıklayın. Blend seçin ve donukluk değiştirmek için kaydırıcıyı kullanın.
- Anlık işlevini kullanarak görüntüler çekin.
Representative Results
Kalp geliştikçe, ventriküler miyokardın çeşitli kaynaklardan endotel hücreleri (EC) tarafından işgal edilir ve vasküler pleksus oluşur. Ventriküler miyokardın içinde geliştirmek gemiler kalp dokusuna 18 oksijenli kan teslim kılcal ve arteriyel ağları oluşturmak için devam edecektir. Aort 14,19,20 lümenini çevreleyen koroner (peritruncal pleksus olarak da bilinir), ayrı bir kılcal ağ bağımsız geliştirmeye başlar sapları (E11.5 civarında), aynı zamanda. Peritruncal pleksus EC başlangıçta ancak sonuçta sadece bir gemi sağ ve sol koroner arterler 21 köklerini oluşturmak için oluyor aort her tarafında devam edecek, valf sinüslerin seviyesinde aort lümeni ile çoklu bağlantı oluşturur. etrafında peritruncal E13.5 ve ventriküler itibaren miyokard damarlar a kan akışını sağlayan, birbirine bağlı bir ağ oluşturmak üzere katılmakorta koroner damarların 14,22 içine. bozulmamış kalpleri BABB temizlenmesi ile birlikte anti-PECAM-1 antikoru ile EC boyanması, mümkün olan en erken aşamalarından itibaren gelişen koroner ağların analiz edilmesini sağlar. geç gelişim evrelerinde olgunlaşan koroner arterlerin desen de incelenebilir. Bu yöntem, aynı zamanda tüm embriyo damar leke için kullanılabilir (kadar E11.5 en az) ve örneğin, farklı antikorlar ile anti-alfa düz kas aktini (Sm22α) ve Endomucin.
Şekil 1, Fiji yazılımı kullanılarak üretilen bir E11.5 kalp maksimum yoğunluğu z projeksiyonunu göstermektedir. Çini işlevi kalbin birden kısmi görüntüler toplamak ve tam bir görüntü içine bunları birleştirmek için kullanılmıştır; Bütün bu örnekte boyanma genel bir fikir vermek için yararlıdır. Bu aşamada PECAM1 antikor ağırlıklı olarak kalp ve çıkış v endokardiyal astar lekeleriessels, ancak birkaç ECS ( '1A büyütülmüş olarak gösterilen, Şekil 1A kutulu bölgesi), sol ventrikül duvarı gözlenebilir. Buna ek olarak, peritruncal pleksus açık çıkış yoluna (OT) (Şekil 1B kutulu bölge) duvarında gözlenebilir. Bu durumda, çıkıntı oluşturmak için kullanılan z yığındaki dilimlerin sayısını azaltarak (Şekil 1B ') daha fazla belirgin görüntülenmiştir aort lümeni ile bağlantı sağlayan, görüntünün netliğini geliştirmiştir. Şekil 2'de, aort artan damar yakın bir E12.5 kalbinde görülebilir. Şekil 3 E12.5 kalbinde peritruncal pleksus gösterir. Şekil 3A 12-dilim z projeksiyon bazı gemiler z-yığını i bölme, (aynı zamanda ağır bir anti-PECAM1 antikoru ile lekeli) aort lümenine ventral lokalize ancak olarak, bütün plexus gösteriralt yığınlarının bir dizi nto (Şekil 3B-D) daha fazla görsel bilgi sağlar. Örneğin, Şekil 3B'de öngörülen alt yığın tam projeksiyon görünür olmayan aort lümeninin ventral yüzeyi, bağlanma peritruncal teknesini göstermektedir. Şekil 4, E15.5 kalp kısmını göstermektedir; Koroner arterler Bu aşamada (Şekil 4A, 30 dilim projeksiyon) açıkça görebilir. 5 dilim z Şekil 4B gösterilen projeksiyonları ve C aort ve pulmoner vanalar da PECAM1 boyama ile görüntülenmiştir olabilir; dalları ve koroner kılcal ağ bağlantıları bu küçük alt-yığını projeksiyonlar da temizdir. Manuel segmentasyon teknikleri Fiji (Şekil 4D) veya Imaris (Şekil 4D ve E) kullanarak koroner arterleri vurgulamak için kullanılmıştır. Koroner arterlerin 3D yüzey hacmi render / aort lümen u oluşturulansing Imaris veya çevredeki damarsal (Şekil 4E ve F) olmadan izlenebilir.
Bütün embriyoların damar da PECAM1 boyama / BABB açıklık kullanılarak incelenebilir. Sırasıyla embriyo ve sol tarafını (z dilimleri 66-110) - Şekil 4A ve A ', sağ tarafında alt yığınlarının üretilen z projeksiyonlar (65 z dilimleri 11) göstermektedir. İki görüntünün karşılaştırması Floresan sinyalin yoğunluğu önemli ölçüde doku derin nüfuz azaltmadığını göstermektedir. Şekil 4B, PECAM1 (kırmızı sinyali) ve Endomucin (yeşil sinyal) antikorlar, bir E11.5 embriyo sırasıyla intersomitic arterler (ISA) ve damarlar etiketlemek için bir araya getirilmiştir. Şekil 4C SM22α (kırmızı sinyal) ve E11.5 embriyoda Uluslararası Denetim Standartlarının PECAM1 boyama (yeşil sinyali) gösterir. Şekil 6'da, E11.5 embriyolarPECAM 1 ile boyanmıştır BABB boşluk (Şekil 4A) hemen sonra görüntü verilen ya da yaklaşık iki ay (Şekil 4B) aradan sonra bulundu. floresan sinyal başarıyla Babb numunenin uzun süreli depolamadan sonra hareketsiz görüntü için yeterince güçlü oldu.
(Alexa 594 Anti-fare IgG Konjuge ile Tespit Edilen) Anti-PECAM1 Antikor ile E11.5 Kalp Şekil 1. immün. (A, B), bir 2 X 2 karo görüntü ters konfokal mikroskop 10X objektif kullanılarak toplanmıştır. PECAM1 antikor lekeleri endokardiyal ve vasküler EC hem. Projeksiyonlar (maksimum yoğunluk) Fiji yazılımı kullanılarak, 22 (A) veya 5 (b) Z, dilimleri 4 um kalınlığında her oluşturuldu. A 've B' enlargemen vardırsırasıyla A ve B kutulu alanların ts. A 'de oklarla ventrikül duvar kan damarları gösterir; B ', dirsek peritruncal pleksus gösterir. OT, çıkış yolu; LV, sol ventrikül, RV sağ ventrikül. Tüm görüntüler ön görüntüleridir. Ölçek A bar ve B = 200 mikron; A 've B' = 100 mikron ölçekli barlar. Panel 1B 'Ivins ve diğ., 2015 19 uyarlanmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Anti-PECAM1 Antikor ile E12.5 Kalp Şekil 2. immün. Panel A 2x2 kiremitli tarama az projeksiyonu (maksimum yoğunluk) gösterir. A kutulu bölge ENLARG gösterilirA Ed '; oklar proksimal aort (Ao) birden fazla kan damarları gösterir. LV, sol ventrikül, RV sağ ventrikül. Tüm görüntüler ön görüntüleridir. A Ölçek çubuğu = 200 mikron; A '= 100 mikron ölçekli bar. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
E12.5 Heart Peritruncal Pleksusu 3. Görüntüleme Şekil. Anti-PECAM1 antikoru ile boyanmış E12.5 aort (AO) Konfokal görüntüler 10X objektif kullanılarak toplanmıştır. A z çıkıntı (maksimum yoğunluk) 12 Z dilimleri (4 um kalınlığında) elde edildi; Oklar peritruncal pleksus damarları göstermektedir. Belirtilen ve ayrı projecti üretmek için kullanılan BD 12 z dilimler üç alt-yığınlarının ayrıldıons; ok uçları aort lümenine peritruncal pleksus oluşturduğu bağlantıları gösterir. Aort lümeni ventral lokalize Peritruncal kaplar B ve C görebilir. Tüm görüntüler ön görüntüleridir. Ölçek çubuğu 50 mikron =. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Bir E15.5 Heart 4. Koroner Arterler ve kapiller ağı Şekil. Anti-PECAM1 antikoru ile boyanmış bir E15.5 kalp Konfokal görüntüler 10X objektif kullanılarak toplanmıştır. Panel A 30 z dilim (4 mikron kalınlığında) üretilen maksimum yoğunluk z projeksiyon göstermektedir; oklar aorta (Ao) bağlanarak görülebilir sol ve sağ koroner arterleri (LCA ve RCA) gösterir. ayırıcı kullanarakt 5 z dilim aort ve pulmoner kapaklar (AOV ve PV) sırasıyla (mavi parantez) B ve C görülebilir alt yığınları. ventriküler kapiller pleksus bu küçük alt-yığını projeksiyonlar da nettir; pulmoner kapak (küçük kutu) proksimal kan damarları paneli C (büyük kutu) sağ alt büyütülmüş gösterilmektedir. Fiji Şişirme / kement aracı projeksiyon öncesi her z dilim el Kırmızı renk ile koroner arterleri doldurmak için kullanılan Panel D, örneğin, bireysel kan damarları, vurgulamak için kullanılmıştır. Imaris yazılım arterlerin (kırmızı) ve E ve F aort lümeninin (yeşil) 3D görüntüler oluşturmak için kullanılan; Yine bu her z dilim nesne hatlarını oluşturmak için sihirli değnek aracını kullanarak, elle yapılıyordu. Çevre hacim opaklık E gibi Karışım modunda değiştirilebilir. F 'de gösterildiği gibi alternatif olarak 3D görüntü elde edilebilir ventrikül. Tüm görüntüler ön görüntüleridir. A = 100 mikron ölçekli bar. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Embriyonik vaskülatürüne 5. Görüntüleme Şekil. Paneller A ve 10X objektif (kiremitli tarama) kullanılarak toplanmıştır anti-PECAM1 antikoru ile boyanmış bir E10.5 vahşi tip embriyo, bir A 'gösterisi konfokal görüntüler. Ortalama yoğunluk Z çıkıntılar embriyo kalınlığı boyunca floresan yoğunluğu, sadece hafif bir kayıp gösteren bir 120 z dilim tarama (4 um kalınlığında dilimler) z dilimleri 11-65 (A) ve 66-110 (A '), elde edildi . Panel B, Antibod ile boyanmış bir E11.5 embriyo intersomitic damarları gösterir Döşenmiş bir (ortalama yoğunluk z çıkıntı sırası intersomitic arter (ok) ve damarları (ok başı) leke PECAM1 (594-konjuge sekonder antikor kırmızı sinyali) ve Endomucin (EMCN, 488-konjuge sekonder antikor yeşil sinyal) karşı ler ) tarayın. Panel C, PECAM1 karşı antikorlar ile boyanmış bir E11.5 vahşi tip embriyo intersomitic arterler (ISA) (yeşil 488-konjuge sekonder antikor sinyali) ve SM22α (594-konjuge sekonder antikor kırmızı sinyal) göstermektedir. Konfokal görüntüler 20X kuru objektif kullanılarak toplandı ve maksimum yoğunluk Z projeksiyonları üretilmesi için kullanılmıştır. Tüm görüntüler sagital görüntüleridir. A ve B Ölçek çubukları = 250 um, C = 100 um 'deki ölçek çizgisi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
d / 54800 / 54800fig6.jpg "/>
Babb Temizlendi Şekil 6. immüno Örnekleri en az iki ay için Floresan Sinyali saklayın. E11.5 embriyolar PECAM1 antikoru ile boyanmış ve Babb ile temizlendi; Aynı partiden embriyoların ya da iki aylık bir aradan sonra görüntülenmiştir. Panel A derhal görüntülü embriyonun intersomitic arterleri gösteriyor ve panel B embriyo iki ay sonra görüntülü gösterir. Konfokal görüntüler 10X kuru objektif kullanılarak toplandı ve maksimum yoğunluk Z projeksiyonları üretilmesi için kullanılmıştır. dAO, dorsal aorta. Görüntüler sagital görünümleri göstermek. Ölçek A bar ve B = 100 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Discussion
Bütün embriyonik kalplerinde koroner damarlar optik açıklık ve konfokal mikroskobu ile takip anti-PECAM1 antikoru ile wholemount immün tarafından görüntülendi. basit bir yöntem Babb ile embriyonik fare kalpleri temizlenmesi için, burada açıklanan, optik penetrasyon artar ve aort ve ventriküler duvarlarında lokalize kan damarlarının yüksek çözünürlüklü görüntüler yakalanmasını sağlar. Bu Vectashield (kırılma indisi 1.45) halinde gliserol tabanlı montaj reaktifler de Babb yüksek refraktif indeksi (1.56), daha derin doku penetrasyonu sağlayan daha da ışık saçılması azaltır, ancak, koroner damar 22 görüntülenmesi için kullanılmaktadır. Doku temizleme gibi daha az hazır araştırmacılara olabilir multiphoton ve hafif levha mikroskopisi olarak mikroskopi daha karmaşık, pahalı formlar için ihtiyacı ortadan kaldırmaktadır. Takas işlemi diğer yöntemlere 6-9 ve küçük örnekler ca olabilir karşılaştırıldığında son derece hızlıdırdoğrudan mikroskopi tabağına reaktiflerin küçük hacimli kullanılarak rried. damar sağlam boyama, yüksek kaliteli görüntüler elde etmek için gereklidir; Anti-PECAM1 antikoru boyama uygun yüksek seviyeleri verdiği bulunmuştur koroner EC ve ticari olarak bir takım antikorların her türlü işaretleri olarak seçilmiştir. Buna ek olarak, floresan boyama Babb son derece sağlam olarak görülmektedir; (Işıktan korunmuş olarak) Babb oda sıcaklığında saklanabilir örnekler birkaç ay süreyle fluoresan sinyali korudu. peritruncal pleksus görüntülerini yakalamak özellikle PECAM1 antikor verimli, hem de damar bazen sorunlu olduğu gibi koroner endokardı etiketler gerçeği. peritruncal EC kıyasla aort lümeninin güçlü boyama görüntüleme parametrelerinin dikkatli ayarlanması gerekli, yani görüntülerin bazı bölgelerde aşırı doygunluk riski sonuçlandı. İdeal olarak, bir antikor boyama sadece damar EC kullanılacaktır; uygulamada,Ancak, Wholemount boyama istenen düzeyde verim uygun antikorlar bulmak zor olabilir. Son zamanlarda, yağlı asit bağlanma proteini 4 (FABP4), koroner damar EC 23 bir göstergesi olduğu gösterilmiştir ve bu nedenle PECAM1 bir alternatif de sağlayabilir.
ancak, numuneler düz monte değildi aort ve kalp boşluklarının 3D morfolojisi korumak için yerine cam tabanlı yemekleri görüntülendi. yansıması için numunelerin derinliği nedeniyle kısa çalışma mesafeleri, yüksek büyütme hedefleri kullanımını engellemiştir. Ancak yüksek çözünürlüklü görüntüler piksel bekleme süresini artırmak ve görüntü yakalamak için en az 1024 x 1024 piksel dizisi boyutu kullanarak 10X objektif kullanılarak hala ulaşılabilir idi. Ancak bu, hücresel yapının ince analiz numunelerinin düz monte gerektirebilir, yapısı ve koroner damarların dağılımının analizi için yeterli idi. Montaj için kalbin bireysel parçaların Diseksiyon,örneğin, ventrikül duvar veya aort, gerekli olabilir. Seçenek olarak ise, aşırı örnekleme dekonvolüsyon ardından görüntünün çözünürlüğünü ve duyarlılığı arttırmak için gerçekleştirilebilir; bu ancak oldukça uzun tarayarak süreleri gerektirir ve işlemek için işlem gücünü bir sürü gerektirir son derece büyük görüntü dosyaları oluşturur.
E15.5 kadar Kalpler başarıyla bu yöntem kullanılarak görüntülendi ve aynı protokol kullanılarak (en azından E11.5 kadar), tüm embriyo damar analiz etmek mümkündür. Diğer hücre tipleri, örneğin, düz kas hücreleri, aynı zamanda, bu teknik kullanılarak laboratuvarda görüntülenmiştir edilmiştir. Kalın dokuların, örneğin, kupa E15.5 daha büyük antikor penetrasyon sınırlayıcı bir faktör olabilir; uzun inkubasyon ve / veya yüksek bir deterjan gerekebilir. Görüntülerin büyük bir z yığını toplarken Buna ek olarak, lazerler doku uzak bölümlerini nüfuz olarak gücü azaltılabilir sinyali; Ancak confOcal arttırmadan Z mesafe ile lazer gücü geliştirmek için ayarlanabilir.
Bu yöntem, koroner damar oluşumunun erken aşamaları ve geç gelişim evrelerinde koroner arterlerin desen hem odaklı mikroskopik analiz kolaylaştırır. dağıtım, dallanma ve kan damarlarının yapısı hakkında detaylı bilgiler bu anjiyogenez yollarının belirli kusurları ile genetik fare mutantlar çalışma için değerli bir araç yapma, kısa bir süre içinde elde edilebilir.
Acknowledgments
iş Çocuklar NHS Foundation Trust ve University College London Great Ormond Street Hastanesi Sağlık Araştırma Biyomedikal Araştırma Merkezi Ulusal Enstitüsü tarafından desteklenen İngiliz Kalp Foundation'and tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Life Technologies | 14190-094 | |
| Forceps | FST | 11251-30 | |
| 10 cm Petri dishes | Falcon | 351029 | |
| 35 mm Petri dishes | Sigma | P5112 | |
| Stainless steel minutien pins 0.2 mm diameter | FST | 26002-20 | |
| Fine tip pastettes | Alpha Laboratories | LW4061 | |
| 1,000 ml pipette tips | Sorenson | 34000 | |
| 48-well plate | Falcon | 353078 | |
| Kwik-Gard | World Precision Instrument | KWIKGARD | Silicone elastomer Sylgard184 packaged in a cartridge for mixing and dispensing |
| Kwik-Gard refill | World Precision Instrument | KWIKGLUE | Refill cartridges and dispensing tips |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Make up in PBS and store at -20 °C |
| 100% methanol | VWR | 20847307 | |
| Tween®20 | Sigma | P1379 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Anti-PECAM1 antibody, rat anti-mouse | BD Pharmingen | 553370 | Primary antibody, dilute 1 in 50 |
| Anti-CD31 polyclonal, rabbit polyclonal | Abcam | ab28364 | Primary antibody, dilute 1 in 50 |
| Anti-CD31/PECAM1 clone 2H8, armenian hamster monoclonal | Thermo Fisher Scientific | MA3105 | Primary antibody, dilute 1 in 400 |
| Endomucin antibody (V.7C7), rat monoclonal | Santa Cruz Biotechnology | sc-65495 | Primary antibody, dilute 1 in 50 |
| Anti-SM22 alpha antibody, rabbit polyclonal | Abcam | ab14106 | Primary antibody, dilute 1 in 250 |
| Goat anti-rat IgG (H+L)Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A11007 | Secondary antibody, dilute 1 in 500 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L)Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | Secondary antibody, dilute 1 in 500 | |
| Goat anti-Armenian Hamster IgG (H+L)Alexa Fluor 488 | Abcam | ab173003 | |
| Goat anti-rat IgG (H+L)Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21208 | Secondary antibody, dilute 1 in 500 |
| Phenolic screw cap | Wheaton | 240408 | |
| Benzyl alcohol | Sigma | 402834 | |
| Benzyl benzoate | Sigma | B6630 | |
| Imaris | Bitplane Imaging | image analysis software | |
| ImageJ software | NIH | Freeware |
References
- Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).
- Tian, X., et al. Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries. Cell Res. 23 (9), 1075-1090 (2013).
- Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).
- Klotz, L., et al. Cardiac lymphatics are heterogeneous in origin and respond to injury. Nature. 522 (7554), 62-67 (2015).
- Nam, J., et al. Coronary veins determine the pattern of sympathetic innervation in the developing heart. Development. 140 (7), 1475-1485 (2013).
- Zhu, D., Larin, K. V., Luo, Q., Tuchin, V. V. Recent progress in tissue optical clearing. Laser Photon. Rev. 7 (5), 732-757 (2013).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat. Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat. Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat. Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Zucker, R. M., Hunter, E. S., Rogers, J. M. Confocal laser scanning microscopy of morphology and apoptosis in organogenesis-stage mouse embryos. Methods Mol. Biol. 135, 191-202 (2000).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat. Protoc. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Erturk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. J. Vis.Exp : JoVE. (89), (2014).
- Dyer, L. A., Wu, Y., Patterson, C. Protein isolation from the developing embryonic mouse heart valve region. J. Vis.Exp s : JoVE. (91), e51911 (2014).
- Wilsbacher, L. D., Coughlin, S. R. Analysis of cardiomyocyte development using immunofluorescence in embryonic mouse heart. J. Vis.Exp : JoVE. (97), (2015).
- StitchArt Guide for Zen 2010. , Zeiss. Available from: http://www.google.co.uk/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&ved=0ahUKEwjC6OPVnO7NAhVD7RQKHQzqALkQFggcMAA&url=ftp%3A%2F%2Fftp.sonic.net%2Fpub%2Fusers%2Flhund%2FMMP%2FBlurWin2012%2FHelpful Docs%2FTiling_and_Stitching in Zen.pdf&usg=AFQjCNH4C6dv8bdmKC651sp_CFz4C1Rq3g (2010).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Tian, X., Pu, W. T., Zhou, B. Cellular origin and developmental program of coronary angiogenesis. Circ. Res. 116 (3), 515-530 (2015).
- Ivins, S., et al. The CXCL12/CXCR4 Axis Plays a Critical Role in Coronary Artery Development. Dev. Cell. 33 (4), 455-468 (2015).
- Theveniau-Ruissy, M., et al. Coronary stem development in wild-type and Tbx1 null mouse hearts. Dev. Dyn : an official publication of the American Association of Anatomists. 245 (4), 445-459 (2016).
- Tomanek, R. J. Formation of the coronary vasculature during development. Angiogenesis. 8 (3), 273-284 (2005).
- Chen, H. I., et al. VEGF-C and aortic cardiomyocytes guide coronary artery stem development. J. Clin.Iinvest. 124 (11), 4899-4914 (2014).
- Tian, X., et al. Vessel formation. De novo formation of a distinct coronary vascular population in neonatal heart. Science. 345 (6192), 90-94 (2014).
