Summary
We presenteren een protocol voor de analyse van coronairvaten geheel muriene embryonale hart tot E15.5, met behulp van standaard immunologische werkwijzen kleuring gevolgd door optische klaring en confocale microscopie. Deze techniek maakt visualisatie van bloedvaten door het gehele hart zonder dat tijdrovende analyse van seriële secties.
Introduction
De oprichting van een functionerend coronaire netwerk is cruciaal voor de werking van het hart en de embryonale ontwikkeling, en de analyse van genetische muismutanten kan waardevol inzicht verschaffen in de moleculaire signalen die ten grondslag liggen aan dit ontwikkelingsproces. De mogelijkheid om de embryonale coronaire plexus visualiseren als een geheel en niet bestaat uit een serie van histologische coupes, is essentieel voor de analyse van het vaartuig patronen in genetische mutanten vergemakkelijken, en vermijdt de potentiële verlies van informatie die kan optreden als gevolg van mechanische snijden van het weefsel. Schepen gedoemd om bloedvaten te vormen en haarvaten zijn gelokaliseerd diep binnen de muren van zowel de ventrikels en de aorta 1-3. Ofschoon fluorescente labeling van cellen in combinatie met laser scanning confocale microscopie kan een hoge resolutie beelden van wholemount gelabelde oppervlakkige veneuze / lymfevaten 4,5, de diepte van beeldvorming wordt beperkt door optische penetratie. Hoge-resolutie beeldvorming van capillaries en slagaders gedurende de gehele diepte van het hart is daarom niet mogelijk zonder enige vorm van weefsel clearing.
Slechte optische penetratie wordt veroorzaakt door de hoge brekingsindex van de meervoudige cellulaire en extracellulaire (bijvoorbeeld collageen en elastische vezels) componenten dikke weefsels. Dit verstrooit de beeldvormende licht, waardoor vervaging en verminderde contrast. Clearing agenten overeenkomen meestal de hoge brekingsindex van dergelijke weefsels, wat betekent dat het licht kan reizen door het monster vrij en dieper doordringen in het weefsel. Voordat clearing, weefsels zijn over het algemeen uitgedroogd als water heeft een relatief lage brekingsindex. Een overvloed aan nieuwe clearing werkwijzen zijn recent ontwikkeld, maar afhankelijk van de gebruikte, het zuiveringsproces kan dagen of weken duren en kostbare reagentia nodig 6-9 techniek. BABB (een 1: 2 mengsel van benzylalcohol en benzylbenzoaat) is een goedkope, gebruikelijke klaringsmiddel, die isvoordeel van clearing monsters zeer snel. BABB-clearing en beeldvorming zijn eerder beschreven voor neurologische monsters en verschillende organen 10-13. Hier beschrijven we een robuuste en eenvoudige techniek voor de BABB klaring van immunostained monsters, gevolgd door confocale microscopie, met een specifieke verwijzing naar het onderzoek van de bloedvaten in muizen harten van E (embryonale dag) 11,5-15,5. Zoals echter ook aangetoond, de techniek kan evengoed worden toegepast op de analyse van hele embryo, evenals andere celtypen, zolang kwaliteit antilichamen tegen de markers van belang zijn.
Protocol
Alle dierlijke onderzoek werd uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen onder licentie van het Britse ministerie van Binnenlandse Zaken uitgevoerd.
1. Dissectie en Fixatie van embryonale Hearts
- Euthanaseren een getimede-zwangere muis op de gewenste dag met behulp van een ethisch goedgekeurd ruiming techniek, bijvoorbeeld CO 2 narcose, gevolgd door cervicale dislocatie, en verwijder de embryonale zakken 14, ze te plaatsen in een 10 cm petrischaal gevuld met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) .
- Met behulp van een dissectie microscoop en een tang voorzichtig het openstellen van de baarmoeder zakken en verwijder elk embryo, het doorsnijden van de navelstreng en het verwijderen van de dooierzak.
- Voor genotypering doeleinden, verwijder de embryonale staart en plaats in een 1,5 ml microcentrifugebuis voor lysis / DNA-extractie later.
- Om het hart uit te verwijderen, pin elk embryo op zijn rug in een PBS-gevulde siliconen elastomeer gecoate 35 mm petrischaal, middels roestvrijstalen minutien pinnen. Met behulp van fijne tang, carefully open de kist en het verbreken van de grote vaten, anterior naar het hart. Dan is het bereiken achter het hart met de tang, pak de schepen achter het hart en trek zachtjes om het hart te verwijderen; de longen ook weg komen tegelijk.
- Transfer het hart om een frisse 35 mm petrischaal met PBS en gebruik fijne tang om weg te trimmen het longweefsel, indien nodig. Vervolgens over het hart om een putje van een 48-wells plaat gevuld met koud PBS.
- Na het verzamelen van alle harten in de 48-well plaat, zuig het PBS met een fijne punt plastic Pasteur pipet en vervangen door 0,5 ml 4% paraformaldehyde (PFA).
LET OP: PFA is een bekende allergeen, kankerverwekkend en giftig.- Fix E11.5 - 12,5 harten voor 15 min, E13.5 harten gedurende 20 min en E14.5 - 15,5 harten voor 30 min in 4% PFA bij kamertemperatuur.
- Zuig het PFA met een fijne punt plastic Pasteur pipet en spoel de harten 2x in koud PBS.
cautION: PFA is gevaarlijk en moet worden afgevoerd in overeenstemming met de institutionele regelgeving. - Indien niet onmiddellijk gebruikt voor de hele mount immunokleuring (zie hoofdstuk 2), dehydrateren de harten door het uitvoeren van opeenvolgende 5 min wassingen in de volgende oplossingen: 25% methanol / 75% PBS, 50% methanol / 50% PBS, 75% methanol / 25 % PBS.
LET OP: Methanol is giftig, handschoenen dragen. Bewaar de harten bij -20 ° C in 100% methanol.
2. Hele Mount Immunokleuring van embryonale Harten met Anti-PECAM1 Antibody
LET OP: Anti-PECAM1 antilichamen werken goed voor het kleuren van de kransslagaders (zie stap 2.4), maar geen pan-endotheliale marker dat een sterk signaal geeft geschikt zou zijn.
- Bij gebruik van harten die zijn opgeslagen in 100% methanol, transfer naar 1,5 ml microcentrifugebuizen en hydrateren door het uitvoeren van opeenvolgende 5 min wassingen in de volgende oplossingen: 75% methanol / 25% PBS, 50% methanol / 50% PBS en 25% methanol / 75% PBS. Permeabilize het hart door middel van 3 x 10 min wassingen in 0,5-1,0 ml PBST (PBS / 0,1% Tween-20), roteren bij kamertemperatuur.
- Blokkeer de harten door rotatie gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in 1,0 ml 10% geit serum in PBST.
- Verwijder blokkerende buffer met een fijne punt plastic Pasteur pipet of 1000 ul pipet tip en te vervangen door 400-500 ul verse blok met het primaire antilichaam anti-PECAM1 1:50 verdund. Draai de buizen overnacht bij 4 ° C.
- De volgende dag, zuig het blok / primaire antilichaam met een fijne punt plastic Pasteur pipet of 1000 ul pipetpunt en voert ten minste 6x 1 uur wassingen in 1,0 ml PBST, draaien de buizen bij kamertemperatuur.
- Vervang de laatste wassen met verse blokkerende buffer die de fluorofoor geconjugeerd secundair antilichaam verdund 1: 500 en incubeer overnacht bij 4 ° C onder rotatie. Beschermen tegen licht door het wikkelen van de buizen in folie.
- De volgende dag, zuig het blok / secdaire antilichaam met een fijne punt plastic Pasteur pipet en voert ten minste 6x 1 uur wassingen in 1,0 ml PBST, draaien de buizen bij kamertemperatuur.
- Bewaar de harten bij 4 ° C (beschermd tegen licht) totdat het nodig is.
3. Voorbereiding van Clearing Solutions en Microscopie Dishes
OPMERKING: Bij beeldvorming harten in BABB is het belangrijk dat geen van de BABB oplossing in contact met de componenten van de microscoop komt. Daartoe de onderstaande voorschriften bevat instructies voor het bereiden van silicone-elastomeer afgedicht servies fluorescentiemicroscopie, die goed kunnen worden bereid op voorhand. Het siliconenelastomeer verschaft een barrière voor de BABB bevatten en voorkomen dat het potentieel sijpelen tussen de glazen bodem en het polycarbonaat wanden van de capsule.
- Om de silicone-elastomeer gecoate gerechten te bereiden, neem optische glazen bodem cultuur gerechten en plaats een dop van een 4 ml schroefdop flacon (ongeveer 1,5 cm in diameter) In het midden van elke schaaltje.
OPMERKING: Dit zal een goed om het monster te vormen wanneer het elastomeer wordt aangebracht op de schotel. - Vul de gerechten met siliconenelastomeer tot een diepte van ongeveer 0,5 cm, met een applicator cartridge om de twee componenten te mengen zoals die worden toegepast volgens de instructies van de fabrikant. Laat uitharden ten minste 24 uur en controleer of de dop altijd in het midden van elk gerecht.
LET OP: Gebruik een veiligheidsbril om onbedoeld contact van het siliconenelastomeer met de ogen te vermijden. - Na harden van het elastomeer, verwijder de dop van elke schaal, zal dit een centrale putje waar het monster af te beelden kan in direct contact met de glazen bodem van de schaal gelegd verlaten.
LET OP: wanneer uitgehard moet het elastomeer stevig en droog aanvoelen. - Bereid de BABB-oplossing (1 deel benzylalcohol tot 2 delen benzylbenzoaat). Dit moet worden bewaard in een glazen fles en beschermd tegen licht.
LET OP: BABB is een giftige, bijtende oplossing. Hanteer in een zuurkast, terwijl het dragen van beschermende kleding. - (- 5 ml 1) in een glazen flesje mix BABB en methanol een 50:50 oplossing. Beschermen tegen licht, bijvoorbeeld door het wikkelen van de flacon in folie.
4. Uitdroging, Clearing en montage van Harten voor confocale microscopie
OPMERKING: grotere monsters kunnen worden gewist in 4 ml glazen flesjes, maar voor kleine monsters (bijvoorbeeld hart tot E13.5) is het beter om het zuiveringsproces direct in de microscopie schotel dragen. Dit helpt voorkomen dat 'verliezen' van de monsters als de harten worden zeer transparant keer gewist. Voor deze kleine monsters clearing is zeer snel, die binnen een paar minuten.
LET OP: Bescherm de monsters van licht tijdens de volgende stappen door de verpakking / met betrekking tot buizen en gerechten met folie.
- Voor het opruimen, dehydrateren de immunostained-harten via een methanol serie door het draaien van het hart bij kamertemperatuur tempetuur in een 1,5 ml microcentrifuge buis opeenvolgende wijzigingen van de volgende oplossingen: 25% methanol / 75% PBS, 50% methanol / 50% PBS en 75% methanol / 25% PBS (5 min elk). Tot slot, draaien voor 3 x 5 minuten in 100% methanol.
- Voor de harten tot E13.5, plaats in het midden van de microscopie gerecht; onder de microscoop verzekeren het hart is georiënteerd met zijn dorsale zijde naar boven. Verwijder alle methanol uit rond het hart met een fijne punt plastic Pasteur pipet.
- Met behulp van een clean-fijne tip plastic Pasteur pipet, voeg BABB: methanol 50:50 oplossing in een voldoende volume om het hart te dompelen (ongeveer 300-400 pi). Zoals de harten soms kan omdraaien in de oplossing, controleer dan de oriëntatie weer, terwijl de harten zijn nog steeds ondoorzichtig. Laat de oplossing gedurende 5 min.
- Verwijder de 50:50 oplossing om een fles glasafval in de zuurkast en te vervangen door BABB, opnieuw met een fijne tip plastic Pasteur pipet.
OPMERKING: Een groot volume niet; add Sufficient zodat het hart ligt binnen een druppel oplossing. Het hart moet binnen 5 minuten te wissen. - Voor grotere harten, schakelt de monsters in glazen flesjes.
OPMERKING: Een E15.5 hart moet binnen 30 min-1 uur te wissen, maar kan 's nachts worden gelaten indien nodig. - Nadat het monster is duidelijk, verwijder de oplossing en te vervangen door een minimaal volume van BABB. Eventueel wordt het monster met een dekglas, zodat het op zijn plaats houden, maar dit is niet absoluut noodzakelijk. Gebruik het hart voor beeldvorming.
5. Imaging Gewist Hearts door confocale microscopie
LET OP: Beelden werden gevangen op een omgekeerde confocale microscoop met 10X of 20X droge doelstellingen. Hoewel het mogelijk is om de schotels te gebruiken op een rechtopstaande confocale, moet extra zorg worden genomen om contact van het doel met de BABB oplossing voorkomen.
- Verzamel een z-scan van het hart 15. Afhankelijk van de grootte van het hart, kan een tegel scan vereist om beeld het gehele hart 16.
LET OP: BABB is een bijtende oplossing Draag schone handschoenen en zorgen voor de buitenkant van de microscopie gerecht is vrij van BABB. Behandel de schotel voorzichtig en houd het deksel op de schaal om het risico van per ongeluk morsen op de microscoop te minimaliseren. - Als de doelstelling werkafstand maakt, gebruik dan een hogere vergroting om hogere-resolutie foto's van de regio's van belang te bereiken.
6. Data-analyse met behulp van Fiji Software
- Open de z-stack van beelden in Fiji 17.
- Om az projectie van de gehele stack of een deel ervan te maken, klikt u op de afbeelding en selecteer Stack, gevolgd door Z-project. Voer de start en stop slice nummers, en selecteer het type z projectie, bijvoorbeeld, de gemiddelde intensiteit, max intensiteit.
- Aan individuele vaartuigen binnen een stapel afbeelding plakken gebruik maken van de Blow gereedschap markeren (uit het Plugins menu selecteer Segmentatie, en vervolgens Blow / Lasso tool) en klik op de gebieden van het beeld in te vullen each slice. Gebruik de Fill commando (klik op Bewerken en selecteer vervolgens Fill) om de geselecteerde gebieden te vullen met de voorgrond kleur naar keuze (klik op Bewerken en kies Opties, gevolgd door kleuren en voorgrond).
- Z project de afbeelding te stapelen als voorheen.
7. 3D Surface Volume Rendering van kransslagaders Vernieuwd behulp Imaris
- Klik op het oog icoon Overtreffen aan de bovenkant van het scherm en sleept het beeld bestand in het venster gegevens. Klik op de View-pictogram 3D aan de bovenkant van het scherm.
- Selecteer het pictogram oppervlakken (blauw icoon) en klik vervolgens op het tabblad Maken. Klik op de 'Ga direct automatisch aanmaken, handmatig bewerken' dialoogvenster en klik op het icoon Draw (dun potlood icoon).
- Selecteer het tabblad Contour en vervolgens op het tabblad Mode. In de modus, klikt u op de toverstaf of Isoline pictogrammen. Kies de aanwijzer modus in de Pointer selectie aan de rechterkant van het scherm door te klikken naast de 'Select', en klik dan op de 'Draw9; box (in de linker benedenhoek van het scherm).
- Gebruik de Isoline of Toverstaf om de contouren van de slagaders in opeenvolgende plakken te selecteren. Navigeren van slice te snijden met behulp van de schuifknop Slice Position.
- Wanneer alle contouren zijn geselecteerd, klikt u op de doos Maak Surface. Het omliggende volume kan onzichtbaar worden gemaakt, of gesmolten min of meer opaak met behulp van de Blend modus; klik op Volume om deze te markeren en selecteer het tabblad Instellingen, gevolgd door het tabblad Modus. Selecteer Blend en gebruik de schuifregelaar om de dekking te veranderen.
- Maak foto's met behulp van de Snapshot-functie.
Representative Results
Als het hart zich ontwikkelt, wordt het ventriculaire myocardium binnengevallen door endotheelcellen (ECs) uit diverse bronnen, en een vasculaire plexus wordt gevormd. Vaartuigen die zich ontwikkelen binnen het ventriculaire myocardium zal gaan om de capillaire en arteriële netwerken leveren van zuurstofrijk bloed naar het hartweefsel 18 te vormen. Tegelijkertijd (rond E11.5) de coronaire stengels beginnen te ontwikkelen zelfstandig uit een afzonderlijke capillair netwerk (zogenaamde peritruncal plexus) de lumen van de aorta 14,19,20 omringt. Peritruncal plexus ECs vormen aanvankelijk meerdere verbindingen met het lumen van de aorta ter hoogte van de klep sinussen, maar uiteindelijk slechts één vat zal blijven aan weerszijden van de aorta, gaat met de wortels van de linker en rechter coronaire aders 21 vormen. Vanaf ongeveer het peritruncal E13.5 en ventriculaire myocard schepen toetreden tot een onderling verbonden netwerk te vormen, waardoor de bloedstroom van de eenorta in de coronaire vaten 14,22. Kleuring van EC met anti-PECAM-1-antilichaam in combinatie met BABB goedkeuring van het intacte hart, maakt de analyse van de coronaire netwerken van vroeg mogelijk stadium. In latere ontwikkelingsstadia de patroonvorming van de rijping kransslagaders kan worden onderzocht. Deze werkwijze kan ook worden gebruikt om de vasculatuur van hele embryo vlek (tot E11.5 tenminste), en met verschillende antilichamen, bijvoorbeeld anti-alfa-gladde spier actine (Sm22α) en Endomucin.
Figuur 1 toont de maximale intensiteit z-projecties van een E11.5 hart gegenereerd met behulp van Fiji software. De Tegel functie werd gebruikt om meerdere gedeeltelijke beelden van het hart te verzamelen en naai ze samen in een volledig beeld; Dit is nuttig om een overzicht van kleuring geven in de hele monster. In deze fase PECAM1 antilichaam kleurt hoofdzakelijk de endocardiale wand van het hart en uitstroom vessels echter enkele EC kan ook worden waargenomen in de linker ventriculaire wand (omkaderd gebied in figuur 1A getoond vergroot 1A). Bovendien kan de peritruncal plexus duidelijk worden waargenomen in de wand van het uitstroomkanaal (OT) (omkaderd gebied in figuur 1B). In het laatste geval, het verminderen van het aantal segmenten in de z-stack gebruikt om het uitsteeksel genereren verbeterde de helderheid van het beeld, waardoor de verbinding met het lumen van de aorta duidelijker zichtbaar worden (Figuur 1B). In figuur 2, kan de verhoogde vasculatuur proximaal van de aorta wordt waargenomen in een E12.5 hart. Figuur 3 toont de peritruncal plexus per E12.5 hart. De 12-slice z projectie Figuur 3A toont het gehele plexus, maar aangezien sommige schepen ventraal zijn gelokaliseerd in het lumen van de aorta (die ook zwaar gekleurd door anti-PECAM1 antilichaam), splitsen de z-stack into een aantal sub-stacks (figuur 3B-D) geeft meer visuele informatie. Bijvoorbeeld, de deelstapel waarop in figuur 3B toont een vaartuig peritruncal aansluiting op het ventrale oppervlak van de aorta lumen, die niet zichtbaar is in de volledige projectie. Figuur 4 toont een deel van een E15.5 hart; de kransslagaders duidelijk zichtbaar in deze fase (Figuur 4A, 30-slice projectie). In de in figuren 4B 5-slice z uitsteeksels en C kunnen de aorta en pulmonaire kleppen worden gevisualiseerd door kleuring PECAM1; de takken en de onderlinge verbindingen van de coronaire capillaire netwerk zijn ook duidelijker in deze kleinere sub-stack projecties. Handmatige segmentatie technieken zijn gebruikt om de kransslagaders behulp Fiji (figuur 4D) of Imaris (figuur 4D en E) te markeren. Het 3D-oppervlak volume rendering van kransslagaders / aorta lumen gegenereerd uzingen Imaris kan worden bekeken met of zonder de omringende vasculatuur (Figuur 4E en F).
Het vaatstelsel van hele embryo's kunnen ook worden onderzocht met behulp van PECAM1 kleuring / BABB klaring. Figuur 4A en A ', tonen z projecties gegenereerd op basis van sub-stacks van de rechterzijde (z slices 11-65) en de linkerkant (z plakjes 66-110) van het embryo respectievelijk. Vergelijking van de twee beelden blijkt dat de intensiteit van het fluorescerende signaal niet significant afneemt met diepere penetratie in het weefsel. In figuur 4B, PECAM1 (rood signaal) en Endomucin (groen signaal) werden antilichamen gecombineerd om de intersomitische slagaders (ISA) en aders respectievelijk labelen van een E11.5 embryo. Figuur 4C toont SM22α (rood signaal) en PECAM1 kleuring (groen signaal) van de ISA's in een E11.5 embryo. In figuur 6, E11.5 embryogekleurd met PECAM 1 werden onmiddellijk na afgebeeld BABB klaring (figuur 4A), of na een periode van ongeveer twee maanden (Figuur 4B). Het fluorescentiesignaal was nog sterk genoeg om het succes na langdurige opslag van het monster in BABB.
Figuur 1. Immunokleuring van een E11.5 Hart met Anti-PECAM1 Antibody (gedetecteerd met anti-rat IgG geconjugeerd aan Alexa 594). (A, B) een beeld 2 x 2 betegelde werd verzameld met de 10X objectief van een omgekeerde confocale microscoop. PECAM1 antilichaam vlekken zowel endocardiale en vasculaire EC. Uitsteeksels (maximum intensiteit) werden gegenereerd uit 22 (A) en 5 (B) z plakjes elk van 4 urn dik, met behulp Fiji software. A 'en B' zijn enlargements van de boxed gebieden in respectievelijk A en B. Pijlen in A 'duiden bloedvaten in het ventrikel wand; in B ', de houder geeft aan peritruncal plexus. OT, uitstroom; LV, linker ventrikel, RV rechterventrikel. Alle beelden zijn frontale uitzicht. Schaal bars in A en B = 200 micrometer; schaalbalken in A 'en B' = 100 urn. Paneel 1B werd aangepast van Ivins et al., 2015 19. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Immunokleuring van een E12.5 Hart met Anti-PECAM1 Antibody. Panel A toont az projectie (maximale intensiteit) van een 2x2 betegelde scan. De boxed regio in A wordt getoond enlarged in A '; pijlen geven meerdere bloedvaten proximaal van de aorta (Ao). LV, linker ventrikel, RV rechterventrikel. Alle beelden zijn frontale uitzicht. Schaal bar in A = 200 micrometer; schaal bar in A '= 100 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Imaging van de Peritruncal Plexus in een E12.5 Hart. Confocale beelden van een E12.5 aorta (Ao) gekleurd met anti-PECAM1 antilichaam werden verzameld met behulp van de 10x doelstelling. De z uitsteeksel (maximum intensiteit) A werd gegenereerd uit 12 z segmenten (4 urn dik); pijlen geven de peritruncal plexus vaten. BD De 12 z schijfjes werden verdeeld in drie sub-stacks zoals aangegeven en gebruikt voor het scheiden projecti genererenons; pijlpunten geven verbindingen gevormd door de peritruncal plexus naar het lumen van de aorta. Peritruncal vaartuigen ventraal gelokaliseerd in het lumen van de aorta zichtbaar in B en C. Alle beelden zijn frontale uitzicht. Schaal bar = 50 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. kransslagaders en capillaire Plexus in een E15.5 Hart. Confocale beelden van een E15.5 hart gekleurd met anti-PECAM1 antilichaam werden verzameld met behulp van de 10x doelstelling. Paneel A toont een maximale intensiteit z projectie gegenereerd uit 30 z plakjes (4 micrometer dik); pijlen geven de linker en rechter coronaire arteriën (LCA en RCA) die zichtbaar aansluiting op de aorta (Ao). Met behulp van different 5 z plak sub-stapelt de aorta en pulmonaire kleppen (AOV en PV) kunnen respectievelijk (blauw haakjes) worden gezien in B en C. De ventriculaire capillaire plexus is duidelijker in deze kleinere deelstapel uitsteeksels; bloedvaten proximaal van de pulmonale klep (klein doosje) worden vergroot weergegeven in de rechterbenedenhoek van het paneel C (grote doos). Fiji werd gebruikt om individuele bloedvaten, bijv markeren van panel D de slag / lasso werd gebruikt om de kransslagaders Rood handmatig elke z slice vóór projectie vullen. Imaris software werd gebruikt om 3D beelden van de slagaders (rood) en aortische lumen (groen) in E en F te creëren; weer werd dit handmatig gedaan, met behulp van de toverstaf om object contouren in elk z slice te creëren. De opaciteit van de omringende volume kan worden gewijzigd mengmodus, zoals in E. Alternatief kan het 3D-beeld te extraheren, zoals getoond in F ventrikel. Alle beelden zijn frontale uitzicht. Schaalbalk in A = 100 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Imaging van embryonale vaatstelsel. Panelen A en A 'tonen confocale beelden van een E10.5 wildtype embryo's gekleurd met anti-PECAM1 antilichaam verzameld met de 10X objectief (tegel scan). Gemiddelde intensiteit z projecties werden gegenereerd uit z segmenten 11-65 (A) en 66-110 (A) van een 120 z segment scan (4 urn dikke plakken), waarin slechts een gering verlies van fluorescentie-intensiteit over de dikte van het embryo . Paneel B toont de intersomitische schepen van een E11.5 embryo gekleurd met Antibod ven tegen PECAM1 (rode signaal van 594-geconjugeerd secundair antilichaam) en Endomucin (EMCN, groen signaal van 488-geconjugeerd secundair antilichaam), waarbij de intersomitische slagaders (pijl) en aders (pijlpunt) vlek respectievelijk (gemiddelde intensiteit z projectie van een betegelde scannen). Paneel C toont intersomitische slagaders (ISA) uit een E11.5 wild-type embryo gekleurd met antilichamen tegen PECAM1 (groene signaal van 488-geconjugeerd secundair antilichaam) en SM22α (rood signaal van 594-geconjugeerd secundair antilichaam). Confocale beelden werden verzameld met behulp van de 20X droge objectieve en gebruikt om maximale intensiteit z projecties te genereren. Alle beelden zijn sagittale uitzicht. Schaal bars in A en B = 250 pm, schaal bar in C = 100 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
d / 54800 / 54800fig6.jpg "/>
Figuur 6. immunostained Monsters Gewist in BABB Behoud Fluorescent Signaal voor ten minste twee maanden. E11.5 embryo's werden gekleurd met PECAM1 antilichaam en opgeruimd met BABB; embryo's van dezelfde partij werden onmiddellijk of na een periode van twee maanden afgebeeld. Paneel A toont de intersomitische slagaders van het embryo onmiddellijk afgebeeld en paneel B toont de embryo afgebeeld twee maanden later. Confocale beelden werden verzameld met behulp van de 10X droge objectieve en gebruikt om maximale intensiteit z projecties te genereren. Dao, dorsale aorta. Beelden tonen sagittale uitzicht. Schaal bars in A en B = 100 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Coronaire vaten geheel embryonale harten werden afgebeeld door wholemount immunokleuring met anti-PECAM1 antilichaam gevolgd door optische klaring en confocale microscopie. De eenvoudige methode die hier beschreven, voor de goedkeuring van de embryonale muis harten met BABB, verhoogt de optische penetratie en maakt het vastleggen van beelden met hoge resolutie van de bloedvaten gelokaliseerd in de aorta en ventriculaire muren. Glycerol gebaseerde montage reagentia zoals Vectashield (brekingsindex 1,45) zijn ook gebruikt voor beeldvorming van de coronaire vasculatuur 22 maar de hogere brekingsindex van BABB (1,56) vermindert lichtverstrooiing nog verder, waardoor diepere penetratie. Weefsel speling ondervangt de behoefte aan complexe, dure vormen van microscopie zoals multifoton microscopie en lichte plaat die minder toegankelijk voor onderzoekers mogelijk. Het zuiveringsproces is zeer snel in vergelijking met andere werkwijzen 6-9 en kleine monsters kan carried met behulp van kleine hoeveelheden van de reagentia direct aan de microscopie schotel. Robuuste kleuring van het vaatstelsel vereist om beelden van hoge kwaliteit te bereiken; anti-PECAM1 antilichaam werd geselecteerd als het markeert alle soorten coronaire EC en een aantal commerciële antilichamen bleken voldoende hoge niveaus van kleuring geven. Bovendien lijkt de fluorescente kleuring zeer stabiel in BABB; monsters bewaard bij kamertemperatuur in BABB (beschermd tegen licht) behielden hun fluorescentiesignaal enkele maanden. Dat PECAM1 antilichaam efficiënt labelt de coronaire endocardium en de vasculatuur was soms problematisch, vooral bij opname van de peritruncal plexus. Sterkere kleuring van de aorta lumen tegenover het peritruncal EC tot een risico van oververzadiging in sommige gebieden van de beelden, wat betekent dat een zorgvuldige aanpassing van de beeldvormende parameters nodig was. Idealiter een antilichaam kleuring alleen vasculaire EC's worden gebruikt; in praktijk,Het vinden van geschikte antilichamen die het vereiste wholemount kleuring verkregen kan moeilijk zijn. Onlangs heeft vetzuurbindend eiwit 4 (FABP4) blijkt een marker van hart- EC 23 en derhalve kan een alternatief PECAM1 vertegenwoordigen.
Om de 3D morfologie van de aorta en hartkamers werden de monsters niet vlak gemonteerde behouden, maar werden in plaats daarvan afgebeeld in glazen bodem gerechten. De diepte van de monsters af te beelden uitgesloten het gebruik van hoge doelstellingen vergroting vanwege hun korte werkafstand. Maar een hoge resolutie beelden waren nog steeds haalbaar is met behulp van een 10x doelstelling door het verhogen van pixel verblijftijd en het gebruik van een pixel array size van ten minste 1024 x 1024 voor het vastleggen van beelden. Dit was voldoende voor de analyse van de structuur en de verdeling van de kransslagaders, maar fijnere analyse van de cellulaire structuur vereisen vlakke montage van monsters. Dissectie van afzonderlijke delen van het hart voor de montage,bijvoorbeeld ventrikel wanden en aorta, kan ook nodig zijn. Als alternatief, over-bemonstering van het beeld, gevolgd door deconvolutie kan worden uitgevoerd om de resolutie en gevoeligheid te verhogen uitgevoerd; Dit vereist echter aanzienlijk langere scantijden en zorgt voor extreem grote beeldbestanden die veel rekenkracht te verwerken vereisen.
Harten tot E15.5 succesvol afgebeeld met behulp van deze methode, en het is ook mogelijk om de vasculatuur van gehele embryo's (tot ten minste E11.5) analyseren met hetzelfde protocol. Andere celtypen, zoals gladde spiercellen zijn eveneens afgebeeld in ons laboratorium met deze techniek. Voor dikkere weefsels, bijvoorbeeld harten ouder dan E15.5, kan antilichaam penetratie beperkende factor; langere incubaties en / of verhoogde schoonmaakmiddel vereist. Bovendien, bij het verzamelen van een groot z stapel afbeeldingen signaalsterkte kan worden gereduceerd omdat de lasers doordringen in de verste delen van het weefsel; maar de confokale kunnen worden aangepast aan laservermogen toenemen met toenemende afstand z.
Deze methode maakt confocale microscopische analyse van zowel de vroegste stadia van de vorming kransslagader en patroonvorming van de kransslagaders in latere ontwikkelingsstadia. Gedetailleerde informatie over de verdeling, vertakking en structuur van bloedvaten kan in korte tijd worden verkregen, waardoor dit een waardevol hulpmiddel voor de studie van genetische muizenmutanten specifieke defecten in angiogenese trajecten.
Acknowledgments
Het werk werd gefinancierd door de British Heart Foundation'and ondersteund door het National Institute for Health Research Biomedical Research Centre in Great Ormond Street Hospital for Children NHS Foundation Trust en University College London.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Life Technologies | 14190-094 | |
| Forceps | FST | 11251-30 | |
| 10 cm Petri dishes | Falcon | 351029 | |
| 35 mm Petri dishes | Sigma | P5112 | |
| Stainless steel minutien pins 0.2 mm diameter | FST | 26002-20 | |
| Fine tip pastettes | Alpha Laboratories | LW4061 | |
| 1,000 ml pipette tips | Sorenson | 34000 | |
| 48-well plate | Falcon | 353078 | |
| Kwik-Gard | World Precision Instrument | KWIKGARD | Silicone elastomer Sylgard184 packaged in a cartridge for mixing and dispensing |
| Kwik-Gard refill | World Precision Instrument | KWIKGLUE | Refill cartridges and dispensing tips |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Make up in PBS and store at -20 °C |
| 100% methanol | VWR | 20847307 | |
| Tween®20 | Sigma | P1379 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Anti-PECAM1 antibody, rat anti-mouse | BD Pharmingen | 553370 | Primary antibody, dilute 1 in 50 |
| Anti-CD31 polyclonal, rabbit polyclonal | Abcam | ab28364 | Primary antibody, dilute 1 in 50 |
| Anti-CD31/PECAM1 clone 2H8, armenian hamster monoclonal | Thermo Fisher Scientific | MA3105 | Primary antibody, dilute 1 in 400 |
| Endomucin antibody (V.7C7), rat monoclonal | Santa Cruz Biotechnology | sc-65495 | Primary antibody, dilute 1 in 50 |
| Anti-SM22 alpha antibody, rabbit polyclonal | Abcam | ab14106 | Primary antibody, dilute 1 in 250 |
| Goat anti-rat IgG (H+L)Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A11007 | Secondary antibody, dilute 1 in 500 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L)Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | Secondary antibody, dilute 1 in 500 | |
| Goat anti-Armenian Hamster IgG (H+L)Alexa Fluor 488 | Abcam | ab173003 | |
| Goat anti-rat IgG (H+L)Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21208 | Secondary antibody, dilute 1 in 500 |
| Phenolic screw cap | Wheaton | 240408 | |
| Benzyl alcohol | Sigma | 402834 | |
| Benzyl benzoate | Sigma | B6630 | |
| Imaris | Bitplane Imaging | image analysis software | |
| ImageJ software | NIH | Freeware |
References
- Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).
- Tian, X., et al. Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries. Cell Res. 23 (9), 1075-1090 (2013).
- Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).
- Klotz, L., et al. Cardiac lymphatics are heterogeneous in origin and respond to injury. Nature. 522 (7554), 62-67 (2015).
- Nam, J., et al. Coronary veins determine the pattern of sympathetic innervation in the developing heart. Development. 140 (7), 1475-1485 (2013).
- Zhu, D., Larin, K. V., Luo, Q., Tuchin, V. V. Recent progress in tissue optical clearing. Laser Photon. Rev. 7 (5), 732-757 (2013).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat. Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat. Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat. Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Zucker, R. M., Hunter, E. S., Rogers, J. M. Confocal laser scanning microscopy of morphology and apoptosis in organogenesis-stage mouse embryos. Methods Mol. Biol. 135, 191-202 (2000).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat. Protoc. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Erturk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. J. Vis.Exp : JoVE. (89), (2014).
- Dyer, L. A., Wu, Y., Patterson, C. Protein isolation from the developing embryonic mouse heart valve region. J. Vis.Exp s : JoVE. (91), e51911 (2014).
- Wilsbacher, L. D., Coughlin, S. R. Analysis of cardiomyocyte development using immunofluorescence in embryonic mouse heart. J. Vis.Exp : JoVE. (97), (2015).
- StitchArt Guide for Zen 2010. , Zeiss. Available from: http://www.google.co.uk/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&ved=0ahUKEwjC6OPVnO7NAhVD7RQKHQzqALkQFggcMAA&url=ftp%3A%2F%2Fftp.sonic.net%2Fpub%2Fusers%2Flhund%2FMMP%2FBlurWin2012%2FHelpful Docs%2FTiling_and_Stitching in Zen.pdf&usg=AFQjCNH4C6dv8bdmKC651sp_CFz4C1Rq3g (2010).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Tian, X., Pu, W. T., Zhou, B. Cellular origin and developmental program of coronary angiogenesis. Circ. Res. 116 (3), 515-530 (2015).
- Ivins, S., et al. The CXCL12/CXCR4 Axis Plays a Critical Role in Coronary Artery Development. Dev. Cell. 33 (4), 455-468 (2015).
- Theveniau-Ruissy, M., et al. Coronary stem development in wild-type and Tbx1 null mouse hearts. Dev. Dyn : an official publication of the American Association of Anatomists. 245 (4), 445-459 (2016).
- Tomanek, R. J. Formation of the coronary vasculature during development. Angiogenesis. 8 (3), 273-284 (2005).
- Chen, H. I., et al. VEGF-C and aortic cardiomyocytes guide coronary artery stem development. J. Clin.Iinvest. 124 (11), 4899-4914 (2014).
- Tian, X., et al. Vessel formation. De novo formation of a distinct coronary vascular population in neonatal heart. Science. 345 (6192), 90-94 (2014).
