Summary
אנו מציגים פרוטוקול לניתוח הכליליים כולן לבבות בעכברים עובריים עד E15.5, בשיטות מכתימות אימונולוגיים תקן ואחריו אישור אופטי מיקרוסקופיה confocal. טכניקה זו מאפשרת הדמיה של כלי דם בכל הלב השלם ללא הצורך בניתוח רב-פעמי של סעיפי סדרתי.
Introduction
הקמת רשת כלילית מתפקדת חיונית לתפקוד לב התפתחות עוברית, וניתוח של מוטנטים עכבר גנטיים יכול לספק תובנה חשובות האותות המולקולריים שבבסיס תהליך התפתחותי זה. היכולת לדמיין את המקלעת כלילית העוברית בכללותו, ולא הציג בסדרת סעיפים היסטולוגית, חיונית כדי להקל על הניתוח של דפוסי כלי מוטנטים גנטיים, ונמנעה את ההפסד הפוטנציאלי של מידע שיכול להתרחש כתוצאה מכאנית חיתוך של הרקמה. כלי נגזר לגבש עורקים וכלי דם הם נקודה עמוקים בתוך הקירות של שני החדרים ואת האאורטה 1-3. עם זאת, תוך תיוג פלורסנט של תאים בשילוב עם מיקרוסקופיה confocal ליזר סריקה יכולה לספק תמונות ברזולוציה גבוהות של כלי הלימפה ורידים / שטחי wholemount שכותרתו 4,5, עומק ההדמיה מוגבל על ידי חדירה אופטית. הדמיה ברזולוציה גבוהה של כובעillaries ועורק ברחבי העומק השלם של הלב ולכן אינו אפשרי ללא צורה כלשהי של סליקת רקמות.
חדירה אופטי מסכן נגרמת על ידי מקדם השבירה גבוה של תאית תאית (סיבים למשל, קולגן וגמיש) מספר מרכיבים של רקמות עבות. זה מפזר את אור ההדמיה, גורם לטשטוש וירידה לעומת זאת. סולקים בדרך כלל להתאים את מקדם השבירה גבוה של רקמות כגון, כלומר האור יכול לנסוע דרך המדגם בלא הפרעה ו להעמיק אל תוך רקמות. לפני הסליקה, רקמות מיובשות בדרך כלל כמו מים יש מקדם שבירה נמוכה יחסית. שפע של שיטות סליקה חדשות פותח לאחרונה, עם זאת תלוי הטכניקה המשמשת, בתהליך הסליקה יכול לקחת ימים או שבועות ועשוי לדרוש ריאגנטים יקרים 6-9. באב (א 1: תערובת 2 של בנזיל אלכוהול ו בנזיל בנזואט) הוא סולק זול, נפוץ, אשר יש לו אתהיתרון של ניקוי דגימות מאוד מהר. באב מבוסס טכניקות ניקוי הדמיה תוארו בעבר עבור דגימות נוירולוגיות ואיברים שונים 10-13. כאן אנו מתארים טכניקה חזקה וברורה עבור האישור באב של דגימות immunostained ואחריו מיקרוסקופיה confocal, עם התייחסות ספציפית לעניין בחינת כלי דם בלב murine מ- E (יום עוברי) 11.5 - 15.5 ומעלה. עם זאת, כמו גם הודגם, הטכניקה יכולה באותה מידה להיות מיושמת על ניתוח של עובר כולו, כמו גם סוגי תאים אחרים, כל עוד נוגדנים איכותיים סמני העניין זמינים.
Protocol
כל המחקר בבעלי החיים בוצע בהתאם להנחיות מוסדיות ברישיון מטעם משרד הפנים בבריטניה.
1. Dissection ו קיבוע של לבבות עובריים
- להרדים עכבר מתוזמן בהריון ביום הנדרש באמצעות טכניקה קולינג אישרה אתית, למשל, CO 2 הרדמה ואחריו נקע בצוואר הרחם, ולהסיר את שקי עובריים 14, הצבתם בצלחת 10 ס"מ פטרי מלאות בופר פוספט (PBS) .
- באמצעות מיקרוסקופ לנתח מלקחיים, לפתוח את שקי הרחם בזהירות להסיר כל העובר, לנתק את חבל הטבור והסרה שק החלמון.
- למטרות גנוטיפ, להסיר את הזנב ומקום עובריים בתוך שפופרת 1.5 מ"ל microcentrifuge להפקת תמוגה / DNA מאוחר יותר.
- על מנת להסיר את הלב, להצמיד כל העובר על גבו בצלחת אלסטומר מצופה סיליקון PBS מלא 35 מ"מ פטרי, באמצעות סיכות נירוסטה minutien. בעזרת מלקחיים בסדר, carefully לפתוח את החזה לנתק את הכלי הנהדר, קדמי ללב. ואז להגיע מאחורי הלב עם המלקחיים, לתפוס את הכלי מאחורי הלב ומשוך בעדינות כדי להסיר את הלב; הריאות יכול לבוא משם גם בעת ובעונה אחת.
- מעביר את לב צלחת מתוקה 35 מ"מ פטרי המכילה PBS ולהשתמש במלקחיים בסדר לקצץ משם רקמת הריאה, במידת צורך. ואז להעביר את הלב אל באר צלחת 48-היטב מלא קר PBS.
- לאחר איסוף כל הלבבות בצלחת 48-היטב, לשאוב את PBS עם פיפטה פסטר מפלסטיק קנס שקצהו ולהחליף עם 0.5 מ"ל paraformaldehyde% 4 (PFA).
זהירות: PFA הוא ידוע להיות אלרגני, מסרטנים, ורעיל.- E11.5 תקן - 12.5 לבבות במשך 15 דקות, לבבות E13.5 במשך 20 דקות ו E14.5 - 15.5 לבבות למשך 30 דקות, ב 4% PFA בטמפרטורת החדר.
- לשאוב PFA עם פיפטה פסטר מפלסטיק קנס שקצהו ולשטוף את ליבם 2x בקור PBS.
CAUTION: PFA מסוכן וחייב להיות מסולק בהתאם לתקנות מוסדיות. - אם אינכם משתמשים מיד immunostaining הר שלם (ראה סעיף 2), מייבשים את לבבות בביצוע שוטף רצופים 5 דקות את הפתרונות הבאים: 25% מתנול / 75% PBS, 50% מתנול / 50% PBS, 75% מתנול / 25 % PBS.
זהירות: מתנול רעיל, ללבוש כפפות. אחסן את הלבבות ב -20 ° C. מתנול 100%.
2. הר שלם Immunostaining הלבבות עובריים עם Anti-PECAM1 נוגדן
הערה: נוגדנים אנטי-PECAM1 לעבוד גם עבור מכתים של כלי הדם כליליים (ראה שלב 2.4) אבל שום סמן הפאן אנדותל שנותן אות יציבה יהיה מתאים.
- אם אתה משתמש לבבות שאוחסנו מתנול 100%, להעביר 1.5 מ"ל צינורות microcentrifuge רעננותם בביצוע שוטף רצופים 5 דקות את הפתרונות הבאים: 75% מתנול / 25% PBS, 50% מתנול / 50% PBS ו -25% מתנול / 75% PBS. Permeabilize את ליבם על ידי ביצוע 3 x 10 שטיפות דקות ב 0.5 - 1.0 מ"ל PBST (PBS / 0.1% Tween-20), מסתובבת בטמפרטורת החדר.
- חסום את ליבם על ידי החלפה עבור שעה 1 בטמפרטורת החדר 1.0 מ"ל סרום 10% עיזים PBST.
- הסר חוצץ חסימת עם פיפטה פסטר מפלסטיק קנס שקצהו או 1,000 קצה פיפטה μl ולהחליף עם 400 - 500 μl לחסום טרי המכיל את הנוגדן הראשוני אנטי PECAM1 בדילול 1:50. סובב את צינור לילה בשעה 4 ° C..
- למחרת, לשאוב את הנוגדן בלוק / העיקרית עם פיפטה פסטר מפלסטיק קנס שקצהו או 1,000 קצה פיפטה μl ולבצע לפחות שוטף hr 1 6x ב 1.0 מ"ל PBST, סיבוב צינורות בטמפרטורת החדר.
- חלף לשטוף האחרון עם חיץ חסימה טרי המכיל נוגדנים משני fluorophore מצומדות בדילול 1: 500, דגירת הלילה ב 4 מעלות צלזיוס, עם רוטציה. להגן מפני אור על ידי עטיפת הצינורות בנייר כסף.
- למחרת, לשאוב את הגוש / secנוגדן רווי עם פיפטה פסטר מפלסטיק קנס שהקצה ולבצע לפחות שוטף hr 1 6x ב 1.0 מיליליטר PBST, סיבוב הצינורות בטמפרטורת חדר.
- אחסן את הלבבות ב 4 ° C (מוגן מפני אור) עד הצורך.
3. הכנת פתרונות סליקה ומנות מיקרוסקופיות
הערה: כאשר הדמית לבבות באב הוא חיוני, כי אף אחד הפתרון באב באים במגע עם הרכיבים של המיקרוסקופ. לשם כך בפרוטוקול הבא מכיל הוראות להכנת מנות אלסטומר אטום סיליקון מתאימות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, אשר ניתן להכין מבעוד מועד. אלסטומר סיליקון מספק מחסום כדי להכיל את באב ולמנוע ממנו מחלחל פוטנציאלי בין תחתית זכוכית הצדדים פוליקרבונט של המנה.
- כדי להכין את הכלים סיליקון אלסטומר מצופה, לקחת תרבות מנות אופטי בעל תחתית זכוכית במקום כובע מתוך בורג 4 מ"ל בקבוקון העליון (כ -1.5 ס"מ קוטרב) במרכז כל צלחת.
הערה: זה יהווה גם למדגם כאשר אלסטומר מוחל על הצלחת. - מלאו את הכלים עם אלסטומר סיליקון עד לעומק של כ -0.5 ס"מ, באמצעות מחסנית המוליך לערבב שני הרכיבים כפי שהם מיושמים, על פי הוראות היצרנים. השאירו לרפא לפחות 24 שעות, כדי לוודא כי שווי הבקבוקון נשאר במרכז כל צלחת.
הערה: השתמש משקפי מגן כדי למנוע מגע מקרי של אלסטומר סיליקון עם עיניים. - לאחר ריפוי אלסטומר, להסיר את כובע הבקבוקון מכל מאכל, זה ישאיר באר מרכזי שבו מדגם להיות צלם ניתן למקם במגע ישיר עם תחתית הזכוכית של המנה.
הערה: כאשר נרפא אלסטומר צריך להיות תקיף יבש למגע. - הכן את הפתרון באב (בנזיל אלכוהול 1 בחלקו בנזיל בנזואט 2 חלקים). זה צריך להיות מאוחסן בתוך בקבוק זכוכית ומוגן מפני אור.
זהירות: BABB הוא פתרון רעיל, מאכל. ידית בארון קטר תוך לבוש מגן מתאים. - מערבבים באב מתנול לבצע פתרון 50:50 (1 - 5 מ"ל) ב בקבוקון זכוכית. להגן מפני אור, למשל, על ידי לפפה את הבקבוקון בנייר כסף.
4. התייבשות, סליקת שמת לבבות למיקרוסקופיה Confocal
ניתן לפנות מדגמים גדולים צלוחיות זכוכית 4 מ"ל, אולם עבור מדגמים קטנים (למשל, לבבות עד E13.5) עדיף לבצע את תהליך ניקוי ישירות בצלחת מיקרוסקופיה: הערה. זה עוזר למנוע "לאבד" את הדגימות כמו הלבבות להיות מאוד שקופים פעם פינה. לקבלת דוגמיות הקטנות אלה סליקה היא מהירה מאוד, המתרחשת בתוך כמה דקות.
הערה: להגן על דגימות מן האור במהלך כל השלבים הבאים על ידי לפפה / כיסוי צינורות ומנות עם רדיד.
- לפני הניקוי, מייבש את לבבות immunostained באמצעות סדרת מתנול על ידי החלפה של הלבבות ב בטמפה בחדרrature צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge ב שינויים רצופים של הפתרונות הבאים: 25% מתנול / 75% PBS, 50% מתנול / 50% PBS ו -75% מתנול / 25% PBS (5 דקות כל אחת). לבסוף, לסובב עבור 3 x 5 דקות ב 100% מתנול.
- עבור לבבות עד E13.5, מקום במרכז צלחת מיקרוסקופיה; מתחת למיקרוסקופ להבטיח בלב פונה עם העליון בצד הגבי שלה. הסר מתנול מרחבי הלב עם פיפטה פסטר מפלסטיק קנס שקצהו.
- בעזרת פיפטה פסטר מפלסטיק נקי שקצהו בסדר, להוסיף באב: פתרון מתנול 50:50 ב נפח מספיק לטבול את הלב (כ -300 - 400 μl). כמו הלבבות לפעמים יכולים להתהפך בתמיסה, לבדוק את הכיוון שוב בעוד הלבבות עדיין אטומים. השאר בתמיסה למשך 5 דקות.
- הסר את 50:50 פתרון בקבוק פסול זכוכית במנדף ולהחליף באב, שוב בעזרת פיפטה פסטר מפלסטיק שקצו בסדר.
הערה: נפח גדול אינו נדרש; להוסיף sufficient כך שהלב יושב בתוך טיפה של פתרון. הלב צריך לנקות בתוך 5 דקות. - עבור לבבות גדולים, לנקות את דגימות צלוחיות זכוכית.
הערה: לב E15.5 צריך לנקות תוך 30 דקות -1 שעה אבל ניתן להשאיר לילה במידת הצורך. - אחרי המדגם הוא ברור, להסיר את הפתרון ולהחליף עם נפח מינימלי של באב. לחלופין, מכסים את המדגם עם תלוש כיסוי, כדי לעזור לשמור אותו במקום, אולם זה לא הכרחי. השתמש לב הדמיה.
5. לבבות הותר הדמיה ידי מיקרוסקופית Confocal
הערה: תמונות שנתפסו על מיקרוסקופ confocal הפוך באמצעות 10X או 20X מטרות יבשות. למרות שניתן להשתמש המנות על confocal זקוף, טיפול נוסף יש לנקוט כדי למנוע מגע של המטרה עם הפתרון באב.
- איסוף z-סריקה של הלב 15. בהתאם לגודל של הלב, סריקה אריח עשוי להידרש התמונה כולה לב 16.
- אם מרחק העבודה האובייקטיבי מאפשר, להשתמש בהגדלה גבוהה יותר כדי להשיג תמונות ברזולוציה גבוהה של אזורים של עניין.
6. ניתוח נתונים באמצעות תוכנת פיג'י
- פתח את מחסנית z של תמונות בפיג'י 17.
- כדי להפוך הקרנת AZ של הערימה כולה או חלק ממנה, לחץ על תמונה ובחר סטאק, ואחריו פרויקט Z. הזן את להתחיל ולהפסיק מספרים פרוסים, ובחר את סוג הקרנת z, למשל, עוצמת ממוצע, עוצמת מקסימום.
- כדי להדגיש כלים בודדים בתוך ערימה של פרוסות תמונה בעזרת כלי Blow (מתוך הפילוח בוחר תפריט התוספים, ואז לפוצץ / כלי לאסו) ולחץ על האזורים בתמונה להתמלא ב EAפרוסת ch. השתמש בפקודת המילוי (לחץ על עריכה, ולאחר מכן בחר 'מילוי) למלא את האזורים הנבחרים עם הצבע של בחירה בחזית (לחץ על עריכה, ולאחר מכן בחר אפשרויות, ואחריו צבעי חזית).
- פרויקט Z התמונה מחסנית כמו קודם.
7. טיוח נפח משטח 3D של העורקים הכליליים שנוצר באמצעות Imaris
- הקש על סמל הנוף לעלות בחלק העליון של המסך גרור ושחרר את קובץ התמונה לתוך חלון הנתונים. הקישו על האייקון של View 3D בראש המסך.
- בחר את סמל משטחים (סמל כחול) ולאחר מכן לחץ על כרטיסיית יצירה. הקישו על 'יצירת דלג אוטומטית, לערוך באופן ידני' בתיבת הדו-שיח ולחץ על סמל Draw (סמל העיפרון הדק).
- בחר בכרטיסיית קונטור, ולאחר מכן על כרטיסיית המצב. במצב, לחץ על מטה קסמים או סמלי isoline. בחר את המצב המצביע בבחירה פוינטר בצד הימני של המסך על ידי לחיצה לצד 'בחירה', ולאחר מכן לחץ על 'הצייר9; תיבה (בפינה השמאלית התחתונה של המסך).
- השתמש isoline או בכלי מטה קסם כדי לבחור את קווי המתאר של העורקים פרוסים רצוף. נווט פרוס לחתוך באמצעות מחוון עמדת Slice.
- כאשר כל קווי המתאר נבחרו, לחץ על תיבת צור Surface. ההיקף שמסביב יכול להיעשות בלתי נראה, או שניתנו פחות או יותר אטום באמצעות מצב Blend; לחץ על עוצמת קול כדי לסמן אותו, ולאחר מכן בחר בכרטיסיית ההגדרות, ואחריו על כרטיסיית המצב. בחר Blend והשתמש במחוון כדי לשנות את האטימות.
- צלם תמונות באמצעות פונקצית Snapshot.
Representative Results
כמו הלב מתפתח, שריר הלב חדרית הוא פלש ידי תאי האנדותל (EC) ממקורות שונים, וכן מקלעת כלי דם נוצרה. כולים המתפתחים בתוך שריר הלב חדרית יימשכו כדי ליצור רשתות נימי עורקי אספקת דם מחומצן אל רקמת לב 18. במקביל (סביב E11.5) מחלת העורקים נובעות מתחילות להתפתח באופן עצמאי מרשת נימים נפרדת (המכונית מקלעת peritruncal) המקיף את לומן של אב העורקים 14,19,20. ECS מקלעת Peritruncal בתחילה ליצור קשרים מרובים עם לומן של אבי העורקים ברמה של הסינוסים שסתום, אבל בסופו של דבר רק כלי אחד תימשך בכל צד של אבי העורקים, קורה כדי ליצור את שורשי העורקים הכליליים שמאל וימין 21. מרחבי E13.5 peritruncal חדרית כלי לבבי להצטרף עד ליצירת רשת ביניהם, המאפשר זרימת הדם מן אאורטה לתוך הכלי כלילית 14,22. הכתמה של ECS עם נוגדן אנטי PECAM-1, בשילוב עם אישור באב של לבבות שלמים, מאפשר ניתוח של רשתות כלילית פיתוח החל מהשלבים המוקדמים ביותר האפשריים. בשלבים התפתחותיים מאוחר יותר דפוסים של העורקים הכליליים התבגרות יכול גם להיבחן. שיטה זו יכולה גם להיות מנוצלת כדי להכתים את כלי הדם של עובר כולו (עד E11.5 לפחות), ועם נוגדנים שונים, למשל, יקטין שריר חלק אנטי-אלפא (Sm22α) ו Endomucin.
איור 1 מציג z-תחזיות בעוצמה מקסימלית של לב E11.5 שנוצר באמצעות תוכנת פיג'י. פונקצית הטייל שמשה לאיסוף תמונות כמה חלקיות של הלב ולחבר ביניהן לתוך תמונה מלאה; זה שימושי כדי לתת סקירה של מכתים את הדגימה כולה. בשעת נוגדן PECAM1 בשלב זה בעיקר מכתים את בטנה endocardial נ לב היצואessels, אולם כמה ECS יכול להיות גם ציין הקיר של החדר השמאלי (אזור התאגרף באיור 1 א ', המוצג בהגדלה 1A'). בנוסף, מקלעת peritruncal ניתן להבחין בבירור הקיר של דרכי יצוא (OT) (אזור התאגרף באיור 1B). במקרה האחרון, צמצום מספר פרוסות Z- המחסנית השתמשה כדי ליצור את ההקרנה שפר את בהירות התמונה, ומאפשר את החיבורים עם לומן של אב העורקים להיות דמיינו יותר בבירור (איור 1B "). באיור 2, הפרוקסימלי כלי הדם עלה ל האאורטה ניתן לצפות לב E12.5. איור 3 מציג את מקלעת peritruncal בתוך הלב E12.5. תחזית z 12-פרוס באיור 3A מראה מקלעת החיים לעומת זאת כמו כמה כלים הם נקודות ventrally לומן של אב העורקים (אשר גם הוא מוכתם בכבדות על ידי נוגדן אנטי PECAM1), פיצול Z- מחסנית iNto מספר ערימות משנה (איור 3 ב-ד) מספק מידע חזותי יותר. למשל, מחסנית תת מוקרן איור 3 ב מציג כלי peritruncal חיבור אל פני השטח הגחון של לומן אבי העורקים, אשר אינו גלוי בתחזית המלאה. איור 4 מראה חלק של לב E15.5; העורקים הכליליים גלויים לעין בשלב זה (איור 4 א, 30-פרוסת תחזית). בשנתי ה תחזיות z 5 פרוסה שמוצגות 4B הדמוי ו- C שסתומי אב העורקים ריאתי יכולים גם להיות מדמיינים ידי מכתים PECAM1; סניפי הגומלין של רשת הנימים כלילית גם ברורים בתחזיות תת-ערימה הקטנות האלה. טכניקות פילוח ידני שימשו כדי להדגיש את העורקים הכליליים באמצעות פיג'י (איור 4D) או Imaris (איור 4D ו- E). טיוח נפח משטח 3D של העורקים הכליליים / לומן העורקים שנוצר uסינג Imaris ניתן לצפות עם או בלי כלי הדם שמסביב (איור 4E ו- F).
כלי הדם של עובר כולו גם ניתן לבדוק באמצעות מכתים PECAM1 / אישור באב. 4A ודמות ', להראות תחזיות z שנוצרו בעקבות ערימות תת מהצד הימני (z פרוסה 11 - 65) בצד שמאל (z פרוסה 66-110) של העובר בהתאמה. השוואת שני התמונות עולה כי עוצמת אות הניאון לא פוחתת באופן משמעותי עם חדירה עמוקה יותר לתוך הרקמה. באיור 4 ב ', PECAM1 (אות אדומה) Endomucin (אות ירוקה) נוגדנים אוחדו לתייג עורקי intersomitic (ISAs) ורידי בהתאמה, של עובר E11.5. איור 4C מראה SM22α (אות אדומה) מכתים PECAM1 (אות ירוקה) של ISAs בעובר E11.5. באיור 6, עובר E11.5מוכתם PECAM 1 הם צילמו מיד לאחר אישור באב (איור 4 א), או לאחר הפסקה של כחודשיים (איור 4B). אות הניאון הייתה עדיין חזקה מספיק כדי תמונה בהצלחה לאחר אחסון ממושך של המדגם באב.
איור 1. Immunostaining של הלב E11.5 עם Anti-PECAM1 נוגדן (זוהה עם Anti-עכברוש IgG מצומדות אלקסה 594). (A, B) תמונה 2 x 2 אריחים נאסף באמצעות המטרה 10X של מיקרוסקופ confocal הפוכה. כתמי נוגדן PECAM1 הוא endocardial וכלי דם ECS. תחזיות (בעוצמה מקסימלית) נבעו 22 (א) או 5 (ב) z פרוסות כל אחד בעובי 4 מיקרומטר, באמצעות תוכנה פיג'י. א 'ו-ב' 'הוא enlargements האזורים התאגרף ב A ו- B בהתאמה. חצים ב א 'מצביעים כלי דם בקיר החדר; בסי ', סוגר מציין את מקלעת peritruncal. OT, בדרכי יצוא; LV, חדר שמאלי, חדר ממני RV. כל התמונות הן מהחזית. ברי סולם ב A ו- B = 200 מיקרומטר; ברים בקנה מידה א 'ו-ב' '= 100 מיקרומטר. לוח 1B 'הותאם מתוך Ivins et al., 2015 19. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. Immunostaining של לב E12.5 עם נוגדן אנטי PECAM1. לוח מראת הקרנת AZ (בעצמה מקסימלית) של סריקת רעפי 2x2. האזור התאגרף ב A מוצג enlargאד בשנת א '; החצים מצביעים כלי דם מרובים הפרוקסימלי האאורטה (Ao). LV, חדר שמאלי, חדר ממני RV. כל התמונות הן מהחזית. בר סולם ב A = 200 מיקרומטר; סרגל ב '= 100 מיקרומטר A. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. הדמיה של מקלעת Peritruncal בתוך הלב E12.5. תמונות Confocal של אבי העורקים E12.5 (Ao) מוכתם נוגדן אנטי PECAM1 נאספו באמצעות המטרה 10X. תחזית z (בעצמה מקסימלית) א נוצרה מתוך 12 פרוסות z (4 מיקרומטר עובי); החצים מצביעים על כלי מקלעת peritruncal. BD 12 פרוסות z חולקו לשלוש ערימות משנה בהתאם להסבר המשמש לייצור projecti נפרדתוספות; ראשי חץ עולה קשרים שיצרו מקלעת peritruncal לומן של אבי העורקים. כלי Peritruncal מקומי ventrally לומן של אבי העורקים גלויים B ו- C. כל התמונות הן מהחזית. בר סולם = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. העורקים הכליליים ואת נימי מקלעת בתוך הלב E15.5. תמונות Confocal של לב E15.5 מוכתם נוגדן אנטי PECAM1 נאספו באמצעות המטרה 10X. לוח מראה השלכה z בעוצמה מקסימלית שנוצר בין 30 פרוסות z (4 מיקרומטר עובי); החצים מצביעים העורקים הכליליים על ימין ועל שמאל (רע"א ו- RCA) אשר ניתן לראות התחברות האאורטה (Ao). באמצעות בידולt 5 z פרוס תת-ערימות שסתומי אב העורקים ריאתי (AoV ו- PV) ניתן לראות ב B ו- C בהתאמה (בסוגריים כחולים). מקלעת הנימים חדרית היא גם ברורה בתחזיות מחסנית הקטנות יותר משנה אלה; כלי הדם הפרוקסימלי שסתום ריאתי (קופסה קטנה) מוצגים מוגדל בפינה הימנית התחתונה של הפאנל C (קופסה גדולה). פיג'י שימש כדי להדגיש כלי דם בודדים, למשל, עבור פאנל D בכלי Blow / לאסו שימש כדי למלא את העורקים הכליליים באדום באופן ידני כל פרוסה z לפני ההקרנה. התוכנה Imaris נעשה שימוש כדי ליצור תמונות 3D של העורקים (אדום) ו לומן אבי העורקים (ירוק) ב E ו F; שוב זה נעשה באופן ידני, באמצעות כלי שרביט הקסם כדי ליצור קווי מתאר אובייקט כל פרוסת z. האטימות של נפח שמסביב ניתן לשנות מצב תערובת, כמו E. לחלופין, את תמונת 3D ניתן לחלץ, כפי שמוצגת F הלב. כל התמונות הן מהחזית. בר סולם ב מיקרומטר A = 100. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. הדמיה של עובריים כלי דם. לוחות A ו- תמונות confocal מופע א 'עובר סוג בר E10.5 מוכתמים נוגדן אנטי PECAM1, שנאספו באמצעות מטרת 10X (סריקת רעפים). תחזיות ממוצעת עוצמת z נבעו פרוסות z 11-65 (א) ו 66-110 (א ') של סריקת 120 z פרוסה (4 מיקרומטר פרוסות עבות), מראות הפסד קל בלבד של עוצמת קרינה על פני העובי של העובר . לוח ב 'מציג את כלי intersomitic של העובר E11.5 מוכתם antibod ies נגד PECAM1 (אות אדומה נוגדנים משני 594 מצומדות) ו Endomucin (EMCN, אות ירוקה נוגדנים משני 488 מצומדות), אשר להכתים את עורקי intersomitic (חץ) ורידים (ראש חץ) בהתאמה (הקרנת z העצמה ממוצעת של רעפים לִסְרוֹק). לוח ג מראה עורקי intersomitic (ISAs) מעובר סוג בר E11.5 מוכתמים נוגדנים נגד PECAM1 (אות ירוקה נוגדנים משני 488 מצומדות) ו SM22α (אות אדומה נוגדנים משני 594 מצומדות). תמונות Confocal נאספו באמצעות המטרה 20X יבשה משמשות להפקת תחזיות z בעצמה מקסימלית. כל התמונות הן נופי sagittal. ברי סולם ב A ו- B = 250 מיקרומטר, סרגל קנה מידה ב- C = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
ד / 54,800 / 54800fig6.jpg "/>
דוגמאות איור 6. immunostained מסומנת ב באב שמור אות ניאון עבור חודשיים לפחות. עוברים E11.5 הוכתמו נוגדן PECAM1 ופינה עם באב; עוברים מהאצווה הם צילמו מיד או לאחר הפסקה של חודשיים. לוח מראה את עורקי intersomitic של העובר צלמו מייד ולוח ב 'מראה את העובר צלם חודשים מאוחר יותר. תמונות Confocal נאספו באמצעות המטרה 10X יבשה משמשות להפקת תחזיות z בעצמה מקסימלית. דאו, אבי העורקים הגב. תמונות להראות נופי sagittal. ברי סולם ב A ו- B = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Discussion
כלי כלילית בלבבות עובריים נלחמו צלם ידי immunostaining wholemount עם נוגדן אנטי PECAM1 ואחריו אישור אופטי מיקרוסקופיה confocal. השיטה הפשוטה המתואר כאן, עבור סליקת לבבות עכבר עובריים עם באב, מגביר את החדירה אופטית מאפשר ללכוד של תמונות ברזולוציה גבוהה של כלי דם מקומיים בקירות האאורטה חדרית. גליצרול מבוסס ריאגנטים הרכבה כגון Vectashield (מקדם שבירה 1.45) גם שמשו במשך הדמיה של כלי הדם הכליליים 22 אולם מקדמת שבירה הגבוהה של באב (1.56) מפחיתה פיזור אור עוד יותר, מה שמאפשר חדירה לרקמות עמוקה יותר. אישור רקמות מייתר את הצורך מורכב יותר, צורות יקרות של מיקרוסקופיה כגון multiphoton מיקרוסקופ גיליון אור אשר עשוי להיות פחות זמינה לחוקרים. תהליך הסליקה הנו מהיר מאוד בהשוואה לשיטות אחרות 6-9 ועבור מדגמים קטנים יכולים להיות carried החוצה באמצעות כמויות קטנות של חומרים כימיים ישירות על צלחת מיקרוסקופיה. מכתים יציב של כלי הדם נדרש על מנת להשיג תמונות באיכות גבוהות; הנוגדן אנטי PECAM1 נבחר הוא מסמן כל הסוגים כלילית ECS ומספר הנוגדנים מסחריים נמצאו לתת רמות גבוהות נאות מכתים. בנוסף, מכתים פלורסנט נראה יציב מאוד באב; דגימות לאחסן בטמפרטורת חדר ב באב (מוגן מפני אור) שומרות אות הניאון שלהם במשך כמה חודשים. העובדה נוגדן PECAM1 ביעילות תוויות endocardium כלילית, כמו גם את כלי הדם היה בעייתי מדי פעם, במיוחד בעת לכידת תמונות של מקלעת peritruncal. מכתים Stronger של לומן העורקים לעומת ECS peritruncal הביא סיכון של הצפת יתר באזורים מסוימים של התמונות, כלומר התאמה המדוקדקת של פרמטרי ההדמיה נדרשה. באופן אידיאלי, מכתים נוגדן רק כלי דם ECS ישמש; בפועל,עם זאת, מציאת נוגדנים מתאימים שמניבים את הרמה הנדרשת של מכתים wholemount יכולה להיות קשה. לאחרונה, חומצת שומן חלבון מחייב 4 (FABP4) הוכח להיות סמן של כלילית כלי הדם ECS 23 ולכן עשויים לייצג אלטרנטיבה PECAM1.
על מנת לשמור על מורפולוגיה 3D של תאי אב העורקים ולב מהדגימות היו לא שטוחות רכוב, אבל הם צלמו במקום במנות עם רצפת זכוכית. עומקה של הדגימות להיות צלם מנע את השימוש של מטרות בהגדלה גבוהות, בשל מרחקי העבודה הקצרים שלהם. עם זאת תמונות ברזולוציה גבוהה עדיין היו השגה באמצעות מטרת 10X על ידי הגדלת זמן פיקסל להתעכב ושימוש גודל מערך פיקסל של לפחות 1,024 x 1,024 עבור לכידת תמונה. זה היה מספיק עבור הניתוח של המבנה וההפצה של כלי דם כליליים, אולם ניתוח מדויק יותר של מבנה תאי עשוי לדרוש שטוח הרכבה של דגימות. דיסקציה של חלקים בודדים של הלב גובר,למשל, קירות החדר, או אבי העורקים, יכול להיות גם צורך. לחלופין, על-דגימה של התמונה ואחריו deconvolution עשוי להתבצע על מנת להגדיל את הרזולוציה והרגישות; אולם זה דורש פעמי סריקה ארוכות בהרבה ויוצר קבצי תמונה גדולים מאוד שדורשים הרבה כוח מחשוב כדי לעבד.
לבבות עד E15.5 הם צילמו בהצלחה באמצעות שיטה זו, וזה גם ניתן לנתח את כלי הדם של עוברים כולו (עד E11.5 לפחות) באמצעות פרוטוקול זהה. סוגי תאים אחרים, למשל, תאי שריר חלק גם כבר צילמו במעבדה שלנו באמצעות טכניקה זו. עבור רקמות עבות יותר, למשל, לבבות מבוגרים E15.5, חדירת נוגדן יכולה להיות גורם מגביל; עוד incubations ו / או חומר ניקוי גדל ייתכן שיידרש. בנוסף, בעת איסוף ערימת z גדולה של תמונות עוצמות אות יכול להיות מופחת כמו הלייזרים לחדור חלקי הקליעה של רקמות; אולם confניתן לכוונן את הגדרות ocal כדי להגדיל את כוח הליזר עם מרחק z גובר.
שיטה זו מקלה ניתוח מיקרוסקופי confocal של שניהם בשלבים המוקדמים של היווצרות כלי כלילית לבין דפוסים של העורקים הכליליים בשלבים התפתחותיים מאוחר יותר. מידע מפורט על ההפצה, ההסתעפות והמבנה של כלי דם ניתן לרכוש תוך זמן קצר, מה שהופך את כלי רב ערך לחקר מוטנטים עכבר גנטיים עם פגמים ספציפיים במסלולים אנגיוגנזה.
Acknowledgments
העבודה מומנה על ידי Foundation'and הלב הבריטי הנתמך על ידי המכון הלאומי המרכז למחקר ביו-רפואי בריאות מחקר בבית החולים גרייט אורמונד סטריט Trust הילדים NHS Foundation ו- University College בלונדון.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Life Technologies | 14190-094 | |
| Forceps | FST | 11251-30 | |
| 10 cm Petri dishes | Falcon | 351029 | |
| 35 mm Petri dishes | Sigma | P5112 | |
| Stainless steel minutien pins 0.2 mm diameter | FST | 26002-20 | |
| Fine tip pastettes | Alpha Laboratories | LW4061 | |
| 1,000 ml pipette tips | Sorenson | 34000 | |
| 48-well plate | Falcon | 353078 | |
| Kwik-Gard | World Precision Instrument | KWIKGARD | Silicone elastomer Sylgard184 packaged in a cartridge for mixing and dispensing |
| Kwik-Gard refill | World Precision Instrument | KWIKGLUE | Refill cartridges and dispensing tips |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Make up in PBS and store at -20 °C |
| 100% methanol | VWR | 20847307 | |
| Tween®20 | Sigma | P1379 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Anti-PECAM1 antibody, rat anti-mouse | BD Pharmingen | 553370 | Primary antibody, dilute 1 in 50 |
| Anti-CD31 polyclonal, rabbit polyclonal | Abcam | ab28364 | Primary antibody, dilute 1 in 50 |
| Anti-CD31/PECAM1 clone 2H8, armenian hamster monoclonal | Thermo Fisher Scientific | MA3105 | Primary antibody, dilute 1 in 400 |
| Endomucin antibody (V.7C7), rat monoclonal | Santa Cruz Biotechnology | sc-65495 | Primary antibody, dilute 1 in 50 |
| Anti-SM22 alpha antibody, rabbit polyclonal | Abcam | ab14106 | Primary antibody, dilute 1 in 250 |
| Goat anti-rat IgG (H+L)Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A11007 | Secondary antibody, dilute 1 in 500 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L)Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | Secondary antibody, dilute 1 in 500 | |
| Goat anti-Armenian Hamster IgG (H+L)Alexa Fluor 488 | Abcam | ab173003 | |
| Goat anti-rat IgG (H+L)Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21208 | Secondary antibody, dilute 1 in 500 |
| Phenolic screw cap | Wheaton | 240408 | |
| Benzyl alcohol | Sigma | 402834 | |
| Benzyl benzoate | Sigma | B6630 | |
| Imaris | Bitplane Imaging | image analysis software | |
| ImageJ software | NIH | Freeware |
References
- Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).
- Tian, X., et al. Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries. Cell Res. 23 (9), 1075-1090 (2013).
- Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).
- Klotz, L., et al. Cardiac lymphatics are heterogeneous in origin and respond to injury. Nature. 522 (7554), 62-67 (2015).
- Nam, J., et al. Coronary veins determine the pattern of sympathetic innervation in the developing heart. Development. 140 (7), 1475-1485 (2013).
- Zhu, D., Larin, K. V., Luo, Q., Tuchin, V. V. Recent progress in tissue optical clearing. Laser Photon. Rev. 7 (5), 732-757 (2013).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat. Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat. Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat. Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Zucker, R. M., Hunter, E. S., Rogers, J. M. Confocal laser scanning microscopy of morphology and apoptosis in organogenesis-stage mouse embryos. Methods Mol. Biol. 135, 191-202 (2000).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat. Protoc. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Erturk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. J. Vis.Exp : JoVE. (89), (2014).
- Dyer, L. A., Wu, Y., Patterson, C. Protein isolation from the developing embryonic mouse heart valve region. J. Vis.Exp s : JoVE. (91), e51911 (2014).
- Wilsbacher, L. D., Coughlin, S. R. Analysis of cardiomyocyte development using immunofluorescence in embryonic mouse heart. J. Vis.Exp : JoVE. (97), (2015).
- StitchArt Guide for Zen 2010. , Zeiss. Available from: http://www.google.co.uk/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&ved=0ahUKEwjC6OPVnO7NAhVD7RQKHQzqALkQFggcMAA&url=ftp%3A%2F%2Fftp.sonic.net%2Fpub%2Fusers%2Flhund%2FMMP%2FBlurWin2012%2FHelpful Docs%2FTiling_and_Stitching in Zen.pdf&usg=AFQjCNH4C6dv8bdmKC651sp_CFz4C1Rq3g (2010).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Tian, X., Pu, W. T., Zhou, B. Cellular origin and developmental program of coronary angiogenesis. Circ. Res. 116 (3), 515-530 (2015).
- Ivins, S., et al. The CXCL12/CXCR4 Axis Plays a Critical Role in Coronary Artery Development. Dev. Cell. 33 (4), 455-468 (2015).
- Theveniau-Ruissy, M., et al. Coronary stem development in wild-type and Tbx1 null mouse hearts. Dev. Dyn : an official publication of the American Association of Anatomists. 245 (4), 445-459 (2016).
- Tomanek, R. J. Formation of the coronary vasculature during development. Angiogenesis. 8 (3), 273-284 (2005).
- Chen, H. I., et al. VEGF-C and aortic cardiomyocytes guide coronary artery stem development. J. Clin.Iinvest. 124 (11), 4899-4914 (2014).
- Tian, X., et al. Vessel formation. De novo formation of a distinct coronary vascular population in neonatal heart. Science. 345 (6192), 90-94 (2014).
