Summary
تطوير ألم الاعتلال العصبي وتشمل التغيرات المرضية للخلايا الحبل الشوكي الدبقية. نظام الثقافة الدبقية موثوقة مستمدة من أنسجة الحبل الشوكي الكبار ومصممة لدراسة هذه الخلايا في المختبر غير متوفرة. لذلك، نعرض هنا كيفية تأسيس الثقافات الدبقية المختلطة الابتدائية من الماوس الكبار نسيج الحبل الشوكي.
Abstract
وقد تم قبول جيدا أن الحبل الشوكي الردود الدبقية تساهم بشكل كبير في تطوير ألم الأعصاب. وقد تم الحصول على معلومات هائلة فيما يتعلق بأنشطة الدبقية على المستويات الخلوية والجزيئية من خلال المختبر في أنظمة زراعة الخلايا. نظم في المختبر تستخدم، وتشمل أساسا الدبقية الأولية المستمدة من الأنسجة القشرية الدماغ حديثي الولادة وخلد خطوط الخلايا. ومع ذلك، قد لا يعكس هذه النظم خصائص خلايا الحبل الشوكي الدبقية في الجسم الحي. من أجل مواصلة التحقيق في أدوار خلايا الحبل السري الدبقية العمود الفقري في تطوير الأعصاب الطرفية ألم الأعصاب الاصابة التي يسببها استخدام نظام الثقافة التي تعكس على نحو أفضل حالة في الجسم الحي، وقد وضعت لدينا مختبر طريقة لوضع الحبل الشوكي الأساسي الثقافات الدبقية مختلطة من فئران بالغة. لفترة وجيزة، يتم جمع النخاع الشوكي من فئران بالغة ومعالجتها من خلال الهضم غراء تليها إزالة المايلين مع أوكارإيتي-التدرج المتوسطة. تعليق خلية واحدة يتم تربيتها في كامل Dulbecco وسائل الإعلام النسر المعدلة (cDMEM) تستكمل مع 2-المركابتويثانول (2-ME) في 35.9 درجة مئوية. تم تحسين هذه الظروف والثقافة خصيصا لنمو الخلايا الدبقية مختلطة. في ظل هذه الظروف، الخلايا جاهزة لاستخدامها في التجارب بين 12-14 د (خلايا وعادة ما تكون في مرحلة سجل خلال هذا الوقت) بعد تأسيس ثقافة (D 0)، ويمكن أن تبقى في ظروف ثقافة تصل إلى D 21. هذا النظام الثقافة يمكن استخدامها لتحقيق استجابات خلايا الحبل الشوكي الدبقية على التحفيز مع مختلف المواد والوكلاء. إلى جانب ألم الأعصاب، وهذا النظام يمكن استخدامه لدراسة الاستجابات الدبقية في غيرها من الأمراض التي تنطوي على التغيرات المرضية للخلايا الحبل الشوكي الدبقية.
Introduction
الألم المزمن هو مشكلة صحية خطيرة تؤثر على ما يقرب من 100 مليون من البالغين في الولايات المتحدة، مع تكلفة سنوية تقديرية تصل إلى 635000000000 $ 1. وقد أشارت أدلة متزايدة على مساهمة كبيرة من خلايا الحبل الشوكي الدبقية في تطوير ألم الأعصاب، واحدة من أكثر أنواع المدمرة للألم المزمن 2. ومن شأن في المختبر نظام الثقافة السليم يساعد بشكل كبير في مواصلة التحقيق في دور الخلايا الدبقية على المستويات الخلوية والجزيئية.
حاليا، في المختبر أنظمة ثقافة الدبقية تستخدم من قبل الباحثين وتشمل الخلايا الدبقية أساسا مشتقة من الأنسجة القشرية من الأطفال حديثي الولادة الماوس أو الفئران العقول وتخليد خطوط الخلايا الدبقية مشتقة من الماوس حديثي الولادة أو خلايا الفئران الدبقية الأولية. خلايا حديثي الولادة تحتوي على أعداد كبيرة من خلايا غير متمايزة التي يمكن زيادة متباينة في الخلايا الدبقية (خاصة الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة)، وبالتالي توفيرخلايا bundant للاستخدام التجريبي 3. ومع ذلك، فقد أظهرت دراستنا السابقة أن الأطفال حديثي الولادة الدماغ الخلايا الدبقية استجابت بشكل ملحوظ مختلفة من خلايا الحبل الشوكي الدبقية الكبار على lipopolysaccharide في (LPS) التحفيز. على سبيل المثال، انترلوكين (IL) -4 المعروضة تعزيز الآثار المثبطة على أكسيد النيتريك التي يسببها LPS (NO) الإنتاج في الفئران البالغين الدبقية الحبل الشوكي مقارنة مع الأطفال حديثي الولادة الدبقية في الدماغ 4. وعلاوة على ذلك، لمحات من إنتاج chemokine على التحفيز من قبل نيوروبيبتيدي، الكالسيتونين الببتيد ذات الصلة الجين (CGRP)، تختلف بلا شك بين الماوس حديثي الولادة الدبقية في الدماغ (الطرق الموضحة في المرجع 5) والفأر الشوكي الكبار الدبقية الحبل (الشكل 1). خطوط الخلايا أنشئت هي سهلة الاستخدام والحفاظ على ويمكن أن توفر عدد كبير من الخلايا في فترة زمنية قصيرة. بشكل عام، خلد يتم إنشاء خطوط الخلايا إما باستخدام نظام تخليد بوساطة فيروس (مثل خط خلية دبقية تستخدم على نطاق واسع BV2) 6 أو 7 أو عشر التاليةتحديد البريد التحول التلقائي (مثل خط خلية نجمية C8-D1A وخط خلية دبقية C8-B4) 8، 9 خطوط خلية ممتازة في دراسة خصائص الجزيئية الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة بشكل فردي؛ ومع ذلك، فإن النتائج التي تم الحصول عليها من خطوط الخلايا تتطلب دائما مزيدا من التحقق من الصحة في الخلايا الأولية أو في ظروف في الجسم الحي. كما ينبغي الإشارة إلى أنه لم يكن هناك تقرير من خط الخلايا الدبقية التي مشتق من الدبقية الحبل الشوكي القوارض.
للمساعدة في التحقيق في دور خلايا الحبل السري الدبقية العمود الفقري في تطوير ألم الأعصاب، ونظام الثقافة التي مشتق من الحبل الشوكي الماوس الكبار تم تطويرها من قبل التكيف مع طريقة ذكرت سابقا يستخدم لتوليد فأر بالغ مختلطة الثقافات الدبقية 4، 5 وقد تم صقل ثقافة الدبقية الماوس الحبل الشوكي مزيد مؤخرا 10 ويوصف في مزيد من التفاصيل في هذه المقالة. الكبار الحبل الشوكي مختلطة الثقافات الدبقية جوتنشأ مع ماوس من السلالات المختارة التي تتناسب مع احتياجات دراسة معينة، ويمكن الحفاظ على الخلايا في الثقافة لمدة تصل إلى 21 د الرد على الشروع في الثقافة. يمكن استخدام هذا الأسلوب في الدراسات ألم الأعصاب، وكذلك في التحقيقات من مختلف الأمراض العصبية التي تنطوي على تغييرات مرضية داخل الحبل الشوكي، مثل التصلب الضموري الجانبي (ALS)، وفيروس نقص المناعة البشرية (HIV) -associated الاعتلال العصبي الحسي، ومتعددة التصلب (MS).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وتمت الموافقة على بروتوكول التالية من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) في جامعة نيو انغلاند. بروتوكول التالية لإعداد الثقافات الدبقية من 4 الماوس الكبار النخاع الشوكي.
1. إعداد حلول في هود الثقافة تحت ظروف معقمة
- إعداد وسائل الإعلام والثقافة: تعديل كامل Dulbecco وسائل الإعلام النسر (cDMEM) التي تحتوي على DMEM (مع 4.5 جم / لتر جلوكوز)، و 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، 2 مم L-الجلوتامين، و 100 وحدة دولية / مل البنسلين، 100 ملغ / مل الستربتومايسين 250 نانوغرام / مل الامفوتريسين B، و 50 ميكرومتر 2-المركابتويثانول (2-ME؛ انظر 1.1.1). خلط وتصفية تعقيم جميع مكونات أخرى ثم قم بإضافة FBS. تخزين وسائل الإعلام والثقافة في 4 درجة مئوية.
- تجهيز 50 مم 2-ME / الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) حل الأوراق المالية: إضافة 100 ميكرولتر من تركزت 2-ME (14.3 م) إلى 28.6 مل من برنامج تلفزيوني 1X، ومرشح تعقيم (يمكن تخزين الحل في 4 درجة مئوية لمدة عدة أشهر). Uحد ذاتها 1 مل من 2-ME حل سهم مقابل كل 1000 مل من وسائط الثقافة.
- إعداد وسائل الإعلام كثافة التدرج
- إعداد المخزون متساوي التوتر حل وسائل الإعلام التدرج الكثافة (على سبيل المثال، 100٪ Percoll) من 1 جزء 10X منتظم برنامج تلفزيوني العقيمة و 9 أجزاء وسائل الإعلام التدرج معقمة كثافة الأوراق المالية (على سبيل المثال، Percoll).
- تمييع 100٪ وسائل الإعلام التدرج الكثافة (صنع في 1.2.1) مع 1X منتظم برنامج تلفزيوني العقيمة لجعل 20٪ من وسائل الإعلام التدرج الكثافة (على سبيل المثال، 10 مل من 100٪ وسائل الإعلام كثافة التدرج مع 40 مل من برنامج تلفزيوني 1X) وتخزينها في 4 درجة مئوية. تحقيق 20٪ من وسائل الإعلام كثافة التدرج في درجة حرارة الغرفة (RT) قبل إعداد ثقافة الخلية.
- إعداد الحلول من نظام التفكك غراء
ملاحظة: يمكن التعرف على نظام التفكك غراء في جدول المواد. ويمكن أيضا مجموعات التفكك مماثلة أخرى (بما في ذلك هؤلاء الذين اجتمعوا في منزل) يمكن أن تستخدم. جميع عناصر حيجب أن يكون اليلة العقيمة.- إضافة 32 مل من ايرل محلول الملح المتوازن (EBSS) إلى خليط مخاطاني البيض المانع (مسحوق).
- إضافة 5 مل من EBSS إلى قارورة غراء واحد (مسحوق). ضع قارورة غراء في 37 درجة مئوية حمام الماء لمدة 10 دقيقة أو حتى يذوب غراء.
- إضافة 500 ميكرولتر من EBSS إلى قنينة الدناز واحد (مسحوق). المزيج بلطف.
- إضافة 250 ميكرولتر من محلول الدناز (أعلاه) إلى القارورة غراء.
- حساب المبلغ الإجمالي للأعلاه خليط غراء / الدناز الحاجة (حوالي 800 ميكرولتر من غراء / الدناز الخليط في الماوس الحبل الشوكي) ونقل خليط حاجة إلى أنبوب 50 مل للهضم الأنسجة (الخطوة 3.2). تخزين الطعام المتبقي في قارورة الأصلي في 4 درجة مئوية لمدة أسبوعين على الأقل.
- منع جميع المكونات من مجموعات على الجليد لحين الحاجة إليها.
- إعداد العمود الفقري أنابيب جمع الحبل: واحد عقيم أنبوب 15 مل مع 5 مل من محلول ملح هانك المتوازن (HBSS، من نظام غراء التفكك،0؛ لجمع النخاع الشوكي) ومعقم 15 أنبوب واحد مل مع برنامج تلفزيوني 1X (لملء حقنة 5 مل، راجع الخطوة 2.4). وبالإضافة إلى ذلك، وإعداد طبق واحد عقيم بتري (35 مم أو 60 مم) مع 5 مل من HBSS وابقائه في هود الثقافة.
2. الحبل الشوكي مجموعة
ملاحظة: يجب أن تكون جميع المعدات المعقمة. أداء المجموعة في مجال معين وافق عليها IACUC.
- الحصول على الأدوات التالية للحصاد الماوس النخاع الشوكي: حادة مقص مستقيمة حادة / 18 سم الجراحية، مشرط 12 سم القياسية (# 3 الصلبة)، والكربون الصلب معقمة شفرات مشرط رقم 10، وهي آلة فصل الرأس الحيوانات الصغيرة، 12 سم، ومعيار المنحني ملقط، و20G إبرة معقمة تعلق على حقنة 5 مل.
- الموت ببطء الحيوان مع CO 2 وتطهير الرأس الماوس والمنطقة الخلفية مع 70٪ من الإيثانول (ETOH).
- قطع رأس الحيوان مع آلة فصل الرأس. جعل شق طولي الأوسط على أسفل الظهر لفضح طبقة العضلات. صنعوtransection نظيفة من خلال العمود الفقاري على مستوى الورك (قطع أيضا من خلال طبقة العضلات التي تغطي العمود الفقاري) مع مقص جراحي مستقيم معقمة (18 سم).
- وضع الحيوان على ورقة جديدة يمكن التخلص منها القضاء. إدراج بعناية إبرة G 20 (تعلق على حقنة 5 مل مملوءة العقيمة برنامج تلفزيوني 1X (الخطوة 1.4)) في العمود الفقري نحو الجانب منقاري. عقد الحيوان أسفل بإحكام ودفع الحقنة بسرعة. الحبل الشوكي كله يجب أن يخرج من نهاية عنق الرحم. جمع النخاع الشوكي في أنبوب 15 مل تحتوي على HBSS.
- كرر الخطوة 2.4 لبقية الفئران. بين كل حيوان، وتطهير جميع الأدوات المستخدمة مع 70٪ ETOH.
ملاحظة: عادة، يمكن إنشاء واحدة 12 لوحة جيدا لكل 4 الماوس النخاع الشوكي (انظر 4.3).
3. إعداد تعليق خلية واحدة
ملاحظة: تنفيذ الخطوات 3 و 4 في الثقافة هود للحفاظ على كل شيء العقيمة.
- نقل عن النخاع الشوكي في طبق بتري HBSS التي تحتوي على (الخطوة 1.4). قطع كل من النخاع الشوكي إلى العديد من القطع الجميلة، الصغيرة مع مقص العقيمة وملقط. نقل الأنسجة في الحبل الشوكي إلى أنبوب مخروطي 50 مل تحتوي على غراء استعداد / الدناز الإنزيم خليط (الخطوة 1.3.5) باستخدام ملقط معقم أو 10 مل ماصة (تجنب إضافة HBSS إلى خليط الانزيم، حيث سيؤدي ذلك إلى مزيد من إضعاف أعدت حل انزيم وقد يؤدي إلى انخفاض الأداء للانزيم).
- دوامة أنبوب بلطف لمزج. احتضان الأنبوب عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في حاضنة / شاكر مع المدار اهتزاز في 150 دورة في الدقيقة.
- دوامة الأنبوب مرة أخرى وبقوة يسحن الحل الانزيم مع النسيج باستخدام 5 مل ماصة لتشجيع المزيد من التفكك.
- نقل تعليق الخلية في أنبوب 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق على RT.
- أثناء الطرد المركزي، خلط 2.7 مل EBSS مع 300 ميكرولتر من إعادة تشكيل INH الألبومين مخاطاني البيضحل ibitor (1.3.1) في أنبوب العقيمة. إضافة 150 ميكرولتر من محلول الدناز (الخطوة 1.3.3).
- بعد الطرد المركزي، وإزالة طاف و resuspend بيليه الخلية مع الحل أعد فوق (الخطوة 3.5). دوامة جيدا لكسر بيليه الخلية.
- إضافة 3 مل من تشكيلها حل المانع الألبومين مخاطاني البيض (الخطوة 1.4.1) إلى تعليق خلية. خلايا الطرد المركزي في 70 x ج لمدة 6 دقائق على RT. إزالة طاف (التي تحتوي على شظايا غشاء).
4. مزيد من إزالة المايلين من تعليق خلية واحدة
- إضافة 8 مل من 20٪ سائل الإعلام التدرج الكثافة (المعد في الخطوة 1.2.2) في الأنبوب الذي يحتوي على بيليه الخلية، دوامة بلطف لعرقلة بيليه، وأجهزة الطرد المركزي الخلايا في 800 x ج لمدة 30 دقيقة في RT دون الكبح. بعناية إزالة الطبقة العليا من الحطام (ومعظمهم المايلين)، وطاف، ولكن يبقى بيليه.
- للتخلص من بقايا التدرج الكثافة، وغسل الخلايا عن طريق resuspendiنانوغرام بيليه الخلية مع 8 مل من cDMEM المخفف (1 جزء cDMEM و 2 أجزاء HBSS). الطرد المركزي الخلايا في 400 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية. إزالة طاف وغسل الخلايا مرة أخرى مع cDMEM المخفف (أعلاه) بنفس الطريقة. تبقي الخلايا على الجليد حتى بذر لهم.
- إزالة طاف و resuspend بيليه خلية في وسائل الإعلام ثقافة (cDMEM المتوفرة مع 2-ME (المعد في الخطوة 1.1)). واحد 12 لوحة جيدا، استخدام 3 مل × 4 (عدد من الفئران المستخدمة) + 2 مل = 14 مل سائل الإعلام. وهذا يضمن أن هناك تعليق خلية كافية لوحة كاملة (12 بئرا)، وسوف توفر للآبار الإضافية التي يمكن استخدامها لتحديد متوسط عدد الخلايا لكل بئر ومحتوى دبقية من الثقافة. إذا كان سيتم استخدام أنواع أخرى من السفن الثقافة، وحساب الحجم الكلي للسائل الإعلام والثقافة اللازمة نسبيا.
- إضافة 1 مل من تعليق خلية في كل بئر من لوحة ال 12 أيضا.
- احتضان الخلايا عند 35.9 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
الشكل 2: صور الممثل الخلايا الدبقية المختلطة في أوقات مختلفة بعد تأسيس ثقافة الدبقية مختلطة أعدت الدبقية مختلطة الحبل الشوكي الأولية من الكبار C57BL / 6 الفئران. صور الممثليظهر تقدم ثقافة الدبقية بعد الطلاء. في يوم 1، وتعلق بعض الخلايا إلى لوحة الثقافة، لكنها لا تزال في معظمها الجولة. هناك أيضا العديد العائمة الخلايا والحطام كبير. في يوم 4، وترد الغالبية العظمى من الخلايا إلى لوحة الثقافة. الخلايا تبدو متشعبة مع عمليات مرئية. يتم توزيع الخلايا بشكل متقطع والثقافات حوالي 20-30٪ متكدسة في هذا الوقت. في يوم 8 والثقافات ما بين 50-60٪ متموجة. بعض المناطق من الثقافات لديها بقع كبيرة من الخلايا. مناطق أخرى من الثقافات لديها نمو متفرق من الخلايا. بعض الخلايا داخل بقع تأخذ على ظهور "مربع يشبه". في اليوم 12 والثقافات هي عند أو فوق 80٪ متموجة (حوالي 90٪ متكدسة في الصورة هو موضح هنا). خلية هم في مرحلة سجل النمو في هذا الوقت وبين أيام 12-14 هو الوقت الأمثل لاستخدام الخلايا الدبقية لإجراء التجارب. الرجاء انقر هنا لعرضنسخة أكبر من هذا الرقم.
- دراسة مضمون دبقية باستخدام خلايا من آبار إضافية (خطوة 4.3) عن طريق القياسية مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS) بروتوكول تلطيخ 11 باستخدام مزيج من مكافحة فأر-CD45 و CD11b الأجسام المضادة وحيدة النسيلة الماوس المضادة. ويتم تحديد الخلايا CD45 + CD11b + كما الخلايا الدبقية الصغيرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وهذه الطريقة يمكن أن تستخدم لإعداد الخلايا الدبقية مختلطة من كل من الفئران والجرذان. يجب أن يكون إجمالي متوسط عدد الخلايا في بئر في لوحة ال 12 أيضا على D 12 بعد بدء للثقافة مستقرة نسبيا، مع حوالي 100،000 الخلايا لكل بئر عندما يتم اشتقاق الخلايا من النخاع الشوكي الماوس. الخلايا الدبقية التي تم الحصول عليها من هذه الطريقة يمكن أن تستخدم في التجارب التي تم تصميمها لدراسة الردود الحبل الدبقية العمود الفقري الكبار على إدارة المواد وكلاء المصالح الشكل 3 مثالا للخلوى وchemokine ردود من تجربة نموذجية واحدة في أي الكبار الحبل الشوكي الخلايا الدبقية الصغيرة تم الحصول عليها من الكبار الفئران BALB / ج وتعامل مع LPS (السالمونيلا مينيسوتا Re595) على D 13 بعد بدء للثقافة. تم جمع Supernatants 24 ساعة العلاج بعد LPS لتحديد مستويات خلوى وchemokine عن طريق فحص انزيم مرتبط المناعي (ELISA) باستخدام تجاريا التواجدمجموعات جنيه.
عندما تم تأسيس هذا النظام الثقافة الدبقية الكبار لأول مرة، وحضنت الخلايا في بيئة الثقافة المعيارية في 37 درجة مئوية. تحت هذا الشرط، تراوح متوسط محتوى دبقية 5-10٪. ومع ذلك، لوحظ أنه على الرغم من استخدام تقنيات ثقافة متسقة والثقافات لن يكون في بعض الحالات محتوى دبقية إما منخفضة جدا (<2٪) أو محتوى دبقية عالية نسبيا (15-20٪) 10. يمكن أن يكون محبطا للحصول على الثقافات التي لديها عدد قليل جدا من الخلايا الدبقية الصغيرة عندما تعتمد النتائج التجريبية على ردود دبقية صغيرة داخل الثقافة المختلطة. وبناء على اقتراح من الدكتور أليخاندرو MS ماير (قسم علم الأدوية، كلية شيكاغو للطب التقويمي) 12، تم تعديل طريقة عن طريق زراعة الخلايا الدبقية المختلطة في 35.9 درجة مئوية. وأدى ذلك إلى العائد دبيقي أكثر اتساقا وارتفاع (تتراوح بين 10-40٪ والباقي معظمهم عس اوند 20٪) في معظم الثقافات. ويتضح هذا التحسن في الشكل (4) وكما ذكر سابقا، وتقدر الخلايا الدبقية الصغيرة لتعويض 5 - 21٪ من السكان الدبقية الجهاز العصبي المركزي في فئران بالغة 13-15. وعلى الرغم من كل الظروف ثقافة توفر الثقافات التي تحتوي على كميات مماثلة من الخلايا الدبقية الصغيرة كما هو مقدر في الجسم الحي، وحالة الثقافة المعدلة (35.9 درجة مئوية) هو أكثر ملائمة للتجارب التي من الأهمية بمكان دراسة الردود من كل الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة.
الشكل 1: تتعلق الجينات كالسيتونين الببتيد (CGRP) -induced Chemokine الإنتاج عن طريق الخلايا الدبقية المختلطة الخلايا الدبقية المختلطة أعدت من الأطفال حديثي الولادة BALB العقول / ج الماوس (يسار) أو الكبار BALB / ج الماوس النخاع الشوكي (يمين) عولجوا بجرعات مختلفة من CGRP. مستويات عدة كيموكينات في supernatants ثقافة تم تحديد عن طريق فحص متعدد (التي تقوم بها الشركة المصنعة) في الأوقات المثلى (يعني ± SEM، ن = 2-6). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3): خلوى وChemokine الردود ماوس الكبار النخاع الشوكي مختلطة الدبقية على LPS تحفيز أعدت الكبار الحبل الشوكي الخلايا الدبقية مختلطة من BALB / ج الفئران وحفز مع جرعات مختلفة من LPS. مستويات IL-6 (A)، عامل نخر الورم (TNF) -alpha (B)، انترفيرون غاما محرض بروتين 10 (IP-10، التي تعرف أيضا باسم CXCL10) (C)، والوحيدات البروتين جاذب كيميائي 1 (MCP- تم تحديد 1، المعروف أيضا باسم CCL2) (D) في supernatants الثقافة عبر ELISAs في 24 ساعة بعد العلاج، LPS.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54801/54801fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4: المحتوى دبقية في الثقافات الدبقية المختلطة الكبار تم إنشاؤها الخلايا الدبقية المختلطة من C57B6 / الفئران L الكبار ومثقف في أي 37 درجة مئوية أو 35.9 درجة مئوية. تم تحليل محتوى دبقية من كل ثقافة عن طريق التدفق الخلوي باستخدام APC-لمكافحة فأر-CD45 (استنساخ 30 F11) وFITC المضادة للماوس CD11b (استنساخ M1 / 70). وترد المؤامرات تمثيلية من التحليلات تدفق cytometric. و(خلايا CD45 + CD11b +) تم تحديد مجموع السكان الخلية من الثقافات في مؤامرات ألف (37 درجة مئوية) و C (35.9 درجة مئوية)، والسكان دبقية مزيد من عزل من مجموع السكان الخلية المعنية في B (37س C) ودال (35.9 درجة مئوية). تم إجراء تحليل تدفق cytometric، وتم تحليل جميع البيانات كما هو موضح سابقا 5. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ومن الأهمية بمكان تنفيذ جميع الخطوات، بما في ذلك وسائل الإعلام تغيير جدول بطريقة متسقة من أجل الحصول على نتائج استنساخه بين التجارب. الخطوات التالية هي الحاسمة ولا سيما في الحصول على نوعية ممتازة الكبار الدبقية مختلطة.
عملية الهضم الأنزيمي هو جانب هام من هذا البروتوكول. ومن الأهمية بمكان أن قطعة نسيج يتم هضمها بشكل جيد من أجل الحصول على تعليق خلية واحدة. ومع ذلك، فإن الإفراط في الهضم يؤدي إلى خلايا أقل بكثير. يحتاج كل مختبر لإجراء الاختبارات التجريبية لتحديد الوقت المحدد الهضم تعتمد على أنواع من قوارير تستخدم لحضانة، فإن متوسط كمية الأنسجة تستخدم في كل مرة، ونوع شاكر (الدورية مقابل شاكر المداري). وعلاوة على ذلك، بغض النظر عن نظام غراء التفكك المختار، فمن الضروري باستمرار استخدام نفس المكونات من مصادر نفسها، وإحلال عرضية من مكونات يمكن أن تؤدي إلى اختلافات كبيرة في المحصولمن العدد الكلي للخلايا.
في هذا البروتوكول، تتم إزالة المايلين باستخدام متوسطة الكثافة التدرج. فمن الأهمية بمكان لتقديم واستخدام حلول كثافة التدرج في RT منذ كثافة هذه الحلول هي حساسة للحرارة. عادة يتم تخزين الحلول كثافة التدرج في 4 درجة مئوية. إذا لزم الأمر، يمكن أن تبقى الحلول كثافة التدرج في RT بين عشية وضحاها قبل يوم من وضع الثقافة. وبالإضافة إلى ذلك، وبعد الطرد المركزي 30 دقيقة من الخلايا في 20٪ كثافة التدرج، يجب إزالة الخلايا مباشرة من أجهزة الطرد المركزي لمنع قطع كبيرة من الحطام من التحول (أي، والابتعاد عن الجزء العلوي من الحل، راجع الخطوة 4.1).
ومن المهم لإزالة الحطام على D 1 آخر الشروع في الثقافة. على الرغم من أن الخلايا على قيد الحياة وتتكاثر إذا تم تغيير ثقافة وسائل الإعلام كل 3-4 د، وتغيير وسائل الاعلام على D 1 سيوفر أكثر "هادئة" و "نظافة" الثقافة في وقت لاحق. هذاتمكن خلايا أن تنمو في بيئة أقل بالانزعاج، والخلايا يمكن أن تظل تصل إلى 21 د بعد الشروع في الثقافة.
محتوى دبقية لكل تجربة يمكن فحص مسبق لاستخدام الدبقية مختلطة. حتى مع هذه التقنية أكثر اتساقا، والمحتوى دبقية قد لا تزال تختلف بشكل كبير بين التجارب. بعض الآثار الخلوية تعتمد على محتوى دبقية 4، 10؛ وبالتالي، لا بد من مراقبة المحتوى دبقية من كل مجموعة من الثقافات الراسخة. يمكن أن البيانات التي تم الحصول عليها من هذه الممارسة تساعد في تفسير الاختلافات بين التجارب، وكذلك لتقديم رواية (غير متوقعة في بعض الأحيان) المعرفة فيما يتعلق بمساهمة النجمية مقابل الخلايا الدبقية الصغيرة في ظل حالة تجريبية معينة. وبالإضافة إلى ذلك، فقد لوحظت التغيرات الموسمية في محتوى دبقية. قد يكون هذا عاملا إضافيا في الاعتبار عند التخطيط مجموعات كبيرة من التجارب. وعلاوة على ذلك، في حين أن الخلايا العصبية عادة لن البقاء على قيد الحياة في ظل ظروف ثقافتنا،كما لم يلاحظ NeuN (علامة neuronal-) خلايا -positive في الثقافات الدبقية لدينا بعد تلطيخ المناعى، قد يحتوي على ثقافة أعداد محدودة من الخلايا قليلة التغصن (هذا لم كميا بشكل روتيني). ينبغي للمرء أن يقرر ما إذا كان هذا الشعب يحتاج إلى دراسة تبعا لظروف تجريبية محددة.
كما هو الحال مع العديد من الأساليب التجريبية، يمكن تعديل هذه الطريقة وفقا لاحتياجات الباحثين الأفراد. ومن الضروري إجراء تجارب رائدة لاختبار تماما تعديلات محددة قبل استخدامها بشكل روتيني. وعلاوة على ذلك، تجدر الإشارة إلى أن الدبقية مختلطة يمكن استخدامها للحصول على المنضب الخلايا الدبقية الصغيرة والتخصيب الخلايا الدبقية الصغيرة الثقافات لدراسة ردود نجمية المهيمنة مقابل الخلايا الدبقية الصغيرة المهيمنة بعد التحفيز محددة، كما هو موضح سابقا لحديثي الولادة الخلايا الدبقية مختلطة 3، 4. ومع ذلك، فإن العائد من الخلايا الدبقية الصغيرة المخصب سيكون محدودا ما لم أعداد كبيرة من العمود الفقريوتستخدم الحبال لتأسيس ثقافة في البداية. هذا هو الحد من هذه الطريقة، خاصة إذا استخدمت الفئران. عندما تستخدم الفئران النخاع الشوكي، واحد الحبل الشوكي الفردية (بدلا من 4 الماوس النخاع الشوكي) يمكن استخدامها لمجموعة واحدة لوحة ال 12 أيضا. وأخيرا، لا يظهر محتوى دبقية أن تكون مختلفة بشكل كبير بين الثقافات الدبقية الماوس والفئران الكبار الحبل الشوكي 4، 5 كل من الفأرة والجرذ الكبار الحبل الشوكي الثقافات الدبقية تنتج استجابة قوية لتحفيز LPS من حيث الإنتاج خلوى؛ ومع ذلك، يمكن ملاحظة ردود الأفعال المختلفة عندما تستخدم المحفزات البديلة.
وإجمالا، يوفر هذا النظام الثقافة الدبقية القوارض الكبار طريقة بديلة لدراسة الخلايا الدبقية في المختبر. النتائج التي تم الحصول عليها من هذا النظام الثقافة بشكل وثيق تعكس ما من شأنه أن يلاحظ في ظل الظروف المجراة مقارنة مع النتائج التي تم الحصول عليها من ثقافات حديثي الولادة أو خطوط الخلايا. في الطريقة الحالية، الخلايا الدبقية هي جollected من القوارض الكبار، كما الدبقية الكبار الاستجابة للمؤثرات مختلفة جدا بالمقارنة مع الدبقية حديثي الولادة 4 (الشكل 1). لا يتم التلاعب بها الخلايا بشكل ملحوظ من خلال إجراءات تخليد، والتي سوف تستخدم لتوليد والحفاظ على خطوط الخلايا. على الرغم من أن وضعت هذه الطريقة في البداية لاستخدامها في دراسات ألم الأعصاب، ويمكن استخدامها لدراسة الأمراض العصبية الأخرى التي تنطوي على التغيرات المرضية داخل الحبل الشوكي، مثل المرض ومرض التصلب العصبي المتعدد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s modification of Eagle’s media (DMEM) with 4.5 g/L glucose | Lonza | 12-709F | The cDMEM media is a standard, widely used culture media. Individual researchers can decide where to purchase the DMEM and all other components used to make cDMEM media. |
| L-Glutamine (100x) | Lonza | 17-605E | The L-glutamine is a standard, widely used component for various culture media. Individual researchers can decide where to purchase L-glutamine. |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) | Corning-Mediatech | 30-004-CI | This is a combination of penicillin, streptomycin and Amphotericin formulated to contain 10,000 units/mL penicillin G, 10 mg/mL streptomycin sulfate and 25 µg/mL amphotericin B. Individual researchers can decide where to purchase individual components. |
| 2-mercaptoethanol (2-ME) | Sigma-Aldrich | M3148 | A BioReagent, suitable for cell culture, molecular biology and electrophoresis. |
| Papain dissociation system | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | Individual components of this kit can be purchased separately. |
| Percoll | GE Health Care | 17-0891-01 | Percoll is sold as sterile solution. Undiluted Percoll can be re-autoclaved if needed. |
| Lab-line incubator/shaker | Barstead/Lab-line | MaxQ4000 | This is the incubator/shaker we have currently. Other types of shakers can be used instead. |
| Lipopolysaccharides, Salmonella Minnesota Re595 | Sigma-Aldrich | L-9764 | Other strains of LPS can also induce glial responses. The magnitude of the responses though, may vary. |
| Mouse IL-6 DuoSet ELISA | R&D Systems | DY406 | Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers. |
| Mouse TNF-alpha DuoSet ELISA | R&D Systems | DY410 | Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers. |
| Mouse IP-10 (CXCL10) DuoSet ELISA | R&D Systems | DY466 | Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers. |
| Mouse MCP-1 (CCL2) ELISA Opteia set | BD Biosciences | 555260 | Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers. |
| Mouse chemokine Q-Plex | Quansys Biosciences | 120251MS | This product was not available for in-house assay at the time. Instead, we sent out samples to the manufacturer for analysis. |
| APC-anti-mouse-CD45 (clone 30-F11) | eBioscience | 17-0451 | Antibody of the same clone but from other vendors can be used. |
| FITC-anti-mouse-CD11b (clone M1/70) | eBioscience | 11-0112 | Antibody of the same clone but from other vendors can be used. |
| Accuri C6 flow cytometer | BD Biosciences | BD Accuri C6 | Each individual Researcher can use any flow cytometer he or she prefers. |
| FlowJo software | Tree Star, Inc. | FlowJo7.6.5 | Each individual Researcher can use any analysis software he or she prefers. |
References
- Gaskin, D. J., Richard, P. The economic costs of pain in the United States. J Pain. 13 (8), 715-724 (2012).
- Ji, R. R., Berta, T., Nedergaard, M. Glia and pain: Is chronic pain a gliopathy? Pain. 154 (01), S10-S28 (2013).
- Ni, M., Aschner, M., et al. Neonatal rat primary icroglia: isolation, culturing and selected applications. Curr Protoc Toxicol. Maines, M. D., et al. , (2010).
- Cao, L., Fei, L., Chang, T. T., DeLeo, J. A. Induction of interleukin-1beta by interleukin-4 in lipopolysaccharide-treated mixed glial cultures: microglial-dependent effects. J Neurochem. 102 (2), 408-419 (2007).
- Malon, J. T., Maddula, S., Bell, H., Cao, L. Involvement of calcitonin gene-related peptide and CCL2 production in CD40-mediated behavioral hypersensitivity in a model of neuropathic pain. Neuron Glia Biol. 7 (2-4), 117-128 (2011).
- Blasi, E., Barluzzi, R., Bocchini, V., Mazzolla, R., Bistoni, F. Immortalization of murine microglial cells by a v-raf / v-myc carrying retrovirus. J Neuroimmunol. 27 (2), 229-237 (1990).
- Bocchini, V., et al. An immortalized cell line expresses properties of activated microglial cells. J Neurosci Res. 31 (4), 616-621 (1992).
- Alliot, F. O., Marty, M. C., Cambier, D., Pessac, B. A spontaneously immortalized mouse microglial cell line expressing CD4. Dev Brain Res. 95 (1), 140-143 (1996).
- Alliot, F. O., Pessac, B. Astrocytic cell clones derived from established cultures of 8-day postnatal mouse cerebella. Brain Res. 306 (1-2), 283-291 (1984).
- Malon, J. T., et al. Microglial content-dependent inhibitory effects of calcitonin gene-related peptide (CGRP) on murine retroviral infection of glial cells. J Neuroimmunol. 279, 64-70 (2015).
- Cao, L., DeLeo, J. A. CNS Infiltrating CD4(+) T lymphocytes Contribute to Murine Spinal Nerve Transection-Induced Neuropathic Pain. Eur J Immunol. 38 (2), 448-458 (2008).
- Mayer, A. M., et al. Effect of a short-term in vitro exposure to the marine toxin domoic acid on viability, tumor necrosis factor-alpha, matrix metalloproteinase-9 and superoxide anion release by rat neonatal microglia. BMC Pharmacol. 1, 7 (2001).
- Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).
- Rock, R. B., et al. Role of Microglia in Central Nervous System Infections. Clin Microbiol Rev. 17 (4), 942-964 (2004).
- Yang, I., Han, S. J., Kaur, G., Crane, C., Parsa, A. T. The Role of Microglia in Central Nervous System Immunity and Glioma Immunology. J Clin Neurosci. 17 (1), 6-10 (2010).
