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Neuroscience

第一次混合胶质细胞培养的成年小鼠脊髓组织准备

doi: 10.3791/54801 Published: November 19, 2016

Summary

神经性疼痛的发展涉及脊髓神经胶质细胞的病理变化。从成年脊髓组织的,设计用于在体外研究这些细胞中的胶质可靠的培养体系缺乏。因此,我们在这里展示了如何建立从成年小鼠的脊髓组织的主要胶质细胞混合培养。

Abstract

它已被广为接受的脊髓神经胶质反应显著到神经性疼痛的发展作出贡献。已通过体外细胞培养系统中获得关于在细胞和分子水平胶质活动巨大的信息。所用的体外系统,主要包括从新生儿脑皮质组织来源的原神经胶质细胞和永生化细胞系。然而,这些系统可能无法反映体内脊髓神经胶质细胞的特性。为了使用培养体系,更好地反映体内状况进一步调查脊髓神经胶质细胞在周围神经损伤引起的神经性疼痛发展中的作用,我们的实验室已经发展到建立原发性脊髓混合胶质细胞培养从方法成年小鼠。简单地说,脊髓从成年小鼠收集,并通过木瓜蛋白酶消化后髓鞘去除与加工窝点性梯度网上平台。单细胞悬浮液是在完整的Dulbecco补充有2-巯基乙醇(2-ME)改良的Eagle培养基(cDMEM)培养在35.9℃。这些培养条件为混合胶质细胞的生长进行了优化。在这些条件下,细胞准备用于12之间实验 - 14天(细胞通常是在这段时间对数期)建立培养物(D 0)之后,并且可以被保持在培养条件达到D 21。该培养系统可以用于研究脊髓神经胶质细胞的刺激时与各种物质和试剂的反应。除了神经性疼痛,这种系统可用于研究在涉及脊髓神经胶质细胞的病理改变其他疾病胶质反应。

Introduction

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慢性疼痛是一种严重的健康问题,影响到在美国的约100万成年人,具有高达635 $ 1十亿预计每年成本。越来越多的证据表明脊髓神经胶质细胞的神经性疼痛,最具破坏性的种慢性疼痛2中的一个发展的显著贡献。一个适当的体外培养体系将在细胞和分子水平深入研究神经胶质细胞的作用显著帮助。

目前,研究人员使用的体外神经胶质培养系统包括从新生小鼠或大鼠大脑皮质组织来源主要是神经胶质细胞和永生化从新生小鼠衍生的神经胶质细胞系或大鼠原胶质细胞。新生细胞含有未分化细胞显著数字,可以进一步分化成神经胶质细胞(主要为星形胶质细胞和小胶质细胞),从而提供一bundant细胞实验使用3。然而,我们以前的研究已经表明,新生儿脑胶质细胞从成人脊髓神经胶质细胞在脂多糖(LPS)刺激的反应显著不同。例如,白细胞介素(IL)-4显示的增强的LPS诱导的一氧化氮的抑制作用(NO)产生的成年大鼠脊髓神经胶质相比新生儿大脑胶质4。此外,趋化因子产生刺激后的由神经肽的型材,降钙素基因相关肽(CGRP),是新生小鼠脑部的神经胶质细胞之间无可争议不同(在参考文献中描述的方法。5)和成年小鼠脊髓神经胶质细胞( 图1)。建立的细胞系是易于使用和维护,可以在很短的时间内提供大量的细胞。在一般情况下,永生化细胞系中产生或者使用病毒介导的永生化系统(如广泛使用的小胶质细胞系BV2)6,7或以下第自发变换电子识别(如星形胶质细胞系的C8-D1A和小胶质细胞系的C8-B4)8,9的细胞系具有优异的学习星形细胞和小胶质细胞单独的分子特征。然而,从细胞系所获得的结果总是需要在原代细胞或在体内条件进一步验证。还应当指出的是,没有发生过一个从啮齿动物的脊髓神经胶质衍生的神经胶质细胞系的报告。

以帮助调查脊髓神经胶质细胞中的神经性疼痛,是从成年小鼠脊髓衍生已通过适应用来产生成年大鼠混合胶质细胞培养4先前报道的方法开发了一种培养系统,5的发展中的作用该小鼠脊髓神经胶质文化进一步细化最近10和更详细的这篇文章中介绍。成人脊髓混合胶质细胞培养Ç一个与来自适合的特定的研究的需要选出的菌株的小鼠建立的,并且细胞能够在培养物中维持长达21天后的培养开始。这种方法可以在神经性疼痛的研究中使用,以及在涉及脊髓内的病理变化,如肌萎缩性侧索硬化症(ALS),人免疫缺陷病毒(HIV)相关的感觉神经病,和多个各种神经疾病的调查硬化症(MS)。

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Protocol

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下面的协议被批准的机构动物护理和使用委员会(IACUC)在新英格兰的大学。以下协议是从4成年小鼠脊髓制备胶质细胞培养。

1.在无菌条件下文化胡德溶液的制备

  1. 制备培养基:Eagle氏培养基(cDMEM)含DMEM的完全Dulbecco氏修改(用4.5克/升葡萄糖),10%胎牛血清(FBS),2mM的L-谷氨酰胺,100IU / mL青霉素,100毫克/毫升链霉素,250纳克/毫升两性霉素B,和50μM2-巯基乙醇(2-ME;见1.1.1)。混合和过滤消毒所有其他组件,然后添加FBS。存储培养基在4℃
    1. 制备50mM的2-ME /磷酸盐缓冲盐水(PBS)原液:添加100μL的浓缩2-ME(14.3 M)到28.6毫升1×PBS中,并过滤消毒(该溶液可以储存在4℃下数月)。 üSE 1毫升的2-ME原液每毫升1000培养基。
  2. 密度梯度介质的制备
    1. 准备一个股票等渗密度梯度媒体解决方案( 例如,100%珀)从1份10X常规无菌PBS和9份无菌股票密度梯度介质( 如,珀)。
    2. 稀释定期1×无菌PBS的100%的密度梯度介质(在1.2.1。制造),使20%的密度梯度介质( 例如,10毫升100%的密度梯度介质的用40mL 1×PBS中),并储存在4 ℃。制备细胞培养物之前,使20%的密度梯度介质至室温(RT)。
  3. 解决方案从木瓜蛋白酶解离系统准备
    注: 木瓜蛋白酶解离系统所用的材料表来识别。其它相似的解离试剂盒(包括在内部装配)也可以使用。所有COMPONENTS必须是无菌的。
    1. 添加32毫升的Earle氏平衡盐溶液(EBSS)中的卵类粘蛋白的抑制剂混合物(粉末)。
    2. 加入5毫升的EBSS的一个木瓜蛋白酶小瓶(粉末)。将在37℃水浴中的木瓜蛋白酶小瓶10分钟或直至木瓜蛋白酶溶解。
    3. 添加EBSS 500微升一个DNA酶小瓶(粉)。轻轻混匀。
    4. 添加脱氧核糖核酸酶溶液(以上)的木瓜蛋白酶小瓶的250微升。
    5. 计算所需的上述木瓜蛋白酶/ DNA酶的混合物(每鼠脊髓木瓜蛋白酶/ DNA酶混合物的约800微升)的合计量和所需要的混合物转移到50 mL管中用于组织消化(步骤3.2)。存储在原始小瓶剩在4℃至少两周。
    6. 保持冰从包的所有组件,直到需要。
  4. 制备脊髓收集管:一种无菌的15毫升管用Hank氏平衡盐溶液(HBSS 5mL的;从所述木瓜蛋白酶解离系统,0;收集脊髓)和一个无菌的15毫升管1X PBS(对于填补了5毫升注射器,见步骤2.4)。此外,5毫升的HBSS准备一份无菌培养皿英寸(35 mm或60毫米),保持它在培养罩。

2.脊髓收藏

注:所有设备必须是无菌的。由IACUC批准的指定区域执行收集。

  1. 获得收获小鼠脊髓以下工具:直锐/钝器18厘米的手术剪,一个12厘米的标准手术刀(#3固体),碳钢无菌手术刀片#10,小动物斩首,12厘米的标准曲线钳,和无菌20G针连接到一个5毫升的注射器。
  2. 安乐死用CO 2对动物和消毒鼠标头并用70%乙醇(EtOH中)的后区。
  3. 动物斩首的刽子手。就后腰中间纵切口,显露肌肉层。使通过在臀部的水平脊椎动物列干净的横断与直无菌手术剪(18厘米)(通过覆盖脊椎动物列肌肉层也切)。
  4. 将动物对新鲜一次性擦拭片。小心地将20G的针(连接到一个5毫升的注射器填充有无菌1×PBS中(步骤1.4))到脊柱朝喙侧。按住向下动物紧密,迅速推向注射器。整个脊髓应该从子宫颈年底问世。收集脊髓到含有HBSS 15毫升管。
  5. 重复步骤2.4小鼠的其余部分。每只动物之间,消毒用70%乙醇所有使用的仪器。
    注意:通常情况下,一个单一的12孔板可以为每4小鼠脊髓(见4.3)成立。

3.单细胞悬液的制备

注:执行步骤3和4的培养罩把一切都无菌。

  1. 传输所有脊髓入含有HBSS的皮氏培养皿(步骤1.4)。削减每个脊髓成许多精美的,小件用无菌剪刀和镊子。转移脊髓组织用无菌镊子或10毫升吸管含有制备的木瓜蛋白酶/ DNA酶的酶混合物(步骤1.3.5)的50-mL锥形管(避免加入HBSS的酶混合物,因为这将进一步稀释制备酶溶液,并可能导致酶的性能降低)。
  2. 然后振荡试管混合。在37℃下1小时管在培养箱/摇床圆周振荡在150转。
  3. 涡管再次大力磨碎用5毫升吸管进一步推动分离组织中的酶溶液。
  4. 在RT细胞悬液转移到15毫升管中并离心,在300×g离心5分钟。
  5. 在离心过程中,混合2.7毫升EBSS与重组白蛋白卵类粘蛋白INH的300微升在无菌管ibitor溶液(1.3.1)。加入DNA酶溶液(步1.3.3)的150微升。
  6. 离心后,除去上清,悬浮与上述制备(步骤3.5)的溶液中的细胞沉淀。涡流以及打破细胞沉淀。
  7. 添加3mL的重组白蛋白的卵类粘蛋白抑制剂溶液(步骤1.4.1),以细胞悬浮液。离心细胞,在70×g离心在RT 6分钟。除去上清液(包含膜碎片)。

从单细胞悬液髓鞘4.进一步去除

  1. 在800 XG在RT轻轻加入8毫升20%的密度梯度介质(在步骤1.2.2制备)到含有细胞沉淀管中,涡流破坏沉淀,离心所述细胞30分钟无制动 。小心除去碎片(主要是髓鞘)和上清液的顶层,但保留沉淀。
  2. 要除去密度梯度的残余,由resuspendi洗细胞纳克用8毫升稀释cDMEM的(1份cDMEM和2份HBSS)中的细胞沉淀。离心在400×g离心10分钟,将细胞在4℃除去上清液并以相同的方式与稀释cDMEM(上文)再次洗涤细胞。保持冰的细胞,直到他们播种。
  3. 除去上清,重悬在培养基中的细胞沉淀(cDMEM供给与2-ME(在步骤1.1中制备))。对于一个12孔板中,使用3毫升×4(使用小鼠数)+ 2毫升= 14毫升介质。这将确保有对整个板足够的细胞悬浮液(12个孔),并提供了可用于确定每孔的平均细胞数和培养物的小胶质含量额外井。如果将被用于其它类型的培养容器,按比例计算所需的培养基的总体积。
  4. 添加1毫升细胞悬液到12孔平板的每个孔中。
  5. 孵育细胞在含有5%CO 2 35.9 摄氏度
  6. 注:在第1天,将培养可以含有由于从脊髓组织中的残余物髓鞘显著的碎片;因此,建议改变第1天传媒(请参阅有关更多信息的讨论)。培养物准备好D之治疗12 - 14细胞通常是在D 12 80%汇合,并可以用D 14通常为接近100%汇合时,对D 12,有每孔约100,000细胞在12孔平板。

图4
图2:在不同时间建立的混合胶质细胞培养物混合后的神经胶质细胞的代表性图像从成年C57BL / 6小鼠中制备初级脊髓混合胶质。代表图像显示神经胶质培养的电镀后的进展。在第1天,一些细胞附着到培养板上,但它们仍然是多为圆形。也有许多漂浮细胞和显著碎片。在第4天,大部分细胞附着到培养板上。细胞似乎网状可见的过程。细胞零星分布和文化在这个时候约20-30%汇合。在第8天,文化是50-60%之间的融合。文化的部分地区有细胞的大片。文化的其他领域有细胞的生长稀疏。补丁中的某些细胞采取了“广场样”外观。第12天,培养物是在等于或高于80%汇合(此处示出的图像中的约90%汇合)。细胞在此时生长的对数期,天之间12-14是使用胶质细胞进行实验的最佳时间。 请点击这里查看更大的版本这个数字。

  1. 检查使用通过标准荧光激活细胞分选(FACS)染色方案11从额外孔细胞(步骤4.3),使用抗小鼠CD45抗体和抗小鼠的CD11b单克隆抗体的组合中的小胶质细胞的内容。 CD45 +细胞CD11b +细胞被识别为小胶质细胞。

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Representative Results

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该方法可用于从小鼠和大鼠制备混合胶质细胞。每孔中的培养的D 12启动后一个12孔板的平均总细胞数应该是相对稳定的,与每孔周围100,000个细胞时细胞从小鼠脊髓的。从该方法获得的神经胶质细胞可以在被设计为检查时的物质和感兴趣剂施用成人脊髓神经胶质反应实验中使用。 图3提供从一个典型的实验中的细胞因子和趋化因子反应的例子,其中成人脊髓小胶质细胞从成年BALB / c小鼠获得,并与在培养的d- 13启动后的LPS( 沙门氏菌明尼苏达 Re595)处理。收集上清液用商业上availab后24小时LPS处理用于经由酶联免疫吸附测定(ELISA)的细胞因子和趋化因子水平的测定乐包。

当第一次成立这样的成人神经胶质培养体系,细胞在一个标准的文化环境, 37℃下保温10% - 在该状态下,一般的小胶质含量从5不等。然而,有人指出,尽管使用了一致的培养技术,文化会在某些情况下,要么非常低的小胶质含量(<2%)或相对较高的小胶质含量(15 - 20%)10。它可以是令人沮丧的获得有极少数小胶质细胞时的实验结果依靠混合培养中的小胶质细胞反应的文化。继亚历杭德罗·梅耶MS博士(药理学教研室,骨科医学学院芝加哥)12的建议下,该方法被越来越多的混合神经胶质细胞在35.9 摄氏度修改这导致更一致的和更高的小胶质细胞产量(范围10之间 - %40和余下大部分芳ound 20%)的大多数培养物的范围内。这一改进在图4中示出如先前报道,小胶质估计,以弥补5 -中枢神经系统的神经胶质人口的21%成年小鼠13-15。虽然这两个培养条件提供了包含小胶质细胞的相似量的作为体内估计培养物中,改性培养条件(35.9℃)是更合适的实验中,它是检查由两个星形胶质细胞和小胶质细胞的反应是至关重要的。

图1
1: 降钙素基因相关肽(CGRP)诱导的趋化因子生产通过混合胶质细胞从新生儿BALB / c小鼠的大脑(左)或成年BALB / c小鼠的脊髓制备混合胶质细胞(右)与各种剂量的治疗CGRP的。在培养物上清液的几个趋化因子的水平通过在最佳时机多重检测(由制造商执行)确定(平均值±SEM,N = 2 - 6)。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图3:混合神经胶质在小鼠成人脊髓细胞因子和趋化因子应答的LPS刺激从BALB / c小鼠中制备并用各种剂量的LPS刺激成人脊髓混合胶质细胞 IL-6的(A),肿瘤坏死因子(TNF)-α(B)中,干扰素γ诱导蛋白10(IP-10,也称为CXCL10)(℃),和单核细胞趋化蛋白1的水平(MCP- 1,也被称为CCL2)(D)在培养物上清液在24小时后LPS处理通过ELISA来测定。ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54801/54801fig2large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。

图3
4: 在成人混合胶质细胞培养小胶质含量从成年C57B6 / L的小鼠产生混合的神经胶质细胞,并在任一37℃35.9℃。培养从每个培养小胶质含量通过流式细胞仪分析用的APC的抗小鼠CD45抗体(克隆30-F11)和FITC-抗小鼠的CD11b(克隆M1 / 70)。从流式细胞分析代表性的图被示出。从培养的总细胞群中小区A(37℃)C(35.9℃),和小胶质细胞群体进行鉴定(CD45 +细胞CD11b +细胞)从B中的各自的总细胞群进一步分离(37℃)D(35.9℃)。进行流式细胞仪分析,如前所述5进行分析的所有数据。 请点击此处查看该图的放大版本。

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Discussion

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它是执行所有步骤,包括媒体,以获得实验之间重复性的结果改变时间表-以一致的方式非常关键。下面的步骤是获得优良的品质成人混合胶质尤为关键。

酶消化是该协议的一个重要方面。至关重要的是,该组织片是为了获得单细胞悬浮液充分消化。然而,过度消化将导致显著较少的细胞。每个实验需要执行导频测试,以确定基于所述类型用于孵化小瓶的确切消化时间,每次使用的平均组织量,并摇动器的类型(旋转与轨道摇床)。此外,无论所选择的木瓜蛋白酶解离系统的,有必要持续使用相同的组件由相同的源,作为组件的偶然替换可能导致产量显著变化的细胞的总数。

在这个协议中,髓鞘是使用密度梯度介质中除去。它是使和自这些溶液的密度是温度敏感在RT使用密度梯度溶液的关键。密度梯度溶液通常保存在4℃。如果需要的话,该密度梯度溶液可在室温下设置的培养的前一天保持过夜。此外,以下在20%的密度梯度的细胞的30分钟离心,将细胞应立即从离心机中取出,以防止大的碎片从移( 即,移动从溶液的顶部离开;参见步骤4.1)。

这对文化的D 1后开始清除杂物是很重要的。虽然细胞将存活,并且如果培养基被改变每3到4天,改变第D 1个媒体将提供更多的“静态”和“清洁”培养以后增殖。这个允许细胞在不太干扰的环境下成长,并且细胞可以保持在培养的第21天后开始。

对于每个实验的小神经胶质内容可在此之前使用混合胶质进行审查。即使在最一致的技术,小胶质含量可能仍然显著实验之间变化。有些细胞效应依赖于小胶质含量4,10;因此,关键是监视每个组建立培养物的小胶质含量。从这种做法获得的数据可以帮助解释实验之间的变化,以及提供新型关于星形细胞与小胶质细胞的特定实验条件下的贡献(有时意外)知识。此外,在小胶质细胞含量的季节性变化已观察到。这可能是策划大型成套实验时,需要考虑的另外一个因素。此外,虽然通常的神经元会不是我们的培养条件下生存,作为的NeuN(一个neuronal-标记)阳性细胞没有被在我们的胶质细胞培养免疫组织化学染色后观察到的,培养可以含有少突胶质细胞的数量有限的(这还没有被常规量化)。之一应该决定该人群是否需要根据具体的实验条件进行审查。

与许多实验方法,这种方法可以根据个人研究人员的需要进行修改。重要的是要执行导频实验全面测试之前,常规地使用它们的具体的修改。此外,应该指出的是,混合的神经胶质可用于获得小胶质贫和小胶质细胞富集的培养物研究星形细胞显性与特定刺激后的小胶质细胞显性细胞的反应,如前对新生儿混合胶质细胞3所述, 4,但是,小胶质细胞富集的细胞的产率将除非大量的脊限定线用于在建立之初的文化。这是这种方法的一个限制,尤其是如果使用的小鼠。当使用大鼠脊髓,一个个体脊髓(代替4-小鼠脊髓)可用于设置一个12孔板中。最后,小胶质含量不出现是小鼠和大鼠成人脊髓神经胶质培养物之间显著不同4,5两者小鼠和大鼠成人脊髓胶质细胞培养产生的细胞因子产生方面到LPS刺激一个强有力的反应。然而,当使用替代刺激可以观察到不同的反应。

总之,这种啮齿类动物成年胶质培养系统提供了另一种方法来研究神经胶质细胞在体外 。从该培养系统更紧密地获得的结果反映了将在体内条件下可观察与从新生儿培养物或细胞系获得的结果。在目前的方法中,神经胶质细胞是C从成年啮齿类ollected相比,新生儿神经胶质4( 图1)时成年胶质响应于非常不同刺激。细胞没有通过永生化的程序,这将被用于产生和维持的细胞系显著操纵。虽然这种方法最初被开发在神经性疼痛的研究中使用,它可以被用来研究涉及脊髓内的病理变化,如ALS和MS其他神经系统疾病。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s modification of Eagle’s media (DMEM) with 4.5 g/L glucose Lonza 12-709F The cDMEM media is a standard, widely used culture media. Individual researchers can decide where to purchase the DMEM and all other components used to make cDMEM media.
L-Glutamine (100x) Lonza 17-605E The L-glutamine is a standard, widely used component for various culture media. Individual researchers can decide where to purchase L-glutamine.
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) Corning-Mediatech 30-004-CI This is a combination of penicillin, streptomycin and Amphotericin formulated to contain 10,000 units/mL penicillin G, 10 mg/mL streptomycin sulfate and 25 µg/mL amphotericin B. Individual researchers can decide where to purchase individual components.
2-mercaptoethanol (2-ME) Sigma-Aldrich M3148 A BioReagent, suitable for cell culture, molecular biology and electrophoresis.
Papain dissociation system Worthington Biochemical Corporation LK003150 Individual components of this kit can be purchased separately. 
Percoll GE Health Care 17-0891-01 Percoll is sold as sterile solution. Undiluted Percoll can be re-autoclaved if needed.
Lab-line incubator/shaker  Barstead/Lab-line MaxQ4000  This is the incubator/shaker we have currently. Other types of shakers can be used instead.
Lipopolysaccharides, Salmonella Minnesota Re595 Sigma-Aldrich L-9764 Other strains of LPS can also induce glial responses. The magnitude of the responses though, may vary.
Mouse IL-6 DuoSet ELISA  R&D Systems DY406 Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.
Mouse TNF-alpha DuoSet ELISA R&D Systems DY410 Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.
Mouse IP-10 (CXCL10) DuoSet ELISA R&D Systems DY466 Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.
Mouse MCP-1 (CCL2) ELISA Opteia set BD Biosciences 555260 Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.
Mouse chemokine Q-Plex Quansys Biosciences 120251MS This product was not available for in-house assay at the time. Instead, we sent out samples to the manufacturer for analysis.
APC-anti-mouse-CD45 (clone 30-F11) eBioscience 17-0451 Antibody of the same clone but from other vendors can be used.
FITC-anti-mouse-CD11b (clone M1/70) eBioscience 11-0112 Antibody of the same clone but from other vendors can be used.
Accuri C6 flow cytometer BD Biosciences BD Accuri C6  Each individual Researcher can use any flow cytometer he or she prefers.
FlowJo software Tree Star, Inc. FlowJo7.6.5 Each individual Researcher can use any analysis software he or she prefers.

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References

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第一次混合胶质细胞培养的成年小鼠脊髓组织准备
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Malon, J. T., Cao, L. Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue. J. Vis. Exp. (117), e54801, doi:10.3791/54801 (2016).More

Malon, J. T., Cao, L. Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue. J. Vis. Exp. (117), e54801, doi:10.3791/54801 (2016).

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