Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Udarbejdelse af Primære Mixed Glia kulturer fra Voksen Mouse Spinal Cord Tissue

doi: 10.3791/54801 Published: November 19, 2016

Summary

Udviklingen af ​​neuropatisk smerte omfatter patologiske ændringer i rygmarven gliaceller. En pålidelig glia kultur-system stammer fra voksen rygmarv væv og designet til at studere disse celler in vitro mangler. Derfor viser vi her hvordan man etablerer primære blandede gliale kulturer fra voksne mus rygmarven væv.

Abstract

Det er blevet godt accepteret, at rygmarv gliale reaktioner bidrager væsentligt til udviklingen af ​​neuropatisk smerte. Enorm oplysninger om gliale aktiviteter på de cellulære og molekylære niveau er opnået gennem in vitro cellekultursystemer. In vitro-systemer anvendes, omfatter hovedsagelig primære glia stammer fra neonatal hjerne kortikale væv og udødeliggjort cellelinjer. Imidlertid kan disse systemer ikke afspejler kendetegnene ved rygmarven gliaceller in vivo. For yderligere at undersøge rollerne for rygmarven gliaceller i udviklingen af perifer nerveskade-induceret neuropatisk smerte ved anvendelse af et dyrkningssystem, der bedre afspejler in vivo tilstand, har vores laboratorium udviklet en metode til at etablere primær rygmarv blandede gliaceller kulturer fra voksne mus. Kort fortalt rygmarv indsamlet fra voksne mus og behandles gennem papainspaltning efterfulgt af myelin fjernelse med et hulerity-gradient medium. Enkeltcellesuspensioner dyrkes i komplet Dulbeccos modificerede Eagle medium (cDMEM) suppleret med 2-mercaptoethanol (2-ME) ved 35,9 ° C. Disse dyrkningsbetingelser blev optimeret specielt til vækst af blandede gliaceller. Under disse betingelser er celler klar til at blive brugt til forsøg på mellem 12 - 14 d (celler er normalt i log-fase i denne periode) efter etableringen af ​​kulturen (D 0) og kan holdes i dyrkningsbetingelser op til D 21. dette dyrkningssystem kan anvendes til at undersøge responser af rygmarven gliaceller ved stimulering med forskellige stoffer og midler. Udover neuropatisk smerte, kan dette system anvendes til at studere gliale reaktioner i andre sygdomme, som medfører patologiske ændringer i rygmarven gliaceller.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kroniske smerter er et alvorligt sundhedsproblem, der rammer cirka 100 millioner voksne i USA, med en anslået årlig udgift på op til $ 635 1 mia. Voksende vidnesbyrd har indikeret et væsentligt bidrag rygmarv gliaceller i udviklingen af neuropatisk smerte, en af de mest ødelæggende former for kronisk smerte 2. En ordentlig in vitro kultursystem ville bidrage betydeligt i yderligere at undersøge den rolle, gliaceller på cellulært og molekylært niveau.

I øjeblikket er de in vitro glia dyrkningssystemer anvendes af forskere omfatter hovedsagelig gliale celler afledt fra corticale væv af neonatale mus eller rotte hjerner og immortaliserede gliale cellelinier afledt fra neonatal mus eller rotte primære gliaceller. Neonatale celler indeholder et betydeligt antal udifferentierede celler, der kan være yderligere differentieret i gliaceller (hovedsagelig astrocytter og mikroglia), hvilket således tilvejebringer enbundant celler til eksperimentel brug 3. vores tidligere undersøgelse har imidlertid vist, at neonatal hjerne gliaceller reagerede signifikant forskelligt fra voksne rygmarven gliaceller efter lipopolysaccharid (LPS) stimulation. For eksempel, interleukin (IL) -4 de viste forøget inhiberende virkninger på LPS-induceret nitrogenoxid (NO) produktion i voksne rotter rygmarv glia sammenlignet med neonatal hjerne glia 4. Endvidere profiler af chemokin produktion ved stimulering af et neuropeptid, calcitonin gen-relateret peptid (CGRP), er ubestrideligt forskellige mellem neonatal musehjerne glia (metoder beskrevet i Ref. 5), og voksne mus rygmarv glia (figur 1). Etablerede cellelinjer er nemme at anvende og vedligeholde og kan give et stort antal celler i en kort periode. Generelt immortaliserede cellelinjer genereres enten ved hjælp af en virus-medieret immortalisering systemet (såsom udbredte mikroglial cellelinie BV2) 6, 7 eller efter the identifikation af spontan transformation (såsom astrocyt cellelinje C8-D1A og mikroglial cellelinie C8-B4) 8, 9 cellelinier er fremragende i at studere de molekylære karakteristika af astrocytter og mikroglia individuelt.; imidlertid opnået fra cellelinjer resultater kræver altid yderligere validering i primære celler eller i in vivo-betingelser. Det skal også bemærkes, at der ikke har været en rapport fra et glial cellelinie, som er afledt af en gnaver rygmarv glia.

For at hjælpe undersøge betydningen af rygmarven gliaceller i udviklingen af neuropatisk smerte, en kultur, der er afledt af voksne mus rygmarven er blevet udviklet ved at tilpasse en tidligere rapporteret fremgangsmåde anvendes til at generere voksne rotter blandede gliale kulturer 4, 5 . musen rygmarv glial kultur blev yderligere forfinet nylig 10 og er beskrevet mere detaljeret i denne artikel. Voksen rygmarv blandet gliale kulturer cen skal etableres med en mus fra udvalgte stammer, som passer til behovene i den særlige undersøgelse, og cellerne kan opretholdes i kultur i op til 21 d sende initiering af kulturen. Denne metode kan anvendes i neuropatisk smerte studier, såvel som i undersøgelser af forskellige neurologiske sygdomme, som medfører patologiske ændringer i rygmarven, såsom amyotrofisk lateral sklerose (ALS), human immundefekt virus (HIV) -associeret sensorisk neuropati og multipel sklerose (MS).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Følgende protokol blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) på University of New England. Følgende protokol er til at forberede gliale kulturer fra 4 voksne mus rygmarv.

1. Udarbejdelse af løsninger i en kultur Hood under aseptiske forhold

  1. Forbered dyrkningsmedier: komplet Dulbeccos modifikation af Eagles medium (cDMEM) indeholdende DMEM (med 4,5 g / l glucose), 10% kalvefosterserum (FBS), 2 mM L-glutamin, 100 IE / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin , 250 ng / ml amphotericin B, og 50 uM 2-mercaptoethanol (2-ME, se 1.1.1). Blandes og filtreres sterilisere alle andre komponenter og derefter tilføje FBS. Kulturen opbevares medier ved 4 ° C.
    1. Forbered 50 mM 2-ME / phosphatbufret saltvand (PBS) stamopløsning: tilsæt 100 pi koncentreret 2-ME (14,3 M) i 28,6 ml 1 x PBS, og Filtersteriliser (opløsningen kan opbevares ved 4 ° C i flere måneder). USE 1 ml 2-ME stamopløsning for hver 1.000 ml kulturmedier.
  2. Fremstilling af densitetsgradient medier
    1. Forbered en bestand isotonisk tæthed gradient media løsning (f.eks 100% Percoll) fra 1. del 10x regelmæssig sterilt PBS og 9 dele sterilt lager densitetsgradient medier (f.eks, Percoll).
    2. Fortynd densitetsgradient medier 100% (made in 1.2.1) med regelmæssige 1x sterilt PBS til at gøre en 20% densitetsgradient medier (f.eks, 10 ml 100% densitetsgradient medier med 40 ml 1x PBS) og opbevare det ved 4 o C. Bring massefylde gradient medier 20% til stuetemperatur (RT), inden udarbejdelsen af ​​cellekultur.
  3. Fremstilling af opløsninger fra papain dissociation systemet
    BEMÆRK: papain dissociation systemet kan identificeres i Materials Tabel. Andre lignende dissociation kits (herunder dem samlet i huset), kan også anvendes. Alle componeNTS skal være sterile.
    1. Tilføj 32 ml af Earles balancerede saltopløsning (EBSS) til ovimucoid inhibitoren blanding (pulver).
    2. Der tilsættes 5 ml EBSS til en papain (pulver). Placer papain hætteglasset i et 37 ° C vandbad i 10 min, eller indtil papain er opløst.
    3. Der tilsættes 500 pi af EBSS til en DNase (pulver). Bland forsigtigt.
    4. Tilsættes 250 pi af DNase opløsning (ovenfor) til papain hætteglasset.
    5. Beregn den totale mængde af det ovenfor papain / DNase blanding nødvendig (ca. 800 pi papain / DNase blanding pr muse rygmarv) og overføre den nødvendige blanding i et 50 ml rør til vævsfordøjelse (trin 3.2). Opbevar efterladenskaber i det originale hætteglas ved 4 ° C i mindst to uger.
    6. Hold alle komponenter fra kittene på is indtil brug.
  4. Forbered rygmarven opsamlingsrør: en steril 15 ml rør med 5 ml Hanks balancerede saltopløsning (HBSS; fra papain dissociation systemet,0; til opsamling rygmarv) og en steril 15 ml rør med 1x PBS (for at fylde de 5 ml sprøjte, se trin 2.4). Desuden forbereder en steril petriskål (35 mm eller 60 mm) med 5 ml HBSS og holde det i kulturen hætte.

2. Spinal Cord Collection

BEMÆRK: Alt udstyr skal være sterile. Udfør samlingen i et bestemt område er godkendt af IACUC.

  1. Opnå følgende værktøjer til høst mus rygmarv: lige skarpe / stumpe 18-cm kirurgiske sakse, en 12-cm standard skalpel (# 3 fast), kulstofstål sterile skalpelblade # 10, et lille dyr decapitator, 12 cm standard buet pincet og en steril 20G nål fastgjort til en 5 ml sprøjte.
  2. Aflive dyret med CO 2 og desinficere Mouse hoved og ryg region med 70% ethanol (EtOH).
  3. Halshugge dyr med decapitator. Foretag en midterste langsgående snit på lænden at blotlægge muskellag. Laveen ren overskæring gennem hvirveldyr kolonnen ved hoften (også skære igennem den muskel lag, der dækker vertebraten kolonne) med de sterile lige kirurgiske sakse (18 cm).
  4. Sende dyret på et ark frisk engangsklud. Sæt forsigtigt 20 G nål (fastgjort til en 5 ml sprøjte fyldt med sterilt 1x PBS (trin 1.4)) i rygsøjlen mod rostrale side. Hold dyret stramt og skub sprøjten hurtigt. Hele rygmarv bør komme ud fra den cervikale ende. Saml rygmarven i 15 ml rør, der indeholder HBSS.
  5. Gentag trin 2.4 for resten af ​​musene. Mellem hvert dyr, desinficere alle brugte instrumenter med 70% EtOH.
    BEMÆRK: Typisk kan etableres en enkelt plade med 12 brønde for hver 4 mus rygmarv (se 4.3).

3. Forberedelse af det fælles Cell Suspension

Bemærk: Udfør trin 3 og 4 i en kultur hætte at holde alt sterile.

  1. Overføre alle rygmarve i HBSS indeholdende petriskål (trin 1.4). Skær hver af de rygmarv i mange fine, små stykker med steril saks og pincet. Overfør rygmarven væv til 50-mL konisk rør indeholdende den fremstillede papain / DNase enzymblanding (trin 1.3.5) under anvendelse af en steril pincet eller en 10 ml pipette (undgå at tilføje HBSS til enzymblandingen, da dette yderligere vil fortynde udarbejdet enzymopløsning og kan resultere i nedsat ydeevne af enzymet).
  2. Vortex røret forsigtigt for at blande. Inkubér røret ved 37 ° C i 1 time i en inkubator / ryster med orbital omrystning ved 150 rpm.
  3. Vortex røret igen og energisk udriv enzymopløsningen med vævet under anvendelse af en 5 ml pipette at fremme yderligere dissociation.
  4. Overfør cellesuspensionen i et 15-ml rør og centrifugeres ved 300 xg i 5 minutter ved stuetemperatur.
  5. Under centrifugeringen blandes 2,7 ml EBSS med 300 pi rekonstitueret albumin-ovimucoid inhibitor opløsning (1.3.1) i et sterilt rør. Tilføj 150 ul af DNase-opløsning (trin 1.3.3).
  6. Efter centrifugering, supernatanten fjernes og resuspender cellepelleten med opløsningen fremstillet ovenfor (trin 3.5). Vortex godt at bryde cellepelleten.
  7. Tilsættes 3 ml rekonstitueret albumin-ovimucoid inhibitor-opløsning (trin 1.4.1) til cellesuspensionen. Centrifuger cellerne ved 70 x g i 6 minutter ved stuetemperatur. Fjern supernatanten (som indeholder membranfragmenter).

4. Yderligere Fjernelse af Myelin fra Single Cell Suspension

  1. Tilsæt 8 ml 20% densitetsgradient medier (fremstillet i trin 1.2.2) ind i rør indeholdende cellepelleten, vortex forsigtigt at forstyrre pelleten, og centrifuger cellerne ved 800 x g i 30 minutter ved stuetemperatur uden bremsning. Fjern forsigtigt det øverste lag af snavs (hovedsagelig myelin), og supernatanten, men holde pelleten.
  2. At fjerne resterne af densitetsgradient, vaske cellerne ved resuspending cellepelleten med 8 ml af en fortyndet cDMEM (1 del cDMEM og 2 dele HBSS). Centrifuger cellerne ved 400 x g i 10 minutter ved 4 ° C. Fjern supernatanten og vask cellerne igen med den fortyndede cDMEM (ovenfor) på den samme måde. Holde cellerne på is indtil podning dem.
  3. Fjern supernatanten og resuspender cellepelleten i dyrkningsmedier (cDMEM leveres med 2-ME (fremstillet i trin 1.1)). For én plade med 12 brønde, bruge 3 ml x 4 (antal mus anvendt) + 2 ml = 14 ml medier. Dette vil sikre, at der er tilstrækkelig cellesuspension for hele pladen (12 brønde) og giver mulighed for ekstra brønde, der kan anvendes til at bestemme den gennemsnitlige celleantal pr brønd, og mikroglial indhold af kulturen. Hvis der skal anvendes andre typer dyrkningsbeholdere, beregne den samlede mængde af nødvendige kulturmedier proportionalt.
  4. Der tilsættes 1 ml af cellesuspensionen i hver brønd i en plade med 12 brønde.
  5. Inkuber cellerne ved 35,9 ° C med 5% CO2.
  6. BEMÆRK: På dag 1 kan kulturen indeholde betydelige mængder af nedbrudt materiale på grund af remanensen myelin fra rygmarven væv; således, ændre medierne på dag 1 anbefales (se venligst Diskussion for mere information). Kulturer er klar til behandling mellem D 12 - 14. Celler sædvanligvis er 80% sammenflydende ved D 12 og kan være nær 100% sammenflydende ved D 14. Typisk på D 12, der er omkring 100.000 celler per brønd i en plade med 12 brønde .

Figur 4
Figur 2:. Repræsentative billeder af blandede gliaceller på forskellige tidspunkter efter oprettelsen af det blandede glia kultur Primære rygmarv blandede glia blev fremstillet af voksne C57BL / 6 mus. repræsentative billederviser forløbet af glial kultur efter udpladning. På dag 1, er nogle celler fastgjort til dyrkningspladen, men de er stadig for det meste rundt. Der er også mange flydende celler og betydelige rester. På dag 4, er de fleste af cellerne fæstnet til kulturen plade. Celler vises forgrenet med synlige processer. Celler sporadisk fordelt og kulturer er ca. 20-30% konfluente på dette tidspunkt. På dag 8 kulturer er mellem 50-60% sammenflydende. Nogle områder af kulturerne har store pletter af celler. Andre områder af kulturerne har sparsom vækst af celler. Nogle celler i plastrene tage på en "firkant-lignende" udseende. På dag 12, kulturer er på eller over 80% sammenflydende (ca. 90% konfluente i billedet vist her). Cell er i loggen vækstfase på dette tidspunkt og mellem dag 12-14 er det optimale tidspunkt for at bruge de gliaceller til eksperimenter. Klik her for at se enstørre version af denne figur.

  1. Undersøg mikroglial indhold under anvendelse af celler fra de ekstra brønde (trin 4.3) via standard fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) farvningsprotokol 11 ved anvendelse af kombinationen af anti-muse-CD45 og anti-muse CD11b monoklonale antistoffer. CD45 + CD11b + celler identificeres som mikroglia.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denne metode kan anvendes til fremstilling af blandede gliaceller fra både mus og rotter. Den gennemsnitlige totale celleantal pr brønd i en plade med 12 brønde på D 12 post-initiering af kulturen bør være relativt stabil, med omkring 100.000 celler per brønd når celler afledt fra muse rygmarv. Gliaceller opnået fra denne metode kan bruges i forsøg, der er designet til at undersøge voksne rygmarven gliale reaktioner efter indgivelse af stoffer og midler af interesse. Figur 3 giver et eksempel på cytokin og kemokin svar fra en typisk eksperiment, hvor voksen rygmarv mikroglia blev opnået fra voksne BALB / c-mus og behandlet med LPS (Salmonella Minnesota-Re595) på D 13 post-initiering af kulturen. Supernatanter blev opsamlet 24 timer efter LPS behandling til bestemmelse af cytokin- og chemokin niveauer via et enzymbundet immunosorbentassay (ELISA) under anvendelse af kommercielt available kits.

Når denne voksne glial kultursystem først blev etableret, blev celler inkuberet i en standard kultur miljø ved 37 ° C. Under denne betingelse er den gennemsnitlige mikroglial indhold mellem 5 - 10%. Imidlertid blev det observeret, at på trods af brugen af konsekvente dyrkningsteknikker, ville kulturer i nogle tilfælde har enten meget lav mikroglial indhold (<2%) eller relativt højt mikroglial indhold (15 - 20%) 10. Det kan være frustrerende at få kulturer, der har meget få mikroglia når de eksperimentelle resultater er afhængige af de microgliale svar inden den blandede kultur. Efter forslag fra Dr. Alejandro MS Mayer (Department of Pharmacology, Chicago College of Osteopathic Medicine) 12, blev metoden ændret ved at dyrke blandede gliaceller på 35,9 ° C. Dette resulterede i en mere ensartet og højere mikroglial udbytte (mellem 10 - 40% og resterende meste around 20%) inden for de fleste kulturer. Denne forbedring er illustreret i figur 4 Som tidligere rapporteret, er mikroglia anslås at udgøre 5 -. 21% af CNS glial befolkning i voksne mus 13-15. Selv om begge dyrkningsbetingelser giver kulturer, der indeholder tilsvarende mængder af mikroglia som anslået i vivo, den modificerede kultur tilstand (35,9 ° C) er mere passende for eksperimenter, hvor det er afgørende at undersøge svarene fra både astrocytter og mikroglia.

figur 1
Figur 1:. Calcitonin Gene-relateret peptid (CGRP) -induceret kemokinproduktion af blandede gliaceller Blandede gliaceller fremstillet ud fra neonatale BALB / c mus hjerner (venstre) eller voksen BALB / c mus rygmarv (højre) blev behandlet med forskellige doser af CGRP. Niveauer af flere kemokiner i kultursupernatanter blev bestemt via multiplex assay (udført af producenten) på optimale tidspunkter (gennemsnit ± SEM, n = 2 - 6). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 3: Cytokin og chemokin responser fra mus Adult Spinal Cord Blandet Glia upon LPS Stimulation Voksen rygmarv blandede gliaceller blev fremstillet fra BALB / c-mus og stimuleret med forskellige doser af LPS.. Niveauer af IL-6 (A), tumornekrosefaktor (TNF) -alfa (B), interferon-gamma-inducerbare protein 10 (IP-10, også kendt som CXCL10) (C), og monocyt-kemoattraktant protein 1 (MCP 1, også kendt som CCL2) (D) i kultursupernatanter blev bestemt via ELISA'er ved 24 timer efter LPS-behandling.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54801/54801fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 4:. Mikroglial indhold i Voksen Mixed gliale kulturer Blandede gliaceller blev dannet fra voksne C57B6 / L mus og dyrket ved enten 37 ° C eller 35,9 ° C. Mikroglial indhold fra hver kultur blev analyseret via flowcytometri under anvendelse APC-anti-muse-CD45 (klon 30-F11) og FITC-anti-muse-CD11 (klon M1 / ​​70). Repræsentative plots fra flowcytometrisk analyse er vist. De samlede cellepopulationer fra kulturerne blev identificeret i parceller A (37 o C) og C (35,9 ° C), og de mikrogliaceller populationer (CD45 + CD11b + celler) blev yderligere isoleret fra de respektive samlede cellepopulationer i B (37o C) og D (35,9 ° C). Flowcytometrisk analyse blev udført, og alle data blev analyseret som beskrevet tidligere fem. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Det er afgørende at udføre alle trin-herunder medierne skiftende tidsplan-på en sammenhængende måde for at opnå reproducerbare resultater mellem eksperimenter. Følgende trin er særligt kritiske i at opnå fremragende kvalitet voksen blandet glia.

Den enzymatiske fordøjelse er et vigtigt aspekt af denne protokol. Det er afgørende, at de vævsstykker er godt fordøjet for at opnå en enkelt cellesuspension. Dog vil over-fordøjelse resultere i væsentligt færre celler. Hver lab behov for at udføre pilotforsøg for at bestemme den nøjagtige fordøjelse tid baseret på de typer af hætteglas, der anvendes til inkubation den gennemsnitlige væv anvendte mængde hver gang, og den type shaker (roterende versus orbitalryster). Endvidere uanset hvilken papain dissociation systemet vælges, er det vigtigt konsekvent at bruge de samme komponenter fra de samme kilder, som lejlighedsvis substitution af komponenter kan føre til betydelige forskelle i udbyttetaf det samlede antal celler.

I denne protokol, er myelin fjernes med en densitetsgradient medium. Det er afgørende at fremstille og ved stuetemperatur bruge densitetsgradient løsninger, da de tætheder af disse løsninger er temperaturfølsomme. Densitetsgradient løsninger sædvanligvis opbevaret ved 4 ° C. Hvis det er nødvendigt, kan densitet gradient løsninger de holdes ved stuetemperatur natten over, før den dag, opsætning af kulturen. Desuden efter 30 minutters centrifugering af celler i densitetsgradient på 20%, celler bør straks fjernes fra centrifugen for at forhindre store stykker affald i at skifte (dvs. bevæger sig væk fra toppen af opløsningen, se trin 4.1).

Det er vigtigt at fjerne snavs på D 1 indlæg initiering af kulturen. Selvom celler vil overleve og formere hvis dyrkningsmedierne ændres hver 3. til 4. d, skiftende medier på D 1 vil give en mere "hvilende" og "renere" kultur senere. Dennetillader celler at vokse i et mindre forstyrret miljø, og cellerne kan holdes op til 21 d efter initiering af kulturen.

Microgliale indhold for hvert forsøg kan undersøges, før du bruger den blandede glia. Selv med de mest konsekvente teknik, kan mikroglial indhold stadig varierer betydeligt mellem forsøgene. Nogle cellulære virkninger er afhængige af mikroglial indhold 4, 10; derfor er det afgørende at overvåge mikroglial indhold af hvert sæt af kulturer, der er etableret. Data opnået fra denne praksis kan bidrage til at fortolke variationer mellem eksperimenter, samt at tilvejebringe hidtil ukendte (undertiden uventet) viden om bidraget fra astrocytter versus mikroglia under en bestemt eksperimentel betingelse. Desuden har sæsonudsving på mikroglial indhold blevet observeret. Dette kan være en yderligere faktor til at overveje, når man planlægger store sæt af eksperimenter. Endvidere mens neuroner normalt ikke vil overleve under vores kultur tilstand,som NeuN (a neuronal- markør) -positive celler ikke er blevet observeret i vore gliale kulturer efter immunhistokemisk farvning, kan kulturen indeholde et begrænset antal oligodendrocytter (dette er ikke blevet rutinemæssigt kvantificeret). Man bør afgøre, om denne population skal undersøges afhængigt af de specifikke eksperimentelle betingelser.

Som med mange eksperimentelle metoder, kan denne fremgangsmåde ændres efter behovene i de enkelte forskere. Det er vigtigt at udføre pilotforsøg til fuldt ud at teste de specifikke ændringer, før du bruger dem rutinemæssigt. Endvidere bør det bemærkes, at den blandede glia kan anvendes til opnåelse af mikroglia-udtømte og microglia-beriget kulturer at studere svarene fra astrocyt-dominerende versus mikroglia-dominerende celler efter specifikke stimuleringer, som tidligere beskrevet for neonatale blandede gliaceller 3, 4. dog vil udbyttet af mikroglia-berigede celler være begrænset, hvis et stort antal spinalledninger er anvendt til at etablere kulturen i begyndelsen. Dette er en begrænsning af denne fremgangsmåde, især hvis der anvendes mus. Når der anvendes rotte rygmarv, kan et individ rygmarv (i stedet for 4 mus rygmarv) anvendes til at etablere én plade med 12 brønde. Endelig giver mikroglial indhold ikke at være signifikant forskellig mellem muse og rotte voksen rygmarv gliale kulturer 4, 5 Både muse- og voksne rotte rygmarv gliale kulturer producere en robust respons på LPS-stimulering i form af cytokinproduktion.; dog kan observeres differentielle reaktioner, når der anvendes alternative stimuli.

Alt i alt, denne voksne gnaver glial dyrkningssystem tilvejebringer en alternativ metode til at studere gliaceller in vitro. Resultater opnået fra denne kultur-systemet nøjere afspejler, hvad der ville blive observeret under in vivo betingelser i forhold til resultater opnået fra neonatale kulturer eller cellelinier. I den nuværende fremgangsmåde, gliaceller er collected fra voksne gnavere, som voksen glia reagere på stimuli meget forskelligt i forhold til neonatal glia 4 (figur 1). Cellerne ikke manipuleres væsentligt gennem immortalisering procedurer, som ville blive anvendt til at generere og vedligeholde cellelinier. Selv om denne metode, der oprindelig blev udviklet til anvendelse i neuropatisk smerte undersøgelser, kan det bruges til at studere andre neurologiske sygdomme, som medfører patologiske ændringer i rygmarven, såsom ALS og MS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s modification of Eagle’s media (DMEM) with 4.5 g/L glucose Lonza 12-709F The cDMEM media is a standard, widely used culture media. Individual researchers can decide where to purchase the DMEM and all other components used to make cDMEM media.
L-Glutamine (100x) Lonza 17-605E The L-glutamine is a standard, widely used component for various culture media. Individual researchers can decide where to purchase L-glutamine.
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) Corning-Mediatech 30-004-CI This is a combination of penicillin, streptomycin and Amphotericin formulated to contain 10,000 units/mL penicillin G, 10 mg/mL streptomycin sulfate and 25 µg/mL amphotericin B. Individual researchers can decide where to purchase individual components.
2-mercaptoethanol (2-ME) Sigma-Aldrich M3148 A BioReagent, suitable for cell culture, molecular biology and electrophoresis.
Papain dissociation system Worthington Biochemical Corporation LK003150 Individual components of this kit can be purchased separately. 
Percoll GE Health Care 17-0891-01 Percoll is sold as sterile solution. Undiluted Percoll can be re-autoclaved if needed.
Lab-line incubator/shaker  Barstead/Lab-line MaxQ4000  This is the incubator/shaker we have currently. Other types of shakers can be used instead.
Lipopolysaccharides, Salmonella Minnesota Re595 Sigma-Aldrich L-9764 Other strains of LPS can also induce glial responses. The magnitude of the responses though, may vary.
Mouse IL-6 DuoSet ELISA  R&D Systems DY406 Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.
Mouse TNF-alpha DuoSet ELISA R&D Systems DY410 Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.
Mouse IP-10 (CXCL10) DuoSet ELISA R&D Systems DY466 Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.
Mouse MCP-1 (CCL2) ELISA Opteia set BD Biosciences 555260 Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.
Mouse chemokine Q-Plex Quansys Biosciences 120251MS This product was not available for in-house assay at the time. Instead, we sent out samples to the manufacturer for analysis.
APC-anti-mouse-CD45 (clone 30-F11) eBioscience 17-0451 Antibody of the same clone but from other vendors can be used.
FITC-anti-mouse-CD11b (clone M1/70) eBioscience 11-0112 Antibody of the same clone but from other vendors can be used.
Accuri C6 flow cytometer BD Biosciences BD Accuri C6  Each individual Researcher can use any flow cytometer he or she prefers.
FlowJo software Tree Star, Inc. FlowJo7.6.5 Each individual Researcher can use any analysis software he or she prefers.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gaskin, D. J., Richard, P. The economic costs of pain in the United States. J Pain. 13, (8), 715-724 (2012).
  2. Ji, R. R., Berta, T., Nedergaard, M. Glia and pain: Is chronic pain a gliopathy? Pain. 154, (01), S10-S28 (2013).
  3. Ni, M., Aschner, M., et al. Neonatal rat primary icroglia: isolation, culturing and selected applications. Curr Protoc Toxicol. Maines, M. D., et al. (2010).
  4. Cao, L., Fei, L., Chang, T. T., DeLeo, J. A. Induction of interleukin-1beta by interleukin-4 in lipopolysaccharide-treated mixed glial cultures: microglial-dependent effects. J Neurochem. 102, (2), 408-419 (2007).
  5. Malon, J. T., Maddula, S., Bell, H., Cao, L. Involvement of calcitonin gene-related peptide and CCL2 production in CD40-mediated behavioral hypersensitivity in a model of neuropathic pain. Neuron Glia Biol. 7, (2-4), 117-128 (2011).
  6. Blasi, E., Barluzzi, R., Bocchini, V., Mazzolla, R., Bistoni, F. Immortalization of murine microglial cells by a v-raf / v-myc carrying retrovirus. J Neuroimmunol. 27, (2), 229-237 (1990).
  7. Bocchini, V., et al. An immortalized cell line expresses properties of activated microglial cells. J Neurosci Res. 31, (4), 616-621 (1992).
  8. Alliot, F. O., Marty, M. C., Cambier, D., Pessac, B. A spontaneously immortalized mouse microglial cell line expressing CD4. Dev Brain Res. 95, (1), 140-143 (1996).
  9. Alliot, F. O., Pessac, B. Astrocytic cell clones derived from established cultures of 8-day postnatal mouse cerebella. Brain Res. 306, (1-2), 283-291 (1984).
  10. Malon, J. T., et al. Microglial content-dependent inhibitory effects of calcitonin gene-related peptide (CGRP) on murine retroviral infection of glial cells. J Neuroimmunol. 279, 64-70 (2015).
  11. Cao, L., DeLeo, J. A. CNS Infiltrating CD4(+) T lymphocytes Contribute to Murine Spinal Nerve Transection-Induced Neuropathic Pain. Eur J Immunol. 38, (2), 448-458 (2008).
  12. Mayer, A. M., et al. Effect of a short-term in vitro exposure to the marine toxin domoic acid on viability, tumor necrosis factor-alpha, matrix metalloproteinase-9 and superoxide anion release by rat neonatal microglia. BMC Pharmacol. 1, 7 (2001).
  13. Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39, (1), 151-170 (1990).
  14. Rock, R. B., et al. Role of Microglia in Central Nervous System Infections. Clin Microbiol Rev. 17, (4), 942-964 (2004).
  15. Yang, I., Han, S. J., Kaur, G., Crane, C., Parsa, A. T. The Role of Microglia in Central Nervous System Immunity and Glioma Immunology. J Clin Neurosci. 17, (1), 6-10 (2010).
Udarbejdelse af Primære Mixed Glia kulturer fra Voksen Mouse Spinal Cord Tissue
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Malon, J. T., Cao, L. Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue. J. Vis. Exp. (117), e54801, doi:10.3791/54801 (2016).More

Malon, J. T., Cao, L. Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue. J. Vis. Exp. (117), e54801, doi:10.3791/54801 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter