Summary
התפתחות כאב נוירופתי כרוך שינויים פתולוגיים של תאי גלייה בחוט השדרה. מערכת תרבות גליה אמינה נגזרה רקמת חוט שדרה מבוגרת ועוצבה ללימוד תאים אלה במבחנה חסרה. לכן, אנו מציגים כאן כיצד להקים תרבויות גליה מעורבות עיקריות מרקמות כבל מבוגר עכבר שדרה.
Abstract
זה כבר טוב כי קיבל תגובות גליה בחוט השדרה לתרום רבות להתפתחות כאב נוירופתי. מידע עצום בנוגע לפעילות גליה ברמות התאיות ומולקולריות הושג באמצעות מערכות תרבות תאים במבחנה. המערכות חוץ הגופייה המנוצלת, כוללות בעיקר גליה עיקרית נגזרה רקמת קליפת מוח מוח בילוד והנציחו שורות תאים. עם זאת, מערכות אלה לא יכולים לשקף את המאפיינים של תאי גלייה בחוט השדרה in vivo. כדי להמשיך לחקור את התפקידים של תאים גליה בחוט השדרה בפיתוח בכאב עצבי-induced פגיעה עצבית היקפית באמצעות מערכת תרבות משקפת טוב יותר את מצב in vivo, במעבדה שלנו פיתחה שיטה להקים תרבויות גליה מעורבת חוט השדרה העיקרי מן עכברים בוגרים. בקצרה, נאספים מיתרי השדרה של עכברים בוגרים ומעובד באמצעות עיכול פפאין ואחריו הסרת המיאלין עם מאורותity-שיפוע בינוני. המתלים תא בודדים בתרבית תקשורת הנשר השונה של שלמה Dulbecco (cDMEM) בתוספת 2-mercaptoethanol (2-ME) ב 35.9 מעלות צלסיוס תנאי תרבות אלה מותאמים במיוחד עבור הצמיחה של תאי גליה מעורבים. בתנאים אלה, תאים מוכנים לשמש לניסויים בין 12 - 14 ד (תאים הם בדרך כלל בשלב יומן במהלך הזמן הזה) לאחר הקמת התרבות (D 0) ו יכולים להישמר בתנאי תרבות עד D 21. מערכת תרבות זו יכולה לשמש כדי לחקור את התגובות של תאי גלייה בחוט שדרה על גירוי עם חומרי סוכנים שונים. מלבד כאב נוירופתי, מערכת זו יכולה לשמש כדי לחקור תגובות גליה במחלות אחרות שכוללות שינויים פתולוגיים של תאי גלייה בחוט שדרה.
Introduction
כאב כרוני הוא בעיה בריאותית חמורה המשפיעה על כ -100 מיליון מבוגרים בארצות הברית, עם עלות שנתית משוערת של עד 635 מיליארדים $ 1. ראיות מצטבר ציינו תרומה משמעותית של תאי גלייה בחוט שדרה בפיתוח בכאב עצבי, אחד המיני ההרסני ביותר של כאב כרוני 2. מערכת תרבות ראויה במבחנה תעזור משמעותית נוספים חוקרים את התפקידים של ותאי גלייה ברמות התאיות ומולקולריות.
נכון לעכשיו, מערכות התרבות גליה במבחנה מנוצלות על ידי חוקרים כוללות בעיקר תאי גלייה נגזרו רקמות קליפת מוח של מוח עכבר או עכברוש בילוד והנציחו שורות תאי גליה הנגזרות עכבר בילוד או להלשין ותאי גלייה עיקריים. תאים עובריים מכילים כמויות משמעותיות של תאים שלא עברו התמיינות אשר ניתן להבדיל נוספת לתאי גליה (בעיקר האסטרוציטים ו microglia), ובכך לספקתאי bundant לשימוש 3 ניסיוני. עם זאת, המחקר קודם שלנו הראה כי תאי גלייה בילוד המוח הגיבו באופן שונה משמעותי מתא גליה בחוט שדרה מבוגרת על lipopolysaccharide (LPS) גירוי. לדוגמה, interleukin (IL) -4 מוצג משופרת השפעות מעכבות על תחמוצת החנקן הנגרמת LPS (NO) ב גליה בחוט השדרה עכברוש מבוגר לעומת גליה 4 המוח בילוד. יתר על כן, את הפרופילים של ייצור chemokine על גירוי על ידי neuropeptide, calcitonin פפטיד הקשורים גן (CGRP), הם unarguably שונים בין גליה המוח עכבר בילוד (השיטות המתוארות Ref. 5) ועכבר מבוגר גליה חוט השדרה (איור 1). שורות תאים הוקמו קלות לשימוש ולתחזוקה והוא יכול לספק מספר רב של תאים בתוך פרק זמן קצר. באופן כללי, הנציח שורות תאים נוצרות גם באמצעות מערכת הנצחה וירוס בתיווך (כגון שורת תאים microglial בשימוש נרחב BV2) 6, 7 או ה הבאהדואר זיהוי של טרנספורמציה ספונטנית (כגון שורת תאי astrocyte C8-D1A וקו תא microglial-B4 C8) 8, 9 שורות תאים מצוינות ללמוד את המאפיינים המולקולריים של האסטרוציטים ו microglia בנפרד.; עם זאת, התוצאות שהתקבלו מן שורות תאים תמיד דורשות אימות נוספת תאים ראשוניים או בתנאי in vivo. כמו כן יש לציין כי לא חל דו"ח של קו תא גלייה כי נגזר גליה בחוט שדרה מכרסמת.
כדי לסייע בחקירת התפקיד של תאי גלייה בחוט השדרה בפיתוח בכאב עצבי, מערכת התרבות הנגזרת חוט השדרה עכבר בוגר פותחה על ידי התאמת שיטת בעבר דיווח השתמשו כדי ליצור תרבויות גליה מעורבת חולדה בוגרת 4, 5 . תרבות גליה שדרת כבל העכבר הייתה מעודנת יותר לאחרונה 10 והוא מתואר בפירוט רב יותר במאמר זה. ג תרבויות שדרה למבוגר גליה מעורבת כבלשתוקם עם העכבר זנים נבחרים שמתאימים לצרכים של מחקר מסוים, ותאי יכול להישמר בתרבות עד 21 לפוסט חניכה של התרבות. שיטה זו יכולה לשמש במחקרים כאב נוירופתי, כמו גם בחקירות של מחלות נוירולוגיות שונות שכוללות שינויים פתולוגיים בתוך חוט השדרה, כגון טרשת לרוחב amyotrophic (ALS), וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) -associated נוירופתיה סנסורית, מרובים טרשת (MS).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הפרוטוקול הבא אושר על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדית השתמש (IACUC) באונ' ניו אינגלנד. פרוטוקול להלן להכנת תרבויות גליה מ -4 מיתרי השדרה עכבר בוגר.
1. הכנת פתרונות במנדף תרבות בתנאי aseptic
- כן תקשורת תרבות: השינוי של Dulbecco המלא של התקשורת של הנשר (cDMEM) המכיל DMEM (עם 4.5 g / גלוקוז L), 10% בסרום שור עובר (FBS), 2 מ"מ L- גלוטמין, 100 פניצילין IU / mL, 100 מ"ג / mL סטרפטומיצין ng, 250 / מ"ל Amphotericin B, ו -50 מיקרומטר 2-mercaptoethanol (2-ME, ראה 1.1.1). מערבבים ולסנן לעקר כל הרכיבים האחרים ולאחר מכן להוסיף FBS. אחסן את התקשורת והתרבות ב 4 מעלות צלסיוס
- הכן 50 מ"מ 2-ME / שנאגרו מלוחים פוספט (PBS) פתרון המניות: להוסיף 100 μL של מרוכז 2-ME (14.3 M) לתוך 28.6 מ"ל של PBS 1x, ולסנן לעקר (הפתרון יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלסיוס עבור מספר חודשים). Use 1 מ"ל של 2-ME פתרון המניות לכל 1,000 מ"ל של התקשורת והתרבות.
- הכנת תקשורת שיפוע הצפיפות
- כן פתרון תקשורת שיפוע צפיפות איזוטוני מניות (למשל, 100% Percoll) מ 1 חלק 10x PBS סטרילי רגיל ו -9 חלקים בתקשורת שיפוע צפיפות מניית סטרילי (למשל, Percoll).
- לדלל את תקשורת שיפוע צפיפות 100% (תוצרת 1.2.1) עם PBS סטרילית 1x הרגיל לעשות תקשורת שיפוע צפיפות 20% (למשל, 10 מיליליטר של תקשורת שיפוע צפיפות 100% עם 40 מיליליטר של PBS 1x) ולאחסן אותו ב 4 o C. תביאו את התקשורת שיפוע צפיפות 20% לטמפרטורת החדר (RT) לפני הכנת תרבית תאים.
- הכנת פתרונות ממערכת דיסוציאציה פפאין
הערה: מערכת ניתוק פפאין יכולה להיות מזוהית טבלת החומרים. ערכות דיסוציאציה דומות אחרות (כולל אלה התאספו ללא צורך במיקור חוץ) יכולות לשמש גם. כל components חייב להיות סטרילי.- להוסיף 32 מ"ל של תמיסת מלח מאוזן של ארל (EBSS) לתערובת מעכב ovomucoid (אבקה).
- הוסף 5 מ"ל של EBSS אל הבקבוקון פפאין אחד (אבקה). מניחים את הצנצנת פפאין באמבט מים C 37 o במשך 10 דקות או עד פפאין נמס.
- הוספת 500 μL של EBSS כדי בקבוקון DNase אחד (אבקה). מערבבים בעדינות.
- הוסף 250 μL של פתרון DNase (לעיל) כדי בקבוקון פפאין.
- לחשב את הסכום הכולל של התערובת פפאין / DNase מעל הצורך (כ 800 μL של תערובת פפאין / DNase לכל כבל העכבר השדרה) ולהעביר את התערובת הדרושה לתוך צינור 50 מ"ל לעיכול רקמת (שלב 3.2). אחסן את שאריות הבקבוקון המקורי ב 4 מעלות צלזיוס למשך שבועיים לפחות.
- שמור את כל רכיבי הערכות על קרח עד צורך.
- הכן צינורות אוסף חוט השדרה: סטרילי אחד 15 מ"ל צינור עם 5 מ"ל של תמיסת מלח מאוזן של האנק (HBSS; ממערכת דיסוציאציה פפאין,0; לאיסוף מיתרי השדרה) וסטרילי אחד 15 צינור מ"ל עם 1x PBS (למילוי את מזרק 5 מ"ל, ראה שלב 2.4). בנוסף, להכין צלחת פטרי סטרילית אחד (35 מ"מ או 60 מ"מ) עם 5 מ"ל של HBSS ולשמור אותו למכסה המנוע בתרבית.
2. אוסף חוט שדרה
הערה: כל הציוד חייב להיות סטרילי. בצע את האוסף באזור מיועד שאושר על ידי IACUC.
- השג את הכלים הבאים עבור מיתרי השדרה עכבר קציר: ישר חדה / מספריים כירורגיות 18 ס"מ בוטה, אזמל תקן 12 ס"מ (# 3 מוצק), להבים אזמל סטרילי פלדה פחמן 10 #, decapitator חיה קטנה, 12 ס"מ סטנדרטי מעוקל מלקחיים, ומחט 20G סטרילי מצורף מזרק 5 מ"ל.
- להרדימו עם CO 2 ולחטא את הראש העכבר באזור הגב עם 70% אתנול (EtOH).
- לערוף חיה עם decapitator. ביצוע חתך אורכי באמצע על הגב התחתון כדי לחשוף את שכבת השריר. עשהחיתוך רוחב נקי דרך עמודת החוליות ברמת הירך (גם חיתוך דרך שכבת השריר המכסה את העמודה החולייתנים) עם מספרי כירורגיות הישרים סטרילי (18 סנטימטרים).
- מניח את החיה על גיליון טרי לנגב הפנויה. בזהירות להכניס 20 המחט G (מצורף מזרק 5 מ"ל מלא PBS 1x סטרילי (שלב 1.4)) לתוך עמוד השדרה כלפי הצד מקורי. להחזיק את החיה למטה בחוזקה ודחף את המזרק במהירות. חוט השדרה כולו צריך לצאת מסוף צוואר הרחם. אסוף את חוט השדרה לתוך 15 הצינור מ"ל המכיל HBSS.
- חזור על שלב 2.4 עבור שאר העכברים. בין כל חיה, לחטא את כל המכשירים המשמשים עם 70% EtOH.
הערה: בדרך כלל, צלחת 12 גם אחת ניתן לקבוע עבור כל 4 עכבר מיתרי השדרה (ראה 4.3).
3. הכנה של תרחיף התא הבודד
הערה: בצע את השלבים 3 ו -4 במנדף התרבות לשמור על הכל סטרילי.
- להעביר את כל מיתרי השדרה לתוך צלחת פטרי HBSS המכילים (שלב 1.4). חותכים כל של מיתרי השדרה לתוך חתיכות רבות בסדר, קטן עם מספריים מלקחיים סטרילית. מעבירים את רקמת חוט השדרה אל צינור חרוטי 50 מ"ל המכיל את פפאין מוכן / תערובת אנזים DNase (שלב 1.3.5) באמצעות מלקחיים סטרילית או פיפטה 10 מ"ל (להימנע מהוספת HBSS לתערובת אנזים, כמו זה יהיה עוד יותר לדלל את מוכן פתרון אנזים ועלול לגרום לביצועים ירד של האנזים).
- וורטקס הצינור בעדינות לתערובת. דגירת הצינור ב 37 o צלזיוס במשך שעה 1 ב שייקר אינקובטור / עם רעד מסלולית ב 150 סל"ד.
- וורטקס הצינור שוב נמרצות triturate הפתרון האנזים עם רקמות בעזרת פיפטה 5 מ"ל לקדם דיסוציאציה נוספת.
- מעבירים את ההשעיה התא לתוך צינור צנטריפוגות 15 מ"ל ב 300 XG במשך 5 דקות ב RT.
- במהלך צנטריפוגה, לערבב 2.7 מ"ל EBSS עם 300 μL של Inh אלבומין-ovomucoid מחדשפתרון ibitor (1.3.1) בצינור סטרילי. הוספת 150 μL של פתרון DNase (שלב 1.3.3).
- בעקבות צנטריפוגה, להסיר את supernatant ו resuspend התא גלולה עם פתרון מוכן לעיל (שלב 3.5). וורטקס היטב כדי לשבור את התא גלול.
- הוסף 3 מ"ל של תמיסת מעכב אלבומין-ovomucoid מחדש (שלב 1.4.1) על השעיית התא. תאים צנטריפוגה ב 70 XG במשך 6 דקות ב RT. הסר את supernatant (המכיל שברי קרום).
הסרת .4 בהמשך של המיאלין מן תרחיף התא הבודד
- הוסף 8 מיליליטר של תקשורת שיפוע צפיפות 20% (מוכנה בשלב 1.2.2) לתוך השפופרת המכילה את התא גלול, מערבולת בעדינות כדי לשבש את הגלולה, צנטריפוגות התאים ב 800 XG במשך 30 דקות ב RT ללא בלימה. מוציאים בזהירות את השכבה העליונה של פסולת (בעיקר המיאלין) ואת supernatant, אבל לשמור על גלולה.
- כדי להסיר שאריות של שיפוע צפיפות, לשטוף את התאים על ידי resuspending התא גלולה עם 8 מ"ל של cDMEM מדולל (1 חלק cDMEM ו -2 חלקים HBSS). צנטריפוגה התאים ב 400 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלסיוס הסר את supernatant לשטוף את התאים שוב עם מדולל cDMEM (לעיל), באותו אופן. שמור את התאים על קרח עד זריעה אותם.
- הסר את supernatant ו resuspend התא גלולה בתקשורת תרבות (cDMEM מסופק עם 2-ME (מוכן בשלב 1.1)). עבור צלחת אחת 12-היטב, השתמש 3 מ"ל x 4 (מספר העכברים בשימוש) + 2 מ"ל = 14 מ"ל התקשורת. פעולה זו תבטיח כי יש השעית תא מספיק עבור הצלחת כולה (12 בארות) ותספק עבור בארות נוספות שיכול לשמש כדי לקבוע את המספר סלולארי הממוצע לכל טוב ותוכן microglial של התרבות. אם סוגים אחרים של כלי התרבות ישמשו, לחשב את הנפח הכולל של תקשורת ותרבות הדרושה באופן יחסי.
- הוסף 1 מ"ל של ההשעיה תא לבאר כל צלחת 12-היטב.
- דגירה התאים ב C 35.9 o עם 5% CO 2.
איור 2:. נציג תמונות של תאי גליה מעורבים בזמנים שונים לאחר הקמת התרבות גליה המעורבת גליה מעורבת חוט השדרה ראשית הוכנה ממבוגר C57Bl / 6 עכברים. נציג תמונותלהציג את ההתקדמות של תרבות גליה לאחר הציפוי. באותו יום 1, תאים מסוימים מצורפים צלחת התרבות, אבל הם עדיין בעיקר סביב. יש גם הרבה תאים צפים ופסולת משמעותית. באותו יום 4, רוב התאים מצורפים צלחת התרבות. תאים להופיע ענפים עם תהליכים גלויים. תאים מופצים באופן ספוראדי ותרבויות הן כ 20-30% ומחוברים בשלב זה. באותו יום 8, תרבויות הן בין 50-60% ומחוברות. באזורים מסוימים של התרבויות כתמים גדולה של תאים. יש תחומים אחרים של תרבויות צמיחה דלילה של תאים. כמה תאים בתוך הטלאים לקחת על מראה "מרובע דמוי". באותו היום 12, תרבויות הן בבית או מעל 80% ומחוברות (כ -90% ומחוברים בתמונה המוצגת כאן). תא נמצא בשלב היומן של צמיחה בשלב זה ובין ימים 12-14 זה הזמן האופטימלי עבור שימוש בתאי גליה לניסויים. אנא לחץ כאן כדי להציגגרסה גדולה יותר של דמות זו.
- בדוק את תוכן microglial באמצעות תאי מבארות הנוספות (שלב 4.3) באמצעות מיון תא קרינה המופעלת סטנדרטי (FACS) פרוטוקול מכתים 11 באמצעות השילוב של נוגדנים חד שבטיים אנטי עכבר CD45 ואנטי עכבר CD11b. CD45 + CD11b + תאים מזוהים microglia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שיטה זו יכולה לשמש כדי להכין ותאי גלייה מעורבים משני עכברים וחולדות. מספר התאים הכולל ממוצע לכל היטב צלחת 12 גם ב -12 D-ייזום פוסט של התרבות צריך להיות יציב יחסית, עם כ 100,000 תאים לכל טוב כאשר תאים נגזרים מייתרי שדרת עכבר. תאי גלייה המתקבלים בשיטה זו ניתן להשתמש בניסויים שנועדו לבחון את תגובות גליה בחוט שדרה מבוגרות על מתן חומרים והסוכנים של עניין. איור 3 מספק דוגמא של תגובות ציטוקינים ו chemokine מניסוי טיפוסי אחד שבו microglia כבל מבוגר השדרה התקבלו מעכברים BALB / ג מבוגר ומטופל עם LPS (סלמונלה מינסוטה Re595) ב -13 D-חניכה לתפקיד התרבות. Supernatants נאספו 24 שעות לאחר LPS טיפול לקביעת רמות ציטוקינים ו chemokine באמצעות assay immunosorbent enzyme-linked (ELISA) באמצעות מסחרית-availabערכות le.
כאשר מערכת ההתרבות מבוגרת גליה זה הוקמה לראשונה, תאים הודגרו בסביבת תרבות סטנדרטית ב 37 o C. תחת תנאי זה, תוכן microglial הממוצע נע בין 5 - 10%. עם זאת, זה היה ציין כי על אף השימוש בטכניקות תרבות עקבית, תרבויות היו בחלק מהמקרים יש גם נמוך מאוד תוכן microglial (<2%) או גבוה יחסית תוכן microglial (15 - 20%) 10. זה יכול להיות מתסכל להשיג תרבויות שיש מעט מאוד microglia כשתוצאות הניסוי להסתמך על תגובות microglial בתוך התרבות המעורבת. בעקבות הצעתו של ד"ר אלחנדרו MS מאייר (המחלקה לפרמקולוגיה, שיקגו המכללה לרפואה לאוסטאופתיה) 12, השיטה שונתה על ידי גידול תאים גליה מעורבת ב 35.9 מעלות צלסיוס זה הביא תשואת microglial עקבית יותר גבוהה (בשיעורים שבין 10 - 40% הנותר בעיקר around 20%) בתוך ברוב התרבויות. שיפור זה מתואר באיור 4 כפי שדווח בעבר, microglia נאמד לפצות 5 -. 21% מאוכלוסיית גליה CNS בעכברים בוגרים 13-15. למרות ששני תנאי התרבות לספק תרבויות המכילות כמויות דומות של microglia כפי שנאמד ב vivo, תנאי התרבות השונה (35.9 מעלות צלסיוס), מתאים יותר ניסויים שבם הוא צורך לבחון את התגובות משתי האסטרוציטים ו microglia.
איור 1:. קלציטונין ג'ין הקשורות פפטיד (CGRP) -induced chemokine ייצור ידי ותאי גלייה מעורבים ותאי גלייה מעורבים שהוכנו מוח עכבר BALB / ג בילוד (משמאל) או מבוגר BALB / c עכבר מייתרי שדרה (מימין) טופלו במינונים שונים של CGRP. רמות של כמוקינים מספר supernatants תרבות נקבעו באמצעות assay זמנית (שבוצעה על ידי היצרן) בזמנים אופטימליים (ממוצע ± SEM, n = 2 - 6). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: ציטוקין ו chemokine תגובות טבורי עכבר למבוגרי שדרה מעורב גליה על LPS גירוי חוט שדרה למבוגר ותאי גלייה מעורבים הוכנו מעכברי BALB / C ו מגורה עם מינונים שונים של LPS.. רמות IL-6 (א), tumor necrosis factor (TNF) -alpha (B), אינטרפרון-גאמא-מושרה חלבון 10 (IP-10, הידוע גם בשם CXCL10) (ג), ו chemoattractant מונוציטים חלבון 1 (MCP- 1, הידוע גם בשם CCL2) (D) ב supernatants התרבות נקבע באמצעות ELISAs ב 24 טיפול שעות לאחר LPS.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54801/54801fig2large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4:. תוכן microglial בתרבויות למבוגרים מעורבת גליה ותאי גלייה מעורבת נוצרו מעכברים C57B6 / L מבוגר ותרבותי בשני 37 מעלות צלסיוס או 35.9 מעלות צלסיוס תוכן microglial מכל תרבות נותח באמצעות זרימת cytometry באמצעות APC-אנטי עכבר CD45 (שיבוט 30-F11) ו FITC-אנטי עכבר CD11b (שיבוט M1 / 70). מגרשי נציג מניתוח התזרים cytometric מוצגים. אוכלוסיות התאים הכוללות מן התרבויות אותרו מגרשי A (37 מעלות צלסיוס) ו- C (35.9 מעלות צלסיוס), ואת אוכלוסיות microglial (CD45 + CD11b + תאים) בודדו רחוק יותר מן אוכלוסיות תאים הכוללות בהתאמה ב B (37o C) ו- D (35.9 מעלות צלסיוס). ניתוח התזרים cytometric בוצע, וכל הנתונים נותחו כפי שתוארו לעיל 5. נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
זה קריטי כדי לבצע את כל השלבים, כולל בתקשורת שינוי לוח זמנים-באופן עקבי על מנת לקבל תוצאות לשחזור בין ניסויים. השלבים הבאים הם קריטיים במיוחד בהשגת גליה מעורבת מבוגרים באיכות מעולה.
עיכול אנזימטי הוא היבט חשוב של פרוטוקול זה. זה חיוני כי פיסות הרקמה הם גם מתעכל כדי לקבל השעיה תא בודד. עם זאת, יתר העיכול יגרום פחות תאים משמעותיים. מעבדה כל צריך לבצע בדיקות ניסיוניות לקביעת זמן עיכול המדויק המבוסס על סוגי הבקבוקונים בשימוש לאינקובטורים, בסך הרקמות הממוצע המשמש בכל פעם, ואת הסוג של שייקר (סיבוב לעומת שייקר מסלולית). יתר על כן, ללא קשר למערכת דיסוציאציה פפאין הנבחר, זה הכרחי להשתמש באותם רכיבים בעקביות מאותם המקורות, כמו ההחלפה מדי פעם רכיבים עלולה להוביל שינויים משמעותיים התשואהשל המספר הכולל של תאים.
בפרוטוקול זה, את המיאלין מוסר באמצעות מדיום שיפוע צפיפות. זה קריטי כדי להפוך ולהשתמש בפתרונות שיפוע צפיפות ב RT מאז הצפיפויות של פתרונות אלה הן רגיש לטמפרטורה. פתרונות שיפוע צפיפות בדרך כלל מאוחסנים 4 o C. במידת צורך, פתרונות שיפוע צפיפות יכולים להישמר ב RT לילה לפני יום הקמת התרבות. בנוסף, בעקבות צנטריפוגה 30 דקות של תאי שיפוע צפיפות 20%, תאים יש להסיר מייד מן צנטריפוגות כדי למנוע חתיכות גדולות של פסולת הסטה (כלומר, מתרחק מהחלק העליון של הפתרון; ראה שלב 4.1).
חשוב להסיר שאריות על ייזום פוסט D 1 של התרבות. למרות שתאים ישרדו מתרבים אם התקשורת והתרבות משתנית כל 3 עד 4 ד, שינוי תקשורת על D 1 יספק תרבות "שקטה" יותר "נקיה יותר" מאוחר יותר. זֶהמאפשר לתאים לגדול בסביבה פחות מופרעת, ותאים יכולים להישמר עד 21 ד שלאחר החניכה של התרבות.
תוכן microglial עבור כל ניסוי ניתן לבדוק לפני השימוש גליה מעורבת. אפילו עם הטכניקה העקבית ביותר, תוכן microglial עדיין עשוי להשתנות באופן משמעותי בין ניסויים. כמה תופעות הסלולר תלויות תוכן microglial 4, 10; וכך, חשוב לנטר את תוכן microglial של כל קבוצה של תרביות מבוססות. נתונים המתקבלים בפועל זה יכול לעזור לפרש וריאציות בין ניסויים, כמו גם לספק רומן ידע (לפעמים בלתי צפוי) לגבי התרומה של האסטרוציטים לעומת microglia תחת תנאי ניסוי בפרט. בנוסף, שינויים עונתיים על תוכן microglial נצפו. זה עשוי להיות גורם נוסף שיש לקחת בחשבון בעת תכנון קבוצות גדולות של ניסויים. יתר על כן, בעוד נוירונים בדרך כלל לא ישרדו בתנאי תרבותנו,כמו NeuN (סמן neuronal-) התאים -positive לא נצפו בתרבויות גליה שלנו לאחר מכתים immunohistochemical, התרבות עשויה להכיל מספר מוגבל של oligodendrocytes (זה לא כומתו שגרתי). אחד צריך להחליט אם אוכלוסייה זו צריכה להיבחן בהתאם לתנאי הניסוי הספציפי.
כמו שיטות רבות ניסיון, שיטה זו יכולה להיות שונה בהתאם לצרכימים של חוקרי פרט. זה חיוני כדי לבצע ניסויי פיילוט כדי לבדוק את השינויים הספציפיים מלא לפני השימוש בהם באופן שגרתי. יתר על כן, יש לציין כי גליה המעורבת יכולה לשמש כדי להשיג מדולדל המיקרוגליה microglia מועשר תרבויות ללמוד את התגובות של astrocyte הדומיננטית לעומת תאי microglia הדומיננטית לאחר גירויים ספציפיים, כפי שתוארו לעיל עבור תאי גליה מעורבים בילוד 3, 4. עם זאת, התשואה של תאים מועשרים microglia תוגבל אלא אם מספר גדול של שדרהמייתרים המשמשים להקמת התרבות בהתחלה. זוהי מגבלה של שיטה זו, במיוחד אם עכברים משמשים. כאשר מיתרי השדרה עכברוש משמשים, אחד חוט השדרה בודדים (במקום 4 מיתרי השדרה העכבר) ניתן להשתמש כדי להגדיר אחד 12 גם צלחת. לבסוף, תוכן microglial אינו מופיע להיות שונה באופן משמעותי בין תרבויות גליה בחוט השדרה מבוגרת עכבר וחולדת 4, 5 שניהם כבל עכבר חולדת בוגרת שדרת תרבויות גליה לייצר תגובה חזקה כדי גירוי LPS במונחים של ייצור ציטוקינים.; עם זאת, תגובות הפרש אפשר לראות כאשר גירויים אלטרנטיביים משמשים.
בסך הכל, מערכת התרבות גליה מבוגר מכרסם זה מספק שיטה חלופית כדי ללמוד ותאי גלייה במבחנה. תוצאות שהתקבלו ממערכת התרבות זו משקפות טוב יותר את מה יהיה ציינו בתנאי vivo ב בהשוואה לתוצאות שהושגו מתרבויות בילוד או שורות תאים. בשיטה הנוכחית, ותאי גלייה הם גollected מפני מכרסמים מבוגרים, כמו להגיב גליה מבוגרת לגירויים שונים מאוד בהשוואת גליה 4 בילוד (איור 1). התאים אינם מניפולציה משמעותית באמצעות הליכי הנצחה, אשר ישמשו להפקה ולשמור שורות תאים. אמנם שיטה זו פותחה בתחילה לשמש במחקרי כאב נוירופתי, זה יכול לשמש כדי לחקור מחלות נוירולוגיות אחרות שכוללות שינויים פתולוגיים בתוך חוט השדרה, כגון ALS ו- MS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s modification of Eagle’s media (DMEM) with 4.5 g/L glucose | Lonza | 12-709F | The cDMEM media is a standard, widely used culture media. Individual researchers can decide where to purchase the DMEM and all other components used to make cDMEM media. |
| L-Glutamine (100x) | Lonza | 17-605E | The L-glutamine is a standard, widely used component for various culture media. Individual researchers can decide where to purchase L-glutamine. |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) | Corning-Mediatech | 30-004-CI | This is a combination of penicillin, streptomycin and Amphotericin formulated to contain 10,000 units/mL penicillin G, 10 mg/mL streptomycin sulfate and 25 µg/mL amphotericin B. Individual researchers can decide where to purchase individual components. |
| 2-mercaptoethanol (2-ME) | Sigma-Aldrich | M3148 | A BioReagent, suitable for cell culture, molecular biology and electrophoresis. |
| Papain dissociation system | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | Individual components of this kit can be purchased separately. |
| Percoll | GE Health Care | 17-0891-01 | Percoll is sold as sterile solution. Undiluted Percoll can be re-autoclaved if needed. |
| Lab-line incubator/shaker | Barstead/Lab-line | MaxQ4000 | This is the incubator/shaker we have currently. Other types of shakers can be used instead. |
| Lipopolysaccharides, Salmonella Minnesota Re595 | Sigma-Aldrich | L-9764 | Other strains of LPS can also induce glial responses. The magnitude of the responses though, may vary. |
| Mouse IL-6 DuoSet ELISA | R&D Systems | DY406 | Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers. |
| Mouse TNF-alpha DuoSet ELISA | R&D Systems | DY410 | Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers. |
| Mouse IP-10 (CXCL10) DuoSet ELISA | R&D Systems | DY466 | Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers. |
| Mouse MCP-1 (CCL2) ELISA Opteia set | BD Biosciences | 555260 | Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers. |
| Mouse chemokine Q-Plex | Quansys Biosciences | 120251MS | This product was not available for in-house assay at the time. Instead, we sent out samples to the manufacturer for analysis. |
| APC-anti-mouse-CD45 (clone 30-F11) | eBioscience | 17-0451 | Antibody of the same clone but from other vendors can be used. |
| FITC-anti-mouse-CD11b (clone M1/70) | eBioscience | 11-0112 | Antibody of the same clone but from other vendors can be used. |
| Accuri C6 flow cytometer | BD Biosciences | BD Accuri C6 | Each individual Researcher can use any flow cytometer he or she prefers. |
| FlowJo software | Tree Star, Inc. | FlowJo7.6.5 | Each individual Researcher can use any analysis software he or she prefers. |
References
- Gaskin, D. J., Richard, P. The economic costs of pain in the United States. J Pain. 13 (8), 715-724 (2012).
- Ji, R. R., Berta, T., Nedergaard, M. Glia and pain: Is chronic pain a gliopathy? Pain. 154 (01), S10-S28 (2013).
- Ni, M., Aschner, M., et al. Neonatal rat primary icroglia: isolation, culturing and selected applications. Curr Protoc Toxicol. Maines, M. D., et al. , (2010).
- Cao, L., Fei, L., Chang, T. T., DeLeo, J. A. Induction of interleukin-1beta by interleukin-4 in lipopolysaccharide-treated mixed glial cultures: microglial-dependent effects. J Neurochem. 102 (2), 408-419 (2007).
- Malon, J. T., Maddula, S., Bell, H., Cao, L. Involvement of calcitonin gene-related peptide and CCL2 production in CD40-mediated behavioral hypersensitivity in a model of neuropathic pain. Neuron Glia Biol. 7 (2-4), 117-128 (2011).
- Blasi, E., Barluzzi, R., Bocchini, V., Mazzolla, R., Bistoni, F. Immortalization of murine microglial cells by a v-raf / v-myc carrying retrovirus. J Neuroimmunol. 27 (2), 229-237 (1990).
- Bocchini, V., et al. An immortalized cell line expresses properties of activated microglial cells. J Neurosci Res. 31 (4), 616-621 (1992).
- Alliot, F. O., Marty, M. C., Cambier, D., Pessac, B. A spontaneously immortalized mouse microglial cell line expressing CD4. Dev Brain Res. 95 (1), 140-143 (1996).
- Alliot, F. O., Pessac, B. Astrocytic cell clones derived from established cultures of 8-day postnatal mouse cerebella. Brain Res. 306 (1-2), 283-291 (1984).
- Malon, J. T., et al. Microglial content-dependent inhibitory effects of calcitonin gene-related peptide (CGRP) on murine retroviral infection of glial cells. J Neuroimmunol. 279, 64-70 (2015).
- Cao, L., DeLeo, J. A. CNS Infiltrating CD4(+) T lymphocytes Contribute to Murine Spinal Nerve Transection-Induced Neuropathic Pain. Eur J Immunol. 38 (2), 448-458 (2008).
- Mayer, A. M., et al. Effect of a short-term in vitro exposure to the marine toxin domoic acid on viability, tumor necrosis factor-alpha, matrix metalloproteinase-9 and superoxide anion release by rat neonatal microglia. BMC Pharmacol. 1, 7 (2001).
- Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).
- Rock, R. B., et al. Role of Microglia in Central Nervous System Infections. Clin Microbiol Rev. 17 (4), 942-964 (2004).
- Yang, I., Han, S. J., Kaur, G., Crane, C., Parsa, A. T. The Role of Microglia in Central Nervous System Immunity and Glioma Immunology. J Clin Neurosci. 17 (1), 6-10 (2010).
