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Neuroscience

वयस्क माउस रीढ़ की हड्डी ऊतक से प्राथमिक मिश्रित glial संस्कृति की तैयारी

doi: 10.3791/54801 Published: November 19, 2016

Summary

न्यूरोपैथिक दर्द के विकास के रीढ़ की हड्डी glial कोशिकाओं की रोग परिवर्तन शामिल है। एक विश्वसनीय glial संस्कृति प्रणाली वयस्क रीढ़ की हड्डी के ऊतकों से ली गई है और इन विट्रो में इन कोशिकाओं के अध्ययन के लिए डिज़ाइन किया गया कमी है। इसलिए, हम यहाँ वयस्क माउस रीढ़ की हड्डी के ऊतकों से प्राथमिक मिश्रित glial संस्कृतियों स्थापित करने के लिए कैसे दिखा।

Abstract

यह अच्छी तरह से स्वीकार किया गया है कि रीढ़ की हड्डी glial प्रतिक्रियाओं न्यूरोपैथिक दर्द के विकास में महत्वपूर्ण योगदान करते हैं। सेलुलर और आणविक स्तर पर glial गतिविधियों के बारे में जानकारी जबरदस्त इन विट्रो सेल संस्कृति प्रणालियों के माध्यम से प्राप्त किया गया है। इन विट्रो प्रणालियों में उपयोग किया, मुख्य रूप से प्राथमिक glia नवजात मस्तिष्क cortical ऊतकों से निकाली गई शामिल हैं और सेल लाइनों अमर। हालांकि, इन प्रणालियों विवो में रीढ़ की हड्डी glial कोशिकाओं की विशेषताओं को प्रतिबिंबित नहीं हो सकता। आदेश में आगे एक संस्कृति प्रणाली है कि बेहतर विवो हालत को दर्शाता है का उपयोग कर परिधीय तंत्रिका चोट प्रेरित न्यूरोपैथिक दर्द के विकास में रीढ़ की हड्डी glial कोशिकाओं की भूमिका की जांच करने के लिए, हमारी प्रयोगशाला से प्राथमिक रीढ़ की हड्डी मिश्रित glial संस्कृतियों की स्थापना के लिए एक विधि विकसित की है वयस्क चूहों। संक्षेप में, रीढ़ की हड्डी डोरियों वयस्क चूहों से एकत्र की है और एक भट के साथ माइलिन हटाने के बाद PAPAIN पाचन के माध्यम से कार्रवाई कर रहे हैंअल्पसंख्यक-ढाल माध्यम। एकल कक्ष निलंबन 35.9 सी पर पूरा Dulbecco संशोधित ईगल मीडिया (cDMEM) 2-मर्केप्टोइथेनाल (2-ME) के साथ पूरक में सुसंस्कृत हैं ये संस्कृति की स्थिति मिश्रित glial कोशिकाओं के विकास के लिए विशेष रूप से अनुकूलित कर रहे थे। इन शर्तों के तहत, कोशिकाओं के बीच 12 प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए तैयार कर रहे हैं - 14 डी संस्कृति की स्थापना (डी 0) के बाद (कोशिकाओं इस समय के दौरान लॉग चरण में आम तौर पर कर रहे हैं) और डी 21 अप करने के लिए संस्कृति की स्थिति में रखा जा सकता है। इस संस्कृति प्रणाली विभिन्न पदार्थों और एजेंटों के साथ उत्तेजना पर रीढ़ की हड्डी glial कोशिकाओं की प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। न्यूरोपैथिक दर्द के अलावा, इस प्रणाली अन्य बीमारियों कि रीढ़ की हड्डी glial कोशिकाओं की रोग परिवर्तन को शामिल में glial प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Introduction

पुराने दर्द एक गंभीर स्वास्थ्य समस्या को 635 $ 1 अरब की अनुमानित वार्षिक लागत के साथ, संयुक्त राज्य अमेरिका में लगभग 100 मिलियन वयस्कों को प्रभावित करता है। बढ़ते सबूत न्यूरोपैथिक दर्द, पुराने दर्द 2 के सबसे अधिक विनाशकारी प्रकार से एक के विकास में रीढ़ की हड्डी glial कोशिकाओं का एक महत्वपूर्ण योगदान संकेत दिया है। एक उचित इन विट्रो संस्कृति प्रणाली आगे सेलुलर और आणविक स्तर पर glial कोशिकाओं की भूमिका की जांच में काफी मदद मिलेगी।

वर्तमान में, इन विट्रो glial संस्कृति प्रणालियों शोधकर्ताओं द्वारा उपयोग नवजात माउस या चूहे के दिमाग के cortical ऊतकों से निकाली मुख्य रूप से glial कोशिकाओं glial सेल लाइनों नवजात माउस से निकाली गई शामिल हैं और अमर या प्राथमिक glial कोशिकाओं चूहा। नवजात कोशिकाओं, undifferentiated कोशिकाओं की बड़ी संख्या है कि आगे glial कोशिकाओं में भेदभाव किया जा सकता (मुख्य रूप से astrocytes और microglia) होते हैं, इस प्रकार एक प्रदानप्रयोगात्मक उपयोग के लिए 3 bundant कोशिकाओं। हालांकि, हमारे पिछले एक अध्ययन से पता चला है कि नवजात मस्तिष्क glial कोशिकाओं पर lipopolysaccharide (LPS) उत्तेजना वयस्क रीढ़ की हड्डी glial कोशिकाओं से काफी अलग तरह से प्रतिक्रिया व्यक्त की। उदाहरण के लिए, इंटरल्यूकिन (IL) -4 LPS प्रेरित नाइट्रिक ऑक्साइड पर निरोधात्मक प्रभाव बढ़ाया प्रदर्शित (सं) वयस्क चूहे रीढ़ की हड्डी glia में उत्पादन नवजात मस्तिष्क glia 4 की तुलना में। इसके अलावा, एक neuropeptide द्वारा उत्तेजना पर केमोकाइन उत्पादन की प्रोफाइल, कैल्सीटोनिन जीन संबंधी पेप्टाइड (CGRP), नवजात माउस मस्तिष्क glia के बीच unarguably अलग हैं (रेफरी में वर्णित विधि। 5) और वयस्क माउस रीढ़ की हड्डी glia (चित्रा 1)। स्थापित सेल लाइनों का उपयोग करने और बनाए रखने के लिए आसान कर रहे हैं और एक कम समय अवधि में कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या प्रदान कर सकते हैं। सामान्य तौर पर, अमर सेल लाइनों उत्पन्न या तो 6, 7 या निम्न वें (जैसे व्यापक रूप से इस्तेमाल microglial सेल लाइन BV2 के रूप में) एक वायरस की मध्यस्थता अमरता प्रणाली का उपयोग कर रहे हैंसहज परिवर्तन के ई पहचान 8, 9 सेल लाइनों astrocytes और microglia व्यक्तिगत रूप से की आणविक विशेषताओं का अध्ययन करने में बहुत ही अच्छे हैं (astrocyte सेल लाइन C8-D1A और microglial सेल लाइन सी 8-बी 4 के रूप में इस तरह के)। हालांकि, सेल लाइनों से प्राप्त परिणामों हमेशा प्राथमिक कोशिकाओं में या विवो परिस्थितियों में आगे सत्यापन की आवश्यकता है। यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि वहाँ एक glial सेल लाइन एक कृंतक रीढ़ की हड्डी glia से प्राप्त होता है की एक रिपोर्ट नहीं किया गया है।

न्यूरोपैथिक दर्द, एक संस्कृति प्रणाली वयस्क माउस रीढ़ की हड्डी से ली गई है कि वयस्क चूहे मिश्रित glial संस्कृतियों 4 उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल एक पूर्व-सूचना विधि आदत डाल द्वारा विकसित किया गया है, 5 के विकास में रीढ़ की हड्डी glial कोशिकाओं की भूमिका की जांच में मदद करने के लिए । माउस रीढ़ की हड्डी glial संस्कृति आगे हाल ही में 10 परिष्कृत किया गया था और इस लेख में और अधिक विस्तार से वर्णन किया गया है। एडल्ट रीढ़ की हड्डी मिश्रित glial संस्कृतियों गएक का चयन किया उपभेदों कि विशेष रूप से अध्ययन की जरूरत है फिट से एक माउस के साथ स्थापित किया जा सकता है, और कोशिकाओं घ पोस्ट संस्कृति की दीक्षा अप करने के लिए 21 के लिए संस्कृति में बनाए रखा जा सकता है। इस विधि के साथ ही विभिन्न मस्तिष्क संबंधी बीमारियों कि इस तरह के Amyotrophic पार्श्व स्केलेरोसिस (ए एल एस), मानव इम्यूनो वायरस (एचआईवी) -associated संवेदी न्यूरोपैथी, और कई के रूप में रीढ़ की हड्डी के भीतर रोग परिवर्तन, शामिल की जांच में, न्यूरोपैथिक दर्द के अध्ययन में इस्तेमाल किया जा सकता है काठिन्य (एमएस)।

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Protocol

निम्नलिखित प्रोटोकॉल संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) न्यू इंग्लैंड के विश्वविद्यालय में द्वारा अनुमोदित किया गया था। निम्नलिखित प्रोटोकॉल 4 वयस्क माउस रीढ़ की हड्डी डोरियों से glial संस्कृतियों की तैयारी के लिए है।

सड़न रोकनेवाला शर्तों के तहत एक संस्कृति हुड में समाधान की 1. तैयारी

  1. संस्कृति मीडिया तैयार: ईगल मीडिया (cDMEM) DMEM युक्त की पूरी Dulbecco के संशोधन, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 2 मिमी एल glutamine, 100 आइयू / एमएल पेनिसिलिन (4.5 छ / एल ग्लूकोज के साथ), 100 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन 250 एनजी / एमएल Amphotericin बी, और 50 माइक्रोन के 2-मर्केप्टोइथेनाल (2-ME; 1.1.1 देखें)। मिक्स और अन्य सभी घटकों बाँझ फिल्टर और फिर FBS जोड़ें। 4 सी पर संस्कृति मीडिया की दुकान
    1. 50 मिमी 2-एमई / फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) शेयर समाधान तैयार: के 100 μL जोड़ने केंद्रित 2-ME (14.3 एम) 1x पीबीएस के 28.6 एमएल, और फिल्टर बाँझ (समाधान के लिए 4 सी पर संग्रहित किया जा सकता है में कई महीने)। यूसंस्कृति मीडिया के हर 1000 मिलीलीटर के लिए 2-ME शेयर समाधान के एसई 1 एमएल।
  2. घनत्व ढाल मीडिया की तैयारी
    1. एक शेयर isotonic घनत्व ढाल मीडिया समाधान तैयार है (उदाहरण के लिए, 100% Percoll) 1 हिस्सा 10x नियमित बाँझ पीबीएस और 9 भागों बाँझ शेयर घनत्व ढाल मीडिया (जैसे, Percoll) से।
    2. 100% घनत्व ढाल नियमित 1x बाँझ पीबीएस के साथ (1.2.1 में किए गए) मीडिया पतला एक 20% घनत्व ढाल मीडिया (जैसे, 1x पीबीएस के 40 एमएल के साथ 100% घनत्व ढाल मीडिया के 10 एमएल) बनाने के लिए और 4 पर दुकान सी सेल संस्कृति तैयार करने से पहले कमरे के तापमान (आरटी) को 20% घनत्व ढाल मीडिया लाओ।
  3. Papain हदबंदी सिस्टम से समाधान की तैयारी
    नोट: papain हदबंदी प्रणाली सामग्री तालिका में पहचाना जा सकता है। (घर में इकट्ठे उन सहित) अन्य समान हदबंदी किट का भी इस्तेमाल किया जा सकता है। सभी घटकएनटीएस बाँझ होना चाहिए।
    1. अर्ल बैलेंस्ड नमक समाधान (EBSS) के 32 एमएल ovomucoid अवरोध मिश्रण (पाउडर) में जोड़े।
    2. EBSS के 5 एमएल एक papain शीशी (पाउडर) में जोड़े। एक 37 सी नहाने के पानी में papain शीशी 10 मिनट के लिए या जब तक papain भंग कर रहा है रखें।
    3. EBSS के 500 μL एक DNase शीशी (पाउडर) में जोड़े। धीरे मिलाएं।
    4. DNase समाधान (ऊपर) papain शीशी के 250 μL जोड़ें।
    5. ऊपर papain / DNase मिश्रण की जरूरत है (प्रति माउस रीढ़ की हड्डी papain / DNase मिश्रण के लगभग 800 μL) की कुल राशि की गणना और ऊतक पाचन (3.2 कदम) के लिए एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में जरूरत मिश्रण हस्तांतरण। कम से कम दो सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मूल शीशी में बचे हुए स्टोर।
    6. जब तक की जरूरत बर्फ पर किट से सभी घटकों रखें।
  4. तैयार रीढ़ की हड्डी संग्रह ट्यूबों: 5 हांक संतुलित नमक समाधान (HBSS के एमएल के साथ एक बाँझ 15 मिलीलीटर ट्यूब; papain हदबंदी सिस्टम से,0; 1x पीबीएस के साथ रीढ़ की हड्डी डोरियों) और एक बाँझ 15 मिलीलीटर ट्यूब इकट्ठा करने के लिए (5 एमएल सिरिंज को भरने के लिए, 2.4 कदम देखें)। इसके अलावा, HBSS के 5 एमएल के साथ एक बाँझ पेट्री डिश (35 मिमी या 60 मिमी) तैयार करने और संस्कृति हुड में इसे रख लो।

2. स्पाइनल कॉर्ड संग्रह

नोट: सभी उपकरण बाँझ होना चाहिए। IACUC द्वारा अनुमोदित एक निर्धारित क्षेत्र में संग्रह का प्रदर्शन।

  1. प्राप्त कटाई माउस रीढ़ की हड्डी डोरियों के लिए निम्नलिखित उपकरण: सीधे तीव्र / कुंद 18 सेमी शल्य कैंची, एक 12 सेमी मानक छुरी (# 3 ठोस), कार्बन स्टील बाँझ स्केलपेल ब्लेड # 10, एक छोटा सा जानवर decapitator, 12 सेमी मानक घुमावदार संदंश, और एक बाँझ 20G सुई एक 5 एमएल सिरिंज से जुड़ी।
  2. सीओ 2 के साथ पशु euthanize और माउस के सिर और 70% इथेनॉल (EtOH) के साथ वापस क्षेत्र कीटाणुरहित।
  3. decapitator के साथ पशु सिर काटना। पेशी परत बेनकाब करने के लिए पीठ के निचले हिस्से पर एक मध्यम अनुदैर्ध्य चीरा। बनानाहिप स्तर पर कशेरुकी कॉलम के माध्यम से एक साफ transection बाँझ सीधे शल्य कैंची (18 सेमी) के साथ (भी मांसपेशियों की परत है कि कशेरुकी स्तंभ शामिल किया गया है के माध्यम से काटने)।
  4. ताजा डिस्पोजेबल पोंछ के एक पत्रक पर पशु रखें। ध्यान से 20 जी सुई व्याख्यान चबूतरे वाला पक्ष की ओर स्पाइनल कॉलम में (5 एमएल बाँझ 1x पीबीएस (1.4 कदम) के साथ भरा सिरिंज से जुड़ी) डालें। नीचे कसकर पशु पकड़ो और जल्दी से सिरिंज धक्का। पूरे रीढ़ की हड्डी ग्रीवा छोर से बाहर आ जाना चाहिए। HBSS युक्त 15 मिलीलीटर ट्यूब में रीढ़ की हड्डी लीजिए।
  5. चूहों के आराम के लिए दोहराएँ कदम 2.4। प्रत्येक जानवर के बीच, 70% EtOH के साथ सभी उपकरणों का इस्तेमाल किया कीटाणुरहित।
    नोट: आमतौर पर, एक एकल 12 अच्छी तरह से थाली हर 4 माउस रीढ़ की हड्डी डोरियों (देखें 4.3) के लिए स्थापित किया जा सकता है।

3. एकल कक्ष निलंबन की तैयारी

नोट: कदम सब कुछ बाँझ रखने के लिए एक संस्कृति हुड में 3 और 4 को पूरा करें।

  1. HBSS युक्त पेट्री डिश (1.4 चरण) में सभी स्पाइनल तार स्थानांतरण। बाँझ कैंची और संदंश के साथ बहुत से ठीक, छोटे टुकड़ों में रीढ़ की हड्डी डोरियों से प्रत्येक कट। 50 एमएल शंक्वाकार तैयार papain / DNase एंजाइम मिश्रण (कदम 1.3.5) युक्त बाँझ संदंश या एक 10 एमएल पिपेट का उपयोग ट्यूब के लिए रीढ़ की हड्डी के ऊतकों स्थानांतरण (एंजाइम मिश्रण करने के लिए HBSS जोड़ने से बचने, के रूप में यह आगे तैयार कमजोर होगी एंजाइम समाधान और एंजाइम की कमी आई है प्रदर्शन में परिणाम हो सकते हैं)।
  2. ट्यूब धीरे भंवर मिश्रण करने के लिए। कक्षीय 150 rpm पर झटकों के साथ एक मशीन / प्रकार के बरतन में 1 घंटे के लिए 37 सी पर ट्यूब सेते हैं।
  3. भंवर ट्यूब फिर से और सख्ती ऊतक आगे हदबंदी को बढ़ावा देने के लिए एक 5 एमएल पिपेट का उपयोग के साथ एंजाइम समाधान triturate।
  4. सेल निलंबन आरटी पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर एक 15 मिलीलीटर ट्यूब और अपकेंद्रित्र में स्थानांतरण।
  5. centrifugation के दौरान पुनर्गठन एल्बुमिन-ovomucoid INH के 300 μL के साथ 2.7 एमएल EBSS मिश्रणibitor समाधान (1.3.1) एक बाँझ ट्यूब में। DNase समाधान (कदम 1.3.3) के 150 μL जोड़ें।
  6. Centrifugation के बाद, तैरनेवाला निकालें और ऊपर तैयार (3.5 कदम) के समाधान के साथ सेल गोली resuspend। भंवर में अच्छी तरह से सेल गोली तोड़ने के लिए।
  7. सेल निलंबन के लिए पुनर्गठित एल्बुमिन-ovomucoid अवरोध समाधान (कदम 1.4.1) के 3 मिलीलीटर जोड़ें। आरटी पर 6 मिनट के लिए 70 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं। सतह पर तैरनेवाला (जो झिल्ली टुकड़े शामिल हैं) निकालें।

एकल कक्ष निलंबन से माइलिन का 4. आगे हटाने

  1. 20% घनत्व ढाल मीडिया (कदम 1.2.2 में तैयार) के 8 एमएल सेल गोली युक्त ट्यूब में धीरे गोली बाधित करने के लिए 800 XG पर 30 मिनट के लिए आरटी पर ब्रेक लगाना बिना जोड़े, भंवर, और सेंट्रीफ्यूज कोशिकाओं। ध्यान से मलबे (ज्यादातर माइलिन) और सतह पर तैरनेवाला के ऊपर परत को हटाने, लेकिन गोली रखने के लिए।
  2. घनत्व ढाल के अवशेष निकालने के लिए, resuspendi द्वारा कोशिकाओं को धोनेएक पतला cDMEM के 8 एमएल (1 हिस्सा cDMEM और 2 भागों HBSS) के साथ सेल गोली एनजी। 4 सी पर 10 मिनट के लिए 400 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र तैरनेवाला निकालें और एक ही तरीके से पतला cDMEM (ऊपर) के साथ फिर से कोशिकाओं को धो लें। उन्हें बोने जब तक बर्फ पर कोशिकाओं रखें।
  3. तैरनेवाला निकालें और संस्कृति मीडिया में सेल गोली resuspend (cDMEM के साथ आपूर्ति की 2-ME (1.1 चरण में तैयार))। एक 12 अच्छी तरह से थाली के लिए, 3 एमएल एक्स 4 (इस्तेमाल चूहों की संख्या) + 2 एमएल = 14 एमएल मीडिया का उपयोग करें। इससे यह सुनिश्चित होगा पूरी थाली के लिए पर्याप्त सेल निलंबन (12 कुओं) है कि वहाँ और अतिरिक्त कुओं कि अच्छी तरह से प्रति औसत सेल नंबर और संस्कृति के microglial सामग्री का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के लिए प्रदान करेगा। संस्कृति वाहिकाओं के अन्य प्रकार के लिए इस्तेमाल किया जाएगा, तो कृपया आवश्यक संस्कृति मीडिया की कुल मात्रा आनुपातिक गणना।
  4. सेल निलंबन के 1 एमएल एक 12 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में जोड़ें।
  5. 5% सीओ 2 के साथ 35.9 सी में कोशिकाओं को सेते हैं।
  6. नोट: 1 दिन, संस्कृति रीढ़ की हड्डी के ऊतकों से छाछ माइलिन के कारण मलबे की काफी मात्रा में हो सकती है; इस प्रकार, 1 दिन पर मीडिया को बदलने की सिफारिश की है (अधिक जानकारी के लिए चर्चा देखें)। संस्कृतियों 12 डी के बीच इलाज के लिए तैयार हैं - 14. कोशिकाओं को आमतौर पर डी 12 में 80% मिला हुआ हैं और डी 14. आमतौर से 100% मिला हुआ पास हो सकता है, डी 12 पर, वहाँ अच्छी तरह से प्रति 100,000 के बारे में कोशिकाओं को एक 12 अच्छी तरह से थाली में हैं ।

चित्रा 4
चित्रा 2:। मिश्रित glia संस्कृति की स्थापना के बाद अलग अलग समय पर मिश्रित glial कोशिकाओं की छवियों प्रतिनिधि प्राथमिक रीढ़ की हड्डी मिश्रित glia वयस्क C57BL / 6 चूहों से तैयार किए गए थे। प्रतिनिधि छवियाँचढ़ाना के बाद glial संस्कृति की प्रगति दिखाने के लिए। 1 दिन में, कुछ कोशिकाओं संस्कृति की थाली से जुड़े होते हैं, लेकिन वे अभी भी ज्यादातर गोल कर रहे हैं। इसमें भी कई अस्थायी कोशिकाओं और महत्वपूर्ण मलबे कर रहे हैं। 4 दिन में, कोशिकाओं के बहुमत संस्कृति की थाली से जुड़े होते हैं। प्रकोष्ठों दिखाई प्रक्रियाओं के साथ डालियां फैला हुआ दिखाई देते हैं। प्रकोष्ठों कई मायनों वितरित कर रहे हैं और संस्कृतियों के इस समय के बारे में 20-30% मिला हुआ हैं। 8 दिन, संस्कृतियों 50-60% मिला हुआ के बीच हैं। संस्कृतियों के कुछ क्षेत्रों कोशिकाओं के बड़े पैच है। संस्कृतियों के अन्य क्षेत्रों में कोशिकाओं की विरल विकास किया है। पैच के भीतर कुछ कोशिकाओं को एक "वर्ग की तरह" उपस्थिति पर ले लो। 12 दिन में, संस्कृतियों में या (छवि यहाँ दिखाया गया है के बारे में 90% मिला हुआ) के ऊपर 80% मिला हुआ हैं। सेल इस समय विकास की लॉग चरण में और दिनों के बीच 12-14 प्रयोगों के लिए glia कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए इष्टतम समय है। एक देखने के लिए यहाँ क्लिक करेंयह आंकड़ा का बड़ा संस्करण।

  1. (4.3 चरण) मानक प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) धुंधला प्रोटोकॉल के माध्यम से 11 अतिरिक्त कुओं से कोशिकाओं का उपयोग विरोधी माउस CD45 और विरोधी माउस CD11b मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के संयोजन का उपयोग कर microglial सामग्री का परीक्षण करें। CD45 + CD11b + कोशिकाओं microglia के रूप में पहचाने जाते हैं।

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Representative Results

इस विधि दोनों चूहों और चूहों से मिश्रित glial कोशिकाओं को तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। D 12 संस्कृति के पद-दीक्षा पर एक 12 अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से प्रति औसत कुल सेल नंबर प्रति अच्छी तरह से चारों ओर 100,000 कोशिकाओं के साथ अपेक्षाकृत स्थिर होना चाहिए, जब कोशिकाओं माउस रीढ़ की हड्डी डोरियों से निकाली गई है। इस विधि से प्राप्त glial कोशिकाओं प्रयोगों है कि पदार्थ और ब्याज के एजेंट के प्रशासन पर वयस्क रीढ़ की हड्डी glial प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए तैयार कर रहे हैं में इस्तेमाल किया जा सकता है। चित्रा 3 एक ठेठ प्रयोग से साइटोकाइन और केमोकाइन प्रतिक्रियाओं का एक उदाहरण प्रदान करता है जो वयस्क रीढ़ की हड्डी microglia में वयस्क BALB / ग चूहों से प्राप्त और LPS (साल्मोनेला मिनेसोटा Re595) डी 13 संस्कृति के पद-दीक्षा के साथ इलाज किया गया। Supernatants एकत्र किए गए थे वाणिज्यिक availab का उपयोग कर एक एंजाइम से जुड़ी immunosorbent परख (एलिसा) के माध्यम से साइटोकाइन और केमोकाइन स्तरों के निर्धारण के लिए 24 घंटे के बाद LPS उपचारLe किट।

जब इस वयस्क glial संस्कृति प्रणाली पहले स्थापित किया गया था, कोशिकाओं को 37 सी पर एक मानक संस्कृति वातावरण में incubated रहे थे 10% - इस शर्त के तहत औसतन microglial सामग्री 5 से लेकर। हालांकि, यह देखा गया है कि लगातार संस्कृति तकनीक के उपयोग के बावजूद, संस्कृतियों होगा कुछ मामलों में या तो बहुत कम microglial सामग्री (<2%) या अपेक्षाकृत उच्च microglial सामग्री (15 - 20%) 10। यह संस्कृतियों बहुत कुछ microglia है कि जब प्रयोगात्मक परिणाम मिश्रित संस्कृति के भीतर microglial प्रतिक्रियाओं पर निर्भर प्राप्त करने के लिए निराशा हो सकती है। डॉ एलेजांद्रो एमएस मेयर (फार्माकोलॉजी विभाग, Osteopathic चिकित्सा के शिकागो कॉलेज) 12 के सुझाव के बाद, विधि 35.9 सी पर मिश्रित glial कोशिकाओं बढ़ रही द्वारा संशोधित किया गया था यह एक अधिक सुसंगत और उच्च microglial उपज के परिणामस्वरूप (10 के बीच लेकर - 40% और ज्यादातर की गिरफ्तारी शेषound 20%) संस्कृतियों के बहुमत के भीतर। इस सुधार चित्रा 4 में सचित्र है जैसा कि पहले बताया, microglia 5 को बनाने के लिए अनुमान है। - वयस्क चूहों 13-15 में सीएनएस glial आबादी का 21%। हालांकि दोनों संस्कृति की स्थिति संस्कृतियों है कि microglia की समान मात्रा में होते हैं के रूप में विवो में अनुमानित प्रदान करते हैं संशोधित संस्कृति हालत (35.9 सी) प्रयोगों जिसमें यह दोनों astrocytes और microglia से प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है के लिए अधिक उपयुक्त है।

आकृति 1
चित्रा 1:। कैल्सीटोनिन जीन संबंधी पेप्टाइड (CGRP) मिश्रित glial कोशिकाओं द्वारा उत्पाद जानकारी उत्पादन प्रेरित नवजात BALB / ग माउस दिमाग (बाएं) या वयस्क BALB / ग माउस रीढ़ की हड्डी डोरियों से तैयार मिश्रित glial कोशिकाओं (दाएं) विभिन्न खुराक के साथ इलाज किया गया CGRP की। संस्कृति supernatants में कई chemokines के स्तर इष्टतम समय पर मल्टीप्लेक्स परख (निर्माता द्वारा किया जाता) के माध्यम से निर्धारित किया गया है (मतलब ± SEM, एन = 2 - 6)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 3: माउस एडल्ट स्पाइनल कॉर्ड पर Glia मिश्रित साइटोकाइन और उत्पाद जानकारी जवाब LPS उत्तेजना एडल्ट रीढ़ की हड्डी मिश्रित glial कोशिकाओं BALB / ग चूहों से तैयार किया है और एलपीएस के विभिन्न खुराक साथ प्रेरित किया गया।। आईएल -6 (ए), ट्यूमर परिगलन कारक (TNF) -alpha (बी), इंटरफेरॉन गामा-inducible प्रोटीन 10 (आईपी-10, भी CXCL10 के रूप में जाना) (सी), और monocyte chemoattractant प्रोटीन 1 के स्तर (MCP- 1, भी CCL2 के रूप में जाना जाता है) संस्कृति supernatants में (डी) 24 घंटे के बाद LPS उपचार पर ELISAs के माध्यम से निर्धारित किया गया है।ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54801/54801fig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 4:। एडल्ट मिश्रित glial संस्कृतियों में microglial सामग्री मिश्रित glial कोशिकाओं वयस्क C57B6 / एल चूहों से उत्पन्न होता है और या तो 37 सी या 35.9 सी पर सुसंस्कृत थे प्रत्येक संस्कृति से microglial सामग्री एपीसी-विरोधी माउस CD45 (क्लोन 30-F11) और FITC-विरोधी माउस CD11b (क्लोन एम 1/70) का उपयोग प्रवाह cytometry के माध्यम से विश्लेषण किया गया था। प्रवाह cytometric विश्लेषण से प्रतिनिधि भूखंडों दिखाए जाते हैं। संस्कृतियों से कुल सेल आबादी भूखंडों एक (37 सी) और सी (35.9 सी), और microglial आबादी में पहचान की गई है (CD45 + CD11b + कोशिकाओं) आगे बी में संबंधित कुल सेल आबादी से अलग थे (37 सी) और डी (35.9 सी)। प्रवाह cytometric विश्लेषण प्रदर्शन किया गया था, और के रूप में पहले से वर्णित 5 में सभी डेटा का विश्लेषण किया गया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

ये सभी कदम-सहित मीडिया आदेश प्रयोगों के बीच प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए तय समय में बदलने के लिए एक सुसंगत तरीके से प्रदर्शन करने के लिए महत्वपूर्ण है। निम्नलिखित कदम विशेष रूप से उत्कृष्ट गुणवत्ता वयस्क मिश्रित glia प्राप्त करने में महत्वपूर्ण हैं।

enzymatic पाचन इस प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण पहलू है। यह महत्वपूर्ण है कि ऊतक के टुकड़े के लिए एक एकल कक्ष निलंबन प्राप्त करने के लिए अच्छी तरह से पच जाता है। हालांकि, पर पाचन काफी कम कोशिकाओं में परिणाम होगा। औसत ऊतक राशि हर बार इस्तेमाल प्रत्येक प्रयोगशाला ऊष्मायन के लिए इस्तेमाल किया शीशियों के प्रकार के आधार पर सटीक पाचन समय निर्धारित करने के लिए पायलट परीक्षण करने की जरूरत है, और शेखर के प्रकार (कक्षीय प्रकार के बरतन बनाम घूर्णन)। इसके अलावा, papain हदबंदी प्रणाली चुना की परवाह किए बिना, यह लगातार एक ही स्रोत से एक ही घटकों का उपयोग करने के लिए आवश्यक है, के रूप में घटकों के कभार प्रतिस्थापन उपज में महत्वपूर्ण बदलाव करने के लिए ले जा सकता हैकोशिकाओं की कुल संख्या की।

इस प्रोटोकॉल में, माइलिन एक घनत्व ढाल माध्यम का उपयोग कर निकाल दिया जाता है। बनाने के लिए और के बाद से इन समाधान के घनत्व के तापमान के प्रति संवेदनशील हैं आरटी पर घनत्व ढाल समाधान का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है। घनत्व ढाल समाधान आमतौर पर 4 सी में जमा हो जाती है यदि आवश्यक हो, घनत्व ढाल समाधान रातोंरात संस्कृति की स्थापना के दिन से पहले आरटी पर रखा जा सकता है। इसके अलावा, 20% घनत्व ढाल में कोशिकाओं के 30 मिनट centrifugation के बाद, कोशिकाओं तुरंत सेंट्रीफ्यूज से स्थानांतरण से मलबे के बड़े टुकड़े को रोकने के लिए हटा दिया जाना चाहिए (यानी, समाधान के ऊपर से दूर जा रहा है, 4.1 कदम देखें)।

यह संस्कृति के डी 1 पद दीक्षा पर मलबे को हटाने के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि कोशिकाओं को जीवित और पैदा करता है, तो संस्कृति मीडिया हर 3 से 4 घ बदल गया है, डी 1 पर मीडिया को बदलने पर बाद में एक अधिक "मौन" और "स्वच्छ" संस्कृति प्रदान करेगा। इसकोशिकाओं को एक कम परेशान वातावरण में विकसित करने के लिए अनुमति देता है, और कोशिकाओं संस्कृति के 21 घ पद-दीक्षा तक रखा जा सकता है।

एक प्रयोग के लिए microglial सामग्री मिश्रित glia उपयोग करने से पहले जांच की जा सकती है। यहां तक ​​कि सबसे सुसंगत तकनीक के साथ, microglial सामग्री अभी भी प्रयोगों के बीच काफी भिन्न हो सकते हैं। कुछ सेलुलर प्रभाव microglial सामग्री 4, 10 पर निर्भर कर रहे हैं; इस प्रकार, यह स्थापित संस्कृतियों के प्रत्येक सेट के microglial सामग्री की निगरानी करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस अभ्यास से प्राप्त आंकड़ों के प्रयोगों के बीच बदलाव की व्याख्या करने के लिए, साथ ही (कभी कभी अप्रत्याशित) एक विशेष प्रयोगात्मक शर्त के तहत microglia बनाम astrocytes के योगदान के बारे में ज्ञान उपन्यास उपलब्ध कराने में मदद कर सकते हैं। इसके अलावा, microglial सामग्री पर मौसमी बदलाव देखा गया है। यह एक अतिरिक्त कारक है जब प्रयोगों के बड़े सेट की योजना पर विचार करने के लिए हो सकता है। इसके अलावा, न्यूरॉन्स आमतौर पर हमारी संस्कृति शर्त के तहत जीवित नहीं रह जाएगा, जबकि,के रूप में NeuN (एक neuronal- मार्कर) पॉजिटिव कोशिकाओं immunohistochemical धुंधला के बाद हमारे glial संस्कृतियों में मनाया नहीं किया गया है, संस्कृति oligodendrocytes की सीमित संख्या को नियंत्रित कर सकते हैं (यह नियमित रूप से नहीं मात्रा निर्धारित किया गया है)। एक फैसला करना चाहिए इस आबादी विशिष्ट प्रयोगात्मक शर्तों के आधार पर जांच की जरूरत है।

कई प्रयोगात्मक विधियों के साथ के रूप में, इस विधि व्यक्तिगत शोधकर्ताओं की जरूरतों के हिसाब से संशोधित किया जा सकता है। यह पूरी तरह से उन्हें नियमित तौर पर उपयोग करने से पहले विशिष्ट संशोधन परीक्षण करने के लिए पायलट प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक है। इसके अलावा, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि मिश्रित glia, जैसा कि पहले नवजात मिश्रित glial कोशिकाओं 3 के लिए वर्णित microglia समाप्त और microglia समृद्ध संस्कृतियों प्राप्त करने के लिए astrocyte प्रमुख बनाम विशिष्ट stimulations के बाद microglia प्रमुख कोशिकाओं की प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, 4। हालांकि, microglia समृद्ध कोशिकाओं की उपज है जब तक कि रीढ़ की हड्डी की बड़ी संख्या को सीमित किया जाएगाडोरियों शुरुआत में संस्कृति की स्थापना के लिए उपयोग किया जाता है। यह इस पद्धति की एक सीमा है, खासकर अगर चूहों का इस्तेमाल किया जाता है। जब चूहे रीढ़ की हड्डी डोरियों उपयोग किया जाता है, (4 माउस रीढ़ की हड्डी डोरियों के बजाय) एक व्यक्ति रीढ़ की हड्डी एक 12 अच्छी तरह से थाली स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। । अंत में, microglial सामग्री माउस और चूहे वयस्क रीढ़ की हड्डी glial संस्कृतियों के बीच काफी अलग 4, 5 दोनों माउस और चूहे वयस्क रीढ़ की हड्डी glial संस्कृतियों साइटोकाइन उत्पादन के मामले में LPS उत्तेजना के लिए एक मजबूत प्रतिक्रिया का उत्पादन होना प्रकट नहीं करता है; हालांकि, अंतर प्रतिक्रियाओं जब वैकल्पिक उत्तेजनाओं इस्तेमाल कर रहे हैं मनाया जा सकता है।

कुल मिलाकर, इस कृंतक वयस्क glial संस्कृति प्रणाली इन विट्रो में glial कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए एक वैकल्पिक तरीका प्रदान करता है। इस संस्कृति प्रणाली को और अधिक बारीकी से प्राप्त परिणामों को प्रतिबिंबित क्या नवजात संस्कृतियों या सेल लाइनों से प्राप्त परिणामों की तुलना में इन विवो की शर्तों के तहत मनाया जाएगा। वर्तमान विधि में, glial कोशिकाओं ग रहे हैंवयस्क कृन्तकों से ollected, के रूप में वयस्क glia प्रतिक्रिया बहुत अलग ढंग से उत्तेजनाओं को जब नवजात glia 4 (चित्रा 1) की तुलना में। कोशिकाओं अमरता प्रक्रिया है, जो पैदा करते हैं और सेल लाइनों को बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा के माध्यम से काफी चालाकी से नहीं कर रहे हैं। हालांकि इस पद्धति शुरू में न्यूरोपैथिक दर्द के अध्ययन में इस्तेमाल किया जा करने के लिए विकसित किया गया था, यह अन्य मस्तिष्क संबंधी बीमारियों कि इस तरह के ए एल एस और एमएस के रूप में रीढ़ की हड्डी के भीतर रोग परिवर्तन को शामिल अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s modification of Eagle’s media (DMEM) with 4.5 g/L glucose Lonza 12-709F The cDMEM media is a standard, widely used culture media. Individual researchers can decide where to purchase the DMEM and all other components used to make cDMEM media.
L-Glutamine (100x) Lonza 17-605E The L-glutamine is a standard, widely used component for various culture media. Individual researchers can decide where to purchase L-glutamine.
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) Corning-Mediatech 30-004-CI This is a combination of penicillin, streptomycin and Amphotericin formulated to contain 10,000 units/mL penicillin G, 10 mg/mL streptomycin sulfate and 25 µg/mL amphotericin B. Individual researchers can decide where to purchase individual components.
2-mercaptoethanol (2-ME) Sigma-Aldrich M3148 A BioReagent, suitable for cell culture, molecular biology and electrophoresis.
Papain dissociation system Worthington Biochemical Corporation LK003150 Individual components of this kit can be purchased separately. 
Percoll GE Health Care 17-0891-01 Percoll is sold as sterile solution. Undiluted Percoll can be re-autoclaved if needed.
Lab-line incubator/shaker  Barstead/Lab-line MaxQ4000  This is the incubator/shaker we have currently. Other types of shakers can be used instead.
Lipopolysaccharides, Salmonella Minnesota Re595 Sigma-Aldrich L-9764 Other strains of LPS can also induce glial responses. The magnitude of the responses though, may vary.
Mouse IL-6 DuoSet ELISA  R&D Systems DY406 Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.
Mouse TNF-alpha DuoSet ELISA R&D Systems DY410 Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.
Mouse IP-10 (CXCL10) DuoSet ELISA R&D Systems DY466 Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.
Mouse MCP-1 (CCL2) ELISA Opteia set BD Biosciences 555260 Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.
Mouse chemokine Q-Plex Quansys Biosciences 120251MS This product was not available for in-house assay at the time. Instead, we sent out samples to the manufacturer for analysis.
APC-anti-mouse-CD45 (clone 30-F11) eBioscience 17-0451 Antibody of the same clone but from other vendors can be used.
FITC-anti-mouse-CD11b (clone M1/70) eBioscience 11-0112 Antibody of the same clone but from other vendors can be used.
Accuri C6 flow cytometer BD Biosciences BD Accuri C6  Each individual Researcher can use any flow cytometer he or she prefers.
FlowJo software Tree Star, Inc. FlowJo7.6.5 Each individual Researcher can use any analysis software he or she prefers.

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References

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वयस्क माउस रीढ़ की हड्डी ऊतक से प्राथमिक मिश्रित glial संस्कृति की तैयारी
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Malon, J. T., Cao, L. Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue. J. Vis. Exp. (117), e54801, doi:10.3791/54801 (2016).More

Malon, J. T., Cao, L. Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue. J. Vis. Exp. (117), e54801, doi:10.3791/54801 (2016).

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