Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Получение первичных смешанных глиальных культур от взрослых спинного мозга мыши ткани

doi: 10.3791/54801 Published: November 19, 2016

Summary

Развитие невропатической боли включает в себя патологические изменения спинного мозга глиальных клеток. Надежная система глиальных культуры происходит от взрослой ткани спинного мозга и предназначен для изучения этих клеток в пробирке отсутствует. Таким образом, мы покажем здесь, как установить первичные смешанные глиальные культуры от взрослых мышей ткани спинного мозга.

Abstract

Он общепризнан, что спинного мозга глиальные ответы вносят значительный вклад в развитие нейропатической боли. Потрясающая информация о глиальных деятельности на клеточном и молекулярном уровнях было получено с помощью лабораторных систем культивирования клеток в. Системы ин витро , используемые, в основном , включают в себя первичный глии , полученный из головного мозга новорожденных кортикальной ткани и линии иммортализованных клеток. Однако эти системы не могут отражать характеристики спинного мозга глиальных клеток в естественных условиях. Для дальнейшего изучения роли спинного мозга глиальных клеток в развитии периферических нервов травмы , вызванной невропатической боли с использованием системы культуры , которая лучше отражает состояние в естественных условиях, наша лаборатория разработала метод для установления первичного спинного мозга смешанных глиальных культур от взрослых мышей. Вкратце, спинной мозг собраны от взрослых мышей и обрабатываются через папаином с последующим удалением миелина с притонов черезность-градиентной среды. Одноклеточных суспензий культивируют в модифицированной Eagle средах полном Дульбекко (cDMEM) с добавлением 2-меркаптоэтанол (2-ME) при 35,9 о С. Эти условия культивирования были оптимизированы специально для роста смешанных глиальных клеток. В этих условиях, клетки готовы к использованию для проведения экспериментов между 12 - 14 г (клетки, как правило, находятся в лог-фазе в течение этого времени) после установления культуры (D 0) и может быть сохранена в условиях культивирования до D 21. Эта система культуры можно использовать для исследования реакции спинного мозга глиальных клеток при стимуляции различными веществами и агентами. К тому же невропатической боли, эта система может быть использована для изучения ответов глиальные при других заболеваниях, которые включают патологические изменения спинного мозга глиальных клеток.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Хроническая боль является серьезной проблемой здравоохранения , которая затрагивает около 100 миллионов взрослых в Соединенных Штатах, с предполагаемой годовой стоимостью до $ 635 миллиардов 1. Монтажные доказательства показали значительный вклад спинного мозга глиальных клеток в развитии нейропатической боли, одной из самых разрушительных видов хронической боли 2. Надлежащая в пробирке системы культуры значительно помочь в дальнейшем исследовании роли глиальных клеток на клеточном и молекулярном уровнях.

В настоящее время экстракорпорального системы культуры глиальные в используемых исследователями в основном включают глиальные клетки , полученные из тканей коры головного мозга у новорожденных мыши или крысы мозга и увековечил глиальные клеточные линии , полученные из неонатальной мыши или крысы первичных клеток глии. Неонатальные клетки содержат значительное количество недифференцированных клеток, которые могут быть дополнительно дифференцировались в глиальные клетки (преимущественно астроциты и микроглии), обеспечивая тем самымbundant клетки для экспериментального использования 3. Тем не менее, наше предыдущее исследование показало, что неонатального мозга глиальные клетки отреагировали значительно отличается от взрослого спинного мозга глиальных клеток при липополисахарида (LPS) стимуляции. Например, интерлейкин (IL) -4 отображается усиление ингибирующего эффекта на ЛПС-индуцированную оксида азота (NO) , производство в взрослых крыс спинного мозга нейроглии по сравнению с неонатальной глии мозга 4. Кроме того, профили производства хемокинов при стимуляции нейропептида, кальцитонин ген-родственный пептид (CGRP), являются неоспоримо отличаются между неонатальной мыши глии мозга (методами , описанными в работе. 5) , а также для взрослых спинного мозга мыши глии (Рисунок 1). Признанные клеточные линии просты в использовании и обслуживании, и может обеспечить большое количество клеток в течение короткого периода времени. В общем, иммортализованные клеточные линии генерируются либо с помощью вирусов-опосредованной системы иммортализации (например, широко используемой линии клеток микроглии BV2) 6, 7 или после гое определение спонтанной трансформации (например, астроциты клеточной линии C8-D1A и микроглии клетки линии C8-B4) 8, 9 Клеточные линии превосходны в изучении молекулярных характеристик астроцитов и микроглии в отдельности.; Тем не менее, результаты , полученные из клеточных линий всегда требует дальнейшей проверки в первичных клетках или в условиях in vivo на . Следует также отметить, что не было отчета о глиальной клеточной линии, который является производным от грызуна спинного мозга глии.

Чтобы помочь исследовать роль спинного мозга глиальных клеток в развитии нейропатической боли, системы культуры , который является производным от взрослого спинного мозга мыши была разработана путем адаптации ранее сообщенному метод , используемый для генерации взрослых крыс смешанных глиальных культур 4, 5 . мышь спинного мозга глиальные культуры дополнительно рафинированные в последнее время 10 и описан более подробно в этой статье. Взрослые спинного мозга смешивают глиальные культуры сбыть установлена ​​с помощью мыши из отобранных штаммов, которые соответствуют потребностям конкретного исследования, и клетки могут поддерживаться в культуре до 21 d размещать начало культуры. Этот метод может быть использован при невропатической боли исследований, а также при исследовании различных неврологических заболеваний, которые вовлекают патологические изменения в спинном мозге, таких как боковой амиотрофический склероз (ALS), вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) -associated сенсорной невропатии, а также несколько склероз (РС).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Следующий протокол был одобрен животных по уходу и использованию комитета (Institutional IACUC) в Университете Новой Англии. Следующий протокол для подготовки глиальных культур от 4 взрослых мышей спинного мозга.

1. Приготовление растворов в культуре Гуда в асептических условиях

  1. Подготовка среды для культивирования: модификация полном Дульбекко медиа Игла (cDMEM), содержащий DMEM (с 4,5 г / л глюкозы), 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС), 2 мМ L-глутамина, 100 МЕ / мл пенициллина, 100 мг / мл стрептомицина , 250 нг / мл амфотерицина и 50 мкМ 2-меркаптоэтанола (2-ME; см 1.1.1). Смешайте и фильтр стерилизовать все другие компоненты, а затем добавить FBS. Храните питательные среды при температуре 4 о С.
    1. Готовят 50 мМ 2-МЕ / фосфатно-солевой буфер (PBS) маточного раствора: 100 мкл концентрированного 2-МЕ (14,3 М) в 28,6 мл 1x PBS и фильтр стерилизуют (раствор можно хранить при температуре 4 ° С в течение несколько месяцев). UС. Е. 1 мл 2-МЕ маточного раствора на 1000 мл культуральной среды.
  2. Подготовка градиента плотности сред
    1. Готовят изотонический раствор градиента плотности материала (например, 100% Перколла) с 1 части 10x обычная стерильным PBS и 9 частей стерильной запас градиента плотности носителя (например, перколлом).
    2. Развести 100% градиент плотности среды (сделано в разделе 1.2.1) с регулярными 1x стерильной PBS , чтобы сделать 20% градиент плотности носителей (например, 10 мл 100% градиента плотности среды с 40 мл 1x PBS) и сохранить его в 4 о С. Привести 20% градиент плотности медиа до комнатной температуры (RT) перед получением клеточной культуры.
  3. Приготовление растворов из системы диссоциации папаин
    Примечание: папаин система диссоциации может быть идентифицирована в таблице материалов. Также могут быть использованы и другие подобные наборы диссоциации (в том числе и те, собранные в доме). Все componeNTS должна быть стерильной.
    1. Добавьте 32 мл Эрла сбалансированного солевого раствора (EBSS) к смеси ингибитора овомукоид (порошок).
    2. Добавляют 5 мл EBSS в одном флаконе папаина (порошок). Поместите флакон папаин в водяной бане C 37 O в течение 10 мин или до папаин растворяется.
    3. Добавьте 500 мкл EBSS в одном флаконе ДНКазы (порошок). Осторожно перемешать.
    4. Добавьте 250 мкл раствора ДНКазы (выше) во флакон папаина.
    5. Подсчитайте общую сумму выше папаин / ДНКазы смеси, необходимое (приблизительно 800 мкл папаина / ДНКазы смеси на мышь спинного мозга) и передать необходимую смесь в 50 мл трубки для переваривания ткани (этап 3.2). Хранить остаточному в оригинальном флаконе при температуре 4 ° С в течение не менее двух недель.
    6. Храните все компоненты из наборов на льду, пока не понадобится.
  4. Готовят спинальные приборке шнура: один стерильный 15 мл пробирку с 5 мл Хэнкса сбалансированный солевой раствор (HBSS; из системы папаин диссоциации,0; для сбора спинного мозга) и один стерильный 15 мл пробирку 1x PBS (для заполнения в 5 мл шприц, см шаг 2.4). Кроме того, готовят одну стерильную чашку Петри (35 мм или 60 мм) с 5 мл HBSS и держать его в капот культуре.

2. Спинной мозг Коллекция

ПРИМЕЧАНИЕ: Все оборудование должно быть стерильным. Выполните сбор в обозначенной области, утвержденной IACUC.

  1. Получить следующие инструменты для уборки мыши спинного мозга: прямые острый / тупой 18-см хирургические ножницы, 12 см стандарт скальпель (# 3 в твердом состоянии), из углеродистой стали стерильным скальпелем лезвия # 10, маленькое животное Decapitator, 12 см стандарт изогнутая пинцет, и стерильный 20G игла прилагается к шприцу 5-мл.
  2. Усыпить животное с CO 2 и дезинфицировать головку мыши и заднюю область с 70% этанола (этанол).
  3. Обезглавьте животное с Decapitator. Сделать средний продольный разрез на нижней части спины, чтобы обнажить мышечный слой. Делатьчистый рассечение через колонку позвоночных животных на уровне бедра (также проходящем через мышечный слой, который покрывает столбец позвоночное) со стерильным прямых хирургических ножниц (18 см).
  4. Поместите животное на листе свежей одноразовой салфеткой. Осторожно вставьте 20 G иглу (прилагается к 5 мл шприц, заполненный стерильным 1x PBS (шаг 1.4)) в позвоночном столбе к ростральной стороне. Держите животное вниз плотно и толкать шприц быстро. Весь спинной мозг должен выйти из цервикального конца. Собирают спинного мозга в 15 мл пробирку, содержащую HBSS.
  5. Повторите шаг 2,4 для остальных мышей. Между каждым животным, дезинфицировать все используемые инструменты с 70% этанола.
    Примечание: Как правило, одна пластина 12 также могут быть установлены на каждые 4 мыши спинного мозга (см 4.3).

3. Получение одноклеточной суспензии

Примечание: Выполните шаги 3 и 4 в капот культуре держать все стерильно.

  1. Перенесите все спинного мозга в HBSS, содержащем чашку Петри (шаг 1.4). Разрежьте каждый из спинного мозга на множество мелких, мелкие кусочки с стерильными ножницами и щипцами. Перенести ткани спинного мозга в коническую пробирку объемом 50 мл, содержащей приготовленный папаин / ферментной смеси ДНКазы (этап 1.3.5) с использованием стерильного пинцета или 10 мл пипетки (избегать добавления HBSS к ферментной смеси, так как это будет далее разбавить приготовленный раствор фермента и может привести к снижению производительности фермента).
  2. Vortex трубку осторожно перемешать. Инкубируйте пробирку при температуре 37 ° С в течение 1 ч в инкубаторе / шейкеры с круговым встряхиванием при 150 оборотах в минуту.
  3. Вихревые трубки снова и энергично растирают раствор фермента с ткани с помощью 5 мл пипетки, чтобы способствовать дальнейшему диссоциации.
  4. Передачи клеточной суспензии в пробирку объемом 15 мл и центрифугируют при 300 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
  5. Во время центрифугирования, смешать 2,7 мл EBSS 300 мкл восстановленного альбумин-овомукоид InhРешение ibitor (1.3.1) в стерильную пробирку. Добавьте 150 мкл раствора ДНКазы (этап 1.3.3).
  6. После центрифугирования, удалить супернатант и ресуспендируют осадок клеток с раствором, полученным выше (шаг 3.5). Vortex хорошо, чтобы сломать осадок клеток.
  7. Добавьте 3 мл восстановленного альбумин-овомукоид раствора ингибитора (этап 1.4.1) к клеточной суспензии. Центрифуга клетки при 70 мкг в течение 6 мин при комнатной температуре. Удалить супернатант (который содержит мембранные фрагменты).

4. Дальнейшее удаление миелина из одноклеточной суспензии

  1. Добавить 8 мл 20% -ного градиента плотности сред (полученного на стадии 1.2.2) в пробирку , содержащую осадок клеток, вихрь осторожно , чтобы разрушить осадок, и центрифуга клетки при 800 мкг в течение 30 мин при комнатной температуре без торможения. Осторожно снимите верхний слой мусора (в основном миелина) и супернатант, но сохранить осадок.
  2. Для того, чтобы удалить остатки градиента плотности, мыть клетки с помощью resuspendiнг осадок клеток с 8 мл разбавленной cDMEM (1 часть cDMEM и 2-х частей HBSS). Центрифуга клетки при 400 мкг в течение 10 мин при 4 о С. Удалить супернатант и промыть клетки снова с разбавленной cDMEM (выше) таким же образом. Держите клетки на льду до высева их.
  3. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок клеток в культуральной среде (cDMEM поставляется с 2-МЕ (полученного на стадии 1.1)). Для одного 12-луночного планшета, используйте 3 мл х 4 (число мышей использовали) + 2 мл = 14 мл среды. Это будет гарантировать, что существует достаточное количество суспензии клеток в течение всей пластины (12 лунок) и обеспечит дополнительных скважин, которые могут быть использованы для определения среднего числа клеток на лунку и микроглии содержание культуры. Если будут использоваться другие типы сосудов для культивирования, рассчитать общий объем необходимой культуральной среды пропорционально.
  4. Добавить 1 мл клеточной суспензии в каждую лунку 12-луночного планшета.
  5. Инкубируйте клетки при 35,9 ° С с 5% CO 2.
  6. Примечание: В 1-й день, культура может содержать значительное количество мусора из-за остатков миелина из ткани спинного мозга; Таким образом, изменение средств массовой информации на 1-й день рекомендуется (смотрите на обсуждение для получения дополнительной информации). Культуры готовы к лечению между D 12 - 14. Клетки обычно 80% сливающийся в D 12 и может быть около 100% сплошности от D 14. Как правило, на D 12, насчитывается около 100 000 клеток на лунку в 12-луночного планшета ,

Рисунок 4
Рис . 2: Типичные изображения смешанных глиальных клеток в разное время после создания смешанной культуры глии спинного мозга Первичные смешанные глии получали из взрослых мышей C57BL / 6. Представитель изображенияпоказать ход глиальных культуры после посева. В 1-й день, некоторые клетки прикреплены к пластине культуры, но они до сих пор в основном круглые. Есть также много плавающих клеток и значительный мусор. На 4-й день, большинство клеток прикрепляются к культуральной пластине. Клетки появляются разветвленное с видимыми процессами. Клетки спорадически и культуры около 20-30% сливающийся в это время. На 8-й день культуры находятся в пределах 50-60% сплошности. Некоторые области культуры имеют большие участки клеток. Другие области культуры имеют разреженный рост клеток. Некоторые клетки в патчах взять на себя "квадратом как" внешний вид. На 12-й день культуры находятся на уровне или выше 80% сплошности (около 90% сплошности в изображении, показанном здесь). Cell находятся в логарифмической фазе роста в это время и между днями 12-14 оптимальное время для использования глиальных клеток для экспериментов. Пожалуйста , нажмите здесь для просмотраБольшая версия этой фигуры.

  1. Изучить микроглиальную содержимое , используя клетки из дополнительных скважин (шаг 4.3) через стандартный флуоресценцией сортировка клеток (FACS) протокола окрашивания 11 с использованием комбинации анти-мыши-CD45 и анти-мышиных моноклональных антител CD11b. CD45 + CD11b + клетки идентифицируются как микроглии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Этот метод может быть использован для получения смешанных глиальные клетки от мышей и крыс. Среднее общее количество клеток на лунку в 12-луночный планшет на D 12 после начала культивирования должна быть относительно стабильной, причем около 100000 клеток на лунку, когда клетки получают из мыши спинного мозга. Глиальные клетки , полученные из этого метода могут быть использованы в экспериментах, которые предназначены для изучения взрослых спинальных ответов корд глиальные при введении веществ и агентов , представляющих интерес. На рисунке 3 приведен пример цитокина и хемокина ответов от одного типичного эксперимента , в котором взрослого спинного мозга микроглии были получены от взрослых мышей линии BALB / C и обрабатывали LPS (сальмонеллы Миннесота Re595) на D 13 после начала культивирования. Супернатанты собирали 24 ч после обработки LPS для определения цитокинов и хемокинов уровней через твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) с использованием коммерчески Доступнле комплекты.

Когда эта взрослая система глиальных культура была впервые установлена, клетки инкубировали в стандартной среде культивирования при 37 о С. При этом условии, среднее содержание микроглии варьировались от 5 - 10%. Тем не менее, было отмечено , что , несмотря на применение последовательных методов культуры, культуры были бы в некоторых случаях имеют либо очень низкое содержание микроглии (<2%) или относительно высокое содержание микроглии (15 - 20%) 10. Это может быть неприятно для получения культур, которые имеют очень мало микроглии, когда экспериментальные результаты опираются на микроглии ответов в рамках смешанной культуры. По предложению д - ра Алехандро М. С. Майер (факультет фармакологии, Чикаго Колледж остеопатической медицины) 12, метод был модифицирован путем выращивания смешанных глиальных клеток при 35,9 о С. Это привело к более последовательной и более высоким выходом микроглии (в диапазоне от 10 - 40%, а остальные в основном аркруглый вырез 20%) в большинстве культур. Это улучшение показано на рисунке 4 Как сообщалось ранее, микроглии, по оценкам, составляют 5 -. 21% от глиальных населения ЦНС у взрослых мышей 13-15. Хотя оба условия культивирования обеспечивают культуры , которые содержат одинаковое количество микроглии , как оценивается в естественных условиях, модифицированного условия культивирования (35,9 ° С) больше подходит для экспериментов , в которых чрезвычайно важно изучить ответы от обоих астроцитов и микроглии.

Рисунок 1
Рисунок 1:. Кальцитонин геном пептида (CGRP) индуцированный Хемокиновые Производство смешанными глиальных клеток Смешанные глиальные клетки , полученные из мозга новорожденных / с мыши BALB (слева) или взрослых BALB / с мыши спинного мозга (справа) обрабатывали различными дозами из CGRP. Уровни нескольких хемокинов в культуральных супернатантах определяли с помощью анализа мультиплекса ( в исполнении производителя) в оптимальные сроки (среднее значение ± SEM, п = 2 - 6). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 3: Цитокины и хемокинов Реакции мыши для взрослых спинномозговой обоего Глия при стимуляции ЛПС взрослых спинного мозга смешанные глиальные клетки получали из BALB / с мышей и стимулировали различными дозами LPS.. Уровни IL-6 (А), фактор некроза опухолей (TNF) -альфа (В), интерферон-гамма-индуцируемых белок 10 (IP-10, также известный как CXCL10) (C), и хемоаттрактант моноцитов белок 1 (MCP- 1, также известный как CCL2) (D) , в супернатантах культуры определяли с помощью ELISA , через 24 ч после обработки LPS.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54801/54801fig2large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рис . 4: микроглии Содержание в взрослых смешанных глиальных культур Смешанные глиальные клетки были получены от взрослых C57B6 L мышей / и культивировали при любом 37 ° С или 35,9 о С. Микроглии содержимое из каждой культуры анализировали с помощью проточной цитометрии с использованием APC-анти-мыши-CD45 (клон 30-F11) и FITC-анти-мыши-CD11b (клон M1 / ​​70). Типичные сюжеты из анализа проточной цитометрии показаны. Суммарные популяции клеток из культур , были идентифицированы на участках А (37 ° С) и С (35,9 ° С), и микроглии популяций (CD45 + CD11b + клетки) были дополнительно выделены из соответствующих общих клеточных популяций B (37° С) и D (35,9 ° С). Анализ проточной цитометрии проводили, и все данные были проанализированы , как описано выше 5. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Крайне важно, чтобы выполнить все шаги, в том числе в средствах массовой информации меняющейся график-последовательным образом для того, чтобы получить воспроизводимые результаты между экспериментами. Следующие шаги особенно важны в получении отличного качества для взрослых смешанных глии.

Ферментативное расщепление является важным аспектом этого протокола. Очень важно, чтобы кусочки ткани хорошо переваривается с целью получения суспензии отдельных клеток. Тем не менее, чрезмерное переваривание приведет к значительно меньше клеток. Каждая лаборатория должна выполнить пробные испытания, чтобы определить точное время пищеварения, основанный на типах флаконов, используемых для инкубации, количество средняя ткань используется каждый раз, и тип шейкера (вращающийся против орбитальный шейкер). Кроме того, независимо от системы, папаин диссоциации выбранного, необходимо последовательно использовать одни и те же компоненты, из тех же источников, а иногда замена компонентов может привести к значительным изменениям в урожайностиот общего количества клеток.

В этом протоколе миелиновой удаляется с использованием градиента плотности среды. Крайне важно, чтобы сделать и использовать градиент плотности растворов при комнатной температуре, так как плотность этих растворов чувствительны к температуре. Градиент плотности растворы обычно хранят при температуре 4 ° С. При необходимости, градиент плотности растворов можно хранить при комнатной температуре в течение ночи до дня создания культуры. Кроме того, после 30 мин центрифугирования клеток в градиенте плотности на 20%, клетки должны быть немедленно удалены из центрифуги для предотвращения больших кусков мусора от сдвига (то есть, удаляясь от верхней части раствора, см шаг 4.1).

Важно, чтобы удалить мусор на D 1 сообщение инициации культуры. Хотя клетки будут выживать и размножаться, если культура СМИ меняется каждые 3 до 4 дней, изменение средств массовой информации на D 1 обеспечит более "покоя" и "чистую" культуру позже. Этапозволяет клеткам расти в менее нарушенным среде, и клетки могут быть сохранены до 21 г после начала культивирования.

Микроглии содержание для каждого эксперимента могут быть рассмотрены перед использованием смешанного глии. Даже с самой последовательной методики, микроглии содержание все еще может значительно отличаться между экспериментами. Некоторые клеточные эффекты зависят от содержания микроглии 4, 10; Таким образом, крайне важно, чтобы контролировать микроглиальную содержание каждого набора культур, созданных. Данные, полученные от этой практики может помочь интерпретировать вариации между экспериментами, а также получение новых (иногда неожиданные) знание о вкладе астроцитов в сравнении с микроглии при определенной условиях эксперимента. Кроме того, наблюдаются сезонные вариации на микроглии содержания. Это может быть дополнительным фактором, который следует учитывать при планировании больших наборов экспериментов. Кроме того, в то время как нейроны обычно не выживают при нашем состоянии культуры,в качестве NeuN (а neuronal- маркер) -положительные клетки не наблюдается в наших глиальных культурах после иммуногистохимического окрашивания, культура может содержать ограниченное количество олигодендроцитов (это не было обычно количественно). Нужно решить, нужно ли это население быть рассмотрены в зависимости от конкретных условий эксперимента.

Как и со многими экспериментальными методами, этот метод может быть изменен в соответствии с потребностями отдельных исследователей. Необходимо выполнить пилотные эксперименты, чтобы полностью проверить конкретные изменения до начала их использования обычно. Кроме того, следует отметить , что смешанный глии может быть использован для получения микроглии обедненный и микроглии обогащенным культур для изучения реакции астроцитов-доминантной против микроглии-доминантный клеток после специфического раздражений, как описано ранее для неонатальных смешанных глиальных клеток 3, 4. Однако выход микроглии обогащенного клеток не будет ограничено , если большое число спинальнаяШнуры используются для установления культуры в начале. Это ограничение этого метода, особенно при использовании мышей. Когда спинной мозг крысы используются, один индивидуальный спинного мозга (вместо 4-х спинного мозга мыши) могут быть использованы для установки одного 12-луночного планшета. Наконец, микроглии содержание не представляется, существенно отличается от мыши и крысы взрослого спинного мозга глиальных культур 4, 5 Обе мыши и крысы взрослого спинного мозга глиальные культуры производят надежный ответ на стимуляцию ЛПС с точки зрения производства цитокина. Тем не менее, могут наблюдаться дифференциальные реакции, когда используются альтернативные стимулы.

В целом, это грызуна взрослых система глиальных культура обеспечивает альтернативный метод для изучения глиальных клеток в пробирке. Результаты , полученные из этой культуры системы более точно отражать то , что будет наблюдаться в условиях , в естественных условиях по сравнению с результатами , полученными из неонатальных культур или клеточных линий. В настоящее время метод, глиальные клетки сollected от взрослых грызунов, так как взрослые глии реагируют на стимулы , совсем по- другому по сравнению с неонатальной глии 4 (рисунок 1). Клетки значительно не манипулировали с помощью процедур иммортализации, которые будут использоваться для создания и поддержания клеточных линий. Хотя этот метод был первоначально разработан для использования при невропатической боли исследованиях, он может быть использован для изучения других неврологических заболеваний, которые вовлекают патологические изменения в спинном мозге, таких как ALS и MS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s modification of Eagle’s media (DMEM) with 4.5 g/L glucose Lonza 12-709F The cDMEM media is a standard, widely used culture media. Individual researchers can decide where to purchase the DMEM and all other components used to make cDMEM media.
L-Glutamine (100x) Lonza 17-605E The L-glutamine is a standard, widely used component for various culture media. Individual researchers can decide where to purchase L-glutamine.
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) Corning-Mediatech 30-004-CI This is a combination of penicillin, streptomycin and Amphotericin formulated to contain 10,000 units/mL penicillin G, 10 mg/mL streptomycin sulfate and 25 µg/mL amphotericin B. Individual researchers can decide where to purchase individual components.
2-mercaptoethanol (2-ME) Sigma-Aldrich M3148 A BioReagent, suitable for cell culture, molecular biology and electrophoresis.
Papain dissociation system Worthington Biochemical Corporation LK003150 Individual components of this kit can be purchased separately. 
Percoll GE Health Care 17-0891-01 Percoll is sold as sterile solution. Undiluted Percoll can be re-autoclaved if needed.
Lab-line incubator/shaker  Barstead/Lab-line MaxQ4000  This is the incubator/shaker we have currently. Other types of shakers can be used instead.
Lipopolysaccharides, Salmonella Minnesota Re595 Sigma-Aldrich L-9764 Other strains of LPS can also induce glial responses. The magnitude of the responses though, may vary.
Mouse IL-6 DuoSet ELISA  R&D Systems DY406 Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.
Mouse TNF-alpha DuoSet ELISA R&D Systems DY410 Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.
Mouse IP-10 (CXCL10) DuoSet ELISA R&D Systems DY466 Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.
Mouse MCP-1 (CCL2) ELISA Opteia set BD Biosciences 555260 Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.
Mouse chemokine Q-Plex Quansys Biosciences 120251MS This product was not available for in-house assay at the time. Instead, we sent out samples to the manufacturer for analysis.
APC-anti-mouse-CD45 (clone 30-F11) eBioscience 17-0451 Antibody of the same clone but from other vendors can be used.
FITC-anti-mouse-CD11b (clone M1/70) eBioscience 11-0112 Antibody of the same clone but from other vendors can be used.
Accuri C6 flow cytometer BD Biosciences BD Accuri C6  Each individual Researcher can use any flow cytometer he or she prefers.
FlowJo software Tree Star, Inc. FlowJo7.6.5 Each individual Researcher can use any analysis software he or she prefers.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gaskin, D. J., Richard, P. The economic costs of pain in the United States. J Pain. 13, (8), 715-724 (2012).
  2. Ji, R. R., Berta, T., Nedergaard, M. Glia and pain: Is chronic pain a gliopathy? Pain. 154, (01), S10-S28 (2013).
  3. Ni, M., Aschner, M., et al. Neonatal rat primary icroglia: isolation, culturing and selected applications. Curr Protoc Toxicol. Maines, M. D., et al. (2010).
  4. Cao, L., Fei, L., Chang, T. T., DeLeo, J. A. Induction of interleukin-1beta by interleukin-4 in lipopolysaccharide-treated mixed glial cultures: microglial-dependent effects. J Neurochem. 102, (2), 408-419 (2007).
  5. Malon, J. T., Maddula, S., Bell, H., Cao, L. Involvement of calcitonin gene-related peptide and CCL2 production in CD40-mediated behavioral hypersensitivity in a model of neuropathic pain. Neuron Glia Biol. 7, (2-4), 117-128 (2011).
  6. Blasi, E., Barluzzi, R., Bocchini, V., Mazzolla, R., Bistoni, F. Immortalization of murine microglial cells by a v-raf / v-myc carrying retrovirus. J Neuroimmunol. 27, (2), 229-237 (1990).
  7. Bocchini, V., et al. An immortalized cell line expresses properties of activated microglial cells. J Neurosci Res. 31, (4), 616-621 (1992).
  8. Alliot, F. O., Marty, M. C., Cambier, D., Pessac, B. A spontaneously immortalized mouse microglial cell line expressing CD4. Dev Brain Res. 95, (1), 140-143 (1996).
  9. Alliot, F. O., Pessac, B. Astrocytic cell clones derived from established cultures of 8-day postnatal mouse cerebella. Brain Res. 306, (1-2), 283-291 (1984).
  10. Malon, J. T., et al. Microglial content-dependent inhibitory effects of calcitonin gene-related peptide (CGRP) on murine retroviral infection of glial cells. J Neuroimmunol. 279, 64-70 (2015).
  11. Cao, L., DeLeo, J. A. CNS Infiltrating CD4(+) T lymphocytes Contribute to Murine Spinal Nerve Transection-Induced Neuropathic Pain. Eur J Immunol. 38, (2), 448-458 (2008).
  12. Mayer, A. M., et al. Effect of a short-term in vitro exposure to the marine toxin domoic acid on viability, tumor necrosis factor-alpha, matrix metalloproteinase-9 and superoxide anion release by rat neonatal microglia. BMC Pharmacol. 1, 7 (2001).
  13. Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39, (1), 151-170 (1990).
  14. Rock, R. B., et al. Role of Microglia in Central Nervous System Infections. Clin Microbiol Rev. 17, (4), 942-964 (2004).
  15. Yang, I., Han, S. J., Kaur, G., Crane, C., Parsa, A. T. The Role of Microglia in Central Nervous System Immunity and Glioma Immunology. J Clin Neurosci. 17, (1), 6-10 (2010).
Получение первичных смешанных глиальных культур от взрослых спинного мозга мыши ткани
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Malon, J. T., Cao, L. Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue. J. Vis. Exp. (117), e54801, doi:10.3791/54801 (2016).More

Malon, J. T., Cao, L. Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue. J. Vis. Exp. (117), e54801, doi:10.3791/54801 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter