Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Yetişkin Fare Omurilik Doku İlköğretim Karışık glial Kültürler hazırlanması

doi: 10.3791/54801 Published: November 19, 2016

Summary

nöropatik ağrı gelişimi omurilik glial hücrelerin patolojik değişiklikleri kapsar. Bu hücrelerin in vitro incelenmesi için, yetişkin omurilik dokusu elde edilir ve tasarlanmış güvenilir bir glial kültür sistemi yoksundur. Bu nedenle, biz yetişkin fare omurilik dokusu primer karışık glial kültürlerin nasıl kurulabileceğini burada gösteriyor.

Abstract

Omurilik glial tepkiler nöropatik ağrı gelişimine önemli ölçüde katkıda bulunduğunu çok iyi kabul edilmiştir. Hücresel ve moleküler seviyede glial faaliyetlerine ilişkin muazzam bilgiler, in vitro hücre kültür sistemleri ile elde edilmiştir. Kullanılan in vitro sistem, esas olarak neonatal beyin kortikal dokudan türetilen primer glia içerir ve hücre hatları ölümsüzleştirilmiş. Bununla birlikte, bu sistemler, in vivo olarak, spinal kord, glial hücrelerin özelliklerini yansıtmayabilir. Daha iyi in vivo durumunu yansıtan bir kültür sistemi kullanılarak periferik sinir hasarı-kaynaklı nöropatik ağrı gelişimi omurilik glial hücre rollerini araştırmak üzere, laboratuar primer omurilik karışık glial kültürleri oluşturulması için bir yöntem geliştirmiştir yetişkin fareler. Kısaca, omurilik, yetişkin farelerden toplandı ve dens olan miyelin uzaklaştırılarak elde edilmiş papain sindirim yoluyla işlenirSığ gradyanlı araç. Tek hücre süspansiyonları, 35.9 O ° C'de 2-merkaptoetanol (2-Me) ile desteklenmiş tam Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (cDMEM) kültürlenmiştir Bu kültür koşulları karışık glial hücrelerin büyümesi için özel olarak optimize edilmiştir. Bu koşullar altında, hücrelerin 12 ile deney için kullanılmak üzere hazır olan - 14 kültürde kurulması (D 0) sonra, (hücre, bu süre içinde log fazında genellikle) ve D 21 kadar kültür koşullarında muhafaza edilebilir. Bu kültür sistemi, çeşitli maddeler ve maddeler ile stimülasyonu ile omurilik glial hücre yanıtları araştırmak için kullanılabilir. Nöropatik ağrı Bunun yanı sıra, bu sistem, spinal kord, glial hücrelerin patolojik değişiklikler içeren diğer hastalıklarda glial yanıt incelemek için kullanılabilir.

Introduction

Kronik ağrı kadar 635.000.000.000 $ 1 tahmini yıllık maliyeti, ABD'de yaklaşık 100 milyon yetişkin etkileyen ciddi bir sağlık sorunudur. Montaj kanıtlar nöropatik ağrı, kronik ağrı 2 en yıkıcı tür bir geliştirme omurilik glial hücrelerin önemli bir katkı göstermiştir. Uygun bir in vitro kültür sistemi ayrıca hücresel ve moleküler seviyede gliyal hücrelerinin rolleri araştırmak önemli ölçüde yardımcı olur.

Şu anda, araştırmacılar tarafından kullanılan in vitro glial kültür sistemleri yenidoğan fare veya sıçan beyinleri kortikal dokulardan elde edilen ağırlıklı glial hücreler içerir ve ölümsüzleştirdi neonatal fare türetilen glial hücre hatları veya primer glial hücreler sıçan. Yenidoğan hücreleri böylece sağlayan başka (özellikle astrositler ve mikroglia) glial hücrelere ayırt edilebilir farklılaşmamış hücreler önemli miktarda içerenDeneysel kullanım 3 bundant hücreleri. Bununla birlikte, daha önceki bir çalışma neonatal beyin gliyal hücreler, lipopolisakkarit (LPS) ile stimülasyon üzerine yetişkin omurilik, glial hücrelerinden önemli ölçüde farklı yanıt göstermiştir. Örneğin, interlökin (IL) -4 neonatal beyin glia 4 ile karşılaştırıldığında, yetişkin fare omurilik glia (NO) üretimi, LPS ile uyarılmış nitrik oksit önleyici etkilerini arttırdığını sergiledi. Bundan başka, gen-ilişkili peptid (CGRP) kalsitonin bir nöro-peptid ile stimülasyon üzerine kemokin üretiminin profilleri, (5. Referans açıklanan yöntemlere) yenidoğan fare beyin glia arasındaki tartışmasız farklıdır ve yetişkin fare omurilik glia (Şekil 1). Hücre serileri kullanımı ve bakımı kolay olan ve kısa bir süre içinde geniş hücre temin edebilmektedir. Genel olarak, hücre çizgileri oluşturulur ya da 6, 7 ya da aşağıdaki TH (örneğin yaygın olarak kullanılan mikroglial hücre hattı BV2 gibi) bir virüs aracılı ölümsüzleşme sistemi kullanan ölümsüzleştirilmişSpontan dönüşümün e tespiti (örneğin astrosit hücre hattı C8-D1A ve mikroglial hücre hattı C8-B4 gibi) 8, 9 Hücre hatları ayrı ayrı astrositler ve mikroglia moleküler özelliklerini okuyan mükemmel.; Ancak, hücre çizgilerinden elde edilen sonuçlar her zaman birincil hücrelerde veya in vivo koşullara de doğrulama gerektirir. Aynı zamanda, bir kemirgen omurilik glia türetilen bir glial hücre hattının bir rapor olmamıştır unutulmamalıdır.

Nöropatik ağrı, yetişkin sıçan karışık glial kültürler 4 üretmek için kullanılan daha önce bildirilen yöntem adapte tarafından geliştirilmiştir yetişkin fare omurilik türetilen bir kültür sisteminin geliştirilmesi, 5 omurilik glial hücre rolünü araştıran yardımcı olmak . fare omurilik glial kültürünü, en son 10 rafine edildi ve bu makalede daha detaylı olarak tarif edilmektedir. Yetişkin omurilik karışık glial kültürleri cBir özel çalışmada ihtiyaçlarına uygun seçilen türlerden bir fare ile kurulacak ve hücreler kültür başlatılmasını yayınlamak d fazla 21 için kültür içinde muhafaza edilebilir. Bu yöntem, hem de bu -associated amiyotrofik lateral skleroz (ALS), insan bağışıklık eksikliği virüsü (HIV), duyusal nöropati, ve birden fazla sıra omurilik içinde patolojik değişikliklerin dahil çeşitli nörolojik hastalıkların araştırmalarda, nöropatik ağrı çalışmalarında kullanılabilir skleroz (MS).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Aşağıdaki protokol New England Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı. Aşağıdaki protokol 4 yetişkin fare omurilik gelen glial kültürler hazırlamak içindir.

Aseptik Koşullarında bir kültür Hood Solutions hazırlanması 1.

  1. Kültür ortamı hazırlayın: Eagle ortamı (cDMEM) DMEM içeren tam Dulbecco modifikasyonu,% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS), 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penisilin (4.5 g / L glukoz ile), 100 mg / ml streptomisin 250 ng / ml amfoterisin B ve 50 uM 2-merkaptoetanol (2-Me, 1.1.1 bakınız). Mix ve diğer tüm bileşenler sterilize filtre ve sonra FBS ekleyin. 4 o C'de kültür ortamı Mağaza
    1. 50 mM 2-ME / fosfat tamponlu salin (PBS) bir stok çözelti hazırlayın: 100 mcL konsantre edildi 2-ME 28.6 1x PBS mL ve filtre ile sterilize (çözelti 4 o C'de saklanabilir halinde (14.3 M) Birkaç ay). UKültür ortamı, her 1000 ml için 2-ME, stok çözeltisinin GD 1 mi.
  2. Yoğunluk gradyan ortamının hazırlanması
    1. Bir hisse senedi izotonik yoğunluk gradyan medya çözümü hazırlayın (örn% 100 Percoll) 1 kısım 10x normal steril PBS ve 9 parça steril stok yoğunluk gradyan medya (örneğin, Percoll) dan.
    2. % 20 yoğunluk gradyan ortamı (örneğin, 1 x PBS, 40 mL% 100 yoğunluk gradyan, 10 mL ortam) yapmak için normal 1x steril PBS ile (1.2.1) yapılan% 100 yoğunluk gradyan ortamı seyreltilir ve 4 ° C'de saklayın o C hücre kültürü hazırlamak önce oda sıcaklığında (RT) 20% yoğunluk gradyan ortamı getirin.
  3. Papain ayrışma sisteminden çözeltilerin hazırlanması
    Not: Papain ayrışma kaplama için Tablo l'de tespit edilebilir. (In-house monte dahil) benzeri diğer ayrışma kitler de kullanılabilir. Tüm components steril olması gerekmektedir.
    1. ovomukoid inhibitörü karışımı (toz) için Earle Dengeli Tuz Çözeltisi (EBSS) 32 ml.
    2. bir papain flakon (toz) için EBSS'ye 5 ml ekleyin. 10 dakika süre ile ya da papain çözünene kadar 37 o C su banyosu içinde papain flakon yerleştirin.
    3. bir DNaz flakon (toz) için EBSS'ye 500 uL ekleyin. hafifçe karıştırın.
    4. Papain şişeye DNase çözeltisi (yukarıda) 250 ul.
    5. gerekli Yukarıdaki papain / DNaz karışımı (fare omurilik başına papain / DNaz karışımının yaklaşık 800 uL) 'nin toplam miktarını hesaplayın ve Doku sindirimi (adım 3.2) bir 50 ml tüp içine gerekli karışımı aktarın. en az iki hafta boyunca 4 ° C'de orijinal şişeye, artmış saklayın.
    6. ihtiyaç kadar buz üzerinde kitleri tüm bileşenleri tutun.
  4. spinal kord toplama tüpleri hazırlanması: Bir steril 15 ml tüp 5 ml Hank'in dengelenmiş tuz çözeltisi (HBSS ile, Papain ayrılma sistemi,0; 1X PBS ile omurilik) ve bir steril 15 ml tüp toplanması için (5 ml şırıngaya doldurulmasında) adım 2.4. Buna ek olarak, HBSS 5 ml ile bir steril petri (35 mm veya 60 mm) hazırlamak ve kültürü kaputu içinde tutmak.

2. Omurilik Koleksiyonu

Not: Tüm ekipman steril olması gerekmektedir. IACUC tarafından onaylanmış belirlenmiş bir alanda toplanmasını gerçekleştirin.

  1. hasat fare omurilik için aşağıdaki araçları edinin: düz keskin / künt 18 cm cerrahi makas, 12 cm standart neşter (# 3 katı), karbon çelik steril neşter bıçakları 10., küçük bir hayvan decapitator, 12 cm standart kavisli forseps ve steril bir 20G iğne 5 ml şırıngaya bağlanmış.
  2. CO2 ile hayvan Euthanize ve fare baş ve% 70 etanol (EtOH) ile arka bölgeyi dezenfekte.
  3. decapitator ile hayvan başını kesmek. kas tabakası açığa alt geri bir orta uzunlamasına bir kesi yapmak. YapmakKalça düzeyinde omurgalı sütun üzerinden temiz bir kesik steril düz cerrahi makas (18 cm) (aynı zamanda omurgalı sütunu kapsayan kas tabakası ile kesme).
  4. tek kullanımlık taze mendil bir kağıda hayvan yerleştirin. Dikkatle rostral tarafına doğru omurganın içerisine (steril 1 x PBS (adım 1.4) ile doldurulmuş, 5 ml şırıngaya bağlanmış) 20 G iğne yerleştirin. aşağı sıkıca hayvan tutun ve hızlı bir şekilde şırınga itin. Bütün omurilik servikal ucundan çıkması gerekir. HBSS içeren 15 ml tüp içine omurilik toplayın.
  5. Farelerin kalanı için yineleyin 2.4. Her bir hayvan arasında,% 70 EtOH ile kullanılan tüm araçların dezenfekte edin.
    NOT: Genellikle, bir tek 12-plaka her 4 fare omurilik (4.3 bakınız) kurulabilir.

Tek Hücre Süspansiyon 3. hazırlanması

Not: Steril her şeyi tutmak için bir kültürü kaputu adım 3 ve 4 gerçekleştirin.

  1. HBSS içeren petri (adım 1.4) içine tüm omurilik aktarın. Steril makas ve forsepsle bir çok ince, küçük parçalar halinde omurilik her kesim. bu daha hazırlıklı sulandırmak gibi steril forseps veya 10 ml pipet kullanarak hazırlanan papain / DNaz enzim karışımı (adım 1.3.5) içeren 50-ml konik tüp omurilik doku transferi (enzim karışımı HBSS eklemekten kaçının enzim çözeltisi ve enzimin azalmış performansa neden olabilir).
  2. karıştırmak için tüp hafifçe karıştırın. Yörünge 150 rpm'de çalkalanarak bir inkübatör / çalkalayıcıda 1 st için 37 o C'de tüp inkübe edin.
  3. Vorteks tüpü tekrar ve şiddetle ileri ayrışmasını teşvik etmek için bir 5 ml pipet kullanarak doku ile enzim çözeltisi çiğnemek.
  4. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de 15 ml tüp ve santrifüj içine hücre süspansiyonu aktarın.
  5. Santrifüj sırasında yeniden albüminsiz ovomukoid inh 300 ul 2.7 mL EBSS karıştırınsteril tüp içinde ibitor çözeltisi (1.3.1). DNaz solüsyonu (adım 1.3.3) 150 mcL ekleyin.
  6. Santrifüj sonrasında, süpernatant kaldırmak ve (3.5 adım a) yukarıda hazırlanan çözelti ile hücre pelletini. Vortex iyi hücre pelletini kırmak için.
  7. Hücre süspansiyonuna yeniden albümin ovomukoid inhibitör çözeltisi (aşama 1.4.1) 3 ml. Oda sıcaklığında 6 dakika boyunca 70 x g'de santrifüjleyin hücreleri. (Membran parçaları içerir) süpernatantı.

Tek Hücre Süspansiyon gelen Miyelin 4. Ek Kaldırma

  1. Freni olmaksızın, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 800 xg'de hücreleri topak bozmaya yavaşça Hücre topaklarını içeren tüpe girdap (adım 1.2.2 hazırlanmıştır)% 20 yoğunluk gradyan ortam 8 mL ekleyin ve santrifüjlenir. Dikkatle enkaz (çoğunlukla miyelin) ve süpernatant üst tabakasını kaldırmak, ancak pelet tutmak.
  2. resuspendi hücreleri yıkayın, yoğunluk gradyanı kalıntıları çıkarmak içinBir seyreltilmiş cDMEM 8 mL (1 kısım cDMEM ve 2 kısım HBSS) hücre pelletini ng. 4 O C 'de 10 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj hücreleri Süpernatantı ve aynı şekilde seyreltilmiş cDMEM (yukarıda) ile tekrar yıkama hücreleri. Onları tohumlama kadar buz üzerinde hücreleri tutun.
  3. Süpernatantı ve kültür ortamında hücre pelletini (cDMEM ile birlikte 2-ME (adım 1.1 hazırlanmış)). Bir 12-yuvalı plaka için, 3 mL x 4 (kullanılan farelerin sayısı) + 2 ml = 14 ml ortamı kullanın. Bu, tüm plaka için yeterli hücre süspansiyonu (12 oyuk) olmasını sağlamak ve oyuk başına ortalama hücre sayısı ve kültür mikroglial içeriğini belirlemek için kullanılabilir ilave kuyu sağlayacaktır. kültür damarlarının diğer türleri kullanılacak ise, orantılı gerekli kültür ortamı toplam hacmini hesaplamak.
  4. 12 oyuklu plakanın her bir hücre süspansiyonu 1 ml.
  5. % 5 CO 2 ile 35.9 o C'de inkübe hücreleri.
  6. NOT: 1. günde, kültür nedeniyle omurilik dokusundan kalıntı miyelin enkaz önemli miktarda içerebilir; böylece, 1 gün medyayı değiştirme (Daha fazla bilgi için tartışma bakınız) tavsiye edilir. D 12, oyuk başına 100,000 hücre 12 oyuklu bir plaka içerisinde bulunmaktadır, 14. hücreler genellikle D 12% 80 konfluent ve tipik olarak D 14 ile% 100 konfluent civarındaki olabilir - Kültürler 12 D arasında tedavi için hazır .

Şekil 4,
Şekil 2:. Karışık glia kültürünün kurulmasından sonra farklı zamanlarda karışık glial hücreler Örnek Çıkan Birincil spinal kordon karışık Glia yetişkin C57BL / 6 farelerinden elde edildi. temsilcisi görüntülerikaplama sonrası glial kültür ilerlemesini gösterir. 1. günde, bazı hücreler kültür plakasına bağlı, ama çoğunlukla hala yuvarlak edilir. yüzen hücreleri ve önemli enkaz birçok vardır. 4. günde, hücreler çoğunluğu kültür plakasına bağlıdır. Hücreler görebilir süreçlerle dallanmış görünür. Hücreler sporadik dağıtılır ve kültürler şu anda yaklaşık% 20-30 konfluent. 8. günde, kültürler% 50-60 konfluent arasındadır. kültürlerin Bazı alanlar hücrelerinin büyük yamalar var. kültürlerin diğer alanlar hücrelerin seyrek bir büyüme var. yamalar içindeki bazı hücreler "kare" gibi görünüm alır. 12. günde, kültürler (Burada gösterilen görüntü ile ilgili olarak% 90 kaynaşık), ya da% 80 konfluent üzerindedir. Hücre şu anda büyüme log fazında ve 12-14 deneyler için glia hücreleri kullanarak için en uygun zaman gün arasında değişmektedir. Bir görmek için buraya tıklayınızBu rakamın daha büyük bir versiyonu.

  1. Anti-fare-CD45 ve anti-fare CD11b monoklonal antikorların kombinasyonu kullanılarak Standart flüoresanslı etkinleştirilmiş hücre tasnif (FACS) boyama protokolü 11 üzerinden ilave kuyulardan hücreler (4.3 aşama) kullanarak mikroglial içeriği inceleyin. CD45 + CD11b + hücrelerinin mikroglialar olarak tanımlanır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu yöntem, farelerde ve sıçanlarda karma glial hücrelerini hazırlamak için de kullanılabilir. Hücreler fare omurilik elde zaman kültür D12 sonrası başlatma üzerinde 12 oyuklu bir plaka içerisinde oyuk başına ortalama hücre sayısı göz başına yaklaşık 100,000 hücre ile nispeten kararlı olmalıdır. Bu yöntemle elde edilen glial hücreler madde ve ilgi maddelerin uygulanması üzerine, yetişkin omurilik, glial yanıt incelemek için dizayn edilmiştir deneylerde kullanılabilir. 3 tipik bir deney, sitokin ve kemokin tepkilerinin bir örneğini sağlar Şekil olan yetişkin omurilik, mikroglia yetişkin BALB / c farelerinden elde edilen ve kültür D 13 sonrası başlandığında LPS (Salmonella minnesota Re595) ile muamele edildi. Yüzey maddeleri piyasada-uygunlğ kullanılarak, bir enzim bağlı immünosorbent deneyi (ELISA) ile, sitokin ve kemokin seviyelerinin belirlenmesi için 24 saat sonra LPS tedavi toplandıle kitleri.

Bu yetişkin glial kültür sistemi ilk kurulduğunda, hücreler 37 o C'de standart kültür ortamında inkübe edildi % 10 - Bu durumda, ortalama mikroglial içerik 5 arasında değişmektedir. (-% 20 15), 10 Bununla birlikte, sürekli kültür teknikleri kullanımı olmasına rağmen, kültür bazı durumlarda ya da çok düşük bir mikroglial içeriği (<% 2) ya da nispeten yüksek mikroglial içeriğine sahip olacağı gözlendi. Deneysel sonuçlar karışık kültür içinde mikrogliyal tepkiler güvenmek zaman çok az mikroglia sahip kültürleri elde etmek sinir bozucu olabilir. Dr Alejandro MS Mayer (Farmakoloji Anabilim Dalı, Kemik Hastalıkları Tıp Şikago Koleji) 12 öneri ardından, yöntem 35.9 o C karışık glial hücreler büyüyen modifiye edildi Bu, daha tutarlı ve daha mikroglia verimle sonuçlanmıştır (10 arasında değişen -% 40 ve daha çok ar Kalankültürlerin çoğunda içinde ound% 20). Bu gelişme Şekil 4'te gösterilmiştir Önceden bildirildiği gibi, mikroglia 5 makyaj tahmin edilmektedir -. Yetişkin farelerin 13-15 CNS glial nüfusun% 21. Her iki kültür koşulları, in vivo olarak tahmin edilen mikroglia benzer miktarlarda içeren kültürler sağlamakla birlikte, değiştirilmiş kültür durumu (35.9 ° C) de astrositler ve mikroglia hem yanıtları incelemek için kritik öneme sahip deneyler için daha uygundur.

Şekil 1
Şekil 1:. Kalsitonin gen-ilişkili peptid (CGRP) Karışık glial hücreler tarafından kemokin üretimi indüklenen yenidoğan BALB / c Fare beyinleri (sol) veya yetişkin BALB / c fare omurilik hazırlanabilir karışık glial hücreler (sağ) çeşitli dozlarda uygulandı CGRP. Kültür süpernatanları çeşitli kemokin düzeyleri uygun zamanlarda (üretici tarafından gerçekleştirilen) multipleks deneyi yoluyla belirlendi (ortalama ± SEM, n = 2-6). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil 3: üzerine Glia Karışık Fare Yetişkin Omurilik, sitokin ve kemokin Yanıtlar LPS uyarımından yetişkin omurilik, karışık glial hücreler, BALB / c farelerinden hazırlanan LPS'nin çeşitli dozlarda ile uyarıldı.. IL-6 (A), tümör nekroz faktörü (TNF) alfa (B), interferon-y-indüklenebilir protein 10 (IP-10 da CXCL10 olarak da bilinir) (C) ve monosit kemo-çekici protein 1 seviyeleri (MCP- kültür süpernatanları da CCL2 şekilde bilinmektedir 1) (D) 24 saat sonra LPS tedavide ELISA ile tespit edilmiştir.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54801/54801fig2large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 4:. Yetişkin Karışık glial Kültürler mikrogliyal içeriği karma glial hücreleri yetişkin C57B6 / L farelerden elde edilen ve 37 ° C'nin ve 35.9 o C, ya da kültürlendi Her bir kültürden mikrogliyal içeriği APC-anti-fare-CD45 (klon 30-F11) ve FITC-anti-fare-CD11b (klon M1 / ​​70) kullanılarak akış sitometrisi ile analiz edilmiştir. akım sitometri analizleri Temsilcisi araziler gösterilmektedir. Kültürlerinden toplam hücre popülasyonları araziler (37 ° C) ve C (35.9 ° C) ve mikroglial popülasyonunda tespit edilmiştir (CD45 + CD11 + hücreleri) ayrıca B, ilgili toplam hücre popülasyonlarının izole edilmiştir (37° C) ve D (35.9 ° C). Akım sitometri analizi yapıldı ve daha önce 5 açıklandığı gibi tüm verileri analiz edildi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tüm adımları dahil deneyler arasında tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için tutarlı bir şekilde programı değişen ortama gerçekleştirmek için çok önemlidir. Aşağıdaki adımlar mükemmel kalitede yetişkin karışık glia elde özellikle kritiktir.

enzimatik sindirim Bu protokolün önemli bir yönüdür. Doku parçaları, tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için iyi sindirilir çok önemlidir. Bununla birlikte, aşırı sindirim önemli ölçüde daha az hücreleri neden olur. Her laboratuar inkübasyon için kullanılmış şişeleri türlerine göre kesin sindirim süresini belirlemek için, pilot testleri gerçekleştirmek için gereken ortalama doku miktarı her zaman kullanılan ve çalkalayıcı tipi (orbital çalkalayıcı karşı dönen). Ayrıca, ne olursa olsun seçilmiş papain ayrışma sistemi, bileşenlerin zaman zaman ikame veriminde önemli değişikliklere yol açabilir olarak, sürekli aynı kaynaklardan aynı bileşenleri kullanmak esastırToplam hücre sayısı.

Bu protokol, miyelin bir yoğunluk gradyan ortamı kullanılarak kaldırılır. Bunu yapmak ve bu çözeltilerin yoğunluğu sıcaklığa duyarlı olduğundan, oda sıcaklığında yoğunluk gradyanlı çözümleri kullanımı için çok önemlidir. Yoğunluk gradyanı çözeltiler genellikle 4 O ° C'de saklanır Gerekirse, yoğunluk gradyanlı çözeltiler, gece boyunca kültür kurma bir gün önce, oda sıcaklığında muhafaza edilebilir. Buna ek olarak,% 20 yoğunluk gradyanı içinde hücrelerin 30 dakika santrifüjlenerek hücreler kaymasını iri parçalar önlemek için santrifüj derhal kaldırılması (yani, uzak çözeltinin üst hareket ettirilmesi; adım 4.1).

Kültürün D 1 mesaj başlatılması üzerine enkaz kaldırmak için önemlidir. hücreler hayatta ve kültür ortamı, daha sonra bir daha "sessiz" ve "temiz" kültür sağlayacak D 1 ortamının değiştirilmesi, 3 ila 4 d değiştirilirse çoğalacak rağmen. BuHücreler daha az rahatsız ortamda büyümesine izin verir, ve hücreler kültür 21 d sonrası başlaması kadar tutulabilir.

Her bir deney için mikrogliyal içeriği karıştırılır glia kullanmadan önce incelenebilir. Hatta en tutarlı tekniği ile, mikroglial içeriği hala deneyler arasında belirgin farklılık gösterebilir. Bazı hücresel etkileri mikroglial içerik 4, 10 bağlıdır; nedenle, kurulan kültürlerin her set mikroglial içeriği izlemek için çok önemlidir. Bu uygulamadan elde edilen veriler deneyler arasında farklılıklar yorumlamak yanı sıra belirli bir deneysel koşul altında mikroglia karşı astrositlerin katkısı konusunda (bazen beklenmedik) bilgi romanı sağlamak için yardımcı olabilir. Buna ek olarak, mikroglial içeriğine mevsimsel değişimi gözlenmiştir. Bu deneylerin büyük setleri planlarken dikkate alınması gereken ek bir faktör olabilir. Ayrıca, nöronlar genellikle bizim kültür koşullarında hayatta olmaz iken,Neun (bir nöronal-işaretleyici) pozitif hücreler immünohistokimyasal sonra bizim glial kültürlerde gözlenmemiştir olarak, kültür (bu rutin miktarı edilmemiştir) oligodendrosit sınırlı sayıda içerebilir. Bir bu nüfus özgü deneysel koşullara bağlı olarak incelenmesi gereken karar vermelidir.

Birçok deney yöntemleri ile olduğu gibi, bu yöntem, bireysel araştırmacılar ihtiyaçlarına göre değiştirilebilir. Tamamen rutin bunları kullanmadan önce özel değişiklikler test etmek için pilot deneyler gerçekleştirmek için esastır. Bundan başka, bir önceki yenidoğan karışık glial hücreler 3 için tarif edildiği gibi karışık Glia, astrosit-özgü baskın stimülasyon sonrasında mikroglia baskın hücrelere kıyasla tepkilerini çalışma mikroglia-tükenmiş ve mikroglia zenginleştirilmiş kültürleri elde etmek için kullanılabilir olduğunu belirtmek gerekir, 4. Bununla birlikte, mikroglia zenginleştirilmiş hücre verimi, spinal sayıda sürece sınırlı olacaktırkordonlar başında kültürünü yerleştirmek için kullanılır. Bu fareler kullanıldığında, özellikle eğer bu yöntemin bir sınırlama yoktur. Sıçan omurilik kullanıldığında, (4 yerine fare omurilik) bir bireysel omurilik tek 12-plaka kurmak için de kullanılabilir. . Son olarak, mikroglial içerik 4, 5 İkisi fare ve sıçan yetişkin omurilik glial kültürler sitokin üretimi açısından LPS stimülasyonu sağlam bir tepki üreten fare ve sıçan yetişkin omurilik glial kültürler arasında anlamlı bir farklılık görünmüyor; Alternatif uyaranlara kullanılır, ancak farklı tepkileri görülebilir.

Toplamda, bu kemirgen yetişkin glial kültür sistemi in vitro glial hücreleri incelemek için alternatif bir yöntem sağlar. Daha yakından bu kültür sisteminde elde edilen sonuçlar neonatal kültürleri veya hücre çizgilerinden elde edilen sonuçlar ile karşılaştırıldığında, in vivo koşullar altında gözlemlenebilir ne yansıtır. Mevcut yöntemde, gliyal hücreler, Cı vardırYenidoğan glia 4 (Şekil 1) ile karşılaştırıldığında, yetişkin glia yanıt çok farklı uyaranlara olarak, yetişkin kemirgenler ollected. hücreleri oluşturmak ve hücre hatları korumak için kullanılacak ölümsüzleşme prosedürleri yoluyla önemli ölçüde manipüle edilmemiştir. Bu yöntem, ilk olarak nöropatik ağrı çalışmalarında kullanılmak üzere geliştirilmiş olmasına rağmen, tür, ALS ve MS omurilik içinde patolojik değişikliklerin dahil diğer nörolojik hastalıklar çalışma için kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s modification of Eagle’s media (DMEM) with 4.5 g/L glucose Lonza 12-709F The cDMEM media is a standard, widely used culture media. Individual researchers can decide where to purchase the DMEM and all other components used to make cDMEM media.
L-Glutamine (100x) Lonza 17-605E The L-glutamine is a standard, widely used component for various culture media. Individual researchers can decide where to purchase L-glutamine.
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) Corning-Mediatech 30-004-CI This is a combination of penicillin, streptomycin and Amphotericin formulated to contain 10,000 units/mL penicillin G, 10 mg/mL streptomycin sulfate and 25 µg/mL amphotericin B. Individual researchers can decide where to purchase individual components.
2-mercaptoethanol (2-ME) Sigma-Aldrich M3148 A BioReagent, suitable for cell culture, molecular biology and electrophoresis.
Papain dissociation system Worthington Biochemical Corporation LK003150 Individual components of this kit can be purchased separately. 
Percoll GE Health Care 17-0891-01 Percoll is sold as sterile solution. Undiluted Percoll can be re-autoclaved if needed.
Lab-line incubator/shaker  Barstead/Lab-line MaxQ4000  This is the incubator/shaker we have currently. Other types of shakers can be used instead.
Lipopolysaccharides, Salmonella Minnesota Re595 Sigma-Aldrich L-9764 Other strains of LPS can also induce glial responses. The magnitude of the responses though, may vary.
Mouse IL-6 DuoSet ELISA  R&D Systems DY406 Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.
Mouse TNF-alpha DuoSet ELISA R&D Systems DY410 Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.
Mouse IP-10 (CXCL10) DuoSet ELISA R&D Systems DY466 Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.
Mouse MCP-1 (CCL2) ELISA Opteia set BD Biosciences 555260 Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.
Mouse chemokine Q-Plex Quansys Biosciences 120251MS This product was not available for in-house assay at the time. Instead, we sent out samples to the manufacturer for analysis.
APC-anti-mouse-CD45 (clone 30-F11) eBioscience 17-0451 Antibody of the same clone but from other vendors can be used.
FITC-anti-mouse-CD11b (clone M1/70) eBioscience 11-0112 Antibody of the same clone but from other vendors can be used.
Accuri C6 flow cytometer BD Biosciences BD Accuri C6  Each individual Researcher can use any flow cytometer he or she prefers.
FlowJo software Tree Star, Inc. FlowJo7.6.5 Each individual Researcher can use any analysis software he or she prefers.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gaskin, D. J., Richard, P. The economic costs of pain in the United States. J Pain. 13, (8), 715-724 (2012).
  2. Ji, R. R., Berta, T., Nedergaard, M. Glia and pain: Is chronic pain a gliopathy? Pain. 154, (01), S10-S28 (2013).
  3. Ni, M., Aschner, M., et al. Neonatal rat primary icroglia: isolation, culturing and selected applications. Curr Protoc Toxicol. Maines, M. D., et al. (2010).
  4. Cao, L., Fei, L., Chang, T. T., DeLeo, J. A. Induction of interleukin-1beta by interleukin-4 in lipopolysaccharide-treated mixed glial cultures: microglial-dependent effects. J Neurochem. 102, (2), 408-419 (2007).
  5. Malon, J. T., Maddula, S., Bell, H., Cao, L. Involvement of calcitonin gene-related peptide and CCL2 production in CD40-mediated behavioral hypersensitivity in a model of neuropathic pain. Neuron Glia Biol. 7, (2-4), 117-128 (2011).
  6. Blasi, E., Barluzzi, R., Bocchini, V., Mazzolla, R., Bistoni, F. Immortalization of murine microglial cells by a v-raf / v-myc carrying retrovirus. J Neuroimmunol. 27, (2), 229-237 (1990).
  7. Bocchini, V., et al. An immortalized cell line expresses properties of activated microglial cells. J Neurosci Res. 31, (4), 616-621 (1992).
  8. Alliot, F. O., Marty, M. C., Cambier, D., Pessac, B. A spontaneously immortalized mouse microglial cell line expressing CD4. Dev Brain Res. 95, (1), 140-143 (1996).
  9. Alliot, F. O., Pessac, B. Astrocytic cell clones derived from established cultures of 8-day postnatal mouse cerebella. Brain Res. 306, (1-2), 283-291 (1984).
  10. Malon, J. T., et al. Microglial content-dependent inhibitory effects of calcitonin gene-related peptide (CGRP) on murine retroviral infection of glial cells. J Neuroimmunol. 279, 64-70 (2015).
  11. Cao, L., DeLeo, J. A. CNS Infiltrating CD4(+) T lymphocytes Contribute to Murine Spinal Nerve Transection-Induced Neuropathic Pain. Eur J Immunol. 38, (2), 448-458 (2008).
  12. Mayer, A. M., et al. Effect of a short-term in vitro exposure to the marine toxin domoic acid on viability, tumor necrosis factor-alpha, matrix metalloproteinase-9 and superoxide anion release by rat neonatal microglia. BMC Pharmacol. 1, 7 (2001).
  13. Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39, (1), 151-170 (1990).
  14. Rock, R. B., et al. Role of Microglia in Central Nervous System Infections. Clin Microbiol Rev. 17, (4), 942-964 (2004).
  15. Yang, I., Han, S. J., Kaur, G., Crane, C., Parsa, A. T. The Role of Microglia in Central Nervous System Immunity and Glioma Immunology. J Clin Neurosci. 17, (1), 6-10 (2010).
Yetişkin Fare Omurilik Doku İlköğretim Karışık glial Kültürler hazırlanması
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Malon, J. T., Cao, L. Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue. J. Vis. Exp. (117), e54801, doi:10.3791/54801 (2016).More

Malon, J. T., Cao, L. Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue. J. Vis. Exp. (117), e54801, doi:10.3791/54801 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter