Summary
イカDoryteuthis pealeii色素胞におけるナノ構造の顆粒から顔料の抽出のためのプロトコルが提示されています。
Introduction
このようなイカ、イカ、タコなどの頭足動的にカモフラージュとシグナリングのため、その外観を変更する能力を持っている。1-6この機能は、色素胞として知られている着色された臓器の選択的な面積の拡大によって部分的にサポートされています。4,7-9色素胞されています筋線維によって放射状に固定されているcytoelastic球形嚢の中に閉じ込められたナノ構造色素顆粒のネットワークを含むソフトアクチュエータ。1,3、それらが作動されるように、色素胞は、臓器全体の顆粒を配布提示表面積が500％によって拡大する。3,7このアクションは色素胞の数の上に協調された場合、10,11は 、動物の全体的な着色が変更されます。それは顔料顆粒は、この色の変化に寄与することが知られているが、それらの組成物が不明のままです。私たちは、将来の組成の研究のために適合させることができる色素胞の顔料を分離し、精製するための手順について説明します。
。3,12色素胞含む組織が頭足類から慎重に摘出を通して収穫されます。消化及び均質化処理は、次に、周囲の組織を解離し、色素胞細胞を分離するために使用されます。ナノ構造の顆粒を繰り返し、超音波処理し、遠心分離を用いて、残りの色素胞から単離され、精製されます。精製の際、顔料は酸性メタノール溶液を使用して蝶の羽からの可視色の抽出から適合されたプロセスにおける顆粒から抽出される。13走査電子顕微鏡（SEM）及び分光光度は色素胞顔料が正常に使用して抽出されていることを確認するために使用されていますこのプロセス。
この方法は、cの分子の寄与を調査するために使用される色素胞顆粒の単離を記載します頭足類でoloration。動物全体から12小分子の抽出は、多くの場合、長くて退屈なプロセスになることがあります。ここでの目的は、頭足類でのナノ構造の顆粒から顔料を取得するための効果的かつ容易なプロトコルの将来の研究者を通知することです。
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Protocol
本明細書中で行わ無脊椎動物動物研究は、米国では規制されていません。したがって、制度的動物実験委員会は、そのようなプロトコルの見直しのための権限を有しません。これらの代わりに、米国における規制の管轄下に落下する著者がここにこれらの研究は、誠実な倫理的な利用に向けた努力、ケア、およびこれらの動物の治療で行われたと述べている、個人の数が最小化され、これらの努力ではありませんバーゼル宣言と実験動物学のための国際評議会（ICLAS）倫理ガイドラインと一致しています。
1. Doryteuthis pealeii（D.のpealeii）解剖
- 購入断頭イカD.ウッズホール、マサチューセッツ州で海洋生物学研究所で海洋資源省から、または任意の新鮮な魚市場からpealeii。フィレットまたは以前にこの手順を適用するために変更された検体は使用しないでください。具体的には、彩度tophore層は依然として、試料上無傷でなければなりません。
- 動物をすぐに使用しない場合は、使用するまで-20℃で保存します。標本を解凍するには、前の解剖に1時間室温の水にそれらを配置します。
- 動物の後側に沿って切断したステンレス鋼ストレート細かい点解剖ハサミを使用。腹マントルの底から始まり、フィン領域に終わります。
- 鉗子を解剖し、解剖ハサミを使用して結合組織を切断して、それらを持ち上げることによって内臓（胃、鰓、インク腺、生殖器官、全身心臓、および上腕心臓）のすべてを削除します。標本袋に臓器を捨てます。
- 柔軟な解剖パッドを含む標準11-1 / 2 "×7-1 / 2"×1-1 / 2 "アルミ解剖パンにマントル（フィン側まで）をピンに解剖T-ピンを使用してください。組織水没使い捨てポリスチレン真空濾過システムを通して濾過された海水を250ml0.2μmの細孔サイズを含みます。
- 慎重に無傷の皮膚層を含む色素胞を保ち、解剖鉗子で表皮層（不透明色）を取り外します。表皮層が除去されると、試料袋に廃棄します。
- 鉗子や解剖ハサミで色素胞層の小さい（1センチメートル×1センチ）のセクションを分析。 1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブ内のサンプルを収集する（解剖組織と各空のチューブの半分を埋めます）。
- チューブを含む組織にフィルタ海水の500μLを加えます。サンプルを、4℃で一晩保存することができます。
2.単離色素胞色素顆粒
- 組織消化
- パパイン/コラゲナーゼの調製
- 紙の重さ4 "×4"低窒素を使用してコラゲナーゼを30mgおよびパパイン5mgを秤量。スクリューキャップを有する50mLのポリプロピレン遠心管にこれらを移します。
- deionizの10ミリリットルを測定します目盛り付きピペットを用いて、ED水。パパイン/コラゲナーゼを含むバイアルに直接追加します。最高の設定上の渦溶液が透明になるまで。
- 細胞外組織を削除します
- 遠心分離14000×gで5分間のステップ1.7から収集した色素胞組織。廃プラスチックのバケツに海水のトップ層を捨てます。
- P1000容量可変シングルチャンネルマイクロピペットを用いて組織にパパイン/コラゲナーゼ溶液500μlを追加します。最高設定に1-2分間、各サンプルをボルテックスし。
- 周囲の組織から細胞を解離するためには40kHzの周波数で5分間サンプルを超音波処理します。
- 14,000×gで5分間遠心分離します。廃プラスチックのバケツに上清を捨てます。
- G X 14,000で5分間収集色素胞組織を遠心。廃プラスチックのバケツに海水のトップ層を捨てます。もう一度繰り返します。
- 手動で任意の残りの大規模な組織秒を削除次のステップに進む前に、ピンセットで、このプロセスに分解しなかったン。
- パパイン/コラゲナーゼの調製
- 顔料顆粒の単離
- 均質化緩衝液の調製
- （4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸）（HEPES、100mMの）、塩化マグネシウム（10ミリモル）0.095 gのカリウム、アスパラギン酸（50ミリモル）の0.856 g及び0.015gの2.38グラム計量ジチオスレイトール（1 mM）の。スクリューキャップと150ミリリットルのポリスチレン容器に移します。 1商業ミニタブレットのプロテアーゼ阻害剤を追加します。
- メスシリンダーを用いて、100mlの脱イオン水を測定します。均質化塩を含有する容器に直接追加します。解決までの渦は明らかです。
- 顔料顆粒の均質化
- 5分間、14,000×gでステップ2.1から各サンプルを遠心分離します。廃プラスチックのバケツに上清を捨てます。このサンプルでは、細胞外組織の空隙でなければなりません。
- 500＆を追加＃181; 1〜2分間ごとに、各チューブとボルテックスに均質化緩衝液のリットルは徹底的にサンプルを混合します。 30分（〜40 kHzの）のためのサンプルを超音波処理し、14,000×gでの遠心分離の5分に従ってください。
- 廃プラスチックのバケツに上清を捨て、そして色素胞の球形嚢とタンパク質テザーの完全な消化を確実にするために、前のステップを2-3回繰り返します。残りの溶液は淡黄色の上澄み液と分離された色素顆粒を含む赤色のペレットを含むべきです。
- 均質化緩衝液の調製
3.顔料の抽出
- 酸性メタノール（塩酸-メタノール）の製造
- 慎重にメタノール5ml（メタノール）に濃縮された（36.5から38までパーセント（w / w）の）塩酸（HCl）の25μlを添加します。スクリューキャップガラス製サンプルバイアル中のHCl-MeOH溶液を保管してください。溶液を均一に混合するために穏やかに渦巻。
注：複数の酸性溶液、より多くの顔料はFiの中に抽出されます最初の抽出。
- 慎重にメタノール5ml（メタノール）に濃縮された（36.5から38までパーセント（w / w）の）塩酸（HCl）の25μlを添加します。スクリューキャップガラス製サンプルバイアル中のHCl-MeOH溶液を保管してください。溶液を均一に混合するために穏やかに渦巻。
- 顔料の抽出
- 14,000×gで5分間（2.2.2から）顔料顆粒サスペンションを遠心し、廃プラスチックのバケツに上清を捨てます。
- 塩酸 - メタノール溶液500μlを加え、3-4分〜のために各サンプルをボルテックス。 10分（〜40 kHzの）のためのサンプルを超音波処理し、その後、14,000×gで5分間遠心します。
- トランスファーピペットを用いて、1ドラムスクリュートップガラスバイアルに上清を収集します。上清の色は暗赤色でなければなりません。
- それ以上の色が抽出されなくなるまで抽出ステップ3.2.2を繰り返し（〜4-5回の洗浄）。
注：各抽出は、顔料の〜1.5ミリリットルを得られます。残りの無色のペレットは、顔料抽出した顆粒です。注：無色顆粒抽出顔料の両方は、さらなる使用まで4℃で水中に保存することができます。
抽出プロセス全体を通じて4.キャラクタリゼーション
- スキャンエル顕微鏡ectron
- 抽出プロセスの純度を確認するために、走査電子顕微鏡（SEM）を用いて（ステップ2.2.1および顔料抽出ステップ3.2.3からの未反応の）画像顆粒。
- イメージングのための顆粒サンプルを調製するには、最初の遠心分離の未反応の顆粒と顔料の両方が14,000×gで5分間顆粒を抽出し、廃プラスチックのバケツに上清を捨てます。再懸濁これらをエタノール1mlに、転送ピペットを用いてアルミニウムSEMスタブ上に顆粒懸濁液を2-3滴を堆積させます。
- 一晩の試料を乾燥した後、15 nmのコーティングを達成するために3分間金 - 白金コーティングでコートスパッタ。
- ショットキー・エミッタ及び二次電子検出器をSEMを用いて画像。 5-7 kVのビーム電圧および画像への8と9ミリメートルこれらの材料間のワーキングディスタンスを使用します。
- 紫外-可視（UV-VIS）分光光度測定
- 吸光度のプロを監視します200〜800ナノメートルからデュアルビーム分光光度計を使用して、すべての3つの条件のためのファイル（2.2.2からの未反応顆粒、3.2.3から抽出された顔料、および3.2.4からの顔料抽出顆粒）。
- 未反応の顆粒および顔料抽出顆粒のための1ミリリットルキュベットに脱イオン水を用いてブランク測定を収集します。両方のサンプルのためのUV-Vis吸収スペクトルを収集します。
- 抽出された顔料のための1ミリリットルキュベット中の酸性メタノール溶液を使用してブランク測定を収集します。サンプル用のUV-Vis吸収スペクトルを収集します。
- 吸光度ピークがその最大相対的な高さに到達する波長を識別することにより、各試料の最大波長を決定します。
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Representative Results
色素胞は、Dから解剖されていますpealeii背マントル（ 図1A、1B）。それらが削除されると、色素胞を溶解させ、着色された顆粒（ 図2A、2B） を出て分離するために遠心分離し、洗浄サイクルを使用して精製されます。酸性メタノール溶液（塩酸-メタノール）は、可溶性色素の抽出物および不溶性の、無色の顔料抽出顆粒を得、顆粒（ 図2C）から色素を抽出するために使用されます。
抽出プロセスは、顆粒の平均直径を減少させます。これは、走査型電子顕微鏡（SEM）を用いて観察されます。 （; 図3A N = 100、誤差は標準偏差である）顆粒をHCl-MeOH中に暴露される前に、彼らは（527.3±91.8）ナノメートルの平均直径を有します。顔料は顆粒から抽出され、サイズ減少（202.6±32.2）nmまでの（N = 100、誤差は標準偏差であり、 図3B）。この小型化をHCl-MeOHで処理した顆粒から顔料の抽出によるものと仮定されます。
この仮説をテストするには、目に見える色の前後の抽出の違いは、光学顕微鏡や分光光度法を使用して監視しています。塩酸-メタノールを添加すると、未反応の顆粒に関連付けられた色が目に見えて（ 図4A）を低下させます。これにより、広い吸光度プロファイル（〜280から800ナノメートル）ははるかに低い強度ではあるが、予備抽出顆粒およびポスト抽出顆粒について観察されたUV-VIS分光光度法（ 図4B）を使用して特徴づけられます。一方、可溶性色素の抽出物は、〜380 nmの肩で、〜500 nmの中心ラムダ極大を示します。まとめると、これらのデータが正常に顆粒から目に見える色を抽出する方法を提案します。
図1： イカD.からの色素胞pealeii。（A）イカD. pealeii背マントル。 （B）、赤、黄、茶色の色素胞の明視野像。スケールバー= 1mmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図 2： 抽出処理の説明図 （A）色素胞が切開されます。 （B）顔料顆粒をホモジナイズ色素胞組織から取り出し、遠心分離及び洗浄サイクルのシリーズを使用して精製されます。 （C）顔料は、exすることができます無色の顔料抽出顆粒から分離された可溶性色素上清を得た塩酸-メタノールを使用して顆粒からtracted。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3： 塩酸-メタノール抽出は、ナノ構造の顆粒の直径を変化させる （A）予め酸性メタノール抽出色素顆粒と、（B）後の酸性メタノール抽出色素顆粒の走査型電子顕微鏡写真。スケールバー=1μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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図4： 塩酸-メタノール抽出は、ナノ構造の顆粒の可視色を変化させる抽出プロセス全体を通して色素顆粒の（A）明視野像。 （B）前（黒）の吸光スペクトル-とポスト（青） - 。顔料上清（赤）と一緒に抽出この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
私たちは、イカ色素胞の顆粒から色素を抽出する方法を示しました。特に顆粒を標的とすることによって、私たちの目標は、適応着色の媒介におけるそれらの役割を決定することです。この方法は、バルク組織サンプル14または凍結乾燥した皮膚15を使用して、頭足類の顔料を特徴付けるために設計された従来の報告とは異なります。
このプロトコルは、色素胞顔料を抽出するのに効果的であるが、それは小さな反応スケールに制限されます。精製された顆粒の〜11 mgの1イカ収量を解剖。この質量の約58％をHCl-MeOH溶液を用いて抽出された水溶性の色素が含まれています。12開始色素胞組織の純度は直接1解剖から製品の歩留まりに影響を与えます。サンプルは過剰表皮や解剖の間に収集虹色素胞組織によって汚染されて表示された場合、それは、サンプルの内容を分離追加bufに再懸濁するのが最適ですFER、および均質化が再びオーバー手順を開始します。色素胞組織から顔料顆粒の純粋な集団を単離すると、4日間にまたがる可能性など、多くの4、8のような時間の超音波処理サイクルを取ることができます。顔料顆粒の純粋な集団を確保するために、単独で患者を維持することが重要です。
出発顆粒液の純度はまた、塩酸 - メタノールと顔料抽出工程に影響を与えます。顆粒が未消化の組織によって閉塞されている場合は、単にボルテックスし、最大1時間にサンプルを超音波処理し、再び抽出を開始する前に、サンプルを均質化します。多くの場合、サンプルあたり塩酸 - メタノール500μlのを使用して4-5回の洗浄は、顆粒から色素を抽出するために必要とされます。正しく行われている場合、この手順は、サンプルあたりの可溶性色素2-3 mlの間で得られます。さらなる精製は、薄層クロマトグラフィーで使用される場合、単離された顔料はxanthommatinとdecarboの種々の濃度を含む4つの異なる画分に分離しますxylated xanthommatin。12
この方法は、より良好な色変調における顔料の役割を理解するために化学、生物、または技術者によって利用され得ます。顆粒中の顔料の存在は、ナノ構造の色素胞の色素顆粒中に含まれる分子成分に由来する頭足類での着色のための階層的メカニズムを示唆しています。これらの知見は、あらかじめパッケージ化色素性ナノ粒子を用いた頭足類に表示された適応的色のダイナミックレンジを模倣するように設計され操作さシステムに通知するために使用することができます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase | Alfa Aesar | 9001-12-1 | No hazard |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 3482-12-3 | Irritant, acute toxicity |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | Mild irritant |
| Hydrochloric acid | EMD Chemicals | 7647-01-0 | Corrosive |
| k-Aspartate | Sigma-Aldrich | 1115-63-5 | Reacts violently with oxidants |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | Mild eye irritant |
| Methanol | Pharmco-AAPER | 67-56-1 | Highly flammable |
| Mini tablet prtoease inhibitor | Sigma-Aldrich | 469315-90-01 | Corrosive to metal and skin |
| Papain | Sigma-Aldrich | 9001-73-4 | Irritant |
References
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