Abstract
وقد استخدمت الحقن تحت الشبكية بنجاح في كل من البشر والقوارض لتقديم التدخلات العلاجية من البروتينات، العوامل الفيروسية، والخلايا إلى interphotoreceptor / حجرة تحت الشبكية التي لديها التعرض المباشر للخلايا مستقبلة للضوء والظهارة الصبغية الشبكية (RPE). وقد أظهرت الحقن تحت الشبكية من البلازمينوجين وكذلك التجارب قبل السريرية والسريرية الأخيرة السلامة و / أو فعالية لإيصال النواقل الفيروسية والخلايا الجذعية للأفراد المصابين بأمراض الشبكية المتقدمة. نماذج الماوس من مرض في شبكية العين، وراثي ولا سيما ضمور شبكية العين، ضرورية لاختبار هذه العلاجات. إجراء الحقن الأكثر شيوعا في القوارض هو استخدام transcorneal صغيرة أو شقوق transcleral مع نهج الأمامي لشبكية العين. مع هذا النهج، وإبرة حقن تخترق الشبكية العصبي الحسي تعطيل RPE الكامنة وعلى الإدراج يمكن بسهولة نيك العدسة، مما تسبب عتامة العدسة وانخفاض قيمة imagi موسعنانوغرام. الوصول إلى الفضاء تحت الشبكية عبر transcleral، نهج الخلفي يتجنب هذه المشاكل: الإبرة تعبر الصلبة حوالي 0.5 ملم من العصب البصري، دون تغلغل في شبكية العين والابتعاد عن تعطيل زجاجي. تقتصر الأضرار الجانبية لتلك المرتبطة بضع الصلبة التنسيق وآثار عابرة، المصلية انفصال الشبكية. بساطة الأسلوب يقلل من إصابة العين، تضمن إعادة المرتكز شبكية العين السريعة والانتعاش، ولديها نسبة الفشل منخفضة. والحد الأدنى من الضرر الذي يلحق بالشبكية وRPE يسمح للتقييم واضح لمدى فعالية والآثار المباشرة للعوامل علاجية أنفسهم. توضح هذه المخطوطة تقنية حقن تحت الشبكية الجديدة التي يمكن استخدامها لاستهداف ناقلات فيروسية، وكلاء الدوائية، والخلايا الجذعية أو خلايا الناجم الجذعية المحفزة (آي بي إس) إلى الفضاء تحت الشبكية في الفئران مع فعالية عالية، الحد الأدنى من الضرر، والانتعاش السريع.
Introduction
الحقن تحت الشبكية هي الوسيلة الأساسية لتقديم وكلاء الخلوية والفيروسية لشبكية العين من الفئران لدراسة تأثيرها على المستقبلات الضوئية وRPE الكامنة 1،2. معظم البروتوكولات حقن تحت الشبكية في الفئران تستخدم transcorneal أو transcleral موقع الحقن والأمامي من خط الاستواء (الشكل 1). هذا النهج يمكن أن يؤدي إلى أضرار جانبية الأصيل الذي يشمل الخدش ويعكر الناتج من العدسة، وتعطل سلامة الجسم الزجاجي، والاختراق من الشبكية العصبي الحسي وقزحية العين، نزيف في شبكية العين والمفارز في شبكية العين كبيرة ودائمة وذمة تحت الشبكية 3-9. يجب التلاعب التجريبية التغلب على هذه الآثار من أجل تقييم آثار التدخلات العلاجية 3،7،10،11. وتقدم هذه الدراسة وصفا تفصيليا والتحقق من صحة الخلفي طريقة الحقن transcleral أن يتجنب هذه المضاعفات، يقلل الصدمة ولديها نسبة نجاح عالية من استهداف الفرعيةالفضاء في شبكية العين.
حقن استهداف الفضاء تحت الشبكية في الفئران وغالبا ما تكون صعبة للغاية لأداء ومعظم المحققين تواجه ارتفاع وتيرة المحاولات الفاشلة التي يتم تسليم متجه إلى موقع غير صحيح أو هناك أضرار في شبكية العين كبير، على سبيل المثال في انفصال الشبكية كاملة 6. وعادة لا يتم إبلاغ عدد من العيون استبعادها من التحليل بسبب مضاعفات حقن في الدراسات الماوس، ولكن في واقع تجربتنا وفي مناقشة مع باحثين آخرين، وعدد من الحقن فشل يمكن أن تصل إلى 50٪ وتختلف تعتمد على الخبرة و قدرات المحقق الذي يقوم بتنفيذ الحقن. وعادة ما يتم تقييم نجاح الحقن بواسطة التصوير قاع المباشر و / أو البصرية تماسك التصوير المقطعي (أكتوبر) 7،9. طريقة يتقن بسهولة مع معدلات نجاح عالية للحقن تحت الشبكية في الفئران يمكن أن يسرع التجريب وخفض تكلفة الدراسات قبل السريرية من عطرatments لأمراض الشبكية التي هي من الأسباب الرئيسية للعمى في الولايات المتحدة.
الخلفي، transcleral تقنية الحقن تحت الشبكية الموصوفة هنا هي التكيف من البروتوكولات السريرية وقبل السريرية 9،12. التقييمات التشخيصية موسع أجريت في حقن الفئران تبين أضرار خفيفة ومحلية للغاية وتفتقر إضافية عدسة ضمانات أو إصابة شبكية العين وRPE. وعلاوة على ذلك، مع القليل من الممارسة نسبيا، يمكن للمجرب تحقيق هذه النتائج مع نسبة نجاح عالية (80-90٪ أو أفضل)، وبالتالي تقليل التكاليف المرتبطة بمثل هذه الدراسات. هذا الإجراء يمكن استخدامها لتقديم التدخلات العلاجية الخلوية، فيروسية، أو الدوائية إلى المستقبلات الضوئية و / أو RPE في الدراسات قبل السريرية وتقييم بسهولة التدخلات التجريبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
الحيوانات: النوع البري C57BL / 6J الفئران ولدت في جامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس (UCLA). وكانت جميع الحيوانات بين 11-17 أسابيع من العمر، وشملت الذكور وإناث الفئران. وكانت جميع الفئران يضم مجموعة وصيانتها في ضوء دورة 0:12 / مظلمة مع بالمال وبالشهرة أيضا الغذاء والماء الإعلانية. أجريت جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية من جامعة كاليفورنيا وجمعية البحوث في الرؤية وبيان العيون لاستخدام الحيوانات في العيون والبحوث الرؤية.
ملاحظة: جميع الأدوية وكلاء عن طريق الحقن هي الولايات المتحدة أدوية (USP) درجة.
1. إعداد الجراحي
- تخدير الفأر مع حقنة داخل الصفاق من 100 ملغم / كغم من الكيتامين و 8 ملغ / كغ زيلازين في مزيج ملحي. إدارة التخدير إلى عمق بحيث الماوس لا يوجد لديه قرصة أخمص القدمين أو ردود الفعل لمس القرنية.
- الحفاظ على درجة حرارة الجسم في 37.0 درجة مئوية مع وسادة المياه المنتشرة.
- تمدد التلاميذ مع 2.5٪ فينيليفرين العين دنظام الحماية من الانقلاب وتقليم شعيرات لتسهيل التصور. توفر شعيرات المدخلات الحسية كبير على الماوس، وبالتالي، الطولي وتقليم يجب إزالة الجزء الوحيد الذي يمنع وصول واضحا للعين، وليس على قاعدة الطولي. في تجربتنا، تظهر الفئران الانتعاش الطبيعي بعد هذا الإجراء. تطبيق العين ميثيل قطرات لمنع جفاف والتقليل من مخدر الناجم عن إعتام عدسة العين عابرة 13.
- تعقيم الأدوات قبل الجراحة (أي betadine والايثانول او الخرز الساخنة).
- إعداد فلوريسئين المخفف (0.01٪ باستخدام المياه المالحة 0.9٪) في بيئة معقمة (أي والسلامة البيولوجية مجلس الوزراء) إذا كان سيتم تنفيذ التصور (انظر القسم 3 أدناه).
2. حقن إعداد الموقع
- تحضير حقنة (على سبيل المثال، 5 ميكرولتر حقنة) مع حجم مناسب حقن (على سبيل المثال، 0،3-1،0 ميكرولتر).
- ضع الماوس بحيث يواجه العين صعودا واضحة للعيان في ديssecting المجهر.
- قرصة بلطف الملتحمة الزمنية مع ملقط الرؤوس الجميلة. جعل شق كفافي ما يقرب من 90 درجة باستخدام منحني مقص Vannas.
- كرر الخطوة 2.3 مع كبسولة لسان الكامنة و.
- بتر الأنسجة الضامة المحيطة يميل ملقط غرامة في حين تناوب العالم أنفيا. العمل من أجل الحقن حوالي 0.5 ملم الزمني في العصب البصري. استخدام عناية كبيرة لتجنب تعطيل الجيوب الرجعية المدارية.
3. بضع الصلبة وتحت الشبكية حقن
ملاحظة: من المستحسن أن حقن 0.01٪ فلوريسئين في 0.9٪ المالحة أن تستخدم للمساعدة في التصور حين تعلم هذا الإجراء. توزيع الطبوغرافية من فلوريسئين يمكن أن تكون موثقة بشكل فعال مع التصوير قاع (انظر القسم 4 أدناه).
- إجراء شق الصلبة صغيرة في موقع الحقن بواسطة خدش بلطف فنجان العين بشفرة العيون 22.5 درجة. هذا الشق شوLD يكون فقط كبيرة بما يكفي للسماح للرأس الإبرة بالمرور الصلبة.
- إدراج مشطوف 33 إبرة G (الزاوية 5 - 10 درجة في بضع الصلبة مع شطبة تواجه وبالتوازي الزاوية لشبكية العين حقن حجم المطلوب (على سبيل المثال، 0،3-1،0 ميكرولتر من 0.01٪ فلوريسئين لأغراض التعلم).
ملاحظة: الحفاظ على عقم حقنة عن طريق تنظيف شامل مع يغسل المتعاقبة من مذيب مناسب والمياه DI قبل كل حقنة. - تضغط على المكبس ببطء (أكثر من ~ 3 ثانية) دون تحريك الإبرة وحتى مع الضغط.
ملاحظة: عندما إبرة في الفضاء تحت الشبكية، سيشعر مقاومة طفيفة في حين تضغط على المكبس. لن يكون هناك لأدنى مقاومة إذا كانت إبرة يثقب شبكية العين، ومقاومة عالية إذا لم إبرة تخترق الصلبة أو RPE. - انتظر عدة ثوان قبل سحب الإبرة لتقليل ارتجاع.
- شطف العين مع مخزنة المالحة عقيمة وضمان ح العينكما استدارة الظهر إلى وضعها الطبيعي.
4. تقييم الشبكية مفرزة من أكتوبر وقاع العين التصوير
- أداء أكتوبر التصوير مباشرة بعد الحقن لتقييم نوعية الحقن وفي الوقت المناسب يشير بعد الحقن حسب الحاجة لتقييم بنية شبكية العين.
ملاحظة: أمثلة على استخدام أكتوبر في دراسات مماثلة وقد وصفت سابقا 7،14.- ضبط ومحاذاة الصورة أكتوبر لاستهداف موقع الحقن. وينبغي أن يكون في موقع الحقن خط الوسط و 0.5 ملم الزمني لرأس العصب البصري. كرر حسب الحاجة إذا كانت مفرزة خارج الإطار أو لا تركز على النحو الأمثل.
- تصور انفصال الشبكية وصبغ منطقة الحقن مع حمام وجه قاع التصوير 7،14.
ملاحظة: إذا كان نظام التصوير أكتوبر غير متوفر، حقن كمية صغيرة من فلوريسئين مع ناقلا لممارسة سيسمح التصور مع أي كاميرا قاع العين التي تنفذ فلوريسئين القسطرةgraphy باستخدام نفس موجات الإثارة ومنع المرشحات. ستظهر مناطق محددة من فرط مضان تحت الأوعية الدموية وسوف الأوعية الدموية لديها حدود حادة ومتميزة إذا استهدفت الفضاء تحت الشبكية بشكل صحيح. سيتم ترسيم حافة فقاعة من الحقن التي كتبها الانتقال من فرط لمضان أوالسكتة. توفر العديد من الصكوك هذا القدرة على الماوس. ووصف الأجهزة المستخدمة هنا في أي مكان آخر (14).
العناية 5. بعد العملية
- تطبيق معطف سميك من الثلاثي كريم العيون المضاد الحيوي على سطح القرنية بالعين حقن.
- وضع الفئران في أقفاص الانفرادي نظيفة لتحقيق الانتعاش. لا تجمع بين الفئران التي خضعت لعملية جراحية حتى يتم استردادها بالكامل.
- مراقبة التنفس ودرجة الحرارة أثناء الانتعاش التخدير. مراقبة الحيوانات حتى يتمكنوا من الحفاظ على الاستلقاء القصية.
- أداء مراقبة إضافية مناسبة بعد الجراحةوالعلاج، بما في ذلك حقن تحت الجلد من كاربروفين (5 ملغ / كلغ) لإدارة الألم بعد الجراحة.
6. تقييم وظيفة الشبكية بواسطة تخطيط كهربية الشبكية (أرج)
- لتحليل أرج قبل الحقن وفي الأوقات المناسبة بعد الحقن حسب الحاجة لتقييم وظيفة الشبكية. إذا تم إجراء حقن في الفضاء تحت الشبكية، ينبغي للانفصال الشبكية حل في غضون 72 ساعة.
- استخدام تقنيات أرج القياسية لتقييم وظيفة شبكية العين قبل وبعد الحقن كما هو موضح سابقا 14،15.
7. 3D التعمير والكمي البثرة حجم
ملاحظة: أكتوبر بالاشعة مع التباين العالي تشمل انفصال كامل في إطار الرأي والأمثل للاستخدام. يماغيج / فيجي 17،18 وImaris استخدمت، ولكن البرامج الأخرى يمكن استخدامها.
- تصدير ب-فحص الفائدة، الاستيراد ليماغيج / فيجي والمحاصيل (صورة> المحاصيل) جزء من الشوري أكتوبروإلى أن تكون على غرار باستخدام أداة التحديد المستطيلة.
- ضبط التباين (صورة> ضبط> السطوع / التباين) وترسيم أي حدود المفقودة من خلال ربط قسمين مع خط.
- رسم خط مستقيم مع (التحول القابضة) أداة الخط الذي يمتد RPE إلى طبقة مبصرة. قياس (تحليل> قياس) على طول الخط للحصول على حجم أقصى مفرزة للخطوة 7.8.
- استيراد الإطارات إلى برنامج 3D إعادة الإعمار اقتصاص (انظر الجدول المواد) باستخدام "RGB إلى الرمادي" المساعد وMATLAB مترجم وقت التشغيل.
- تعيين حجم فوكسل (ضمن خصائص صورة) باستخدام المعلمات معايرة من الفحص أكتوبر (س، ص، ض).
- تنفيذ "RGB إلى رمادي" المساعد (تحت خصائص الصورة)، على قدم المساواة مع الترجيح لكل قناة، لإنشاء قناة الرابعة. حذف القنوات الأحمر والأخضر والأزرق الأصلي.
- عكس قناة الرمادي باستخدام تغيير التباين. متجر الصورة.
- انقر على "إضافةسطح مصريات "الموجود في 3D-علامة التبويب عرض، وبدء الموجهة 4 خطوة عملية لخلق السطح.
- تعيين التفاصيل مستوى سطح (الخطوة 1 من 4).
ملاحظة: في تجربتنا 8،0-12،0 كان نطاق الأكثر فعالية. - تعيين الحد الأقصى لحجم المجال (تحت اختيار الخلفية) إلى أقل قليلا من الحد الأقصى لحجم مفرزة تقاس 7.1.2. إنشاء السطح والتراجع عن الانقلاب قناة الرمادي (الخطوة 2 من 4).
- تعيين العتبة إلى القيمة القصوى حتى سطح المساحات السلبية خارج شبكية العين وانفصال لا تأتي في اتصال (الخطوة 3 من 4).
- تعيين نوع فلتر لعدد من voxels وعزل الفضاء السلبي في الموقع مفرزة من حيث الحجم. الانتهاء من السطح (الخطوة 4 من 4).
ملاحظة: يوجد حجم سطح مفرزة تحت وحدة التخزين في علامة التبويب الإحصائيات.
- تعيين التفاصيل مستوى سطح (الخطوة 1 من 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الخلفي أجريت نهج الحقن تحت الشبكية transcleral في 31 عيون صحية من 16 الفئران نوع البرية مع حقن 0.3 ميكرولتر (ن = 18)، و 0.5 ميكرولتر (ن = 8) و 1.0 ميكرولتر (ن = 5) من 0.01٪ فلوريسئين. تم استبعاد عين واحدة من الحقن بسبب عتامة القرنية موجودة مسبقا التي حالت دون التحليل البنيوي والوظيفي. يتم تضمين كل عين حقن في هذا التقرير. لا انفصال الشبكية غير مقصودة، تم الكشف عن ثقوب الشبكية العصبي الحسي، أو تسرب في الجسم الزجاجي ولا كان أي دليل على الخدش عدسة، الاستجابات الالتهابية، التهاب القزحية، أو العدوى بعد العمليات الجراحية في أي عيون ملاحظتها.
تم تقييم بنية شبكية العين قبل الحقن، 10 دقيقة بعد الحقن و 4 أسابيع بعد الحقن باستخدام التصوير أكتوبر (الشكلان 2 و 3). والشبكة 9 نقاط، مع نقطة المركز التي تغمر مركز مفرزة القصوى، وضعت على 10 دقيقةبعد الحقن أون مسح الوجه (الشكل 2B). باستخدام المعالم الأوعية الدموية، قبل الحقن ولمدة 4 أسابيع بالاشعة بعد الحقن وتناوب ليكون في التسجيل مع 10 دقائق مسح بعد الحقن. يسمح هذا التحديد بالضبط نفس المواقع في حقن مسح شبكية العين قبل وبعد (الشكل 2A، C).
أسفرت الحقن تحت الشبكية في تشكيل فقاعة أن كان مركزه بعيدا عن موقع الحقن حيث دخلت إبرة الفضاء تحت الشبكية (الشكل 2B السهم)، وكانت إما مسطح الشكل (3A) مع مفرزة الضحلة التي تمتد على مساحة ممتدة أو القبة (الشكل 3B - D) مع مفرزة عميقة في منطقة مقيدة (الجدول 1). وقد عرف فقاعة القبة كأي مفرزة التي تجاوزت 50 ميكرون متعامد إلى RPE. ، لم يلاحظ أي ريدات، وهو نمط مائج التي تنتجها تمتد من طبقات شبكية العين الخارجية. السابقوقد تصور خيمة ترسب حقن مع حمام وجه أكتوبر (الشكل 2D، خط متقطع)، فلوريسئين تصوير قاع العين (الشكل 2E) وأكتوبر B-المسح (الشكل 3). معظم الفقاعات (29 من 31) لأكثر من مجال الرؤية لمسح أكتوبر، والتي تشمل ما يقرب من 10٪ من شبكية العين الماوس. لم يكن هناك سيطرة على شكل فقاعة بخلاف زيادة تواتر الفقاعات القبة مع حقن كميات أكبر (الجدول 1). جميع الفقاعات حلها بواسطة 2 أسابيع (لا تظهر البيانات).
مجموع سمك شبكية العين (غشاء بروك لطبقة الألياف العصبية) وتقييمها كميا بعد 4 أسابيع لحقن 0.3 ميكرولتر (الشكل 3A)، و 0.5 ميكرولتر (الشكل 3B) و 1.0 ميكرولتر (الشكل 3C) من حجم الضخ في كل نقطة على الشبكة موجودة في ب-المسح المقابلة (الجدول 1). الفرق النسبة المئوية (٪ Δ) ثكما تحسب على أساس الفرق المتعلقة القياسات قبل حقن لكل مقاييس الهيكلية والوظيفية. لا تم الحصول عليها جميع نقاط الشبكة خلال جميع جلسات التصوير. على سبيل المثال، كان 3 عيون 1 أو 2 نقطة، وكان 4 عيون 3 أو 4 نقاط، وكان 23 عيون 5-9 نقاط في جميع بالاشعة. وقد انهارت القبة والفقاعات مسطحة، وحقن كميات منذ كان مجموع سمك شبكية العين لا تختلف كثيرا عن ما قبل وما بعد الحقن، على الرغم من أن لوحظ اتجاه عام نحو ترقق الشبكية لكل من (الجدول 2).
أظهر مزيد من التحليل رقيق صغيرة ولكنها ذات دلالة إحصائية من 6.5٪ ± 1.9 عموما (قبل = 196 ± 1، ن = 31؛ آخر = 183 ± 4، ن = 31، ر 60 = 3.4، ع = 0.001) (الجدول 3). لتحديد مكان حدوث ترقق شبكية العين، وقد تم تحليل مجموعة فرعية من 10 العيون التي ترد قياسات سمك لجميع نقاط الشبكة 9. على غرار التحليل لجميع العيون، وأظهر فرعية من عيون أيضا صغيرة ولكنها مهمة ترقق الشبكية الإجمالي (10.3٪ ± 3.5، قبل = 199 ± 1، ن = 10؛ آخر = 179 ± 8، ن = 10، ر 18 = 2.4، ع = 0.02). ولم يلاحظ أي ترقق الشبكية في المواقع البعيدة إلى موقع الحقن (7.2٪ ± 4.0، قبل = 199 ± 2، ن = 10؛ آخر = 185 ± 8، ن = 10، ر 18 = 1.7، ص = 11). وقد لوحظ ترقق الشبكية في موقع انفصال الشبكية القصوى (11.2٪ ± 5.0، قبل = 201 ± 2، ن = 10؛ آخر = 179 ± 10، ن = 10، ر 18 = 2.1، ع = 0.04)، موقع الحقن دون ضرر (13.8 ± 6.0، قبل = 201 ± 1، ن = 4؛ آخر = 173 ± 10، ن = 4، تي 6 = 2.8، ع = 0.03)، مواقع حقن مع السجن في شبكية العين عند منطقة صغيرة من الشبكية سحبت من خلال الصلبة على سحب إبرة (14.1٪ ± 1.0، قبل = 199 ± 1، ن = 3؛ آخر = 171 ± 3، ن = 3، تي 4 = 8.9، ع = 0.001)، والحقن المواقع مع تندب (26.5٪ ± 1.6، قبل = 200 ± 3، ن = 3؛ نقاط البيعر = 147 ± 10، ن = 3، تي 4 = 5.1، ع = 0.007). في المجموع، وقعت فى السجن في 14 من أصل 31 الحقن، 3 مما أدى إلى تشكيل ندبة من المشيمية مع فقدان ما يصل إلى نصف طبقات الشبكية الخارجية (الشكل 3E). في كل حالة، ومع ذلك، كانت هذه الآثار المترجمة للغاية.
تم إجراء تخطيط كهربية الشبكية الميدان الكامل قبل الحقن وتكرر بعد 4 أسابيع حقن مع التغيرات النسبية تقييمها بشكل فردي لكل عين لتقييم التغيرات الوظيفية (الجدول 1). إلا الظلام تكييفها وسجلت ردود بوساطة قضيب. تم تركيب وظائف استجابة كثافة مع المعادلات ميخائيل-مينتن لاستخلاص VMAX لكل من المستقبلات الضوئية (أ -waves) والشبكية الوسطى (ب -waves). كانت الردود لا يتأثر شكل فقاعة وبالتالي تم انهار (الجدول 4). كان هناك انخفاض طفيف لكن ذات دلالة إحصائية في VMAX علىو-waves (F (1، 28) = 7.1، ع = 0.013) ولكن ليس -waves ب (F (1، 28) = 4.0، ع = 0.055) بعد الحقن (الجدول 4). ويبين الطول الموجي تمثيلية للقبل وبعد حقن 0.3 ميكرولتر و 0.5 ميكرولتر و 1.0 ميكرولتر (الشكل 4). كان هناك أثر لحجم الحقن على حد سواء - وب -waves (F (2، 28) = 6.2، ع = 0.006 و F (2، 28) = 8.8، ع = 0.001 على التوالي).
وأخيرا، تم استخدام النمذجة 3D لتصور هيكل كل الفقاعات القبة ومسطحة. مثال على فقاعة القبة (الشكل 5A) يدل على مفرزة مملوءة بسائل القبة الموجودة داخل منطقة المسح الضوئي. أمثلة من الفقاعات مسطحة (الشكل 5B، C) تظهر مناطق مملوءة بسائل الضحلة التي تمتد إلى ما بعد منطقة المسح الضوئي. عندما يحدث السجن في شبكية العين، ويعتبر وجود ثقب صغير في إعادة الإعمار (الشكل 5C). وتظهر حدود مصطنعة على حافة تي المسحس تسمح إعادة الإعمار (الشكل 5C). وأشارت حساب كميات فقاعة من هذه الحقن العينة أن ما لا يقل عن 0.15 ميكرولتر و 0.01 ميكرولتر استهدف بنجاح إلى الفضاء تحت الشبكية 0.3 حقن ميكرولتر مما أدى إلى الفقاعات القبة ومسطحة، على التوالي. حجم يحسب حقن المرجح أن يقلل من الحجم الفعلي بسبب قرار من التصوير وإعادة الإعمار، وارتشاف السوائل أثناء إجراء كما يحدث في الحقن تحت الشبكية الإنسان، والفقاعات مسطحة أو القبة بشكل خاص، إذا مفرزة كلها لم تكن ممثلة في مسح أكتوبر
الجدول 1. وظيفية التأثيرات والإنشائية من تحت الشبكية الحقن عن طريق العين. قياسات عيون الفردية ونتائجها من الحقن تحت الشبكية. ردود شبكية العين للضوء (الشبكية المتوسطة ب -waves ومستقبلة للضوء في -waveيتم إعطاء قياسات الصورة) وسمك شبكية العين (غشاء بروك لطبقة الألياف العصبية). الحواشي:
نوع BT = البثرة، شقة (F) أو القبة (D)
ب #gp = عدد نقاط الشبكة قياس
* عيون استخدامها لإعادة بناء حجم الحقن.
** نقطة الشبكة فقط 1 المتاحة لقياس في ندبة.
# عيون مع تشكيل ندبة.
| مرة | القبة البثرة | البثرة مسطحة | 0.3 ميكرولتر | 0.5 ميكرولتر | 1.0 ميكرولتر | |
| (ميكرون) | (ميكرون) | (ميكرون) | (ميكرون) | (ميكرون) | ||
| قبل الحقن 194 ± 2 | 197 ± 3 | 195 ± 1 | 197 ± 1 | 197 ± 3 | ||
| بعد الحقن | 176 ± 8 | 188 ± 3 | 180 ± 6 | 184 ± 5 | 192 ± 5 |
الجدول 2. تأثير تحت الشبكية الحقن على إجمالي الشبكية السماكة. تحليل شكل فقاعة وحجم الحقن على سمك شبكية العين.
| سمك (ميكرون) | |||||
| موقع | ن (العيون) | قبل | 4 أسبوع | Δ | ٪ Δ |
| شبكية العين (جميع نقاط متطابقة) | 31 | 196 ± 1 | 183 ± 4 | -13 ± 4 | -6.5 ± 1.9 |
| شبكية العين مع جميع نقاط الشبكة 9 * | 10 | 199 ± 1 | 179 ± 8 | -20 ± 7 | -10.3 ± 3.5 |
| البعيدة لحقن * | 10 | 199 ± 2 | 185 ± 8 | -14 ± 7 | -7.2 ± 4.0 |
| القصوى مفرزة * | 10 | 201 ± 2 | 179 ± 10 | -22 ± 9 | -11.2 ± 5.0 |
| حقن دون الأضرار * | 4 | 201 ± 1 | 173 ± 10 | -28 ± 12 | -13.8 ± 6.0 |
| السجن في حقن * | 3 | 199 ± 1 | 171 ± 3 | -28 ± 2 | -14.1 ± 1.0 |
| ندبة في حقن * | 3 | 201 ± 3 | 147 ± 10 | -53 ± 10 | -26.5 ± 1.6 |
الجدول 3. تأثير الأضرار في بنية شبكية العين. تحليل ترقق الشبكية التي تعتمد على الموقع. الحواشي: * تحليل من 10 الفئران مع البيانات من جميع نقاط الشبكة 9.
| VMAX (μV) | القبة (ن = 12) | شقة (ن = 6) | 0.3 ميكرولتر (ن = 18) | 0.5 ميكرولتر (ن = 8) | 1.0 ميكرولتر ن (= 5) |
| و-waves | > | ||||
| قبل الحقن | -338 ± 13 | -351 ± 13 | -347 ± 9 | -334 ± 16 | -425 ± 15 |
| بعد الحقن | -311 ± 8 | -321 ± 16 | -318 ± 11 | -318 ± 18 | -355 ± 29 |
| -waves ب | |||||
| قبل الحقن | 604 ± 30 | 578 ± 11 | 595 ± 20 | 542 ± 26 | 708 ± 21 |
| بعد الحقن | 537 ± 35 | 551 ± 15 | 542 ± 24 | 538 ± 31 | 612 ± 45 |
ضمن الصفحات = "1"> تي قادرة 4. تأثير تحت الشبكية الحقن على ظلامية رود بوساطة و- وب -waves. تحليل شكل فقاعة وحجم الحقن على الردود شبكية العين للضوء (الشبكية المتوسطة ب -waves ومستقبلة للضوء في -waves).
الشكل 1. التمثيل التخطيطي من تحت الشبكية حقن. التخطيطي من أعلى إلى أسفل من العين الفأر في المقبس يظهر هذا النهج في الحقن تحت الشبكية التقليدية، وذلك باستخدام transcorneal (السهم أ) أو transcleral (السهم ب) موقع الحقن بالقرب من مسطح بارس. يستخدم هذا الأسلوب نهج transcleral بالقرب من القطب الخلفي (السهم ج)، من خلال تناوب العين انفيا لفضح القطب الخلفي تحقيقه.ليه / ftp_upload / 54808 / 54808fig1large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. تسجيل الصور أكتوبر يسمح تحديد مواقع الشبكية لتحليل سمك. AC، أون الوجه أكتوبر صورة الماوس 1OS في اتجاه الأصلي. أ) صورة من شبكية العين قبل حقن مع شبكة تسجيل تنصهر. ب) صورة من شبكية العين 10 دقيقة بعد الحقن. كان وضعه والشبكة 9 نقاط مع نقطة المركز في موقع انفصال الشبكية القصوى. موقع الحقن مرئيا (السهم). C) صورة شبكية العين 4 أسابيع بعد الحقن مع شبكة تسجيل تنصهر. DE، صور الماوس 9OS. D) أون الوجه أكتوبر صورة شبكية العين 4 أسابيع بعد الحقن تظهر تمديد للانفصال تحت الشبكية. E)تراكب من قاع (الخضراء) وحمام وجهه الصور أكتوبر من شبكية العين 10 دقيقة بعد الحقن. شريط مقياس = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. تحت الشبكية الحقن السبب المؤقتة الشبكية مفارز مع الحد الأدنى من الشبكية التخفيف. وتظهر الممثلة أكتوبر B-المسح في موقع انفصال الشبكية القصوى لمرحلة ما قبل الحقن، 10 دقيقة بعد الحقن و 4 أسابيع بعد الحقن. أ) تشكيل وقرار من فقاعة مسطحة من حقن 0.3 ميكرولتر. ب) تشكيل وقرار من فقاعة القبة من حقن 0.5 ميكرولتر. ج) تشكيل وقرار من فقاعة القبة من حقن 1.0 ميكرولتر. D) مثال تشو شديد تندب roidal وترقق الشبكية في موقع الحقن. شريط مقياس = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. شبكية العين يحتفظ وظيفة عادية بعد البثرة القرار. ويبين الطول الموجي للردود بوساطة قضيب ظلامية لمرحلة ما قبل الحقن (الخط الأسود) و 4 أسابيع بعد الحقن (خط متقطع أحمر) لأ) 0.3 ميكرولتر، B) 0.5 ميكرولتر وC) حقن 1.0 ميكرولتر في 9 شدة إضاءة تتراوح بين 4.37 × 10 -6 إلى 0.51 شمعة / م 2. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
-together.within الصفحات = "1"> 
الرقم 5. 3D إعادة الإعمار من الفقاعات. أ) اعادة البناء 3D ممثل ولدت البرمجيات) القبة وB، C) الفقاعات مسطحة من الحقن 0.3 ميكرولتر. التضليع هو قطعة أثرية من برنامج إعادة الإعمار. وضعت الحواجز الاصطناعية في مئوية للسماح إعادة الإعمار. شريط مقياس = 150 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الحقن تحت الشبكية هي الأسلوب المفضل لتسليم ناقلات فيروسية ووقف العلاج المستمدة من خلية لمعالجة خلايا مستقبلة للضوء وRPE في كل من البحوث الأساسية والعلاج السريري. في المرضى، وعادة ما يتم الحقن تحت الشبكية مع بضع الصلبة الأمامي في مسطح بارس، واستئصال الزجاجية الخلفية الأساسية والاختراق من شبكية العين عن طريق الإبرة مع رؤية مباشرة. كما هو الحال مع معظم الإجراءات استئصال الزجاجية، ومن الشائع لتشكيل إعتام عدسة العين تحدث قبل الأوان ما لم تكن العين هي بالفعل pseudophakic. في الفئران، وتتم الحقن تحت الشبكية عادة مع الجزء الأمامي بضع الصلبة لشبكية العين، وهي طريقة كثيرا ما يرتبط مع كل من الخدش للعدسة، والتي تحتل معظم التجويف الخلفي من العين، واختراق transretinal التي يمكن أن تؤدي إلى انحباس الزجاجي وكامل مفارز شبكية العين. باستخدام تقنية نهج الخلفي في الفئران يقلل هذه النتائج غير المرغوب فيها ويحسن القدرة على تفسير EFتأثيرات سلبية للتلاعب مقصود.
وتشمل فوائد تقنية الحقن تحت الشبكية ذكرت هنا تأثيرات هيكلية أو وظيفية الحد الأدنى والحد من الأضرار الجانبية (على سبيل المثال، يعكر من الخدش عدسة، تسريب الزجاجي أو التهاب) التي تسمح بتقييم أسهل من النتائج التجريبية وأوقات الانتعاش بشكل أسرع. هذا الأسلوب يتطلب معالجة أكبر من العين للوصول إلى القطب الخلفي ولكن يمكن أن تكتمل في حوالي 10-15 دقيقة في العين مع نسبة نجاح عالية حيث تم رفض أي العينين من التحليل. في الغالبية العظمى من الحقن، وقد لوحظ بنية شبكية العين الطبيعي وظيفة في غضون 4 أسابيع. وعلى سبيل المقارنة، دراسات سابقة تفيد 5-8 أسابيع للتعافي من بنية ووظيفة أو لا تفيد وقت الانتعاش 6،7. ونتيجة لذلك، والتجارب يمكن أن تكتمل في وقت أقل مع عدد أقل من الحيوانات.
وتشمل مضاعفات هذه التقنية حقن تحت الشبكية تشكيل ندبة وفقدانخلايا مستقبلة للضوء في ما يقرب من 10٪ من عمليات الحقن، مع ثلاث حالات فقط من العجز الهيكلية والوظيفية الهامة. الإبقاء على شبكية العين الاستجابات الطبيعية للضوء فقط مع أكبر ندبة التناقص وظيفة إلى 80٪ من استجابة مستقبلة للضوء و 77٪ من استجابة شبكية العين الداخلية مقارنة مع ما قبل الحقن. قد يتم تخفيض توقيفات في شبكية العين مع استخدام إبرة جديدة لكل الحقن، على الرغم من أن هذا لم يكن تقييمها في الدراسة الحالية. بدلا من ذلك، فإنها قد تحدث بسبب الضغط السلبي وبالتالي يكون لا مفر منه. توقيفات شائعة جدا في الحقن تحت الشبكية الإنسان، ومع ذلك، ونظرا للحجم الكبير من العين، والسجن فترات تمثل أقل الأضرار التي لحقت الكلية شبكية العين. ونتيجة لذلك، إذا تم حقن عامل علاجي، و 90٪ من العيون حقن ستكون متاحة لتقييم آثار هذا التدخل.
التغير في قياسات سمك الشبكية قبل تحت الشبكية وبعد حقن يعكس استنساخ رانه أكتوبر الصك على الفئران، ودقة التوفيق بين المواقع الشبكية عبر الصور، والتغيرات في شبكية العين من حقن محلول ملحي فيزيولوجي مع جرعة منخفضة صبغة فلوريسئين. ويمكن لهذه القياسات تعمل على توجيه المحققين في حسابات السلطة لعدد من العيون والمواقع الشبكية اللازمة للكشف عن تغيرات صحيحة إحصائيا نتيجة للحقن تحت الشبكية أم لا عامل علاجي موجود. في 10 الحالات التي كانت هناك 9 نقاط الشبكة في كل بمسح شبكية العين، وتقلب من سمك الشبكية خارج موقع الحقن (5-8 نقطة في العين) كانت 7.2٪ ± 4.0٪، حتى في حالة عدم وجود سمية أو وكيل العلاجية أو ضمور الشبكية الوراثي. هذا التباين هو النظر لوضع معايير للمقارنة بين النتائج السريرية باستخدام نماذج الماوس للعلاج تحت الشبكية، وتشير بقوة إلى أن الضوابط المناسبة وتشمل حقن تحت الشبكية مركبة بدلا من العين uninjected 3. وأخيرا، فإننا نشجع investigators للقيام العديد من مسح أكتوبر من المناطق الشبكية متعددة قبل الحقن لتحسين التغطية من موقع الحقن في جميع بالاشعة.
ومن المرجح أن تتحقق الكفاءة العلاجية عندما يتم تسليم وكلاء التجريبية إلى فسحة أكبر من شبكية العين. في هذه الحالات، كميات أكبر مثالية ولكن قد لا تكون ضرورية الى 0.3 حقن ميكرولتر غالبا ما تتشكل الفقاعات المسطحة التي تغطي مساحة الشبكية الكبيرة. كان شكل فقاعة لا يمكن السيطرة عليها، على الرغم من أن حقن كميات أكبر تنتج الفقاعات أكثر القبة. تصل إلى 1 ميكرولتر يمكن حقنه دون النتائج السلبية، ومع ذلك، فمن الممكن أن الفقاعات القبة تصبح بذلك بمد أن اللمسات شبكية العين ويلتزم الكبسولة الخلفية للعدسة، ولا سيما في الفئران الشباب مع وحدات التخزين زجاجي منخفضة. وعلى الرغم من حجم تسليمها من الحقنة، ويتم احتساب الحجم الفعلي تستهدف الفضاء تحت الشبكية لتكون أقل. قد يعكس هذا حجم لا يحصلون عليها في المسح أكتوبر، ولا سيما بالنسبة للالقبة أو وقد يعكس الفقاعات خطوط الطول، أو قطعة أثرية من الفحص أكتوبر والتعمير اللاحقة، ولكن خسارة حجم من ارتجاع على سحب الإبرة.
وخلاصة القول، وذلك باستخدام نهج الخلفي للحقن تحت الشبكية لديها عدد أقل من المضاعفات وتحسين الانتعاش، مما أدى إلى نسبة نجاح عالية من استهداف وانخفاض معدل الاستبعاد. هذه التقنية مثالية للتلاعب الفيروسية، الدوائية، والخلوية في شبكية العين القوارض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hamilton Model 62 RN SYR | Hamilton | 87942 | Syringe x 1 |
| Hamilton Needle 33 G, 1.0", 20 DEG, point 3 (304 stainless steel) | Hamilton | 7803-05 | Needles x 6 |
| Vannas Curved Scissors | Ted Pella, INC. | 1347 | 5 mm Blade |
| 22.5 Degree Microsurgery Knife | Wilson Ophthalmic Corp. | 91204 | |
| Ketaject | Phoenix | NDC 57319-609-02 | Ketamine |
| Anased | Lloyd Laboratories | NDC 61311-482-10 | Xylazine |
| Fluorescein 10% AK-Fluor | Akorn | NDC 17478-253-10 | 100 mg/ml |
| 0.9% Saline USP | Hospira | NDC 0409-4888-50 | 0.9% NaCl |
| Antibiotic Ointment | Akorn | NDC 17478-235-35 | Ophthalmic |
| Water Circulating Pump | Gaymar | TP-500 T/Pump | P/N 07999-000 |
| sd-OCT | Bioptigen | R-Series | Commercial |
| Fundus Camera | Phoenix Research Laboratories | MICRON III | |
| Tweezers Type 3 | Ted Pella, INC. | 5385-3SU | |
| 2.5% Phenylephrine | Paragon BioTeck | NDC 42702-102-15 | Ophthalmic |
| IMARIS8 | Bitplane | Version 8.1.2 | |
| ImageJ | NIH | V1.8.0_77 | |
| Hypromellose 2.5% | Goniovisc | AX0401 | Methylcellulose |
| Eye Drops (Rinse) | Bausch & Lomb | Saline Solution | |
| Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | Microscope |
| Light source | Fostec | P/N 20520 | Light source |
References
- Garoon, R. B., Stout, J. T. Update on ocular gene therapy and advances in treatment of inherited retinal diseases and exudative macular degeneration. Curr Opin Ophthalmol. 27 (3), 268-273 (2016).
- Pierce, E. A., Bennett, J. The Status of RPE65 Gene Therapy Trials: Safety and Efficacy. Cold Spring Harb Perspect Med. 5 (9), a017285 (2015).
- Tolmachova, T., et al. Functional expression of Rab escort protein 1 following AAV2-mediated gene delivery in the retina of choroideremia mice and human cells ex vivo. J Mol Med (Berl). 91 (7), 825-837 (2013).
- Nork, T. M., et al. Functional and anatomic consequences of subretinal dosing in the cynomolgus macaque. Arch Ophthalmol. 130 (1), 65-75 (2012).
- Ye, G. J., et al. Safety and Biodistribution Evaluation in Cynomolgus Macaques of rAAV2tYF-PR1.7-hCNGB3, a Recombinant AAV Vector for Treatment of Achromatopsia. Hum Gene Ther Clin Dev. , (2016).
- Qi, Y., et al. Trans-Corneal Subretinal Injection in Mice and Its Effect on the Function and Morphology of the Retina. PLoS One. 10 (8), e0136523 (2015).
- Engelhardt, M., et al. Functional and morphological analysis of the subretinal injection of retinal pigment epithelium cells. Vis Neurosci. 29 (2), 83-93 (2012).
- Lambert, N. G., et al. Subretinal AAV2.COMP-Ang1 suppresses choroidal neovascularization and vascular endothelial growth factor in a murine model of age-related macular degeneration. Exp Eye Res. 145, 248-257 (2016).
- Muhlfriedel, R., Michalakis, S., Garcia Garrido, M., Biel, M., Seeliger, M. W. Optimized technique for subretinal injections in mice. Methods Mol Biol. 935, 343-349 (2013).
- Nusinowitz, S., et al. Cortical visual function in the rd12 mouse model of Leber Congenital Amarousis (LCA) after gene replacement therapy to restore retinal function. Vision Res. 46 (22), 3926-3934 (2006).
- Huang, R., et al. Functional and morphological analysis of the subretinal injection of human retinal progenitor cells under Cyclosporin A treatment. Mol Vis. 20, 1271-1280 (2014).
- Maguire, A. M., et al. Safety and efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis. N Engl J Med. 358 (21), 2240-2248 (2008).
- Ridder, W. 3rd, Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. Causes of cataract development in anesthetized mice. Experimental Eye Research. 75 (3), 365-370 (2002).
- Ridder, W. H. 3rd, Nusinowitz, S. The visual evoked potential in the mouse--origins and response characteristics. Vision Res. 46 (6-7), 902-913 (2006).
- Matynia, A., et al. Intrinsically photosensitive retinal ganglion cells are the primary but not exclusive circuit for light aversion. Experimental Eye Research. 105, 60-69 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
